Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Фізико-хімічний інститут ім. О.В.Богатського

НАН України

Cтепневська Яна Валеріївна

УДК 543.218.1:422,3:645,3

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук

Фізико-хімічні методи виділення та визначення суми алкалоїдів “Чистотілу великого”

02.00.02 - аналітична хімія

Одеса - 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фізичної хімії та електрохімії Дніпропетровського національного університету Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор кафедри аналітичної хімії Ткач Володимир Іванович, Український державний хіміко-технологічний університет, завідувач кафедрою аналітичної хімії Українського державного хіміко-технологічного університету.

Офіційні опоненти:

доктор хімічних наук, професор за спеціальністю аналітична хімія Бельтюкова Світлана Вадимівна, Фізико-хімічний інститут ім. О.В.Богатського НАН України, старший науковий співробітник;

кандидат хімічних наук, Єгорова Алла Володимирівна Одеський національний університет, ім. І.І. Мечникова, доцент кафедри фармацевтичної хімії.

Провідна установа: Ужгородський національний університет, кафедра аналітичної хімії, Міністерство освіти і науки України.

Захист відбудеться 17.02.2004 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.219.01 в Фізико-хімічному інституті ім. О.В.Богатського НАН України, 65080, м. Одеса, Люстдорфська дорога, 86.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Фізико-хімічного інституту ім. О.В.Богатського НАН України (м. Одеса, Люстдорфська дорога, 86).

Автореферат розісланий 16.01.2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, к.х.н. Назаренко Н.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останнім часом у медичній практиці все більшої популярності набувають лікарські засоби рослинного походження, які мають широкий спектр дії. Це пояснюється тим, що у порівнянні з синтетичними препаратами вони мають достатньо широку та м'яку тера-певтичну дію, менш токсичні та відзначаються мінімальними побічними ефектами, що відноситься також і до лікарської рослини Чистотілу великого (Chelidonium majus L.) сімейства Papaveracеae. Алкалоїди чистотілу, вилучені з рослинної сировини, входять до ряду лікарських форм - екстрактів, напарів, мазей, супозиторіїв, ампульних розчинів.

Більшість існуючих методів кількісного вилучення та визначення алкалоїдів є трудомісткими, недостатньо чутливими і селективними, не гарантують потрібної надійності результатів. Тому розробка нових методик кількісного визначення алкалоїдів чистотілу є актуальним завданням. Вирішення перелічених проблем можливе при використанні гетерополіаніону (ГПА) структури Кеггіна як аналітичного реагенту на нітрогенвмісні біологічноактивні речовини. Це обумовлене різноманіттям властивостей ГПА - велика молекулярна маса, здатність до часткового зворотного відновлення, утворення малорозчинних речовин постійного складу з великими орга-нічними катіонами, а також іонообмінними властивостями їх солей, дешевизною та доступністю реагенту.

Взаємодія ГПА з органічними катіонами (ОК) алкалоїдів може бути використана як аналітична реакція в амперометричному та потенціометричному титруванні алкалоїдів, а малорозчинні продукти реакції з асоціативним характером зв'язку між ГПА та ОК зарекомендували себе як оптимальні електродноактивні речовини (ЕАР) при розробці іоноселективних електродів (ІСЕ), оборотних до нітрогенвмісних біоактивних речовин. Ці сполуки можна також використовувати як вагову форму в гравіметричному аналізі, а реакцію їх утворення як аналітичну для визначення алкалоїдів методом хроматографії та електрофорезу.

Таким чином, актуальним є комплексне дослідження реакції взаємодії ГПА структури Кеггіна з ОК алкалоїдів та її аналітичне використання в інструментальних методах аналізу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з держбюджетною темою Дніпропетровського національного університету Мініс-терства освіти і науки України № 06-112-99, номер державної реєстрації 0199V001298 „Теоретичне обґрунтування та розробка фізико-хімічних методів аналізу лікарських препаратів та біоактивних речовин з використанням гетерополіаніонів в якості аналітичних форм та реагентів”.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є розробка простих та експресних методик виділення та кількісного визначення алкалоїдів (Alk) чистотілу, вилучених з рослинної сировини, за допомогою аналітичного реагенту - молібдофосфат-аніону РМо₁₂О₄₀^3-.

Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

- вивчити взаємодію 12-молібдофосфатної кислоти з ОК алкалоїдів чистотілу методами УФ, ІЧ спектроскопії та амперометричного титрування;

- розробити прості та експресні методики кількісного виділення суми алкалоїдів чистотілу з рослинної сировини методами кислотної екстракції та електролізу;

- виявити залежності електродних характеристик розроблених мембранних ІСЕ від природи використаних ЕАР і оптимального вмісту його в мембрані;

- розробити методики кількісного електрохімічного визначення суми алкалоїдів чистотілу, що забезпечують контроль вмісту алкалоїдів у рослинній сировині та різних лікарських формах з високими метрологічними характеристиками

Об'єктом дослідження є одержання та дослідження властивостей асоціатів алкалоїдів чистотілу, виділених з рослинної сировини, з 12-молібдофосфатом як аналітичних форм.

Предметом дослідження є виділення та визначення різними фізико-хімічними методами суми та індивідуальних алкалоїдів чистотілу за допомогою їх сполук з молібдофосфат - аніоном.

Методи дослідження. УФ, ІЧ спектроскопія, амперометрія, електрофорез, потенціометрія, тонкошарова хроматографія та електроліз.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Знайдені нові аналітичні форми для гравіметричного, іонометричного та амперометричного визначення суми алкалоїдів чистотілу, індивідуальних берберину та хелідоніну на основі їх важкорозчинних асоціатів з молібдофосфатною кислотою.

2. Встановлена можливість застосування цих асоціатів як електродноактивних речовин селективно оборотних до алкалоїдів.

3. З'ясований механізм електрохімічного виділення суми алкалоїдів чистотілу з їх кислотних напарів при електролізі за рахунок підвищення рН у тонкому прикатодному шарі та утворення там важкорозчинних основ AlkОН.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблена методика виділення суми алкалоїдів чистотілу з рослинної сировини методом електролізу, яка дозволяє скоротити час (в 6 разів) та підвищити ступінь (до 43%) виділення у порівнянні з екстракційним способом.

