Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет імені В. Н. Каразіна

УДК 597.222: 547.2

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

АВТОРЕФЕРАТ

МЕХАНІЗМИ НАКОПИЧЕННЯ ЕРГОСТЕРИНУ В КЛІТИНАХ ДРІЖДЖІВ SACCHAROMYCES CEREVISIAE В ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ

Леонова Ірина Сергіївна

Харків - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в НДІ біології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Божков Анатолій Іванович, Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України, директор НДІ біології/

Офіційні опоненти: доктор сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник Іонов Ігор Анатолійович, Харківський національний педагогічний університет імені Г.С. Сковороди Міністерства освіти і науки України, декан природничого факультету, м. Харків доктор біологічних наук, професор Бондаренко Тетяна Петрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем, м. Харків

Провідна установа: Львівський національний університет імені Івана Франка (кафедра генетики і біотехнології) Міністерства освіти і науки України, м. Львів

Захист відбудеться “8” червня 2005 р. о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. ІІІ-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “5” травня 2005 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради Падалко В.І.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з центральних проблем сучасної біохімії є дослідження молекулярних механізмів адаптації, які спрямовані на перебудову системи метаболізму відповідно до вимог факторів середовища. Актуальність дослідження відповідних реакцій на дію екзо- і ендогенних факторів зумовлена, тим що без знань цих механізмів неможливо зрозуміти такі фундаментальні явища, як онтогенез, розвиток патологий та інші. Зазначенні питання є темою досліджень фахівців різних наукових напрямків. Основна частина робіт присвячена вивченню первинного обміну - реакцій, подібних у всіх живих організмів, і пов'язаних із синтезом нуклеїнових кислот та білків. Однак поряд з цим існує величезна кількість метаболічних шляхів, які приводять до утворення і накопичення сполук, властивих лише деяким біологічним видам чи одній хімічній расі - вторинних сполук [Лукнер М., 1979; Zinser E., 1993]. Сучасні дослідження показують, що продукти вторинного обміну можуть як опосередковано, так і безпосередньо впливати на первинний обмін і, таким чином, на структурно-функціональні характеристики клітини: інтенсивність проліферації, швидкість старіння [F. Ness, 1998].

У зв'язку з цим вивчення впливу різних факторів на накопичення продуктів вторинного обміну і його можливий взаємозв'язок зі структурно-функціональним станом клітини становить інтерес для розуміння регуляції метаболізму в процесі адаптації.

Вторинний метаболізм добре виражений у такого різнобічно вивченого об'єкта, як дріжджі-сахароміцети [Pereira R. 1998; Meunier J.R. et al., 1999], на яких проведений ряд біохімічних, молекулярно-генетичних і геронтологичних досліджень [Matsuyama S., 1999; Nose H, 2002].

Основним вторинним метаболітом дріжджів є стерини, зокрема, ергостерин, на частку якого припадає 60-90% усіх стеринів клітини [Синицкая Н.А., 1993]. Ергостерин є попередником сполук, які мають Д-вітамінну та гормональну активність, тому ергостерин дріжджів становить інтерес для вирішення проблеми авітамінозів групи Д у дітей і молодняку тварин, що є гострм питанням у багатьох країнах світу, у тому числі й в Україні.

Використання клітин дріжджів як харчових і кормових добавок ускладнено через особливості будови їх клітинної стінки [Kapteyn J.C., et al., 1999], на яку припадає до 30% сухої маси клітини [Smith A.E., et al., 2000]. У зв'язку з цим розробка нових способів руйнування або видалення клітинної стінки дріжджів, що дозволить одночасно підвищити вихід цільового продукту, є досить актуальною.

Незважаючи на те, що процес стериноутворення досліджується протягом багатьох років [Yang H., 1996; Yu C., 1996; Dimster-Denk D. et al.,1999], усе ще недостатньо вивченими є питання впливу складу середовища, умов росту клітин дріжджів та віку культури на активність вторинного метаболізму, зокрема, на накопичення ергостерину і взаємозв'язок між первинним і вторинним метаболізмом.

Вивченню цих питань і присвячена дана робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилися в науково-дослідному інституті біології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна в рамках теми “Дослідження екстрацелюлярних ферментів фітопатогенів і їх ролі у формуванні рослинного імунітету” (НДР: 0103U004281).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було визначення механізмів накопичення ергостерину в клітинах дріжджів Saccharomyces cerevisiae у процесі старіння культури і за різних умов культивування, а також розробка методів гідролітичного руйнування клітинних стінок дріжджів. Відповідно до цього були поставлені такі задачі:

1. Вивчення впливу популяційного віку культури на накопичення ергостерину клітинами дріжджів і їх стійкість до осмотичного і температурного шоку.

