Роль металотіонеїнів в детоксикації йонів міді, цинку, марганцю та свинцю в організмі прісноводних риб і молюсків

Металспецифічні склад і відповідь МТ коропа і беззубки можуть бути пояснені еволюційними особливостями комплексного механізму регуляції метаболічно активної форми того чи іншого металу, важливого для життєдіяльності. Це припущення підтверджується встановленою нами високою чутливістю і видоспецифічністю відповіді на дію міді СОД, яка виконує буферну функцію для міді у взаємозв'язку з МТ і ГSH (Ciriolo M.R. et al., 2001).

Встановлено зв'язок між детоксикаційною функцією МТ та ступенем антиоксидантного захисту організму. Для властивостей МТ та АПС печінки коропа виявлені чіткі ознаки концентраційно залежної відповіді організму на токсиканти. Їх активізація, або “Hormesis” (Stebbing A.R.D., 1981) проявляється за дії МК металів як посилення спектральних ознак МТ та/або акумуляції ними металів у всіх дослідних групах. Більшість показників АПС за цих умов відповідають нормі, або їх зміни мають антиоксидантну спрямованість. За дії СК йонів металів вміст МТ та їх здатність зв'язувати метал-токсикант значно зменшуються, а спектральні ознаки послаблюються. За цих умов певне компенсаторне значення можуть мати олігомерні форми МТ, які акумулюють надлишок металів, що дозволяє оцінити СК як стадію компенсованого підвищення активності стресових систем. Цій концентрації відповідає найбільший діапазон відхилень від контролю показників АПС. За дії ВК йонів металів спостерігається зростанням вмісту продуктів пероксидації ліпідів та білків у тканині і зменшенням активності антиоксидантних ферментів, що свідчить про фазу вичерпання антистресових систем організму. Дослідження ТБ за цих умов свідчить про посилення їх олігомеризації. Надлишок металів за цих умов зв'язується з термолабільними компонентами тканин. Отже, ступінь ефективності зв'язування металів з МТ є показником їх токсичності.

Використання інтегрованого показника КАС дозволило диференціювати ступінь змін АПС залежно від концентрації металу та виду організму. За розбалансування окремих компонентів АПС зміни КАС у обох організмів вірогідно корелюють із змінами активності СОД (r=0,85 при r(0,95, 21)=0,42).

Таблиця 3. Типи змін диференційних спектрів І і ІІІ фракцій термостабільних білків тканин коропа і беззубки в експериментальних умовах: ? - “дзвоноподібна”, ? - “висхідна діагональ”, \ - “нисхідна діагональ”, ? -“зміщення” піку, - - не визначали, * - еталони, r(21, 0,99)=0,54

Для всіх досліджених нами металів та їх суміші послаблення здатності МТ зв'язувати їх у малотоксичні комплекси супроводжується появою ознак токсичності, зокрема активацією ПОЛ. Свинець, який не акумулюється МТ, посилює ПОЛ вже за дії МК. Подібну дію має і мідь у коропа, тоді як у беззубки вона пригнічує ПОЛ. Марганець значно пригнічує ПОЛ у коропа, але посилює його у беззубки. Певні ознаки токсичності металів дозволяють поділити їх на групи. Так, відмінність впливу металів на білкові і небілкові тіоли узгоджується з їх належністю до відносно м'яких і жорстких основ і відповідає їх поведінці в системі in vitro (Maracine M., Segner H., 1988). Дія марганцю і свинцю особливо позначається на процесах, залежних від забезпечення йонами заліза. Мідь і цинк здатні викликати відповідь по типу “гострої фази” у плазми крові, мають подібний дозо-залежний вплив на СОД відповідно до подібних рис їх гомеостазу в печінці.

При інтерпретації результатів варто також враховувати, що дія кожного металу викликає значні і специфічні зміни у гомеостазі інших металів, які можуть в свою чергу впливати на сигнальні механізми відповіді на стрес - індукцію стресорних білків - МТ, СОД тощо, діючи або безпосередньо на геном, або через генерацію активних форм кисню. Причому антагонізм між марганцем і міддю найкраще виявляється на рівні зв'язування з МТ.

Аналіз одержаних результатів свідчить, що ефективним показником концентраційно-залежної і металспецифічної дії металів виявились диференційні спектри ТБ. За експериментальних умов спостерігалось чотири типи їх змін (табл. 4). “Дзвоноподібна” форма спектру низькомолекулярної фракції ТБ відповідає активізації відповіді з боку МТ, така ж форма високомолекулярної фракції ТБ свідчить про утворення олігомерів МТ. Всі три метали, яки виявили здатність до утворення високомолекулярних форм МТ - мідь, марганець і свинець - відомі здатністю каталізувати процеси аутоокиснення біомолекул із залученням їх SH-груп (Shen X.M., Dryhurst G., 1998; Velez-Pardo C. et al., 1995). “Дзвоноподібна” форма спектру в більшості випадків узгоджується із збільшенням у фракції вмісту металів, що відповідає відомостям про більшу ємність олігомерної форми МТ до металів, ніж мономерної (Wilhelmsen T.W. et al., 2002) і підтверджується кореляційним аналізом.

Форма спектру у вигляді “висхідної діагоналі” узгоджується з втратою ознак метал-тіолатних кластерів. Рідко зустрівана форма “нисхідної діагоналі” виникає за дії таких сильних окисників як мідь і марганець у білків І фракції. “Зміщення” піку специфічне для дії цинку.

Отже, проведене нами дослідження дозволяє зробити висновок про залежність детоксикаційної здатності прісноводних тварин щодо йонів міді, цинку, марганцю і свинцю від ефективності їх зв'язування металотіонеїнами у малотоксичні комплекси та визначити показники, які адекватно і кількісно відображають її.