Розроблені методики кількісного визначення суми алкалоїдів чистотілу в рослинній сировині та лікарських формах за допомогою нових плівкових мембранних ІСЕ, амперометричного титрування та гравіметрії. Запропоновані методики забезпечують контроль якості сировини та препаратів з високими метрологічними характеристиками, відзначаються експресністю, достатньою чутливістю, дозволяють визначати вміст суми алкалоїдів чистотілу у різних сумішах і ме-дичних формах і можуть бути використані при аналізі рослинної сировини та готової продукції на фармацевтичних підприємствах, в аптеках, тощо.

Особистий внесок здобувача полягає в проведенні аналізу літературних даних, отриманні наукових результатів, викладених в дисертації, в постановці і проведенні експерименту та математичної обробки одержаних результатів, розробці аналітичних методик. Постановка задач досліджень здійснювалась науковим керівником за участю дисертанта. Тлумачення результатів, формування висновків та узагальнень виконані спільно з науковим керівником - проф., д.х.н. Ткачом В.І. Пояснення механізму виділення суми основ алкалоїдів чистотілу методом електролізу- спільно з к.х.н. Ковтуном В.Н.

Апробація результатів дисертації. Основні результати доповідались та обговорювались на Всеукраїнській (з міжнародною участю) конференції з аналітичної хімії, присвяченій 100-річчю від дня народження проф. М.П. Комаря (Харків, 2000), Науково - практичній конфе-ренції пам'яті д.х.н., проф. П.П. Кіша (Ужгород, 2001), ХV Українській конференції (з міжнародною участю) з неорганічної хімії (Київ, 2001), Всеросійській конференції „Актуальные проблемы химии” (Москва, 2002), сесіях наукової ради з проблем „Аналітична хімія” (Харків, 2002; Ужгород, 2003), міжнародній конференції „Функціоналізовані матеріали”. Синтез, властивості та застосування” (Київ, 2002), І міжнародній науково-технічній конференції студентів та аспірантів „Хімія і сучасні технології” (Дніпропетровськ, 2003), наукових конференціях ДНУ (2000-2003).

Публікації. Основні результати дисертації опубліковані в 5 статтях у наукових фахових журналах та матеріалах і тезах 8 доповідей на конференціях, патенті України.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 152 сторінках і складається з вступу, огляду літератури, п'ятьох розділів експериментальної частини, висновків, обговорення результатів, списку використаних джерел (159 найменувань), 4 додатків. Робота ілюстрована 39 рисунками та містить 25 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність теми, сформульовані мета і основні задачі дослідження, наведена наукова новизна та практична цінність роботи.

В огляді літератури розглянута загальна характеристика, класифікація та властивості алкалоїдів рослинного походження. Зроблений аналіз літературних даних щодо методів виділення, якісного і кількісного визначення алкалоїдів, виділених із рослинної сировини, зокрема чистотілу. Відмічено, що незважаючи на досить велику кількість робіт, присвячених виділенню та визначенню алкалоїдів чистотілу, методики мають ряд недоліків: застосування великої кількості токсичних органічних розчинників, довготривалість та складність процесу, труднощі з подальшим очищенням алкалоїдів від домішок. При виділенні алкалоїдів чистотілу з рослинної сировини відомими методами вихід алкалоїдів складає не більше ніж 20% з ступенем чистоти не більше 95%.

Розглянуті типи та характеристики мембранних пластифікованих ІСЕ, оборотних до біоактивних речовин, наведені існуючі припущення щодо впливу основних компонентів мембрани на електродні характеристики ІСЕ такого типу. Вивчений оптимальний компонентний склад мембран ІСЕ для визначення алкалоїдів.

Аналіз даних з використання ГПА в аналітичній хімії біоактивних речовин свідчить про невикористані їх можливості і перспективність ГПА як аналітичного реагенту.

Вивчення закономірностей виділення алкалоїдів чистотілу з рослинної сировини та їх ідентифікація

Знайдені закономірності впливу природи та концентрації кислот, періоду вегетації, ступеня подрібнення та співвідношення екстракційних фаз на умови кількісного виділення суми солей алкалоїдів чистотілу з сухої рослинної сировини, яка висушена за фармакопейними вимогами, методом кислотного напарювання. Отримані кислотні напари були використані для виділення суми основ алкалоїдів методом електролізу.

Для виділення з суми алкалоїдів чистотілу окремих алкалоїдів - берберину та хелідоніну методом перекристалізації використана різна розчинність цих алкалоїдів у воді. Ідентифікували ці алкалоїди спектрофотометричним методом, методом висхідної тонкошарової хроматографії (ТШХ) та за температурою плавлення.

Вивчене явище іонного обміну катіонів алкалоїдів на хроматографічному папері, імпрегнованому амонію молібдофосфатом. При виборі рухомої фази в методі осадової хроматографії слід враховувати умови утворення осаду. Малорозчинний асоціат алкалоїдів чистотілу з аніоном МФК найбільш повно осаджується у кислому середовищі. Тому були використані розчини неорганічних кислот (хлоридної, сульфатної, нітратної та фосфатної) як рухомі фази.

Найбільш чіткі піки спостерігалися при хроматографуванні розчином фосфатної кислоти, що обумовлене спорідненістю Н₃РО₄ та РМо₁₂О₄₀^3- і обміном більш розчинних фосфатів алкалоїдів на менш розчинні їх молібдофосфати. Знайдена залежність між висотою піка та природою і ступенем розведення кислоти. При промиванні первинних хроматограм розчином фосфатної кислоти, що розведена у співвідношенні 1:1, спостерігається максимальна висота піка та інтенсивність забарвлення вторинних хроматограм (табл.1) у порівнянні з HCl та Н₂SO₄. Забарвлення плями алкалоїдів на хроматограмі та значення R_f є якісним критерієм наявності суми алкалоїдів чистотілу та алкалоїдів берберину (Berb) і хелідоніну (Hel), які є основними компонентами суми алкалоїдів чистотілу.

