Механізми реалізації дії альфа-латротоксину як стимулятора нейросекреції

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМЕНІ О.В. ПАЛЛАДІНА

АВТОРЕФЕРАТ

МЕХАНІЗМИ РЕАЛІЗАЦІЇ ДІЇ АЛЬФА-ЛАТРОТОКСИНУ ЯК СТИМУЛЯТОРА НЕЙРОСЕКРЕЦІЇ

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НAH України.

Науковий керівник - кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник ГІММЕЛЬРЕЙХ Ніна Германівна, завідувач відділу нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НAHУ.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор МАТИШЕВСЬКА Ольга Павлівна, професор кафедри біохімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник БАБІЧ Лідія Григорівна, старший науковий співробітник відділу біохімії м'язів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ

Провідна установа - Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України, відділ нейрохімії

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розіслано 6 травня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук О.В. Кірсенко

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. З'ясування механізму здійснення синаптичної передачі посідає провідне місце серед найважливіших проблем нейробіології та є предметом особливої уваги в багатьох лабораторіях світу. Ключовим етапом передачі нервового імпульсу є вивільнення нейромедіатора в синаптичну щілину, тобто процес нейросекреції. Останнім часом було доведено, що вивільнення із нервових терміналей таких нейромедіаторів, як g-аміномасляна кислота (ГАМК), глутамат, ацетилхолін, відбувається за участю двох механізмів: Са²⁺-активованого процесу екзоцитозу - злиття синаптичних везикул із пресинаптичною мембраною, та Ca²⁺-незалежного Na⁺-залежного процесу вивільнення медіаторів із цитозольного пулу за участю специфічних транспортерів медіаторів, локалізованих у плазматичній мембрані.

Унікальним інструментом вивчення процесу нейросекреції є б-латротоксин (---LTX), основний токсичний компонент отрути павука каракурта (Latrodectus mactans tredecimguttatus). Внаслідок специфічного зв'язування з Ca²⁺-залежним (нейрексин Іб) або з Ca²⁺-незалежним (латрофілін/CIRL) рецепторами, локалізованими на пресинаптичній мембрані, токсин стимулює потужне вивільнення нейромедіаторів із нервових терміналей як за наявності, так і за відсутності позаклітинного Са²⁺ в експериментах in vitro. Але, незважаючи на досить високий інтерес науковців до дослідження ---LTX, механізм його секретогенної дії ще не до кінця з'ясований. Тому нові дані, одержані в результаті даного дослідження, матимуть важливе значення для розвитку уявлень про механізм нейротоксичної дії ---LTX зокрема і механізму нейросекреторного процесу взагалі.

Результати багатьох попередніх досліджень свідчать, що стимуляція нейросекреції внаслідок зв'язування б-LTX з двома різними рецепторними білками на пресинаптичній мембрані відбувається із залученням тих самих механізмів екзоцитозу, які задіяні й у потенціалзалежному вивільненні медіаторів. Але у низці лабораторій було показано, що цей токсин здатен викликати вивільнення нейромедіаторів за умов, коли екзоцитоз не може бути стимульований ані потенціалом дії, ані кальцієвими іонофорами, ані гіпертонічним розчином сахарози. Очевидно, ефект б-LTX передбачає обхід деяких етапів, наявних у звичайному механізмі нейросекреції, викликаному потенціалом дії.

Досі нез'ясованим залишається питання, чи приєднання токсину до різних рецепторів залежно від присутності чи відсутності Ca²⁺ в середовищі стимулює реалізацію одного чи різних механізмів дії. Особливий інтерес дослідників викликає секретогенна дія б-LTX в безкальцієвому середовищі. Гостро дискусійним є питання щодо джерела нейротрансміттерів, вивільнення яких стимулює токсин: чи викликає він тільки екзоцитоз синаптичних везикул, чи здатен також стимулювати вихід нейромедіатора з цитозольного (невезикульованого) пулу? Якщо токсин вивільняє нейромедіатор із цитозолю, то яким є механізм цього вивільнення - через пори, які формує ---LTX у мембрані, чи через специфічний транспортер нейромедіатора на плазматичній мембрані?

Наші експерименти мали на меті з'ясувати чи може стимулювати б-LTX процес екзоцитозу, тобто вивільнення нейромедіатора з везикульованого пулу, в безкальцієвому середовищі; чи є мішенню дії токсину цитозольний пул нейромедіатора, і якщо так, то яким є механізм вивільнення медіатора з нього під дією токсину.

