Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

УДК 577.152.313

КІНЕТИЧНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ ІНГІБУВАННЯ ЛУЖНОЇ ФОСФАТАЗИ З КИШОК ТЕЛЯТИ L-ЦИСТЕЇНОМ, ВІДНОВЛЕНИМ ГЛУТАТІОНОМ І ФОСФОНОВИМИ КИСЛОТАМИ

02.00.10 - біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Музичка Оксана Володимирівна

Київ 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Науковий керівник доктор хімічних наук, старший науковий співробітник Вовк Андрій Іванович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу механізмів біоорганічних реакцій

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Кібірєв Володимир Костянтинович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу хімії білка

доктор хімічних наук, професор Тьортих Валентин Анатолійович, Інститут хімії поверхні НАН України, головний науковий співробітник

Провідна установа Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, відділ біохімії м'язів

Захист відбудеться 19 листопада 2004 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

Автореферат розісланий 18 жовтня 2004 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Лужні фосфатази є неспецифічними цинк- і магній-залежними металоферментами, що каталізують гідроліз моноалкілфосфатів і реакцію трансфосфорилювання. Лужна фосфатаза з Е. Coli найбільше вивчена; встановлено структуру комплексу ферменту з неорганічним фосфатом (Kim et al., 1991), ванадатом (Holtz et al., 1999) та фосфоновими кислотами (Holtz et al., 2000). Припускається, що будова активного центру лужної фосфатази з тканин ссавців подібна до будови активного центру бактеріального ферменту. Складовою частиною мембраноактивних лужних фосфатаз є гідрофобні якірні залишки з пептидними, фосфоліпідними, жирнокислотними та іншими фрагментами (Manes et al., 1999).

Активність лужних фосфатаз, що виконують важливі фізіологічні функції в процесах метаболізму неорганічного фосфату, може змінюватись при патологіях. Останні дослідження свідчать, наприклад, про підсилену експресію лужної фосфатази в остеобластах при остеопорозі (Boyan et al., 2003). З огляду на значний рівень складності функціонування лужних фосфатаз з тканин ссавців, механізми ферментативного гідролізу природних моноалкілфосфатів і його регуляція багато в чому не з'ясовані. Тому актуальними є модельні дослідження, в тому числі вивчення перспективних у використанні природних і синтетичних інгібіторів лужної фосфатази.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є складовою частиною науково-дослідних робіт Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (тема 2.1.10.13-03 "Дослідження механізмів біоорганічних реакцій природних низькомолекулярних сполук та їх синтетичних структурних аналогів в модельних хімічних, ферментативних і білкових системах", № держреєстрації 0103U005434).

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи було зясування кінетичних закономірностей впливу L-цистеїну, відновленого глутатіону і фосфонових кислот на активність лужної фосфатази з кишок теляти, а також пошук нових ефективних фосфорорганічних інгібіторів цього ферменту.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

- встановлення кінетичних закономірностей інгібування лужної фосфатази відновленим глутатіоном та іншими тіольними антиоксидантами;

- дослідження кінетичних аспектів і механізму зв'язування L-цистеїну в активному центрі лужної фосфатази;

- вивчення інгібуючої дії L-цистеїну і відновленого глутатіону на активність гідрофобних і гідрофільних форм лужної фосфатази;

- дослідження впливу амінофосфонових кислот на активність лужної фосфатази;

- дослідження фосфонових кислот на макроциклічній платформі як інгібіторів лужної фосфатази.

Обєкт дослідження - інгібітори лужної фосфатази з кишок теляти.

Предмет дослідження - механізми інгібування і активації лужної фосфатази. фосфатаза лужний цистеїн глутатіон

Методи дослідження - спектрофотометрія, ферментативна кінетика.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено кінетичні закономірності інгібуючої дії відновленого глутатіону та дигідроліпоєвої кислоти на активність лужної фосфатази з кишок теляти. Показано, що вплив відновленого глутатіону описується закономірностями частково змішаного інгібування. Взаємодія L-цистеїну з лужною фосфатазою в центрі зв'язування субстрату охарактеризована як двостадійний процес, що включає швидке утворення первинного комплексу і повільну стадію формування наступного комплексу інгібітора з ферментом. Розраховано мікроскопічні константи швидкості повільної стадії взаємодії L-цистеїну з лужною фосфатазою з кишок теляти. Доведено, що більшу спорідненість до відновленого глутатіону та L-цистеїну проявляють гідрофільні фракції цього ферменту у порівнянні з гідрофобними, одержаними після його розділення на октилсефарозі. Встановлено, що -аміно- і -амінофосфонові кислоти можуть бути активаторами лужної фосфатази з кишок теляти. Продемонстровано високу ефективність інгібіторів лужної фосфатази, що вміщують у своїй структурі гідрофобний калікс[4]арен як фундамент для одного або двох фрагментів метиленбісфосфонової кислоти.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційної роботи можуть бути застосовані для дизайну нових інгібіторів лужної фосфатази. Одержані дані поглиблюють уявлення про зв'язок поміж антиоксидантним статусом організму та активністю лужних фосфатаз, а також можуть бути враховані при розробці необхідних лікарських засобів.