Для визначення піків малих концентрацій вторинну хроматограму розміщують на шляху УФ випромінювання і за допомогою лінійки екстраполюють верхівку піка. Чутливість визначення методом піків приблизно дорівнює чутливості відповідних крапельних реакцій. Висота піка вторинної хроматограми пропорційна логарифму концентрації алкалоїдів.

Таким чином, отримані експериментальні дані можуть бути використані для ідентифікації алкалоїдів чистотілу та їх кількісного визначення в аналітичному контролі лікарських форм та їх розчинів методом осадової хроматографії.

Таблиця 1 Ідентифікація алкалоїдів чистотілу за забарвленням хроматограм після обробки розчинами неорганічних кислот (1:1), С_Alk=510^-1моль/л, V_проби=0,02мл

Визначуваний іон	Кислота	Забарвлення вторинної хроматограми	Rf	, хв
?Alк+	Н3РО4 Н2SO4 HNO3 HCl	зелено-голубе жовте жовто-коричневе голубе	0,73 0,45 0,47 0,55	55 35 12 15
Hel+	Н3РО4 Н2SO4 HNO3 HCl	голубе жовте жовте голубе	0,75 0,36 0,22 0,68	50 35 11 13
Berb+	Н3РО4 Н2SO4 HNO3 HCl	зелено-голубе жовте коричневе голубе	0,68 0,63 0,47 0,54	45 30 12 11

Для прискорення процесу ідентифікації суми алкалоїдів чистотілу в 2-2,5 рази на хроматографічному папері з використанням неорганічних кислот використаний електрофорез.

При визначенні суми алкалоїдів краще використовувати низьковольтний електрофорез, тому що при накладанні більших напруг виділяється велика кількість тепла, що призводить до швидкого випаровування буферного розчину зі смуг паперу та викривлення зон, що ускладнює інтерпретацію електрофореграм. Електрофорез здійснювали в камерах для горизонтального електрофорезу при напрузі 200 V та силі струму 250 мА. Як рухому фазу використовували розчин 5%-ної ацетатної кислоти (рН=2,24) та буферний розчин Бриттона - Робінсона (рН=2,30) (табл. 2).

Таблиця 2 Залежність площі зон суми алкалоїдів чистотілу від кількості нанесеної речовини, електроліт - буферний розчин Бриттона-Робінсона (рН=2,3)

Введено суму алкалоїдів, мкг	20	60	100	150	200
Знайдено S, см2	69,8	90,0	122,7	162,1	201,0

Встановлена прямолінійна залежність між кількістю нанесеної на стартову лінію речовини та площею зони після проведення електрофорезу на папері (табл. 2) з використанням модельних розчинів.

Дослідження взаємодії катіонів алкалоїдів чистотілу з молібдофосфат-аніоном

Методами УФ, ІЧ спектроскопії була досліджена реакція між катіонами алкалоїдів чистотілу та ГПА РМо₁₂О₄₀^3-. УФ спектри поглинання розчинів Н₃РМо₁₂О₄₀, алкалоїдів берберину та хелідоніну, а також УФ спектри сполук алкалоїдів із МФК, що утворилися (загальної формули (Alk)_хРМо₁₂О₄₀) мають смуги поглинання вихідних реагентів, що дозволяє зробити висновок про збереження хромофорної системи в молекулах учасників реакції. Даний висновок, а також адитивність світлопоглинання свідчать про іонно-асоціативний характер взаємодії між Alk⁺ та РМо₁₂О₄₀^3-.

Проведене порівняльне дослідження УФ спектрів поглинання розчинів алкалоїдів чистотілу з різними значеннями рН показало, що в спектрах спостерігається гіпсохромний зсув л_аналіт при рН менше 4, це пов'язане з протонуванням атома Нітрогену. Для підтвердження протонування алкалоїдів в кислому середовищі та встановлення інтервалу існування ОК співставлені дані спектроскопічних досліджень і квантово-хімічних розрахунків. Дані УФ спектроскопії та квантово - хімічних розрахунків свідчать про протонування в молекулах алкалоїдів одного атома Нітрогену з утворенням стійких катіонних форм. алкалоїд чистотіл електроліз екстракція

ІЧ спектри досліджуваних алкалоїдів та їх сполук з молібдофосфат-аніоном містять по 20-25 смуг поглинання і мають загальні характеристичні частоти на ділянках 3700-3400, 3000-2800, 1650-1590 см^-1.

В ІЧ спектрах малорозчинних сполук досліджуваних ОК алкалоїдів із ГПА РМо₁₂О₄₀^3- спостерігаються наступні закономірності: характеристичні смуги коливань Ме=О та Ме-О-Ме на ділянці 1100-700 см^-1 зберігаються, що свідчить про збереження структури МФК; зберігаються характеристичні смуги валентних коливань зв'язків N-СН₃ на ділянці 2810-2800 см^-1. В ІЧ спектрах алкалоїдів та асоціатів спостерігаються смуги поглинання на ділянці 1140-1120 см^-1, обумовлені наявністю в молекулах зв'язків С-О. Незначне зміщення частоти смуги коливання С=N зв'язків при 2800 см^-1 в ІЧ спектрах асоціатів може слугувати доказом локалізації взаємодії молібдофосфат-аніона за цим атомом Нітрогену.

Віднесення смуг коливань в ІЧ спектрах МФК, алкалоїдів і продуктів їх взаємодії підтверджує висловлене раніше припущення про асоціативну природу хімічного зв'язку в малорозчинних і стійких сполуках, що утворилися.

Методом амперометричного титрування встановлене співвідношення реагуючих компонентів Alk:РМо₁₂О₄₀^3-=(3,00,3):(1,00,1) при (Р=0,95, n=7) та розраховані іонні добутки (ІД) отриманих сполук. Величини умовних ІД асоціатів органічних катіонів алкалоїдів та усереднене значення величини ІД для суми алкалоїдів, берберину хелідоніну дорівнюють відповідно -ІД[(Alk)₃РМо₁₂О₄₀]=(3,00,2)10^-27; ІД[(Berb)₃РМо₁₂О₄₀]=(2,30,2)•10^-26; ІД[(Hel)₃РМо₁₂О₄₀]= =(5,20,1)•10^-26, при n=5, P=0,95.