Мета дослідження полягала у з'ясуванні механізму секретогенної дії б-латротоксину, зокрема встановленні залежності ефекту токсину від наявності або відсутності позаклітинного Са²⁺ (а отже, від типу рецептору, з яким зв'язується токсин), а також участі двох пулів нейромедіатора - везикульованого та цитозольного - в реалізації секретогенної дії б-LTX. Відповідно до цього були поставлені такі задачі дослідження:

Дослідити вплив б-LTX на вивільнення ГАМК із нервових терміналей (синаптосом) головного мозку щурів за умов виснаження цитозольного пулу ГАМК шляхом: а) пермеалізації синаптосом дигітоніном; б) гетерообміну нейромедіатора з конкурентними інгібіторами ГАМК-транспортера плазматичної мембрани - ніпекотиновою кислотою або 2,4-діамінобутиратом.

Дослідити вплив б-LTX на вивільнення ГАМК за умов модулювання процесу екзоцитозу інгібіторами протеїнфосфатаз - окадаєвою кислотою та циклоспорином А.

Дослідити вплив б-LTX на вивільнення ГАМК за умов пригнічення екзоцитозу інгібітором ФІ 4-кінази феніларсен оксидом.

Дослідити вплив б-LTX на вивільнення ГАМК за умов виснаження везикульованого пулу нейромедіатора шляхом деполяризації синаптичних везикул за допомогою: а) протонофора FCCP; б) специфічного інгібітора Н⁺-АТФази синаптичних везикул - бафіломіцина А₁ .

Дослідити вплив б-LTX на вивільнення ГАМК за умов інгібування ГАМК-транспортера плазматичної мембрани його несубстратним блокатором NO-711.

Наукова новизна одержаних результатів. Застосовуючи різні підходи, які полягали у використанні агентів, які впливають на цитозольний або везикульований пули ГАМК, було показано, що:

---латротоксин як в присутності Са²⁺, так і в безкальцієвому середовищі здатен стимулювати екзоцитоз синаптичних везикул;

токсин викликає вихід ГАМК із цитозольного пулу, причому ця його здатність не залежить від фактору наявності Са²⁺ в позаклітинному середовищі;

механізм реалізації секретогенної дії ---LTX певною мірою залежить від використаної концентрації токсину: у високій концентрації він значно ефективніше стимулює вихід нейромедіатора із невезикульованого пулу;

вперше показано, що вивільнення ГАМК із цитозолю під впливом ---LTX відбувається через ГАМК-переносник плазматичної мембрани;

розвиток секретогенної дії ---LTX відбувається у два етапи - спочатку (протягом перших 2 хв дії токсину) відбувається екзоцитоз, пізніше (на 5-10 хв дії ---LTX) нейромедіатор починає виходити із цитозолю.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дані щодо механізму реалізації дії б-LTX як стимулятора нейросекреції мають передусім фундаментальне значення, оскільки дозволяють доповнити сучасні уявлення про механізми функціонування нервової клітини. Результати цієї роботи можуть бути використані для створення фармакологічних препаратів, які специфічно впливають на процес передачі нервового імпульсу, тобто становлять і прикладний інтерес.

Особистий внесок здобувача. Автор виконувала експериментальну частину роботи, здійснювала підбір та обробку літературних даних. Аналіз, обробка та обговорення результатів були проведені спільно з науковим керівником. Друковані праці підготовані за безпосередньої участі автора.

Структура дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 151 сторінках друкованого тексту. Робота складається з вступу, огляду літератури, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків, списку літератури з 302 джерел, 39 рисунків, 1 таблиці.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися на:

Поглибленій школі для молодих фізіологів з проблем клітинних мембран та сигнальних систем, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця, Київ, 2000;

Літній школі "Фармакологія синаптичної передачі в нервовій системі", Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця, Київ, 2002;

Школі з нейронаук товариства IBRO, Вроцлав, Польща, 2002;

4-ій Парнасівській конференції ''Молекулярні механізми активації клітини: біологічні сигнали та їхні ферменти-мішені", Вроцлав, Польща, 2002;

4-ій Конференції із сигнальних систем клітини, Дубровнік, Хорватія, 2004;

Поглибленій школі з нейронаук товариства IBRO, Ялта, Крим, 2004;

конференціях-конкурсах молодих учених у 2001-2002 рр. та на семінарах в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ.

Публікації. Результати досліджень опубліковані в 5 статтях у наукових фахових виданнях та 6 тезах доповідей у збірках наукових конференцій.

Матеріали і методи досліджень

Дослідження виконані на щурах (самці вагою 100-120 г). У декапітованих тварин швидко вилучалися великі півкулі головного мозку. Синаптосоми виділяли з гомогенату великих півкуль шляхом диференційного центрифугування та центрифугування в градієнті фіколла за методом Котмана (Cotman, 1974). Фракцію синаптосом суспендували в стандартному сольовому розчині, що містив (мM): NaCl - 126, KCl - 5, MgCl₂ - 1.4, NaH₂PO₄ - 1.0, HEPES - 20 (pH 7.4), d-глюкозу - 10, амінооксиоцтову кислоту (інгібітор ГАМК-трансамінази) - 0.1. Сольовий розчин насичували O₂ перед використанням. Усі операції проводили при 0-4⁰С. Концентрацію білка визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951) у модифікації Ларсона (Larson et al., 1986).