Особистий внесок здобувача. Дисертанткою самостійно виконано експериментальну частину роботи, проведено обробку результатів кінетичних досліджень. Очистку і виділення гідрофобних та гідрофільних препаратів лужної фосфатази виконано разом з канд. біол. наук О.В. Харченко. Аналіз отриманих даних, обговорення механізмів і формулювання висновків проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на наукових конференціях Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (Київ, 2003 р., 2004 р.) та XVI Міжнародній конференції з хімії фосфору (Бірмінгем, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті в наукових фахових виданнях та тези доповіді.

Структура та обєм роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, екпериментальної частини, викладу отриманих результатів та їх обговорення, висновків і списку літератури (126 найменувань). Дисертаційна робота налічує 120 сторінок друкованого тексту, проілюстрована 8 таблицями та 27 малюнками.

Основний зміст роботи

Огляд літератури

Огляд літератури включає обговорення механізмів гідролізу моноалкілфосфатів в модельних неферментативних системах, механізмів каталітичної дії лужних фосфатаз та впливу природних і синтетичних інгібіторів на їх активність.

Матеріали і методи досліджень

В роботі використовували лужну фосфатазу з тонких кишок теляти (Fluka), п-нітрофенілфосфат (Sigma), L-цистеїн (Sigma), відновлений глутатіон (Serva), дигідроліпоєву кислоту (Sigma). Амінофосфонові кислоти були надані старшим науковим співробітником Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України Т.М.Кашевою. Фосфорильовані калікс[4]арени були синтезовані в Інституті органічної хімії НАН України професором В.І.Кальченком та аспірантом С.О.Черенком.

Очистку препаратів лужної фосфатази проведено на колонці з Toyopearl HW-55 в натрій-ацетатному буфері (0,025 М, рН 5,5). Методика одержання гідрофільних і гідрофобних фракцій лужної фосфатази включала дві стадії: гель-фільтрацію на Toyopearl HW-55 і гідрофобну хроматографію на октилсефарозі CL-4В. Елюцію білка, який зв'язався з октилсефарозою, проводили лінійним градієнтом сульфату амонію від 20% до 0% в 0,025 М натрій-ацетатному буфері (рН 5,5). Активність одержаних фракцій лужної фосфатази дорівнювала 1,7-3,0 мкмоль/хв на мг білка (трис-НСl-буфер, рН 9,0, 23⁰С). Функціоналізацію вільних аміногруп лужної фосфатази хлорангідридом адамантил-1-оцтової кислоти проводили в міцелах аерозолю ОТ в октані за відомою методикою (Наметкин и др., 1992). Модифікований фермент переосаджували ацетоном, центрифугували і очищали на колонці з сефадексом G-10.

Кінетику гідролізу п-нітрофенілфосфату в присутності лужної фосфатази досліджували за зміною оптичної густини реакційної суміші при 400 нм (для п-нітрофенолу е = 8300 М^-1см^-1). Реакцію проводили в термостатованій кюветі спектрофотометру Specord M-40 при 23⁰С.

Експериментальні дані оброблено загальноприйнятими методами варіаційної статистики. Кількість експериментів в серіях дослідів з визначення констант інгібування за змішаним типом складала 4-5. Константи інгібування за частково змішаним типом розраховано згідно з аналізом стаціонарної кінетики (Березин и др., 1971). Коефіцієнти кореляції лінійних анаморфоз залежностей констант Міхаеліса і максимальної швидкості від концентрації інгібітора перевищували 0,98.

Результати та обговорення

Відновлений глутатіон і дигідроліпоєва кислота як інгібітори лужної фосфатази

Інгібуючий вплив відновленого глутатіону (L-глутаміл-L-цистеїнілгліци-ну) на активність лужної фосфатази з кишок теляти досліджували в трис-НСl-буфері (рН 9). Із залежностей 1/V_о від 1/[S]_о (рис. 1) були визначені константи Міхаеліса (K_m) і значення максимальної швидкості (V_max) реакції без інгібітора і K'_m, V'_max при його фіксованих концентраціях. При цьому залежність K'_m від концентрації відновленого глутатіону виявилась гіперболічною (рис. 2).

Ці результати свідчать про те, що вплив відновленого глутатіону описується закономірностями частково змішаного інгібування (схема 1).