2. Дослідження впливу джерела вуглецю (різні концентрації пивного сусла й етилового спирту) та етапу росту культури, на якому вносили добавку, на вміст ергостерину в клітинах дріжджів.

3. Дослідження комплексного впливу іонів кальцію, етилового спирту і різних температурних режимів культивування на накопичення ергостерину клітинами дріжджів.

4. Вивчення можливості індукції стериноутворення ферментними комплексами міцеліальних грибів, що руйнують клітинні стінки дріжджів.

Об'єкт дослідження - механізми накопичення ергостерину клітинами дикого штаму пивних дріжджів Saccharomyces cerevisiae.

Предмет дослідження - показники вмісту ергостерину й інтенсивності дихання культури дріжджів, динаміка росту культури дріжджів, вміст продуктів перекисного окислення ліпідів, вміст білку і нуклеїнових кислот у біомасі дріжджів.

Методи дослідження - спектрофотометричні (кількість клітин дріжджів у культурі, вміст ергостерина, рівень перекисного окислення ліпідів, вміст нуклеїнових кислот), мікроскопічні (кількість клітин дріжджів, діаметр клітин) метод тонкошарової хроматографії ліпідів, полярографичний метод визначення інтенсивності дихання клітин дріжджів, статистичні методи обробки даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Виявлено, що інтенсивність накопичення ергостерину визначалася як індуктором, так і станом метаболізму клітини на момент впливу. Зміна вмісту ергостерину в клітинах дріжджів залежала не тільки від концентрації етилового спирту у середовищі культивування, але і від етапу росту культури, на якому він був внесений. Сумісне внесення іонів кальцію та етилового спирту у середовище культивування дріжджів спричиняло адитивний ефект при накопиченні ергостерину, що може свідчити про їх регуляторну дію на різних етапах синтезу ергостерину в клітинах дріжджів.

Вперше показано, що комплекс екзогенних гідролітичних ферментів міцеліального гриба Chaetomium globossum Kunze може забезпечити руйнування клітинних стінок дріжджів. Уперше виявлена можливість індукції стериноутворення в клітинах культури дріжджів при їх інкубації з екзометаболітами Chaetomium globossum Kunze. У випадку пролонгованої дії ферментного комплексу виявлявся ефект накопичення ергостерину, що може свідчити про адаптивну роль ергостерину у клітині. Виявлено, що накопичення ергостерину в клітинах дріжджів, до якого призводив вплив комплексу екзогенних ферментів, у ряді випадків може розглядатися як адаптивна реакція клітини на дію екстремальних факторів.

Виявлено, що збільшення популяційного віку культури дріжджів призводило до зниження вмісту ергостерину в клітинах, зменшення розміру клітин, збільшення кількості мертвих клітин у культурі, а також до зниження їх стійкості до теплового й осмотичного шоку.

Практична значимість роботи. Отримані результати свідчать про зміну вихідних характеристик культури клітин дріжджів при тривалому й інтенсивному пасируванні, що необхідно враховувати при використанні культур клітин дріжджів у науковій і практичній діяльності. Застосування комплексу гідролітичних екзоферментів міцеліального гриба Chaetomium globossum Kunze, здатного модифікувати або цілком руйнувати клітинну стінку дріжджів, дозволить:

- одержувати харчові добавки, що мають високу харчову цінність.

- одержувати протопласти дріжджів, необхідні для сучасних біотехнологій і молекулярно-генетичних досліджень.

Підбір умов культивування зможе забезпечити стабільне і більш інтенсивне (в 1,5 - 2 рази у порівнянні з контролем) накопичення ергостерину клітинами дріжджів, дозволить одержати харчову і кормову добавку, збагачену попередником вітаміну Д, що необхідно для профілактики рахіту у дітей і молодняку тварин.

Результати цієї роботи були використані у навчальному процесі біологічного факультету Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна і кафедри біотехнології Харківського національного політехнічного університету “Харківський політехничний інститут”, а також при утилізації залишкових пивних дріжджів на ОАТ“Пивзавод “Рогань”.