Синаптосоми (2 мг білка/мл) навантажували [³H]ГАМК у стандартному сольовому розчині, що містив 1 мМ кальцію. Синаптосоми, відмиті шляхом центрифугування від [³H]ГАМК, яка не захопилася, та від Са²⁺, суспендували в номінально безкальцієвому стандартному сольовому розчині. Препарат (1мг білка/мл) використовувався для досліджень одразу і не довше 4 год після виділення.

Кількість вивільненої [³H]ГАМК визначали в супернатантах і в SDS-розчинених осадах шляхом вимірювання радіоактивності у сцинтиляційній рідині AСS на лічильнику Delta 300 (“Tracor Analytic”, США). Вміст [³H]ГАМК у супернатантах вира-жався у відсотках від загальної кількості мітки у синаптосомах. Вивільнення [³H]ГАМК із синаптосом, преінкубованих без стимулювальних агентів в Ca²⁺-вмісному або без-кальцієвому середовищі, приймалося за базальне вивільнення. Стимульоване вивіль-нення [³H]ГАМК обчислювали як різницю між кількістю [³H]ГАМК, що вивільняється під впливом стимулювальних агентів, і базальним вивільненням.

Для перемеалізації брали навантажені [³H]ГАМК синаптосоми протягом 2 год після навантаження. Синаптосоми, суспендовані у номінально безкальцієвому стан-дартному сольовому розчині з 2 мM АТФ, обробляли 20 мкг/мл дигітоніном протягом 5хв при 25⁰С. Потім на препараті досліджували стимульоване вивільнення [³H]ГАМК.

Зміни трансмембранного потенціалу синаптосом реєстрували, вимірюючи флуоресценцію катіонного потенціалчутливого зонду родаміну 6G на спектрофлуориметрі Hitachi MPF-4 (Японія) у термостатованій кюветі при постійному перемішуванні. Довжини хвиль збудження і флуоресценції були 528 нм і 551 нм, відповідно.

Статистична обробка даних проводилась за загальновизнаними методами варіаційної статистики за допомогою ПК. Всі чисельні значення результатів досліджень наводились у вигляді ± середньоквадратичне відхилення (SEM). Після кожного результату наводиться значення кількості експериментів (n). Достовірність статистичних відмінностей для груп даних досліджень визначалася за допомогою Стьюдент тесту (t-тесту). Критерієм достовірності відмінностей було значення р 0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Для дослідження особливостей механізмів стимуляції б-латротоксином нейросекреції було обрано декілька експериментальних стратегій: в синаптосомах змінювали кількість нейромедіатора у везикульованому пулі або в цитозолі, або пригнічували екзоцитоз різними агентами, також комбінували ці підходи, і потім досліджували особливості дії б-LTХ за цих умов.

Дія -LTX на синаптосоми з виснаженим цитозольним пулом [³H]ГАМК

В рамках першої серії дослідів нашим завданням було з'ясувати, чи визначає кількість ГАМК у цитозолі відповідь синаптосом на дію б-LTХ. Загальний підхід полягав у тому, щоб виснажити цитозольний пул [³H]ГАМК шляхом пермеалізації синаптосом або використовуючи конкурентні інгібітори ГАМК-транспортера (НК і 2,4-ДАМК), і після цього виміряти Ca²⁺-залежне і Ca²⁺-незалежне LTХ-стимульоване вивільнення [³H]ГАМК. Якщо джерелом медіатору є цитозоль, то логічно припустити, що виснаження цього пулу має спричинити відповідне послаблення виходу нейромедіатора.

В результаті проведених дослідів ми встановили, що для пермеалізованих дигітоніном синаптосом необхідна наявність екзогенного АТФ для підтримання протонного градієнту синаптичних везикул і здатності їх до екзоцитозу у відповідь на зростання [Са²⁺]_i. Додавання б-LTХ до синаптосом, пермеалізованих у базкальцієвому буфері, спричиняє швидке вивільнення [³H]ГАМК, що є більшим за присутності АТФ, аніж за його відсутності. Вивільнення відбувається і у середовищі з ЕГТА, отже ефект токсину може розвиватися і за дуже низьких концентрацій Са²⁺.

Для того, щоб з'ясувати, чи за цих умов зв'язується б-LTХ специфічно з Са²⁺-незалежним рецептором, були проведені експерименти з конканаваліном А. Цей лектин практично не змінює здатність токсину приєднуватися до рецепторів, але пригнічує нейросекрецію, стимульовану б-LTХ. Преінкубація з ConА майже повністю інгібує здатність токсину вбудовуватися до плазматичної мембрани. Крім того, після зв'язування із мембранним рецептором б-LTХ піддається конформаційним змінам, яким і перешкоджає ConА (Khvotchev &Sudhof, 2000). В наших дослідах, коли синаптосоми перед пермеалізацією обробляли 5мкМ ConА, 1 нМ токсин за таких умов не викликав вивільнення [³H]ГАМК. Отже, можна зробити припущення, що нейросекреція, стимульована б-LTХ з пермеалізованих синаптосом у середовищі, вільному від Са²⁺, є результатом специфічного впливу токсину на процес екзоцитозу. Це узгоджується і з даними інших дослідників (Bittner&Holz, 2000).