Висновки

Здійснено системне дослідження участі металотіонеїнів коропа і беззубки в детоксикації йонів міді, цинку, марганцю і свинцю, в результаті якого з'ясовано зміни фізико-хімічних властивостей металотіонеїнів за підвищення вмісту металу-токсиканту в середовищі, а також показано наявність зв'язку між здатністю металотіонеїнів акумулювати токсикант та станом антиоксидантно-прооксидантної системи організму залежно від виду тварин, природи йонів металів, їх концентрації та часу дії.

З тканин коропа і беззубки виділені металотіонеїни як термостабільні білки з молекулярною масою близько 6 кДа й ідентифіковані за спектральними ознаками, амінокислотним складом та утворенням ізоформ МТ-1 і МТ-2 при йонообмінній хроматографії. За спектральними ознаками та поведінкою при електрофорезі виявлені олігомерні форми металотіонеїнів. За складом металів металотіонеїни коропа належать до Zn-МТ, а металотіонеїни беззубки - до Zn,Cu-МТ.

Металотіонеїни коропа і беззубки відіграють важливу роль у зв'язуванні міді в тканинах, але проявляють видову специфічність щодо участі в її детоксикації. Металотіонеїни коропа не зв'язують надлишок міді і зазнають олігомеризації за зростання її вмісту у складі термостабільних компонентів тканин (p<0,05). Металотіонеїни беззубки за дії 0,01 мг/л міді зв'язують на 100 - 300% більше міді порівняно з контролем.

Вплив йонів цинку на коропа не приводить до істотних змін вмісту цинку в металотіонеїнах за зростання його вмісту в термостабільних компонентах печінки в 1,9 разів (p<0,05). У беззубки вплив йонів цинку на організм викликає істотне зростання вмісту цинку в металотіонеїнах. Проте його загальний вміст в тканинах беззубки на порядок вищий від акумулюючої здатності металотіонеїнів та в умовах досліду зростає в 1,5 - 2,0 разів проти контролю (p<0,05).

Металотіонеїни коропа зв'язують порівняно велику частку марганцю від його загального вмісту в тканинах коропа (близько 40% загального вмісту в печінці в контролі). За дії на організм йонів марганцю його вміст у металотіонеїнах та їх олігомерних формах зростає. У беззубки металотіонеїни не беруть істотної участі у зв'язуванні надлишку марганцю в тканинах.

Показано, що металотіонеїни коропа та беззубки не беруть істотної участі у зв'язуванні свинцю в контролі і, особливо, за його підвищеного вмісту в середовищі.

За впливу суміші йонів міді, цинку, марганцю і свинцю на коропа та беззубку видова специфічність детоксикаційної функції металотіонеїнів зберігається. В складі металотіонеїнів коропа особливо зростає вміст марганцю і зменшується - міді. У металотіонеїнах беззубки міститься підвищена кількість цинку, підтримується стабільний вміст міді, але зменшується вміст марганцю, що відповідає напряму вірогідних змін вмісту цих металів у тканинах (p<0,05).

За змінами властивостей металотіонеїнів коропа визначено три концентраційно-залежні стадії дії металів: активації металзв'язуючої функції; посилення утворення олігомерів та зв'язування ними надлишку метал-токсиканту; виснаження металзв'язуючої функції.

Встановлено зворотню залежність між здатністю металотіонеїнів акумулювати метал-токсикант та проявами його прооксидантної дії. Найбільший рівень антиоксидантного захисту, який вірогідно корелює зі зростанням активності супероксиддисмутази та пригніченням пероксидації ліпідів, виявлено у коропа за дії марганцю і у беззубки - за дії міді. Найвищий рівень активації пероксидації ліпідів та розбалансування ферментної системи антиоксидантного захисту спостерігається у коропа за дії свинцю. Найістотніші видові відмінності показників антиоксидантно-прооксидантного стану спостерігаються за дії міді та її суміші.

Зменшення здатності металотіонеїнів печінки коропа зв'язувати метал-токсикант супроводжується проявами специфічних ознак токсичності його йонів, такими як зміни вмісту небілкових і білкових тіолів, активності супероксиддисмутази та каталази в тканинах, складу середньомолекулярних пептидів плазмі крові.

У беззубок, які знаходились в умовах комплексного забруднення природної водойми, спостерігали пригнічення металзв'язуючої функції металотіонеїнів, але активацію інших ендогенних захисних систем організму - ферментів антиоксидантного захисту та зростання вмісту небілкових тіолів.

Спостерігались зміни вмісту в складі металотіонеїнів та інших компонентів тканин міді, цинку, марганцю та заліза, навіть за умов постійного вмісту в них металу-токсиканту. Здебільшого цинк і марганець - синергісти, а мідь і марганець - антагоністи за акумуляцією в термостабільних білках.

На підставі узагальнення одержаних результатів можна рекомендувати низку критеріїв для оцінки ступеня ураження організму прісноводних тварин важкими металами:

визначення типу металотіонеїнів (Zn-MT або Zn,Cu-МТ) за співвідношенням вмісту в них цинку і міді для прогнозу толерантності організму щодо дії міді, цинку і марганцю;

кореляційний аналіз диференційних УФ-спектрів термостабільних білків для кількісної оцінки метало- та концентраційно-специфічних змін властивостей металотіонеїнів, зокрема олігомеризації;

обчислення інтегрального показника антиоксидантно-прооксидантного стану - КАС для порівняльної оцінки токсичної дії металів залежно від природи, концентрації, а також тканинної і видової специфіки відповіді;

визначення вмісту білкових і небілкових тіолів у тканинах та їх співвідношення для встановлення моделі дії токсичної концентрації металу.

Основні публікації за темою дисертації