Отримані характеристики нових сполук дозволили зробити висновок про можливість використання їх як електродноактивних речовин для розробки іоноселективних електродів, оборотних до суми алкалоїдів чистотілу та алкалоїдів берберину та хелідоніну.

Розробка та вивчення електродних характеристик іоноселективних електродів, оборотних до катіонів алкалоїдів “чистотілу великого”

На електродні характеристики ІСЕ впливають такі фактори як природа полімерної матриці, рН аналізованого розчину, розчинність ЕАР у воді і мембранних розчинниках (МР) та властивості мембранного розчинника. Тому актуальним є дослідження впливу цих факторів на електродні характеристики ІСЕ, оборотних до суми алкалоїдів та алкалоїдів берберину та хелідоніну.

Для синтезу малорозчинних солей суми алкалоїдів чистотілу із МФК вихідні компоненти брали у стехіометричному співвідношенні, яке було встановлене методом амперометричного титрування. Мембрани ІСЕ готували за стандартною методикою. Основні електродні характеристики розроблених ІСЕ наведені в таблиці 3. Електроди мають катіонну функцію з нахилами, близькими до теоретичного для однозарядних катіонів.

Аналіз електродних характеристик ІСЕ залежно від природи МР свідчить про кращі електродні характеристики при використанні таких малополярних МР як діоктилфталат (ДОФ) та трикрезилфосфат (ТКФ), які дозволяють експресно вимірювати активну концентрацію суми алкалоїдів в межах 10^-5-10^-2 моль/л. Нижня межа визначення катіонів алкалоїдів методом іонометрії корелює з розчинністю електродноактивних речовин.

При вивченні впливу величини рН на електродні властивості ІСЕ, оборотних до катіонів суми алкалоїдів чистотілу і алкалоїдів берберину та хелідоніну (таблиця 3), встановлено, що в інтервалі рН 4-7 зберігається максимальний нахил електродної функції ІСЕ на берберин та суму алкалоїдів, а в інтервалі рН 3-6 - для ІСЕ на хелідонін. При вищих значеннях рН знижується верхня межа визначення препаратів до 10^-3 моль/л, тому що в даних умовах з розчину випадає осад молекулярної форми. Оптимальним для роботи розроблених ІСЕ є рН 5.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.1 Залежність ЕРС ІСЕ на суму алкалоїдів чистотілу від концентрації визначуваної речовини

Залежність ЕРС розробленого ІСЕ від негативного логарифму концентрацій суми алкалоїдів (рис.1), яка описується рівнянням E=a+b?lgC і статистична обробка отриманих залежностей методом найменших квадратів свідчить про досить хорошу кореляцію і близькість вивченої залежності до функціональної (таблиця 4).

Таблиця 3 Основні електродні характеристики розроблених ІСЕ з мембранами пластифікованими МР: (трикрезилфосфат - ТКФ, дибутилфталат - ДБФ, дипропілфталат - ДПФ, диоктилфталат - ДОФ)

Визначуваний катіон	МР	Інтервал лінійності, моль/л	S мВ/рС	Час відгуку, с	Час життя ІСЕ, доба	Дрейф потенціалу, мВ/добу	Інтервал рН
Хелідонін	ТКФ	110-5-110-2	60	5-10	65-70	2-5	3-6
	ДБФ	110-5-110-2	47	4-7	35-55	3-5	5-6
	ДОФ	110-5-110-2	55	5-10	55-60	3-5	3-6
	ДПФ	510-4-110-2	51	6-8	40-50	4-6	4-6
Берберин	ТКФ	110-5-110-2	58	5-10	60-65	3-5	4-7
	ДБФ	110-4-110-2	45	5-7	30-45	3-5	4-6
	ДОФ	110-5-110-2	53	7-9	55-60	4-6	4-7
	ДПФ	510-5-110-2	50	5-8	30-35	4-6	5-7
Сума алкалоїдів чистотілу	ТКФ	110-5-110-2	59	5-10	60-65	2-5	4-7
	ДБФ	110-4-110-2	45	4-8	30-35	2-5	5-7
	ДОФ	110-5-110-2	58	5-7	55-60	3-7	5-7
	ДПФ	510-4-110-2	49	8-10	40-50	4-6	4-6

Таблиця 4 Результати регресійного аналізу градуювальних графіків ІСЕ для визначення суми алкалоїдів

МР	a	b	S02	r
ТКФ	153,71,3	49,70,7	1,71	0,994
ДОФ	144,12,6	48,01,2	3,25	0,994
ДПФ	108,73,5	49,20,9	2,52	0,985
ДБФ	146,81,7	49,50,8	0,95	0,999

Методом змішаних розчинів були визначені потенціометричні коефіцієнти селективності ІСЕ, оборотних до суми алкалоїдів чистотілу за відношенням до біогенних елементів таких як К⁺, Na⁺, Са²⁺, які можуть бути присутні як в лікарських препаратах, так і в біологічних рідинах (табл. 5). Знайдені також коефіцієнти селективності ІСЕ на хелідонін та на берберин відносно один одного (табл. 6). Встановлено, що вивчені катіони не впливають на електродну функцію ІСЕ в межах концентрацій 110^-5-510^-2 моль/л. Селективність розроблених ІСЕ на берберин та хелідонін свідчить про можливість використання їх при вимірюванні концентрації визначуваних іонів в присутності інших алкалоїдів.

Таблиця 5 Коефіцієнти селективності ІСЕ

Катіон, що заважає j	МР Кі/j
	ДПФ	ДБФ	ДОФ	ТКФ
К+	110-2	110-2	110-2	110-2
Na+	310-2	110-2	210-2	110-2
Са2+	510-2	810-2	210-2	210-2

Таблиця 6 Коефіцієнти селективності ІСЕ на хелідонін - (1), на берберин - (2). МР=ТКФ; m_ЕАР=0,015г; рН=5

Катіон, що заважає j	(1)	(2)
К+	110-2	210-2
Na+	310-2	310-2
Са2+	510-2	410-2
Hel+/Berb+	810-1	110-1

Одержані результати дозволили розробити методику кількісного визначення суми алкалоїдів чистотілу та алкалоїдів берберину і хелідоніну методом прямої потенціометрії.