Наступними були проведені досліди з конкурентними інгібіторами зворотного захоплення ГАМК. Отримані результати свідчать, що НК і 2,4-ДАМК ефективно виснажують цитозольний пул [³H]ГАМК. Після додавання до навантажених синаптосом цих агентів відбувається гетерообмін нейромедіатора з ними, внаслідок чого спостерігається значне зростання кількості позасинаптосомальної мітки.

Водночас, виснаження цитозольного пулу [³H]ГАМК має різні наслідки для дії - LTХ. За таких умов у механізмі дії субнаномолярної та наномолярної концентрацій токсину спостерігаються істотні відмінності. Після зменшення цитозольного пулу [³H]ГАМК секретогенний ефект 3нМ ---LTХ (концентрація, що перевищує К_д токсин-рецепторного комплексу) був у 2 -3 рази слабшим за контроль. Причому результати таких дослідів були подібними, незалежно від наявності в середовищі Ca²⁺, а отже і від типу залученого рецептора токсину.

В той же час, із синаптосом з виснаженим цитозольним пулом [³H]ГАМК вивільнення, викликане 0.5 нМ токсином, було навіть трохи вищим за контроль. Це можна пояснити конкурентним блокуванням НК зворотного входу [³H]ГАМК. Результати цих експериментів були подібними, незалежно від наявності в середовищі Ca²⁺. Логічно було припустити, що у субнаномолярній концентрації (нижчій за К_д комплексу токсин-рецептор) ---LTХ не викликає помітного виходу цитозольної ГАМК.

Таким чином, механізм вивільнення ГАМК, скоріш за все, не визначається наявністю чи відсутністю Са²⁺ в середовищі (а отже, і типом рецептора, до якого приєднується токсин). Експерименти вказували на можливість того, що під дією токсину ГАМК виходить із цитозолю. Варто було продовжити дослідження із застосуванням підходу, який би міг підтвердити та поглибити зроблені висновки.

2. Вплив ---латротоксину на синаптосоми за умов модулювання процесу екзоцитозу синаптичних везикул інгібіторами протеїнфосфатаз.

Відомо, що багато білків, які беруть участь у здійсненні процесу екзоцитозу, регулюються шляхом фосфорилювання-дефосфорилювання. Ми обробляли синаптосоми інгібіторами основних серинових/треонінових протеїнфосфатаз (ПФ) - 1, 2А і 2В, щоб порівняти, чи однаково потребують активності певних ПФ для своєї секретогенної дії 4-амінопіридин (стимулятор Са²⁺-залежного екзоцитозу) та ---LTХ.

В наших експериментах 1мкM окадаєва кислота (інгібує ПФ 1 та 2А) помітно пригнічувала секретогенний ефект 2мM 4-амінопіридина. 1мкM циклоспорин А (інгібітор ПФ 2B), навпаки, посилював екзоцитоз, стимульований 4-амінопіридином. Отже, ПФ 1, 2А та 2В є важливими для цього процесу. Це узгоджується і з висновками інших дослідників (Baldwin et al., 2003). Як 1мкM ОК, так і 10мкM CsА посилювали стимулювальну дію ---LTХ. Це свідчить про те, що механізми нейросекреції, викликаної токсином і 4-амінопіридином, мають певні відмінності.

Окремо варто зазначити, що по-перше, ефекти обох агентів на дію токсину були однаковими середовищах з Са²⁺ та без Ca²⁺. По-друге, чим нижчою була використана концентрація ---LTХ, тим помітнішою була активація CsА нейросекреції, стимульованої ---LTХ. Можливо, що у випадку високих концентрацій токсину зростав внесок процесу витікання ГАМК із цитозолю (нечутливе до дії інгібітора ПФ).

3. Дія ---LTX за умов інгібування процесу екзоцитозу інгібітором ФІ 4-кінази феніларсен оксидом

Наступна серія експериментів була проведена на синаптосомах, в яких було пригнічено синтез фосфатидилінозитол-4,5-дифосфату, який є однією з молекул, важливих для здійснення екзоцитозу. Для цього був використаний інгібітор ФІ4-кінази (а зрештою, і процесу екзоцитозу) феніларсен оксид (ФАО). Завданням був детальний аналіз дії ФАО на вивільнення [³H]ГАМК, стимульоване деполяризацією 4-АП або різними концентраціями ---LTХ.