Особистий внесок здобувача. Самостійно була підібрана і проаналізована література за темою дисертації, здійснена постановка експериментів, вибір досліджуваних показників і статистична обробка отриманих результатів. Усі експерименти проведені самостійно, крім експериментів з руйнування клітинних стінок дріжджів екзометаболітами Chaetomium globossum Kunze, які були виконані разом з В.І. Облак. Аналіз і інтерпретація отриманих результатів проведені разом з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати й основні положення роботи доповідалися на конференції “Научные исследования в наукоградах Московской области: От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям” (Пущино, 2002), конференції “Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии” (Томськ, 2004), VII Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і освіта`2004” (Дніпропетровськ, 2004), VI Міжнародному симпозіумі “Біологічні механізми старіння” (Харків, 2004) і наукових семінарах у НДІ біології Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна.

Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковані 3 статті і 4 тез доповідей.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу і розділів: огляд літератури, матеріали і методи дослідження, результати власних досліджень та їх обговорення (5 розділів), узагальнення отриманих результатів і висновків, а також списку цитованої літератури (260 літературних джерел, з яких 122 іноземних авторів). Робота викладена на 153 сторінках друкованого тексту і містить 15 таблиць і 18 малюнків.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Огляд складається з 4-х підрозділів, у яких наведено аналіз наукової літератури щодо метаболізму ергостерину: механізмів синтезу і його регуляції, ролі ергостерину в клітинах дріжджів, а також залежності накопичення ергостерину в клітинах дріжджів середовища культивування. Розібрані питання будови клітинної стінки дріжджів і методи її руйнування. В огляді обґрунтовано вибір напрямків досліджень і наведені способи вирішення задач, що поставлені у роботі.

Матеріали і методи дослідження. Дослідження проводили на дикому штамі пивних дріжджів Saccharomyces cerevisiae.

Динаміку росту культури визначали за кількістю клітин, яку рахували загальнопринятим методом у камері Горяєва, а також по зміні оптичної щільністі при довжині хвилі 550 нм на спектрофотометрі СФ-46 (“ЛОМО”, Росія). Нативність плазматичної мембрани клітин дріжджів оцінювали за допомогою фарбування барвником 0,8% трипановим синім [Seglen P.O., 1976] і виражали у відсотках від загальної кількості клітин. Діаметр клітини вимірювали, використовуючи мікроскоп МБІ-6 з окуляр-мікрометром. Екстракцію стеринів із клітин дріжджів здійснювали за методом Бревика і Оводса в модифікації Вудса [Woods R.A., 1971]. Визначення вмісту ергостерину проводили за допомогою двопроменевої спектрофотометрії при довжині хвилі 200-310 нм на спектрофотометрі Specord UV VIS "Carl Ziess Jena" (Німеччина), максимум поглинання при 281 нм [Яхимович Р.И., 1978], використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції 11500 М-1? см-1 [Huber W., 1945], а також за методом тонкошарової хроматографії [Хиггинс Д.А., 1990] і виражали у нмоль на 10клітин. Інтегральну активність метаболізму клітин дріжджів оцінювали за інтенсивністю ендогенного дихання клітин [Аливердиева Д.А., 2001, Рихванов Е.Г., 2001], яку визначали полярографічно за швидкістю споживання кисню з використанням закритого платинового електроду Кларка [Зеленский М.И., 1986] і виражали у натом О/ хв. на 10клітин. Інтенсивність вільно-радикального ушкодження оцінювали за вмістом ТБК-активних продуктів перекисного окислення ліпідів у суспензії дріжджів і виражали у нмоль малонового діальдегіду на мг білку. Вміст нуклеїнових кислот визначали після фракціонування за Шмідтом і Тангаузером з наступною спектрофотометрією за методом Спіріна [Спирин А.С., 1958] при довжинах хвиль 260, 270, 290 нм і виражали у мкг на 10клітин [Сокурова Е.Н., 1973]. Вміст білка досліджували за методом Лоурі в модифікації Міллера [Miller G.L., 1959]. Як стресорні чинники були обрані температурний і осмотичний шок. Тепловому шоку культуру дріжджів піддавали у водяному термостаті з температурою 45 ?С. Експозиція становила 15, 30 і 60 хвилин [Рихванов Е.Г. и др., 2001]. Для вивчення стійкості клітин дріжджів до осмотичного шоку в культуру дріжджів вносили NaCl до кінцевої концентрації 1,3 М [Albertyn J. et al., 1994]. Експозиція становила 15, 30 і 60 хвилин. Стійкість культур дріжджів оцінювали за кількістю мертвих клітин, пофарбованих барвником трипановим синім. Продуцентами ферментного комплексу були міцеліальні гриби Chaetomium globossum Kunze:Fr., Trichoderma viride Pers.et Harz., Bipolaris sorokiniana Sacc.et Shoem., та Fusarium sp. Статистичну обробку нормально розподілених даних проводили за допомогою методу Стьюдента-Фішера [Лакин Г.Ф., 1990]. Рангову кореляцію обчислювали за Спірманом.