Виділення алкалоїдів методом електролізу

Основи алкалоїдів, отримані екстракцією з рослинної сировини, потребують багаторазового доочищення. Тому нами досліджена можливість застосування електролізу для виділення основ алкалоїдів з високим ступенем чистоти з кислотного напару рослинної сировини чистотілу великого. Також досліджено механізм електрокристалізації суми основ алкалоїдів на катоді і визначені оптимальні умови кількісного виділення суми основ алкалоїдів методом електролізу.

Для цього використали аналіз поляризаційних кривих, які одержали з застосуванням електронного потенціостата П-5827. Вольтамперні криві реєстрували на нікелевому катоді в розчинах NaCl+HCl (рН=3,5) та кислотному напарі чистотілу. Вольтамперна крива свідчить про те, що на електроді послідовно відбуваються два електрохімічних процеси, перший пов'язаний з реакцією виділення водню за рахунок іонів гідроксонію за реакцією 1, а другий - з реакцією відновлення молекул води за реакцією 2:

H₃O⁺+e 1/2H₂ + H₂O (1)

H₂O+з=1/2H₂+OH- (2)

Розраховані та експериментально визначені струми і_гр та і_о співпадають між собою, що свідчить про правильність висновку щодо реакції (1).

В результаті реакції 2 у прикатодному дифузійному шарі різко змінюється рН розчину за рахунок утворення ОН^- іонів, що співпадає з літературними даними рН в прикатодному шарі зростає до 10 та навіть більше залежно від густини струму. В цьому випадку у тонкому прикатодному шарі створюються умови для протікання хімічної реакції (3).

Alk⁺+OH-AlkОН (3)

Про утворення малорозчинного гідроксиду алкалоїдів на висхідній ділянці поляризаційної кривої при Е>0,8 В свідчить петля гістерезиса, тобто неспівпадання величини граничного струму дифузії в прямому та зворотному ході кривих. Мале значення і_гр на зворотному ході кривої пов'язане з осадженням AlkОН на електроді та механічним екрануванням його поверхні.

В результаті проведених досліджень показано, що прикатодний шар при електролізі слабкокислих розчинів солей алкалоїдів має складну структуру та складний характер дифузійних потоків. Вперше висловлене припущення про існування нейтрального шару розчину (шар ІІ), який розділяє лужне середовище біля поверхні електрода та кисле середовище всередині розчину (шар ІІІ). Існування такого шару обумовлює стійкість шару І (лужного шару біля поверхні електрода) та дифузійний механізм перенесення катіонів алкалоїдів з шару ІІІ у шар І, де утворюється малорозчинний осад AlkОН. Все це свідчить про те, що молекули алкалоїдів електрохімічно не активні, і, таким чином, зберігають свої природні властивості. Осад утворюється за рахунок хімічної реакції (3), яка перебігає з дифузійним контролем.

Вивчений вплив різних факторів на ступінь виділення суми алкалоїдів чистотілу. Найбільш впливає на ступінь виділення алкалоїдів підвищення температури розчину та введення добавок, кінцевим продуктом перетворення яких на електроді є ОН^- іони та рівноважний потенціал яких є негативнішим за рівноважний потенціал відновлення молекул води:

С1О₃^-+H₂O+зС1О₂+2OH^- E_p= -0,45 B

SO₃^2-+3H₂O+6зS^2-+6OH^- E_p= -0,61 B

SO₃^2-+3H₂O+4зS₂O₃^2-+6OH^- E_p= -0,58 B

В таблиці 7 наведені результати впливу неорганічних добавок на виділення суми основ алкалоїдів при електролізі.

Як добавки були використані солі сульфіту натрію та хлорату калію. Зростання виходу продукту залежно від природи та концентрації добавки пов'язане зі збільшенням об'єму приелектродного шару, де перебігає хімічна реакція утворення осаду AlkОН. Для перевірки виділених на катоді алкалоїдів на чистоту було проведене їх амперометричне визначення. Чистота основ алкалоїдів, які отримані методом електролізу, складає 96%, що перевищує чистоту продукту, отриманого існуючими екстракційними методами.

Таблиця 7 Вплив добавок солей на виділення основ алкалоїдів при електролізі

Добавка	Збільшення виходу від концентрації добавки, n*
	0,001моль/л	0,01моль/л	0,1моль/л
KClO3	1,18	1,24	1,30
Na2SO3	2,56	3,00	3,36

^*, де , маси суми основ алкалоїдів виділених електролізом з розчинів з добавкою та без добавки відповідно.

Використання отриманих результатів в аналітичній практиці

Отримані результати дозволили розробити та запатентувати методику виділення суми основ алкалоїдів чистотілу з рослинної сировини методом електролізу, яка має ряд переваг у порівнянні з іншими відомими методиками. В 6 разів скорочується час виділення, токсичні органічні розчинники замінені на розчини неорганічних кислот, ступінь чистоти виділеної суми алкалоїдів складає 96%. Метрологічні характеристики запропонованого методу виділення задовільні (табл.8).

Таблиця 8 Результати електролізу кислотного напару чистотілу великого: І=100мА; Е=2,0-2,6 В; ф=60 хвилин; рН 3,5, об'єм розчину для електролізу - 100,0мл; (n=5; Р=0,95)

№п/п	Вміст алкалоїдів в 100мл напару, m0,г	Маса алкалоїдів виділена з 100мл напару, mел, г	Вихід·100,%	Метрологічні характеристики
1	0,1386	0,0603	43,51	Sr=0,01 (x±д)=43,49±0,25
2	0,1386	0,0602	43,43
3	0,1386	0,0608	43,87
4	0,1386	0,0600	43,29
5	0,1386	0,0601	43,36

Дані, одержані при дослідженні взаємодії алкалоїдів чистотілу з молібдофосфатною кислотою і вивчені залежності електрохімічних характеристик розроблених ІСЕ, оборотних до катіонів алкалоїдів, були використані в аналітичних цілях. Розроблені методики іонометричного визначення суми алкалоїдів та окремих алкалоїдів берберину і хелідоніну в різних сумішах і лікарських формах. Методика прямого потенціометричного визначення апробована на модельних розчинах і таблетках „Берберину бісульфату” (вміст берберину в таблетці 5 мг) (табл. 9,10). Правильність результатів визначення алкалоїдів чистотілу в модельних розчинах перевірена методом добавок (табл. 9). Одержані дані підтверджують правильність результатів визначення алкалоїдів чистотілу та відсутність систематичної похибки. Відносне стандартне відхилення визначення не перевищує 0,02. Мінімальна визначувана концентрація суми алкалоїдів і берберину - 2,8мкг/мл, хелідоніну- 3,4 мкг/мл. Запропоновані методики дозволяють визначати вміст препарату в одиниці лікарської форми.