ФАО майже повністю пригнічував нейросекрецію, стимульовану як деполяризацією 4-АП (тобто екзоцитоз), так і субнаномолярною концентрацією токсину. Це можна було розглядати, як ще одне підтвердження того, що основна дія низьких концентрацій токсину - стимуляція екзоцитозу. Чутливість до ФАО ---LTХ-стимульованого екзоцитозу не залежала від наявності Са²⁺ в позаклітинному середовищі.

Цікаво, що чим вищою була концентрація токсину, тим меншою ставала чутливість його впливу до ФАО (так само, як і до циклоспорину А в попередніх експериментах). Отже, із зростанням концентрації токсину в реалізації його дії зростає внесок фактора, нечутливого до ФАО. Цим фактором може бути пасивний вихід нейромедіатора через пори, сформовані токсином у плазматичній мембрані, або вихід внаслідок оберненої роботи ГАМК-транспортера плазматичної мембрани.

Припущення про цитозольне джерело вивільнюваної ---латротоксином ГАМК підтвердили результати подальших експериментів, в яких вплив ФАО вивчався на синаптосомах з попередньо виснаженим цитозольним пулом медіатора. В препараті, обробленому ніпекотиновою кислотою, [³H]ГАМК представлена в основному везикульованим пулом, на який і діє інгібітор. За цих умов чутливість до ФАО нейросекреції, стимульованої і високою, і низькою концентраціями ---LTХ, було подібною. Це свідчить про те, що чутливість до ФАО виявляє лише процес екзоцитозу. І "внесок" екзоцитозу до дії токсину в даному разі, швидше за все, є практично однаковим, незалежно від концентрації -LTХ.

Важливо зазначити, що в усіх проведених експериментах інгібітор діяв на вихід [³H]ГАМК, викликаний токсином, незалежно від присутності позаклітинного Са²⁺. Отже, фактор наявності Са²⁺ в середовищі не визначає здатності токсину вивільнювати нейромедіатор із цитозолю. Найбільш імовірно, що інтенсивність витікання медіатору залежить лише від кількості утворених у мембрані--латротоксинових каналів, що в свою чергу залежить від використаної концентрації токсину.

Ці результати суперечать висновкам Ashton et al. (2001), які припустили, що в лише безкальцієвому середовищі--відбувається вихід нейромедіаторів із цитозольного пулу через латротоксинові пори. Але узгоджуються з даними Hlubek et al. (2000), Volynski et al. (2000), які показали, що проникні властивості згаданих пор визначає сама молекула токсину, а не тип рецептора (до Са²⁺-залежного нейрексину 1 чи до Са²⁺-незалежного латрофіліну), до якого вона приєдналась.

4. Відповідь на -LTX синаптосом з виснаженим везикульованим пулом ГАМК

Наступний етап досліджень передбачав проведення експериментів на синаптосомах зі зміненим везикульованим пулом ГАМК. Ми використали агенти, які, викликаючи активний вихід нейромедіатора з синаптичних везикул, спричиняють його перерозподіл між везикульованим та цитозольним пулами, збільшуючи вміст останнього. Це були протонофор FCCP та інгібітор Н⁺-АТФази синаптичних везикул бафіломіцин А_1. Якщо дія -LTХ спрямована на різні пули, то можна припустити, що такий перерозподіл [³H]ГАМК змінюватиме співвідношення між внесками кожного з механізмів дії токсину.

У всіх попередніх дослідженнях ми вимірювали вивільнення [³H]ГАМК, стимульоване 0.5 нМ -LTХ за час, що не перевищував 5 хв. В експериментах із FCCP продовження інкубації з -LTХ до 10 хв дозволило виявити певні особливості механізму дії токсину, пов'язані з виходом [³H]ГАМК з невезикульованого пулу. Виснаження везикул і, відповідно, збагачення цитозольного пулу нейромедіатора спричиняло зникнення (або значне зниження) вивільнення [³H]ГАМК, що спостерігається протягом перших 2 хв дії -LTХ, але вже на 5-тій та особливо на 10-тій хв кількість вивільненої мітки різко зростала.

Кінетика процесу в експериментах з FCCP відрізнялася залежно від використаної концентрації токсину. Максимум активності токсину, пов'язаної зі стимулюванням екзоцитозу, спостерігався протягом перших 2 хв для всіх концентрацій -LTХ, але момент початку другої стадії вивільнення нейромедіатора залежав від використаної концентрації токсину. Для наномолярного -LTХ він майже збігався з моментом закінчення першої стадії, а для субнаномолярного - наставав лише на 5-ту хв.