Основні результати та їх обговорення

Зміна деяких морфофункціональних характеристик у процесі тривалого культивування дріжджів. Старіння клітинних культур внаслідок численних пересаджень, яке веде за собою зміну вихідних характеристик - це загальнобіологічна проблема, що стосується як культур мікроорганізмів, так і рослинних та тваринних клітин. Разом з тим, у наукових дослідженнях і на виробництві часто застосовується тривале й інтенсивне пасирування культур, що може вести до морфофункціональних зрушень у клітинах, обумовлених накопичуванням різних генетичних модифікацій [Божков А.И. и др., 2000; Голтвянский А.В., 2004], внаслідок чого культура клітин втрачає свої вихідні характеристики. Дослідження інтенсивності вторинного метаболізму, про яке судили за вмістом ергостерину в культурі дріжджів, при тривалому інтенсивному пасируванні раніше не проводилися.

Метою даного етапу досліджень було визначення вмісту ергостерину в процесі тривалого культивування дріжджів Saccharomyces cerevisiae (10-15 пасажів - популяційно-“молода” культура і 70-75 пасажів - популяційно-“стара” культура) і деяких морфофункціональних характеристик клітин дріжджів. Пересадження культури проводили кожні 14-16 днів, тобто вік популяційно-“молодої” культури становив 5-6 місяців, а популяційно-“старої” культури - 3-3,5 роки. Виходячи з цього терміни популяційно-“молода” і популяційно-“стара” культура у даному випадку відбивають саме популяційний вік культури дріжджів.

До 14-ї доби росту вміст ергостерину був порівняно невисоким в обох культурах і істотних розходжень виявлено не було. На 21 добу вміст ергостерину в популяційно-“молодій” культурі був на 23% вище, ніж у “старій” (табл. 1).

Таблиця 1 - Вміст ергостерину в клітинах популяційно-“молодої” і популяційно-“старої” культури дріжджів Saccharomyces cerevisiae у контролі та при внесенні у середовище 0,3 % етилового спирту в першу добу культивування (n=20) (середовище росту: 1% глюкоза, 0,5% сусло, 0,5% дріжджовий екстракт)

Оптимальною температурою культивування клітин дріжджів для накопичення ергостерину є 25°С: на 24 добу вміст ергостерину становив біля 20 нмолей на 10клітин. При культивуванні дріжджів при 30°С кількість ергостерину незначно зростала (мал. 5), однак кількість мертвих клітин у культурі збільшувалась .

Внесення іонів кальцію при рості культури дріжджів при неоптимальному для накопичення стеринів режимі вело до збільшення накопичення ергостерину клітинами дріжджів тільки у випадку росту при температурі 20°С. При культивуванні клітин дріжджів при температурі 35°С наявність іонів кальцію в середовищі не тільки не призводила до підвищення вмісту ергостерину, а навіть знижувала його на 12%.

Мал. 5. Вміст ергостерину в клітинах дріжджів Saccharomyces cerevisiae за умов росту при різних температурних режимах (n=10)

Розробка засобів руйнування клітинних стінок дріжджів: видалення клітинних стінок дріжджів ферментним комплексом Chaetomium globossum

Клітини дріжджів широко використовуються як модельний об'єкт генетичних досліджень і як продуценти в сучасних біотехнологіях: використовуючи їх високу модифікаційну мінливість, можна одержувати широкий спектр амінокислот, вітамінів, ферментів. Однак вирішення цих задач ускладнено через ригідність клітинної стінки дріжджів, на яку припадає до 30% сухої маси клітини [Kollar R. et al., 1995]. Найбільш ефективним способом видалення клітинної стінки на даний час є ферментативний гідроліз її компонентів ферментами однієї субстратної специфічності або такими, що руйнують різні компоненти клітинних стінок одночасно. Одними з продуцентів гідролітичних ферментів є міцеліальні гриби, екзоферменти яких мають високу активність відносно компонентів клітинної стінки дріжджів [Hashem A.M. et al, 2001].