Розроблена методика кількісного визначення суми алкалоїдів амперометричним титруванням у досить широкому інтервалі концентрацій та рН розчинів. Правильність результатів була перевірена методом варіювання маси наважки (табл. 9). Результати апробації розробленої методики визначення суми алкалоїдів на модельних розчинах і реальних об'єктах - кислотних напарах чистотілу великого та лікарській формі „Настоянка чистотілу великого” свідчать про достатню чутливість методики і відтворюваність результатів. Мінімальна визначувана концентрація суми алкалоїдів чистотілу - 0,035мг/мл.

Реакція взаємодії РМо₁₂О₄₀^3- і ОК алкалоїдів з утворенням малорозчинної у воді сполуки сталого складу використана для гравіметричного визначення суми алкалоїдів чистотілу (С_min- 1мг/мл) з достатніми аналітичними та метрологічними характеристиками. Статистичний аналіз контролю вмісту суми алкалоїдів чистотілу в рослинній сировині гравіметричним методом показав задовільні результати (табл.10).

Таблиця 9 Результати визначення алкалоїдів чистотілу в модельних розчинах (n=5, Р=0,95)

Визначувана речовина	Метод	Введено, мг	Знайдено (x±д) мг	Sr
Сума алкалоїдів чистотілу	Іонометрія	5,00	5,040,12	0,02
	Перевірка методом добавок	5,00+0,30	5,310,10	0,02
		5,00+0,50	5,490,11	0,02
	Гравіметрія	50,00	50,310,72	0,01
	Перевірка методом варіювання наважки	75,00	75,220,50	0,01
		100,00	100,531,71	0,01
	Амперометричне титрування	5,00 6,00 7,00	5,050,10 6,010,12 7,020,20	0,02 0,02 0,02
	Осадова хроматографія	5,00	4,980,23	0,04
	Електрофорез	0,50	0,510,02	0,04
Хелідонін	Іонометрія	5,00	5,020,10	0,02
	Перевірка методом добавок	5,00+0,50	5,510,11	0,02
		5,00+1,00	6,020,14	0,02
	Осадова хроматографія	5,00	5,040,18	0,04
Берберин	Іонометрія	5,00	4,980,10	0,02
	Перевірка методом добавок	5,00+0,50	5,490,12	0,02
		5,00+1,00	6,010,14	0,02
	Осадова хроматографія	5,00	4,970,28	0,05

Використані також іонообмінні властивості ГПА структури Кеггіна РМо₁₂О₄₀^3- для ідентифікації та визначення суми алкалоїдів чистотілу та алкалоїдів берберину та хелідоніну методом осадової тонкошарової хроматографії. Метрологічні характеристики визначення суми алкалоїдів чистотілу за допомогою тонкошарової осадової хроматографії (табл. 9). Мінімальні визначувані концентраціі суми алкалоїдів чистотілу-0,35мг/мл, берберину-0,4мг/мл, хелідоніну-0,3мг/мл.

Таблиця 10 Результати визначення алкалоїдів чистотілу в реальних об'єктах - рослинній сировині (100г сухої рослинної сировини в 800 мл 2%-ного розчину Н₂SO₄) та лікарських формах (n=7, Р=0,95)

Об'єкт	Метод	Знайдено (х),г	Sr
Кислотний напар сухої рослинної сировини	Амперометричне титрування	0,7800,016	0,02
	Гравіметрія	0,7837±0,0044	0,01
Таблетки „Берберину бісульфату”	Амперометричне титрування	4,970,18	0,03
	Іонометрія	4,980,10	0,02
Лікарська форма „Настоянка чистотілу великого”	Амперометричне титрування	0,770,02	0,03
	Гравіметрія	0,7708±0,0102	0,01
	Потенціометричне титрування (фармакопейна методика)	0,713±0,049	0,07

При розробці методики визначення суми алкалоїдів чистотілу методом електрофорезу на папері за допомогою планіметрії зон, як проявник було використано РМо₁₂О₄₀^3-. Результати визначення суми алкалоїдів чистотілу великого методом електрофорезу апробовані на модельних розчинах суми алкалоїдів, виділених методом електролізу, свідчать про достатню чутливість методики і відтворюваность результатів (табл. 9). Мінімальна визначувана концентрація суми алкалоїдів чистотілу - 12мкг/мл.

Запропоновані методики кількісного визначення алкалоїдів чистотілу мають ряд переваг у порівнянні з існуючими - це експресність, чутливість, заміна токсичних органічних розчинників на розчини мінеральних кислот, методики забезпечують контроль препаратів з високими метрологічними характеристиками та дозволяють визначати вміст суми алкалоїдів чистотілу в рослинній сировині та аналізувати одиницю лікарської форми.

ВИСНОВКИ

1. Розроблені методики виділення суми солей та основ алкалоїдів чистотілу із рослинної сировини кислотним напарюванням та електролізом, які відрізняються експресністю та досить високою чистотою одержаних препаратів. Знайдені оптимальні умови виділення суми основ алкалоїдів з кислотних напарів методом електролізу та зроблені припущення щодо механізму виділення основ алкалоїдів чистотілу на електроді.

2. Запропонований спосіб розділення суми алкалоїдів чистотілу на індивідуальні речовини (берберин та хелідонін), який ґрунтується на різній розчинності їх солей у воді, та проведена їх ідентифікація.