Досліди з макролідним антибіотиком бафіломіцином А₁ підтвердили, що на різних етапах дії -LTХ реалізуються різні механізми вивільнення [³H]ГАМК. Нейросекреція, що відбувається протягом перших 2 хв дії токсину була дуже чутливою до бафіломіцина А₁, що свідчило про те, що на цьому етапі вихід [³H]ГАМК відбувається шляхом екзоцитозу. Другий етап (через 5 хв дії -LTХ) характеризувався практичною нечутливістю до дії використаного інгібітора, вказуючи на інше джерело вивільнюваної [³H]ГАМК - цитозоль. Важливо зазначити, що були отримані практично ідентичні результати в середовищі з Са²⁺ та без Са²⁺. Це підтверджує наші попередні висновки про те, що -LTХ не потребує наявності позаклітинного Са²⁺ для стимуляції вивільнення нейромедіатора.

Якщо -LTХ вивільняє ГАМК із цитозолю, то постає логічне питання: яким є механізм такого виходу. Одним з можливих шляхів є витікання ГАМК через пори, які формує токсин у плазмалемі. Іншим імовірним механізмом є обернена робота ГАМК-транспортера плазматичної мембрани. Участь цього транспортера у відповіді синаптосом на -LTХ на сьогодні є зовсім недослідженою.

Щоб з'ясувати це питання ми використали NO-711, несубстратний блокатор ГАМК-переносника плазматичної мембрани, який пригнічує як вхід, так і вивільнення нейромедіатора, зупиняючи транспорт ГАМК на проміжному етапі.

Проведені експерименти з інгібітором NO-711 підтвердили, що ГАМК-транспортери залучені -LTХ-стимульованого вивільнення [³H]ГАМК, а точніше до другого етапу цього процесу (після 2 хв дії токсину). NO-711 пригнічував вивільнення [³H]ГАМК, стимульоване як низькими, так і високими концентраціями -LTХ. Хоча кінетика цього процесу відрізнялася для різних концентрацій токсину. латротоксин нейромедіатор екзоцитоз

Для того, щоб секретогенна дія -LTХ ставала чутливою до блокатора ГАМК-транспортера, у всіх експериментах необхідний був деякий час, який залежав від концентрації токсину. Протягом цього лаг-періоду, ймовірніше за все, відбувається формування токсинових пор у клітинній мембрані, а тривалість цього процесу залежить від концентрації -LTХ (Гиммельрейх и др., 1990). З одного боку, вхід через ці пори дивалентних катіонів викликає швидку деполяризацію пресинаптичної мембрани, що може бути достатнім для помітного виходу ГАМК завдяки оберненій роботі ГАМК-переносників. З іншого - через дані пори, які проникні також і для невеликих молекул, може частково витікати і вільна цитозольна ГАМК. Цим можна пояснити неповне пригнічення NO-711 виходу [³H]ГАМК, стимульованого 0.5нМ LTХ. Таким чином, токсинові пори можуть відігравати подвійну роль в цьому процесі - пряму і непряму. Хоча не можна відкидати і можливість безпосередньої взаємодії молекули -LTХ та мембранного переносника нейромедіатора.

Висновки

Латротоксин завдяки своїй здатності стимулювати потужне вивільнення нейромедіаторів з пресинаптичних нервових закінчень є широко вживаним інструментом для фундаментальних досліджень нейросекреції. Особливий інтерес викликає секретогенна дія -LTX в середовищі без Са²⁺. Гостро дискусійним є питання щодо здатності токсину залучати до секреторного процесу цитозольний (невезикульований) пул нейротрансмітерів, а також щодо того, як реалізується така дія токсину. Розв'язання цієї проблеми вимагає застосування нових методичних підходів.

Показано, що б-LTХ здатен специфічно стимулювати процес екзоцитозу у вільному від Са²⁺ середовищі за умов виснаження цитозольного пулу ГАМК внаслідок пермеалізації синаптосом дигітоніном.

З використанням конкурентних інгібіторів транспортера ГАМК (ніпекотинової кислоти та 2,4-діамінобутирату), які модулюють вміст ГАМК у цитозольному пулі шляхом гетерообміну, продемонстрована здатність б-LTХ стимулювати вивільнення ГАМК за рахунок не лише активації екзоцитозу, але і залучення вільного цитозольного нейромедіатора

Досліджено секретогенну дію -LTX за умов модулювання процесу екзоцитозу інгібіторами протеїнфосфатаз. Показано, що окадаєва кислота (інгібує ПФ 1 та 2А) та циклоспорин А (інгібує ПФ 2В) посилюють стимулювальну дію -LTХ. Чутливість до циклоспорину А знижується із зростанням використаної концентрації б-LTХ (тобто із залученням цитозольної ГАМК до процесу секреції). Водночас, окадаєва кислота помітно пригнічує секретогенний ефект 4-амінопіридину, а циклоспорин А, навпаки, його підвищує. Отже, механізми нейросекреції, викликаної токсином і 4-АП, певним чином відрізняються.