Схема 1. Інгібування лужної фосфатази відновленим глутатіоном

Рис. 3 Лінійні анаморфози концент-раційних залежностей впливу відновле-ного глутатіону на значення уявних К'_m (1) і V'_max (2)

Видно, що відновлений глута-тіон знижує спорідненість ферменту до субстрату, а також частково інгібує розклад комплексу фермент-субстрат. Слід зазначити, що розклад комплексу ES (схема 1) може включати три стадії: утворення ковалентного фермент-фосфатного комплексу; його гідроліз і утворення нековалентного комплексу неорганіч-ного фосфату з лужною фосфатазою; вивільнення неорганічного фосфату (Kim et al., 1991). Швидкість лімітуючою стадією ферментативної реакції може бути утворення або розпад нековалентного комплексу лужної фосфатази з неорганічним фосфатом (Sun, 1999).

За наявності відновленого глутатіону ще один шлях реакції може бути пов'язаний з частковим перетворенням комплексу EIS до неорганічного фосфату. Відповідно до схеми 1 швидкість вивільнення р-нітрофенолу в присутності інгібітора дорівнює:

Деякі перетворення і заміна K_S на K_m дають рівняння (Березин, 1971):

Очевидно, для частково змішаного інгібування лужної фосфатази відновленим глутатіоном справедливі нерівності: >1 і <1 (б=К_s?/K_s і в=k₂?/k₂). Значення параметрів і , а також константи інгібування K_i і K_i були розраховані з лінійних залежностей {(K'_m/K_m)-1}^-1 від 1/[I] і {(V'_max/V_max)-1}^-1 від 1/[I] (рис. 3).

Для препаратів лужної фосфатази без додаткового очищення константи інгібування відновленим глутатіоном складають 2,110^-5 М (K_i) і 1,910^-4 М (K_i). При цьому = 8,8 і = 0,6, тобто, константа дисоціації комплексу ЕІS (К_S?) значно перевищує К_S комплексу ES, тоді як константи швидкості розкладу комплексів ES і EIS з утворенням продуктів реакції відрізняються менше (схема 1).

Порівняльний аналіз інгібуючої дії відновленого глутатіону на активність фракцій лужної фосфатази з кишок теляти, отриманих після розділення ферменту на октилсефарозі, показав, що властивості гідрофільних форм ферменту є близькими до властивостей препаратів лужної фосфатази, що не підпадала додатковому очищенню. У випадку гідрофобних фракцій лужної фосфатази інгібування відновленим глутатіоном зменшувалось: K_i=5,910^-5 М, K_i=3,710^-4 М (=6,3, =0,8). Хімічна модифікація вільних аміногруп лужної фосфатази залишками адамантил-1-оцтової кислоти також знижувала інгібуючий ефект відновленого глутатіону (K_i=6,410^-5 М, K_i=4,510^-4 М, =7,0, =0,5).

Вплив дигідроліпоєвої кислоти на активність лужної фосфатази з кишок теляти в інтервалі концентрацій ефектора від 0,075 мМ до 0,17 мМ описувався закономірностями змішаного інгібування (K_i=(3,7±1,4)10^-5 М і K_i=(5,7±2,4)10^-4 М). Спорідненість ліпоєвої кислоти до ферменту була значно нижчою (K_i = (9,8±2,1)10^-4 М і K_i = (2,2±0,7)10^-3 М).

Отримані дані вказують на те, що реалізація регуляторних механізмів в живій клітині, які забезпечують функціонування лужної фосфатази, може бути пов'язана з рівнем відновленого глутатіону та інших природних антиоксидантів. Виходячи з досить високої середньоклітинної концентрації відновленого глутатіону в живих організмах, можна припустити, що інгібуюча дія трипептиду на активність лужної фосфатази моделює його властивості in vivo.

Кінетичні аспекти зв'язування L-цистеїну в активному центрі лужної фосфатази з кишок теляти

Специфічність впливу L-цистеїну на активність гідрофобних форм лужної фосфатази з кишок теляти (карбонатний буфер, рН 10-10,6), як і для ферменту з деяких інших джерел (Zhy et al., 1999) проявляється в зни-женні швидкості гідролізу субстрату в процесі перебігу ферментативної ре-акції (рис. 4). При цьому початкова швидкість (V_о) дефосфорилювання зменшується до постійного граничного значення (V_гр.). Типові залежності 1/V_о і 1/V_гр. від 1/[S] (рис. 5) узгоджуються зі змішаним типом інгібування лужної фосфатази L-цистеїном. Якщо врахо-вувати швидкість реакції після вста-новлення рівноваги з інгібітором, то K_i =4,52,1 мкМ, K_i=169 мкМ.