Задачами даної частини роботи були: підбір продуцентів ферментативних комплексів, що мають здатність гідролізувати клітинні стінки дріжджів, і оцінка ступеня гідролітичного розщеплення внутрішньоклітинних компонентів клітин культури дріжджів протягом їх інкубації з гідролітичними екзоферментами грибів.

У результаті попереднього скринінгу з Chaetomium globossum Kunze:Fr., Trichoderma viride Pers.et Harz., Bipolaris sorokiniana Sacc.et Shoem., та Fusarium sр. нами був відібраний міцеліальний гриб Ch. globossum Kunze, про ступінь руйнування клітин дріжджів ферментним комплексом цього гриба свідчить проведений мікроскопічний аналіз суспензії дріжджових кліти.

При порівнянні ефективності руйнування клітин дріжджів ферментним комплексом і автолізу при температурі 37°С и 50°С було виявлено, що кількість мертвих клітин і вміст білку в надосадовій рідині були значно більшими, а загальна кількість клітин і інтенсивність їх дихання - значно меншими при інкубації клітин дріжджів з екзоферментами Ch. globossum. Ефект дії підсилювався при збільшенні терміну інкубації (табл. 4).

Таблиця 4 - Кількість клітин, вміст білку й інтенсивність дихання культури клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae підданих автолізу (37°С і 50°С) і гідролізу ферментним комплексом Chaetomium globossum, після 12-и і 24-и годин інкубації (n=5)

*- Р ???0,05 у порівнянні з контролем

**- Р ???0,05 у порівнянні з автолізом при 50°С

На підставі цього можна зробити висновок про значно більшу ефективність руйнування клітинної стінки ферментним комплексом Ch. globossum.

Отримані результати можуть свідчити при руйнуватися й інші органел клітини.

Таблиця 5 - Вміст нуклеїнових кислот в осаді і надосадовій рідині при руйнуванні клітин дріжджів у результаті автолізу (37°С і 50°С) і гідролізу ферментним комплексом Chaetomium globossum (n=5)

* - Р ???0,05 у порівнянні з відповідним контролем

** - Р ???0,05 у порівнянні з відповідним автолізом при 37?С

Як критерій гідролітичного розщеплення внутрішньоклітинних компонентів використовували оцінку ступеня визвільнення нуклеїнових кислот у культуральне середовище та утворення продуктів перекисного окислювання ліпідів після автолізу і гідролізу. Кількість нуклеїнових кислот, що звільняються у культуральне середовище, при інкубації клітин з екзогенними ферментами у кілька разів перевищувала даний показник при автолізі (табл. 5).

Вміст продуктів перекисного окислення при інкубації клітин з екзогенними ферментами також перевищував такий при автолізі.

Ефективність руйнування клітинних стінок S. cerevisiae комплексом екзогенних гідролітичних ферментів Ch. globossum не залежала від віку культури дріжджів (табл. 6).

Таблиця 6 - Кількість клітин, вміст білку в надосадовій рідині й інтенсивність дихання культури клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae при автолізі (37°С і 50°С) і гідролізі ферментним комплексом Chaetomium globossum на різних фазах росту культури (n=7)

* - Р ??0,05 у порівнянні з контролем

**- Р ??0,05 у порівнянні з автолізом при 50°С

Попередній автоліз при 37?С и 50?С протягом 4 і 8 годин не підсилював глибини подальшого гідролізу клітин дріжджів, про що свідчило порівняння інтенсивності дихання суспензії, вмісту білку і нуклеїнових кислот у надосадовій рідині, а також вміст продуктів перекисного окислення ліпідів (мал. 7).