Вивчено дію -LTX за умов інгібування ФІ-4-кінази (важливої для здійснення екзоцитозу) феніларсен оксидом. Показано, що ФАО відчутно пригнічує секрецію, стимульовану субнаномолярним -LTX, або у разі дії токсину на синаптосоми з виснаженим цитозольним пулом ГАМК (у цих випадках дія -LTX реалізується шляхом екзоцитозу). Дія високих концентрацій -LTX, які спричиняють не лише стимуляцію екзоцитозу, мало чутлива до ФАО. Залежність ступеню інгібування секреторного процесу від концентрації -LTX ? ще одне свідчення здатності токсину індукувати різні шляхи вивільнення нейромедіатора.

Вивчено, як впливає перерозподіл ГАМК між везикульованим і цитозольним пулами на розвиток секретогенної дії -LTX. Показано, що внаслідок виснаження везикул протонофором FCCP (в середовищі без Са²⁺) або бафіломіцином А₁ (в присутності та відсутності Са²⁺) відбувається зникнення або пригнічення першого швидкого (перші 2 хв) та значне посилення пізнішого етапу (на 5-10 хв) секреторної дії -LTX (як у низькій, так і у високій концентрації). Це свідчить про залучення різних механізмів вивільнення ГАМК на різних етапах розвитку процесу: екзоцитозу на першому етапі та витікання ГАМК із цитозолю - на другому.

Вперше одержані прямі докази участі ГАМК-транспортера плазмалеми у вивільненні ГАМК під дією -LTX. Продемонстровано, що блокування транспорту ГАМК несубстратним інгібітором NO-711 пригнічує другий етап розвитку секретогенної дії токсину. Отже, саме на пізнішому етапі відповіді синаптосом відбувається залучення -латротоксином цитозольного пулу ГАМК, а її вихід із цитозолю відбувається (принаймні частково) шляхом оберненої роботи переносника ГАМК.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Storchak L.G., Kravchuk (Linetska) M.V., Himmelreich N.H. Ocadaic acid and cyclosporin A modulate [³H]GABA release from rat brain synaptosomes // Neurochemistry Int. - 2001. - Vol. 38. - P. 445-451.

2. Linetska М.V., Storchak L.G., Himmelreich N.H. Does extracellular calcium determine what pool of GABA is the target for -latrotoxin? // Neurochemistry Int. - 2002. - Vol. 40. - P. 387-395.

3. Лінецька М.В., Сторчак Л.Г., Гіммельрейх Н.Г. Вплив виснаження цитозольного пулу [³H]ГАМК у синаптосомах на секретогенну дію -латротоксину // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74. - №3. - С. 65-73.

4. Linetska М.V., Storchak L. G., Himmelreich N. H. Phenylarsine oxide inhibits alpha-latrotoxin-stimulated [³H]GABA release from rat brain synaptosomes. - Neurochemistry Int. - 2003. - Vol. 42. - №7. - P. 583-590.

5. Linetska М.V., Storchak L.G., Tarasenko A.S., Himmelreich N. H. Involvement of membrane GABA transporter in -latrotoxin-stimulated [³H]GABA release // Neurochemistry Int. - 2004. - Vol. 44. - P. 303-312.

6. Kravchuk (Linetska) M.V. and Storchak. L.G. A phosphatase 2B inhibitor, cyclosporin A, potentiates -latrotoxin-induced [³H]GABA release from the rat brain synaptosomes // Neurophysiology. - 2000. - Vol. 32. - N 2/3. - P. 199.

7. Linetska M.V., Storchak L.G., Himmelreich N.H. Depolarization- and -latrotoxin-induced [³H]GABA release from the rat brain synaptosomes: effect of phenylarsine oxide // Neurophysiology. - 2002. - Vol. 34. - N 2/3. - P. 187.

8. Linetska M.V., Storchak L.G., Himmelreich N.H. Phenylarsine oxide inhibits exocytotic [³H]GABA release from the rat brain synaptosomes / Thesis of the 4^th Parnas Conference, September 15-18, 2002, Wroclaw. - P. 50.

9. Лінецька М.В., Сторчак Л.Г., Гіммельрейх Н.Г. Вивільнення [³H]ГАМК з синаптосом мозку щурів під впливом деполяризації та б-латротоксину: ефект феніларсин оксиду // Укр. біохім. журн. / Спец. випуск "Матеріали VIIІ Укр. біохім. з'їзду 1-3 жовтня 2002 р., м. Чернівці" - 2002. - Т. 74. - N 4a (додаток 1). - С. 56.

10. Linetska М.V., Storchak L.G., Himmelreich N. H. Inhibitor of phosphatidylinosytol 4-kinase modulates depolarization- and -latrotoxin-induced [³H]GABA release from rat brain synaptosomes // Abstracts of FEBS Lecture Course on Cellular Signaling & 4^th Dubrovnik Signaling Conference, Dubrovnik-Cavtat, May 21-27, 2004. - P. 98.