Кінетика зміни активності ферменту в присутності L-цистеїну до певного граничного значення описувалась закономірностями оборотної реакції псевдо-першого порядку. Із залежності активності ферменту від часу можна вирахувати константу швидкості псевдопершого порядку, що спостерігається (k₁^спост.). Так як

k₁^спост. = k₂^спост.[Cys] + k_-1^спост.,

то із залежності k₁^спост. від концентрації інгібітора ([I]>>[E]) можна отримати значення константи зворотної реакції першого порядку k_-1^спост. та константи швидкості прямої реакції другого порядку k₂^спост..

Ми припустили, що процес взаємодії L-цистеїну з лужною фосфатазою є принаймні двостадійним: повільній модифікації ферменту, що описується константою швидкості k₁^спост., передує стадія швидкого утворення комплексу інгібітора з ферментом. Тоді інгібування можна представити як результат взаємодії L-цистеїну з ферментом в центрі зв'язування субстрату (двостадійний процес зі стадією повільного перетворення комплексу EI в EI?) і взаємодії інгібітора з фермент-субстратним комплексом (схема 2).

Схема 2 Зв'язування L-цистеїну в активному центрі лужної фосфатази

Відповідно до схеми 2, швидкість прямої реакції взаємодії інгібітора з ферментом, що характеризується константою k₂^спост., пропорційна концентрації комплексу EI

Оскільки концентрація комплексу фермент-інгібітор визначається константою його дисоціації (K_i), то з рівняння

можна одержати значення k₂^спост.

Згідно рівняння

з залежностей 1/k₂^спост.K_i від початкової концентрації п-нітрофенілфосфату (рис. 6) можна визначити мікроскопічну константу швидкості k₊₀. Виявилося, що при зміні рН 10 на рН 10,6 величини K_i знижуються з 5,410^-5 М до 1,610^-5 М, а K_i - з 4,510^-4 М до 2,110^-5 М (рис. 7). При цьому немає істотних розходжень у значеннях констант швидкості k₊₀ (середнє значення (5,10,3)10^-3 с^-1).

Особливості впливу L-цистеїну на активність гідрофільних і гідрофобних форм лужної фосфатази

Особливості інгібуючої дії L-цистеїну (трис-НCl-буфер, рН 9) на активність препаратів лужної фосфатази, одержаних після розділення ферменту на октилсефарозі, ілюструються даними рис. 8. Зміна співвідношень констант Міхаеліса та максимальної швидкості з інгібітором і без інгібітора (K'_m/K_m і V'_max/V_max) свідчить про те, що при переході від гідрофільних до гідрофобних форм лужної фосфатази ефективність інгібування знижується. Розраховані значення уявних констант інгібування L-цистеїном складають: K_і=(4,40,6)10^-5 М, K_і=(2,20,5)10^-4 М для гідрофільних фракцій; K_і=(1,40,4)10^-4 М, K_і=(5,20,5)10^-4 М для гідрофобних фракцій ферменту.

Рис. 8 Зміна співвідношень K'_m/K_m (1, 2) і V'_max/V_max (3, 4) в залежності від концентрації L-цистеїну для гідрофоб-ної (1, 4) і гідрофільної (2, 3) фракцій лужної фосфатази

Кінетика накопичення продукту реакції в присутності L-цистеїну при рН 9 при використанні гідрофільних фракцій лужної фосфатази, як і ферменту без попередньої очистки, характеризується кривою з насичен-ням, що свідчить про повільну фіксацію інгібітора в активному центрі ферменту. Розрахована з даних кінетики константа швидкості повільної стадії встановлення рівноваги поміж ферментом, до складу якого входять гідрофільні фракції, та інгібітором (k₂^спост.) дорівнює 100,2 М^-1с^-1, а мікроско-пічна константа швидкості k₊₀ (схема 2) складає 1,710^-2 с^-1. За таких же умов (трис-НCl-буфер, рН 9) при каталізі гідрофобними ізоформами лужної фосфатази кінетичні залежності накопичення продукту реакції від часу є практично лінійними, а відхилення від лінійності спостерігаються при рН?10.

Отже, активність природних гідрофобних фракцій лужної фосфатази з кишок теляти, що проявляють більшу спорідненість до октилсефарози, пригнічується L-цистеїном менше, ніж активність гідрофільних форм ферменту. Відмінності в спорідненості природних гідрофобних і гідрофільних ізоформ лужної фосфатази до L-цистеїну виявляються на стадіях формування комплексів EI, EI і EIS (схема 2).