Мал. 7. Вміст продуктів перекисного окислення ліпідів (визначених за МДА) у розчині ферментного комплексу Ch. globossum (1), суспензії S. cerevisiae (2), автолізатах дріжджів при 37?С (3), і 50?С (4), після гідролізу суспензії дріжджів ферментним комплексом Ch. globossum (5) і гідролізі з попереднім автолізом при 37?С протягом 4-х (6) і 8-и (7) годин і при 50?С протягом 4-х (8) і 8-и (9) годин. (n=10)

Можливість індукції стериноутворення у дріжджів комплексом екзогенних ферментів міцеліальних грибів. У численних роботах було показане утворення комплексів стеринів із рядом органічних сполук - спиртами, фенолами, амінами, вуглеводами, білками, що знайшло практичне застосування у препаративній і аналітичній хімії стеринів [Блох К., 1983]. Здатність до комплексоутворення обумовлює велику частину біологічних функцій стеринів [Михайлова Н.П.и др., 1987]. Показано, що завдяки комплексуванню стеринів з різними клітинними отрутами, антибіотиками та іншими токсичними сполуками, знижується негативний вплив цих ксенобіотиків на живий організм. Посилення синтезу стеринів у клітинах дріжджів може бути захисним механізмом проти токсичної дії багатьох природних сполук і деяких зовнішніх впливів [Михайлова Н.П.и др., 1987].

Ми вважали, що екзометаболіти міцеліальних грибів, які здатні до руйнування клітини дріжджів, можна розглядати як стрес-фактор, що спричиняє зміну метаболізму клітини і супроводжується посиленням синтезу ергостерину.

Метою даної частини роботи було вивчення можливості індукції стериноутворення у дріжджів S. cerevisiae комплексом екзогенних ферментів гриба Ch. globossum Kunze, що культивувався на різних середовищах.

Посилення накопичення ергостерину відбувалося в перші кілька годин інкубації з культуральним фільтратом, коли руйнування і загибель клітин були мінімальні. Приріст ергостерину спостерігався при інкубації дріжджів з тими комплексами екзогенних ферментів, що приводили до максимального гідролізу клітин, тобто при рості Ch. globossum на середовищі Гетчинсона з 0,5% сухими дріжджами і на середовищі з 20% відваром жита (табл. 7).

Таблиця 7 - Вміст ергостерину, інтенсивність дихання і кількість клітин у 14-добовій культурі дріжджів Saccharomyces cerevisiae після 3-годинної інкубації з екзоферментами Chaetomium globossum (температура 37°С) (n=5)

*-Р < 0,05 у порівнянні з контролем

Збільшення терміну інкубації дріжджів з ферментними комплексами до 12-и і 24-х годин не призводило до подальшого збільшення накопичення ергостерину, а відсоток руйнування і загибелі клітин різко зростав. При 24-годинній інкубації спостерігалася тенденція до зниження вмісту ергостерину у всіх варіантах, можливо, за рахунок гідролітичного й автолітичного руйнування частини молекул ергостерину.

Очевидно, ферментні комплекси, що мають найбільшу гідролітичну активність стосовно клітинної стінки дріжджів є більш токсичними для клітини і активують у ній синтез ергостерину як стрес-відповідь. Накопичення ергостерину у даному випадку є механізмом адаптації клітини. Можливий і інший варіант: регулятори синтезу стеринів, що містяться в культуральному фільтраті Ch. globossum, впливають разом з гідролітичними ферментами, однак через кілька годин інкубації з ферментами клітини дріжджів починають руйнуватися і гинути, тому подальшого приросту стеринів не спостерігається. Можливо у даному випадку мають місце обидва механізми індукції синтезу ергостерину: і стресорний, і регуляторний. Вважаємо, що вивчення механізмів адаптації до стресорних впливів і використання грибних культур як регуляторів синтезу стероїдів у різних типах клітин мають стати важливими напрямками у сучасній біохімії.

ВИСНОВКИ

1. Накопичення ергостерину в клітинах дріжджів залежало від концентрації екзогенних джерел вуглецю і стадії росту культури, на якій вносилася ця добавка. Сумісне внесення іонів кальцію і етилового спирту забезпечувало адитивний ефект щодо накопичення ергостерину. У процесі популяційного старіння культури дріжджів спостерігалося зниження вмісту ергостерину у клітинах, що корелювало зі зменшенням діаметру клітин і збільшенням кількості мертвих клітин у культурі, також зменшувалась стійкість клітин до термічного і осмотичного шоку.

2. Найбільший вміст ергостерину в клітинах дріжджів спостерігався при культивуванні на середовищі з 25% 35% пивного сусла або при комбінації 25% сусла з 1% глюкозою. Подальше збільшення вмісту пивного сусла в середовищі супроводжувалося зниженням інтенсивності дихання клітин дріжджів і зменшенням їх стійкості до термічного і осмотичного шоку.