3. Синтезовані нові електродноактивні речовини з органічними катіонами берберину, хелідоніну та суми алкалоїдів та протиіоном - молібдофосфат-аніоном. Визначені їх хіміко-аналітичні властивості (склад, характер зв'язку, розчинність) з використанням методів УФ та ІЧ спектроскопії. Підтверджена індивідуальність отриманих сполук.

4. Виготовлені нові плівкові ІСЕ, зворотні до вивчених катіонів, знайдені закономірності впливу природи ЕАР, складу мембрани, властивостей розчинника-пластифікатора на електродні характеристики ІСЕ, які дозволили їх оптимізувати. Нові аналітичні форми використані для розробки нові методики визначення суми алкалоїдів чистотілу методами прямої потенціометрії, амперометричного титрування, граві-метрії, зонального електрофорезу та осадової хроматографії, які апробовані на реальних об'єктах- лікарських формах, напарах чистотілу та модельних розчинах суми алкалоїдів, виділених електролізом. За своїми метрологічними характеристиками та експресністю розроблені методики відповідають вимогам фарманалізу. Розроблені експресні методики визначення алкалоїдів берберину та хелідоніну методами іонометрії та тонкошарової осадової хроматографії. Методики апробовані на модельних розчинах та відрізняються високою селективністю та чутливістю.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ ВИКЛАДЕНий В РОБОТАХ

1. Ткач В.И., Степневская Я.В., Привалов В.Н. Выделение и количественное определение суммы алкалоидов в лекарственном растении “Чистотел большой” //Вісник ДДУ. Сер. “Хімія”.-2000.-Вип.4.- С.22-24.

Виділення суми алкалоїдів чистотілу методами мацерації та кислотного напарювання на водяній бані з рослинної сировини, визначення стехіометричного співвідношення органічний катіон : гетерополіаніон амперометричним методом, визначення суми алкалоїдів спектрофото-метричним і гравіметричним методами.

2. Степневська Я.В., Циганок Л.П., Вакуліч А.Н., Ткач В.І. Виділення, ідентифікація та амперометричне визначення суми алкалоїдів у кислотних напарах “Чистотілу великого” //Вопросы химии и химтехнологии.-№2.-2001.-С.9-11.

Розробка методики визначення суми алкалоїдів амперометричним методом в рослинній сировині, розділення суми алкалоїдів чистотілу за групами, математична обробка результатів аналізу.

3. Степневська Я.В., Коврей К.Л., Циганок Л.П., Ткач В.І. Аналіз суми алкалоїдів чистотілу великого методом осадової тонкошарової хроматографії //Фармац. журнал.-2002.-№4.-С.73-75.

Вивчення умов якісного та кількісного визначення суми алкалоїдів чистотілу методом тонкошарової хроматографії, визначення суми алкалоїдів чистотілу, математична обробка результатів.

4. Степневская Я.В., Карандеева Н.И., Цыганок Л.П., Ткач В.И. Гетерополианион структуры Кеггина РМо₁₂О₄₀^3- как аналитический реагент на алкалоиды “Чистотела большого” //Журн. аналит. химии.- 2002.-Т.57, №11.-С.1206-1210.

Вивчення реакції взаємодії органічних катіонів алкалоїдів і гетерополіаніона РМо₁₂О₄₀^3-, встановлення складу одержаного іонного асоціату методом амперометричного титрування, розрахунок іонного добутку розчинності, виконання експерименту при розробці іоноселективного електроду на основі синтезованого асоціату, розробка методики визначення суми алкалоїдів в екстрактах та напарах методами іонометрії та амперометричного титрування.

5. Степневська Я.В., Ковтун В.Н., Вакуліч А.М., Ткач В.І. Виділення суми основ алкалоїдів із рослинної сировини Chelidonium Majus L методом електролізу //Вопросы химии и химтехнологии.-2003.-№3.-С.12-14.

Вивчення механізму та оптимальних умов виділення основ алкалоїдів чистотілу з кислотних напарів методом електролізу. Розробка економічного способу вилучення основ алкалоїдів з рослинної сировини, математична обробка отриманих результатів.

6. Патент 54148 А Україна, МКИ С07D307/50, С25В3/00. Спосіб отримання алкалоїдів із рослинної сировини Chelidonium Majus L./ Ткач В.І., Степневська Я.В.- №2002054258; Заявл. 24.05.2002; Опубл. 17.02.2003. Бюл. № 2.

7. Ткач В.І., Степневська Я.В., Привалов В.М., Циганок Л.П. Електрохімічне визначення суми алкалоїдів чистотілу великого в екстрактах та настойках //Тези доп. Всеукр. конф. з аналіт. хімії.-Харків.-2000.-С.144.

8. Степневська Я.В., Ткач В.І., Циганок Л.П. Вивчення реакції взаємодії суми алкалоїдів чистотілу з молібдофосфорною кислотою методом УФ- спектроскопії //Тези доп. на XV українській конф. з неорг. хімії .-Київ.-2001.-С.261.

9. Степневська Я.В., Олійник О.В., Коврей К.Л. Визначення суми алкалоїдів “Чистотілу великого” електрохімічними методами //Тези доп. на ІІІ регіональній конф. молодих вчених та студентів з актуальних питань хімії.-Дніпропетровськ.-2001.-С.49.

10. Степневская Я.В., Ткач В.И. Электроаналитические характеристики ионоселективных электродов, обратимых к сумме алкалоидов “Чистотела большого” //Тез. докл. на конф. “Актуальные проблемы химии”.- Москва.-2002.- С.154-155.

11. Степневська Я.В., Ткач В.І. Електрохімічні методи виділення та визначення суми алкалоїдів чистотілу великого //Тези доп. на сесії наук. ради з проблем аналіт. хімії.-Харків.-2002.-С.27-28.

12. Ткач В.І., Степневська Я.В., Головей О.П., Сухацька І.Ю., Стекленьов А.Л. Синтез електродноактивних речовин іоноселективних електродів, оборотних до азотвміщуючих органічних катіонів //Тези доп. на конф. функціоналізовані матеріали.-Київ.-2002.-С.134-135.