Взаємодія амінофосфонових кислот з лужною фосфатазою - модель активації ферменту

Амінофосфонові кислоти як структурні аналоги природних амінокислот характеризуються широким спектром біологічної дії. Вивчення кінетики впливу б-аміно- та в-амінофосфонових кислот 1-7 на активність лужної фосфатази з кишок теляти показало, що за їх наявності може відбуватися зростання початкової швидкості ферментативної реакції. Активуюча дія амінофосфонових кислот проявляється в інтервалі значень рН 10-10,5, а при рН?9 спостерігається незначний інгібуючий ефект.

Перетин прямих в координатах Лайнуівера-Берка, побудованих з даних дослідів з ефектором і без ефектора, обмежується лівим верхнім чи лівим нижнім квадрантом. При цьому залежності K'_m і V'_max від концентрації амінофосфонової кислоти в більшості випадків є нелінійними. Характер залежностей K'_m/K_m і V'_max/V_max від концентрації інгібітора (рис. 10, 11) вказує на те, що вплив амінофосфонових кислот може відбуватися на стадіях утворення і розпаду комплексу Міхаеліса.

Виходячи зі схеми 3, у випадку -амінофосфонових кислот 1, 2 і 3 справджуються нерівності: <1 і >1. В залежності від природи і концентрації -амінофосфонових кислот 5, 6, 7 1, 1; при цьому 1.

Схема 3 Активація лужної фосфатази амінофосфоновими кислотами

В ряду сполук 1, 2 і 3 (R=H, Me, Ph) активуюча здатність на стадіях зв'язування субстрату знижується, а максимальна швидкість гідролізу зростає. Аналогічний характер впливу замісників спостерігається і в ряду в-амінофосфонових кислот 5, 6, 7 (R=Me, Et, Ph), проте при цьому можливе як зниження, так і збільшення K'_m. Тобто, сполуки 1-4 сприяють формуванню і наступному перетворенню комплексу Міхаеліса, а сполуки 5-7 промотують стадії перетворення цього комплексу, при цьому активуючи чи пригнічуючи його утворення. Залежність характеру активації для сполук 5 і 7 ілюструє результат впливу стеричних факторів і гідрофобних взаємодій при зв'язуванні ефекторів активним центром ферменту.

Отримані результати свідчать про те, що фосфонові кислоти здатні забезпечувати реалізацію можливих механізмів як інгібування, так і активації фосфатазних перетворень.

Інгібування лужної фосфатази метиленбісфосфоновими і амінофосфоновими кислотами на платформі калікс[4]арену

Відомо, що потенціал алкілфосфонових кислот як інгібіторів лужних фосфатаз є низьким. Ми припустили, що більшу спорідненість до ферменту будуть проявляти фосфонові кислоти, закріплені на гідрофобній макроциклічній платформі. Нами було встановлено, що ефективними інгібіторами лужної фосфатази з кишок теляти є фосфорильовані похідні калікс[4]арену, які містять у своїй структурі один або два фрагменти фосфонової кислоти.

Для дослідження використовували 5-біс(дигідроксифосфорил)метил-25,27-дипропоксикалікс[4]арен (10) і 5,17-біс[біс(дигідроксифосфорил)метил]-25,27-дипропоксикалікс[4]арен (11). Інгібування макроциклічними інгібіторами 10 і 11 порівнювали з дією метиленбісфосфонової кислоти (8), 4-гідроксифеніл-метиленбісфосфонової кислоти (9), а також естеру фосфонової кислоти калікс[4]арену (12).

Вплив сполук 8-12 на активність лужної фосфатази з кишок теляти описувався закономірностями змішаного або частково змішаного інгібування.

Рис. 12 Інгібування лужної фосфатази калікс[4]ареном 11. Концентрація інгібітора, мкМ: 0 (1), 10 (2), 20 (3), 30 (4), 40 (5)

Залежності K'_m і V'_max від концентрації фосфонових кислот 8, 9, та естеру 12 були лінійними, а у випадку сполук 10 і 11 вони характеризувалися від'ємними відхи-леннями від лінійності. Тип інгі-бування калікс[4]ареном 11 демонст-рує рис. 12. Гіперболічна залежність інгібування фосфорильованим калікс-[4]ареном 11 та її лінійна анаморфоза приведені на рис. 13. Ці результати вказують на те, що макроциклічні сполуки 10 та 11 знижують спорідне-ність ферменту до субстрату, а також змінюють властивості фермент-субстратного комплексу, частково інгібуючи його розпад.