3. Збільшення вмісту ергостерину в клітинах дріжджів залежить не тільки від концентрації етилового спирту, але і від терміну його внесення в культуру: внесення 0,3%-го етилового спирту в першу добу росту спричиняло збільшення вмісту ергостерину до середини стаціонарної фази. Внесення тієї ж концентрації у стаціонарній фазі не приводило до збільшення вмісту ергостерину в клітинах дріжджів. Найбільший вміст ергостерину в клітинах дріжджів відзначався при концентрації етилового спирту у середовищі 2,1% - 2,4%, однак кількість мертвих клітин при цьому значно зростала.

4. Іони кальцію у концентрації 0,5 мг/мл збільшували вміст ергостерину та інтенсивність дихання клітин у культурі дріжджів. Був виявлений адитивний ефект дії іонів кальцію та етилового спирту при концентраціях 0,5 мг/мл і 1,0% відповідно щодо накопичення ергостерину клітинами дріжджів - це свідчило про регуляторний вплив етилового спирту й іонів кальцію на різних етапах біосинтезу стеринів.

5. Підвищення температури культивування до 35°С супроводжувалося зниженням вмісту ергостерину у порівнянні з культивуванням при 25?С і 30°С. Вплив іонів кальцію на накопичення ергостерину залежав від температури культивування. При підвищенні температури понад 35°С внесення іонів кальцію у культуральне середовище не приводило до збільшення накопичення ергостерину клітинами дріжджів.

6. Ефективність руйнування клітинних стінок дріжджів Saccharomyces cerevisiae комплексом екзогенних гідролітичних ферментів міцеліального гриба Chaetomium globossum не залежить від віку культури дріжджів. Попередній автоліз при 37?С и 50?С протягом 4 і 8 годин не підсилював глибини подальшого гідролізу клітин дріжджів.

7. Протягом перших годин інкубації клітин Saccharomyces cerevisiae з комплексами екзогенних гідролітичних ферментів Chaetomium globossum відбувалося збільшення накопичення ергостерину в клітинах, що свідчить про можливий адаптивний механізм накопичення ергостерину. Збільшення терміну інкубації дріжджів з ферментними комплексами до 12 і 24 годин подальшого зростання накопичення ергостерину не викликало, відсоток руйнування і загибелі клітин при цьому різко зростав.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Леонова И.С., Рыбак Л.И. Накопление эргостерина пивными дрожжами Saccharomyces cerevisiae при внесении этилового спирта на различных фазах роста культуры // Биологический вестник. - 2003. - Т.7, № 1-2. - С.84 - 87.

(Леонова І.С. отримала експериментальні дані по вмісту ергостерину, інтенсивності дихання, динаміці росту культури та кількісті мертвих клітин, проаналізувала їх та зробила статистичні розрахунки, оформила роботу).

2. Леонова И.С., Рыбак Л.И. Влияние этилового спирта и ионов Cа на содержание эргостерина в клетках Saccharomyces cerevisiae // Биологический вестник. - 2004. - Т.8, № 1. - С. 118 - 121.

(Леонова І.С. отримала експериментальні дані по вмісту ергостерину, інтенсивності дихання, динаміці росту культури та кількісті мертвих клітин, проаналізувала їх та зробила статистичні розрахунки, оформила роботу).

3. Божков А.И., Леонова И.С., Облак В.И. Удаление клеточных стенок Saccharomyces cerevisiae ферментным комплексом Chaetomium globossum Kunze // Биотехнология. - 2004. - № 6. - С. 46 - 54.

(Леонова І.С. особисто проводила експерименти по дослідженню інтенсивності дихання клітин дріжджів, динаміки росту культури дріжджів, кількості продуктів вільно-радикального окиснення ліпідів у суспензії дріжджів, приймала участь у експериментах по визначенню кількості РНК та ДНК у суспензії дріжджів, оформила роботу).

4. Падалко В.И., Леонова И.С. Возможные механизмы цитотоксического действия ионов кадмия на клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Научные исследования в наукоградах Московской области: От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям. Пущино, 11-14 ноября 2002. Труды конференции. - Пущино, 2002. - С.108.

5. Леонова И.С. Влияние ионов Са на накопление ергостерина клетками пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae при разных температурных режимах культивирования // Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии. Томск, 8-10 февраля 2004. Сборник научных трудов. - Томск, 2004. - № 3. - С. 322.