13. Степневська Я.В., Ткач В.І. Фізико-хімічні методи виділення та визначення суми алкалоїдів “Чистотілу великого” //Тези доп. на сесії наук. ради з проблем аналіт. хімії.-Ужгород.-2003.-С.11-12.

14. Степневська Я.В., Ткач В.І. Фізико-хімічні методи визначення алкалоїдів “Чистотілу великого” //Тези доп. на І міжнар. науково-технічній конф. студентів і аспірантів.-Дніпропетровськ.-2003.-С.302-303.

АНОТАЦІЇ

Степневська Я.В. Фізико-хімічні методи виділення та визначення суми алкалоїдів “Чистотілу великого”.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.02 - аналітична хімія.- Фізико-хімічний інститут ім. О.В.Богатського НАН України, Одеса, 2003.

Дисертація присвячена розробці методик виділення та кількісного визначення суми алкалоїдів чистотілу, алкалоїдів берберину та хелідоніну. Вивчений вплив ряду факторів на виділення суми алкалоїдів методом електролізу, зроблене припущення що до механізму утворення суми основ алкалоїдів на електроді.

Розроблені іоноселективні електроди (ІСЕ), оборотні до катіонів алкалоїдів чистотілу і вивчений вплив на їх електрохімічні та аналітичні характеристики ряду факторів, врахування яких дозволяє прогнозувати властивості пластифікованих мембранних ІСЕ та розробити електроди з заданими параметрами.

Запропонована та запатентована методика виділення суми основ алкалоїдів чистотілу методом електролізу та розроблений комплекс чутливих, експресних методик визначення суми алкалоїдів в лікарських формах і сумішах методами прямої потенціометрії, електрофорезу, осадової хроматографії і амперометричного титрування.

Ключові слова: сума алкалоїдів чистотілу, берберин, хелідонін, електроліз, іоноселективні електроди, електроаналітичні характеристики, пряма потенціометрія, амперометричне титрування, електрофорез, хроматографія.

Stepnevskaya Y.V. The physico-chemical methods of the separation and determination of the sum of Chelidonium Majus L. alkaloids. - Manuscript.

The thesis for a scientific degree of Candidate of Sciences in Chemistry. The speciality: 02.00.02- Analytical Chemistry.- A.V.Bagatsky Physico - chemical institute of the National Academy of sciences of Ukraine, Odessa 2003.

The dissertation is devoted to elaborating of separation and determination methods of sum of Chelidonium Majus L alkaloids and alkaloids berberin, helidonin. The influence of number of the factors on the separation of sum of alkaloids of Chelidonium Majus L. was studed and the mechanism of formation of sum alkaloids on the electrode was proposed.

It was studed the influence of number of the factors on the electrochemical and analytical characteristics of ionselective electrodes (ISE), convertible to cations of alkaloids of Chelidonium Majus L., which account allows to predict the properties of membrane ISE and to develop electrodes with the given characteristics.

The complex of sensitive, express techniques of alkaloids of Chelidonium Majus L. definition in the medicinal forms and solutions by the direct potentiometry, electrophoresis, chromatography and amperometric titration is offered.

Key words: the sum of alkaloids, berberin, helidonin, electrolyses, ionselective electrodes, electroanalytical characteristics, the direct potentiometry, amperometric titration, electrophoreses, chromatography.

Степневская Я.В. Физико-химические методы выделения и определения суммы алкалоидов “Чистотела большого”.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.02 - аналитическая химия.- Физико-химический институт им. О.В.Богатского НАН Украины, Одесса, 2003.

Диссертация посвящена разработке методик выделения и количественного определения суммы алкалоидов чистотела? алкалоидов берберина и хелидонина. Изучено влияние ряда факторов на выделение суммы алкалоидов методом электролиза, сделана попытка объяснения механизма выделения суммы оснований алкалоидов на электроде.

Разработаны ионоселективные электроды (ИСЭ), обратимые к катионам алкалоидов чистотела и изучено их электрохимические и аналитические характеристики, учет которых позволяет прогнозировать свойства пластифицированных мембранных ИСЭ и разрабатывать электроды с заданными характеристиками. В качестве электродноактивных веществ ИСЭ использованы синтезированные малорастворимые соединения исследуемых катионов с молибдофосфат-анионом (МФА). Методами УФ и ИК спектроскопии доказан ассоциативный характер связи в соединениях катионов алкалоидов с МФА. Методом амперометрического титрования определен состав образующихся малорастворимых соединений, изучены их физико-химические свойства.

Изготовлены пленочные ИСЭ и установлены зависимости их электродных свойств от величины рН раствора и природы растворителя-пластификатора. Изучена селективность разработанных электродов по отношению к катионам щелочных и щелочноземельных металлов, рассчитаны коэффициенты селективности.

Изучен механизм выделения оснований алкалоидов методом электролиза. Полученные результаты свидетельствуют о том, что молекулы алкалоидов не принимают участия в электрохимической реакции, выделение основания проходит за счет химической реакции. Изучено влияние различных факторов на степень выделения суммы алкалоидов чистотела. Наибольшее влияние на степень выделения оказывает повышение температуры раствора и введение добавок, конечным продуктом восстановления которых являются ОН^- ионы и равновесный потенциал которых менее отрицателен по сравнению с равновесным потенциалом восстановления молекул воды.

Разработана и запатентована методика выделения суммы оснований алкалоидов чистотела методом электролиза и разработан комплекс чувствительных, экспрессных методик количественного определения суммы алкалоидов в растительном сырье, лекарственных формах и различных смесях методами прямой потенциометрии, электрофореза, осадочной хроматографии и амперометрического титрования. Разработанные методики имеют ряд преимуществ по сравнению с существующими фармакопейными методиками: простота, экспрессность, - и отличаются хорошими метрологическими характеристиками.

Ключевые слова: сумма алкалоидов чистотела, берберин, хелидонин, электролиз, ионоселективные электроды, электроаналитические характеристики, прямая потенциометрия, амперометрическое титрования, электрофорез, хроматография.

Размещено на Allbest.ru

...