З'ясувалося, що значення констант K_i і K_i суттєво знижуються при переході від метиленбісфосфонової кислоти і сполуки 9 до фосфорильованого калікс[4]арену 10. Подальше значне збільшення ефективності інгібування спостерігалось при введенні в структуру калікс[4]арену двох фрагментів метиленбісфосфонової кислоти. Сполука 11 виявилась сильним інгібітором лужної фосфатази з кишок теляти з K_i 0,38 мкМ і K_i 2,8 мкМ, при цьому співвідношення k₂/k₂ становило 0,3. Спорідненість лужної фосфатази до калікс[4]арену 11 приблизно на два порядки перевищувала спорідненість ферменту до п-нітрофенілфосфату і більше, ніж на три порядки, до сполуки 12. Результати визначення активності лужної фосфатази з кишок теляти в присутності сполук 8-12 представлено в табл. 1.

Таблиця 1

Константи інгібування лужної фосфатази з кишок теляти метиленбісфосфоновою кислотою та її похідними (трис-HCl-буфер, рН 9)

Сполука	Ki, мкМ	Ki, мкМ
8	675	750100
9	224	290110
10	2,5	46
11	0,38	2,8
12	820180	85002100

Ефективне зв'язування калікс[4]арену 11 може включати зворотне хелатування іонів цинку в активному центрі лужної фосфатази. Участь фосфорильної групи при інгібуванні витікає з порівняння констант інгібування калікс[4]аренами 10, 11 і 12. Зростання інгібуючої дії сполуки 11 порівняно з продуктом 10 можна пояснити взаємодією з ферментом обох фрагментів метиленбісфосфонової кислоти. Очевидно, в процесі фіксації фосфорильних груп макроциклічного інгібітора 11 беруть участь також позитивно заряджені амінокислотні залишки, суттєві для каталізу і розташовані поряд з активним центром. Зв'язування сполуки 11 активною поверхнею забезпечують як певна орієнтація фосфорильних груп по відношенню до іонів металів та катіонних центрів ферменту, так і гідрофобність макроциклічної платформи інгібітора.

Таблиця 2

Константи інгібування лужної фосфатази з кишок теляти амінофосфоновими кислотами (трис-HCl-буфер, рН 9)

Сполука	Ki, мкМ	Ki, мкМ
13	52239	81401510
14	254	480130
15	5,40,6	9022

Таким чином, нами продемонстровано результати використання калікс[4]арену як макроциклічної платформи при конструюванні інгібіторів лужної фосфатази. Перевагами таких інгібіторів є: забезпечення гідрофобних взаємодій при закріпленні інгібітора на поверхні ферменту; можливість введення декількох функціональних груп, які здатні збільшувати інгібуючий ефект; певне розміщення цих груп в просторі. Можна сподіватися, що запропоновані підходи будуть корисними при пошуку і створенні нових інгібіторів лужної фосфатази біологічно активних сполук на платформі макроциклів.

Висновки

1. Вплив відновленого глутатіону на активність лужної фосфатази з кишок теляти описується закономірностями частково змішаного інгібування, що свідчить про утворення комплексів фермент-інгібітор та фермент-субстрат-інгібітор, а також здатність останнього розкладатися до продукту реакції. Проаналізовано залежність уявних кінетичних параметрів ферментативної реакції від концентрації інгібітора і розраховано константи інгібування. Результати дослідження обгрунтовують механізми можливого впливу відновленого глутатіону та інших природних тіольних антиоксидантів на функціонування цього ферменту in vivo.

2. На підставі аналізу кінетики інгібування лужної фосфатази L-цистеїном (за змішаним типом) взаємодію інгібітора з ферментом охарактеризовано як двостадійний процес, що включає утворення первинного комплексу і наступну повільну стадію його стабілізації в оточенні ферменту. Розраховано мікроскопічні константи швидкості повільної стадії фіксації L-цистеїну в активному центрі лужної фосфатази.

3. Встановлено особливості впливу L-цистеїну та відновленого глутатіону на активність гідрофільних і гідрофобних форм лужної фосфатази, одержаних після розділення ферменту на октилсефарозі. Гальмуючий ефект, що проявляється в зростанні значень уявних констант інгібування K_i і K_i, зменшується при переході від гідрофільних до гідрофобних фракцій ферменту.

4. Представлено нову модель функціонування лужної фосфатази в присутності амінофосфонових кислот, яка включає не тільки інгібування ферменту, але і його активацію (рН 10-10,5). Активуючий вплив залежить від природи амінофосфонової кислоти. Показано, що б-амінофосфонові кислоти сприяють утворенню і наступному розкладу комплексу Міхаеліса, а в-аміно-фосфонові кислоти промотують перетворення цього комплексу, активуючи або гальмуючи його утворення.