11. Linetska М.V., Storchak L.G., Himmelreich N. H. Plasma membrane GABA transporter is involved in alpha-latrotoxin-evoked [³H]GABA release // Abstract book of IBRO Advanced School of Neuroscience, Yalta, Crimea, Sept. 16-28, 2004. - P. 24.

Лінецька М.В. "Механізми реалізації дії альфа-латротоксину як стимулятора нейросекреції". - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2005.

Дисертацію присвячено з'ясуванню механізму вивільнення нейромедіатора з нервових закінчень головного мозку щурів, індукованого б-латротоксином (б-LTX) - основним компонентом отрути павука каракурта. Досліджено механізм дії токсину за наявності або відсутності позаклітинного Са²⁺. Показано участь двох пулів ГАМК - везикульованого та цитозольного - в реалізації секретогенної дії б-LTX. З'ясовано, що механізм дії б-LTX певною мірою залежить від концентрації токсину: у високій концентрації він значно ефективніше стимулює вихід нейромедіатора із невезикульованого пулу. Вперше одержані дані щодо участі ГАМК-переносника плазматичної мембрани у вивільненні ГАМК під дією -LTX.

Линецкая М.В. "Механизмы реализации действия альфа-латротоксина как стимулятора нейросекреции". - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. О.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена выяснению механизма освобождения нейромедиатора из нервных окончаний головного мозга крыс, индуцированного б-латротоксином (б-LTX) - основным компонентом яда паука каракурта. Изучен механизм действия токсина в присутствии или отсутствии внеклеточного Са²⁺. Показано вовлечение двух пулов ГАМК - везикулированного и цитозольного - в реализацию секретогенного действия б-LTX. Доказано, что механизм действия б-LTX определённым образом зависит от концентрации токсина: в высокой концентрації он значительно эфективнее стимулирует выход нейромедиатора из невезикулированного пула. Впервые получены данные об участии ГАМК-переносчика плазматической мембраны в высвобождении ГАМК под действием -LTX.

Linetska M.V. " -Latrotoxin as stimulator of neurosecretion: mechanisms of action". - Manuscript.

Thesis for a candidate degree in biological sciences, 03.00.04 - Biochemistry. - Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

The study was concentrated on mechanism of neurotransmitter release from nerve terminals induced by -latrotoxin (б-LTX) - the major component of black widow spider venom. Rat brain synaptosomes were employed to investigate the mechanism of б-LTX action in the presence and absence of extracellular Ca²⁺. Different experimental approaches were used to examine the participation of the two pools of [³H]GABA (vesicular and cytosolic) in the realisation of secretogenic action of -LTX.

The effect of LTX was studied under conditions when cytosolic [³H]GABA pool was depleted either by applying competitive inhibitors of the GABA transporter, nipecotic acid (NA) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DABA), or by permeation with digitonin. It was shown that LTX is able to stimulate Ca²⁺-independent exocytosis from digitonin-permeated synaptosomes. Experiments with NA and 2,4-DABA revealed that depletion of cytosolic GABA impairs LTX-stimulated [³H]GABA release. So LTX can induce not only exocytotic release of [³H]GABA, but also outflow of the neurotransmitter from the cytosolic pool.

The other strategy was to test LTX action under conditions when exocytosis was modulated by inhibitors of enzymes, important for this process. Ocadaic acide (inhibits of protein phosphatases 1, 2A), cyclosporine A (inhibits protein phosphatase 2B) and phenylarsine oxide (inhibitor of phosphatidylinositol 4-kinase) were exploited. It was shown that [³H]GABA release evoked by the nanomolar toxin concentrations was less sensitive to this modulators, in comparison with release, evoked by subnanomolar LTX. Thus, the effect of the high LTX concentrations is likely to be due not only to stimulation of exocytosis, but also to additional factor, insensitive to modulators of exocytosis. It is reasonably to suggest that the leakage from cytosolic [³H]GABA pool could be this factor.

At the next step of research the LTX effect was studied when synaptic vesicle [³H]GABA was depleted and non-vesicular pool was enlarged. To create this conditions protonophore FCCP and bafilomycin A₁ (inhibitor of vesicle H⁺-ATPase) were used. GABA redistribution between two synaptosomal pools caused abolishment of early response to LTX (during first 2 min) and increase of tardy step (5-10 min). It could be concluded that first rapid step of toxin action reflects stimulation of vesicle exocytosis and the second tardy step is due to release of cytosolic GABA.

To determine the participation of GABA carrier in the toxin-stimulated GABA release, non-substrate high-affinity GABA transport blocker NO-711 was used. Preliminary incubation of synaptosomes with NO-711 caused no effect on the first step (2 min) of LTX action but significantly decreased second step. This means that during the tardy step of LTX action [³H]GABA releases from cytosole via GABA-transporter (at least in part). The involvement of plasma membrane GABA transporter in -LTX-stimulated GABA release was demonstrated for the first time.

Размещено на Allbest.ru