5. Продемонстровано перспективний підхід до дизайну інгібіторів лужної фосфатази, згідно з яким гідрофобний макроцикл - калікс[4]арен - використовується як платформа для діючого бісфосфонатного або амінофосфонатного фрагменту. Значне зростання ефективності інгібування спостерігається при введенні в структуру калікс[4]арену одного або двох фрагментів фосфонової кислоти. Встановлено, що калікс[4]аренбісметилен-бісфосфонова кислота є сильним інгібітором лужної фосфатази з кишок теляти з K_i 0,38 мкМ і K_i 2,8 мкМ.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Вовк А.И., Музычка О.В., Харченко О.В. Кинетика и механизм взаимодействия L-цистеина со щелочной фосфатазой из кишок теленка // Укр. біохім. журн. - 2003. Т. 75, № 6. С. 35-39.

2. Музычка О.В., Харченко О.В., Вовк А.И. Кинетические особенности влияния L-цистеина на активность гидрофильных и гидрофобных форм щелочной фосфатазы // Доповіді НАН України. 2003, № 11. С. 147-152.

3. Музычка О.В., Харченко О.В., Вовк А.И. Восстановленный глутатион как ингибитор щелочной фосфатазы // Доповіді НАН України. 2004. № 4. С. 131-135.

4. Vovk A.I., Kalchenko V.I., Cherenok S.A., Kukhar V.P., Muzychka O.V., Lozynsky M.O. Calix[4]arene methylenebisphosphonic acids as calf intestine alkaline phosphatase inhibitors // Org. Biomol. Chem. 2004. Vol. 2, № 21. Р. 3162-3166.

5. Kalchenko V.I., Cherenok S.A., Solovyov A., Muzychka O.V., Vovk A.I., Kukhar V.P. Bіо-relevant derivatives of calixarene phosphonic acids // 16th International conference on phosphorus chemistry. Abstracts. Birmingham, UK, 2004. P. 84.

Анотація

Музичка О.В. Кінетичні закономірності інгібування лужної фосфатази з кишок теляти L-цистеїном, відновленим глутатіоном і фосфоновими кислотами. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. - Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2004.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню кінетичних закономірнос-тей інгібування лужної фосфатази з кишок теляти природними тіольними антиоксидантами - L-цистеїном, відновленим глутатіоном, дигідроліпоєвою кислотою, - а також пошуку і вивченню нових фосфорорганічних інгібіторів цього ферменту. Встановлено, що взаємодія відновленого глутатіону з лужною фосфатазою характеризується утворенням комплексів фермент-інгібітор і фермент-субстрат-інгібітор, при цьому останній здатний розкладатися до неорганічного фосфату (частково змішаний тип інгібування). Запропоновано двостадійний механізм зв'язування L-цистеїну лужною фосфатазою, який включає швидке утворення первинного комплексу інгібітора і його повільну фіксацію в активному центрі ферменту. Показано, що інгібування відновленим глутатіоном і L-цистеїном залежить від природи ізоформ лужної фосфатази. Обгрунтовано оригінальний напрям дизайну інгібіторів лужної фосфатази, що полягає у використанні макроциклічної платформи для одного або двох залишків фосфонової кислоти. Досліджено властивості калікс[4]аренметилен-бісфосфонових кислот - нових ефективних інгібіторів лужної фосфатази.

Ключові слова: лужна фосфатаза, інгібування, кінетика, L-цистеїн, відновлений глутатіон, метиленбісфосфонові кислоти, амінофосфонові кислоти, калікс[4]арен.

Аннотация

Музычка О.В. Кинетические закономерности ингибирования щелочной фосфатазы из кишок теленка L-цистеином, восстановленным глутатионом и фосфоновыми кислотами. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. - Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2004.

Диссертация посвящена изучению кинетических закономерностей ингибирования щелочной фосфатазы из кишки теленка природными тиольными антиоксидантами - L-цистеином, восстановленным глутатионом, дигидроли-поевой кислотой, - а также поиску и исследованию новых фосфорорганических ингибиторов этого фермента. На основании анализа полученных результатов обсуждаются механизмы ингибирования щелочной фосфатазы.

Рассчитаны константы ингибирования щелочной фосфатазы восстановленным глутатионом и дигидролипоевой кислотой. Нелинейные зависимости кажущихся констант Михаэлиса и максимальной скорости ферментативной реакции от концентрации восстановленного глутатиона указывают на то, что его взаимодействие со щелочной фосфатазой характеризируется образованием комплексов фермент-ингибитор и фермент-субстрат-ингибитор, при этом последний способен разлагаться до неорганического фосфата (ингибирование по частично смешанному типу). Предполагается, что ингибирующее действие восстановленного глутатиона на активность щелочной фосфатазы моделирует его свойства in vivo.

Влияние L-цистеина на активность щелочной фосфатазы характеризуется снижением скорости гидролиза субстрата в процессе протекания реакции. Определены кажущиеся константы ингибирования щелочной фосфатазы L-цистеином по смешанному типу (до и после установления равновесия ингибитора с ферментом). Кинетика изменения активности фермента до определенного предельного значения описывалась закономерностями обратимой реакции псевдопервого порядка. Предложен двухстадийный механизм связывания L-цистеина щелочной фосфатазой из кишки теленка, который включает быстрое образование первичного комплекса ингибитора и его медленную фиксацию в активном центре фермента. Рассчитаны микроскопические константы скорости прямой стадии медленно устанавливающегося равновесия L-цистеина со щелочной фосфатазой. Изучено влияние рН среды на кажущиеся константы ингибирования и кинетические параметры ферментативной реакции в присутствии L-цистеина.

Установлено, что ингибирование щелочной фосфатазы восстановленным глутатионом и L-цистеином зависит от природы изоформ фермента. Активность гидрофобных фракций щелочной фосфатазы, обладающих более выраженным сродством к октилсефарозе, подавляется восстановленным глутатионом и L-цистеином в меньшей мере, чем активность гидрофильных форм фермента. Химическая модификация свободных аминогрупп щелочной фосфатазы остатками адамантил-1-оцтовой кислоты приводила к снижению ингибирующего эффекта восстановленного глутатиона.

Показано, что аминофосфоновые кислоты могут быть как ингибиторами, так и активаторами щелочной фосфатазы (рН 10-10,5). Активирующее действие зависит от природы аминофосфоновой кислоты. б-Аминофосфоновые кислоты способствуют формированию и последующему превращению комплекса Михаэлиса, а в-аминофосфоновые кислоты промотируют стадии превращения этого комплекса, при этом активируя или подавляя его образование.

Обосновано перспективное направление поиска ингибиторов щелочной фосфатазы, заключающееся в использование макроциклических каликс[4]-аренов в качестве платформы для действующего остатка фосфоновой кислоты. Установлено, что значения констант ингибирования K_i и K_i существенно снижаются при переходе от метиленбисфосфоновой кислоты (смешанное ингибирование) к каликс[4]аренам, содержащим один или два фрагмента метиленбисфосфоновой кислоты в своей структуре (частично смешанное ингибирование). Впервые показано, что сильным ингибитором щелочной фосфатазы из кишки теленка является каликс[4]аренбисметиленбисфосфоновая кислота с K_i 0,38 мкМ и K_i 2,8 мкМ. Сродство щелочной фосфатазы к этому соединению приблизительно на два порядка превышает сродство фермента к п-нитрофенилфосфату и более чем на три порядка - к соответствующему этилфосфонату, связанному с каликс[4]ареном. В качестве ингибиторов щелочной фосфатазы из кишки теленка исследованы также каликс[4]арен-аминофосфоновые кислоты. К преимуществам новых ингибиторов на макроциклической платформе относятся: обеспечение гидрофобных взаимодействий при закреплении макроцикла на поверхности фермента; возможность ковалентного присоединения нескольких функциональных групп, способных увеличивать ингибирующий эффект; определенное расположение этих групп в пространстве.

Ключевые слова: щелочная фосфатаза, ингибирование, кинетика, L-цистеин, восстановленный глутатион, метиленбисфосфоновые кислоты, аминофосфоновые кислоты, каликс[4]арен.

Annotation

Muzychka O.V. The kinetic regularities of calf intestine alkaline phosphatase inhibition by L-cysteine, reduced glutathione and phosphonic acids. - Manuscript.

Thesis for the candidate degree in chemical sciences, speciality 02.00.10 - bioorganic chemistry. - Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2004.

The thesis is devoted to studying of kinetic regularities of calf intestine alkaline phosphatase inhibition by natural thiol antioxidants - L-cysteine, reduced glutathione, dihydrolipoic acid - and also to search of new organophosphorus inhibitors of this enzyme. The effect of reduced glutathione on activity of calf intestine alkaline phosphatase is described by partial mixed-type inhibition. The mechanism of equilibrium establishment between L-cysteine and enzyme involves the initial rapid formation of intermediate complex and a subsequent slower step leading to its stabilization at the substrate binding site. The microscopic rate constants for slow step of L-cysteine interaction with alkaline phosphatase have been calculated. Calix[4]arenes bearing one or two methylenebisphosphonic acid fragments displayed stronger inhibition of calf intestine alkaline phosphatase than simple methylenebisphosphonic acid. Preorganizing phosphonic acid fragments using a calixarene platform therefore provides in a promising approach for the design of efficient alkaline phosphatase inhibitors.

Key words: alkaline phosphatase, inhibition, kinetics, L-cysteine, reduced glutathione, methylenebisphosphonic acids, aminophosphonic acids, calix[4]arene.

Размещено на Allbest.ru

...