Кінетичні закономірності транспорту іонів Са в мітохондріях міометрія та вплив кофеїну на цей процес

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Гладенькі м'язи відіграють суттєву роль у забезпеченні життєдіяльності організму. Серед гладеньком'язової мускулатури важливе значення має міометрій з огляду на функцію, яку він виконує в організмі при виношуванні плоду та пологах. Вважають, що виникнення різноманітних патологій репродуктивної функції (спонтанні аборти, гіпо- і гіпертонус матки тощо) пов'язане з порушенням гомеостазу іонів Са, яким, як відомо, належить фундаментальна роль у забезпеченні контролю скоротливої активності м'яза [Burdyga T., Wray S., 2002; Бабіч Л.Г., 1999].

Внутрішньоклітинний гомеостаз Са2+ забезпечується узгодженим функціонуванням Са2+-транспортуючих систем, локалізованих у мембранних структурах клітини [Bernardi P, 1999; Lee A.K, 2005]. Ідентифікація цих систем, вивчення їхніх властивостей, особливостей регуляції транспортної активності та фізіологічної ролі у кальцієвому гомеостазі має виключно важливе значення для розуміння іонних, молекулярних та мембранних механізмів електро- та фармакомеханічного спряження в гладеньких м'язах [Kosterin S. et al, 1999; Kosterin S., 2003].

Серед субклітинних структур, що бeруть участь у внутрішньоклітинному гомеостазі Са2+, важливу роль відіграють мітохондрії (МХ). Зокрема доведено, що вони здатні регулювати цитоплазматичну концентрацію іонів Са, підтримуючи постійну амплітуду її коливань [Grubelnik V. et al, 2002]. Участь МХ у внутрішньоклітинному гомеостазі Са2+ обумовлюється їх переважним розміщенням у тих частинах клітини, де виникають локальні високі концентрації Са2+, що необхідні для активації мітохондріального Са2+-уніпортера - біля кальцієвих каналів ендо/саркоплазматичного ретикулуму (ЕР, СР) та плазматичної мембрани (ПМ) [Gunter E. et al, 2004; Rizutto R. et al, 2004].

Електрофоретична Mg2+, АТР-залежна Са2+-акумулююча система МХ характеризується високою швидкістю транспорту катіону, що разом із великою кальцієвою ємністю матриксу дозволяє цим субклітинним структурам накопичувати значну кількість Са2+ за короткий проміжок часу [Коsterin S. et al, 1994; Bernardi P., 1999; Gunter E. et al, 2004;]. Ця динамічна властивість системи енергозалежного транспорту Са2+ у МХ визначає їх особливу роль у регуляції гомеостазу цього катіону в цитоплазмі при різноманітних патологіях, що супроводжуються зростанням його концентрації в клітині [Ткачук В.А., 1999; Sward K., 2002].

Не дивлячись на те, що питання про роль МХ у підтримці внутрішньоклітинного гомеостазу іонів Са у гладеньких м'язах вже давно привертає увагу дослідників, ряд експериментальних задач потребують подальшого з'ясування. Так, важливим є дослідження динамічних закономірностей трансмембранного переносу іонів Са в МХ гладеньком'язових клітин, визначення кінетичних характеристик процесів активного та пасивного транспорту цих іонів у зазначених субклітинних структурах. Зокрема, мова йде про розрахунок такого важливого характеристичного параметру, як константа швидкості транспортного процесу k, яка не залежить від часу інкубації. З іншого боку, бракує інформації щодо закономірностей впливу різноманітних ефекторів, фізіологічно-активних та фармакологічних сполук на транспорт Са2+ в МХ гладеньких м'язів.

Клінічні спостереження свідчать про розвиток кардіосудинної патології і порушень репродуктивної функції при зловживанні напоями, що містять алкалоїд кофеїн: зокрема, встановлено зв'язок між його вживанням та підвищеним ризиком спонтанного аборту [Fenster Z. et al 1998; Fernandes O. et al, 1998; Koren G., 2000]. Така дія кофеїну може бути обумовлена його впливом на скоротливу активність гладенької мускулатури [Burdyga T. et al, 1995]. Приймаючи до уваги провідну роль Са2+ у розвитку процесу скорочення, вбачається корисним дослідити вплив даного алкалоїду на мембранозв'язані Са2+-транспортуючі системи, що беруть участь у регуляції внутрішньоклітинного гомеостазу іонів Са у гладеньких м'язах. Зокрема, для розуміння біохімічних механізмів дії кофеїну доцільним є вивчення закономірностей впливу цієї сполуки на транспорт Са2+ на рівні такої експериментальної моделі, як ізольовані субклітинні мембранні структури.

Добре відома здатність кофеїну індукувати викид іонів Са через ріанодин-, кофеїн-чутливі канали ЕР/СР [Yaras N., 2005]. На скелетних м'язах було продемонстровано не тільки вивільнення Са2+ із ретикулуму під дією кофеїну, але й пригнічення його акумуляції у внутрішньоклітинних кальцієвих депо та внаслідок цього стимуляцію м'язового скорочення Bassani R.A. et al, 1992. Втім, у ряді робіт були наведені переконливі докази, що кофеїн викликає ряд порушень функціонування МХ (пригнічення дихання, руйнування структури внутрішньої мембрани) та безпосередньо впливає на гомеостаз Са2+ у клітинах [Bruyere H. et al, 1988; Sardao V. et al, 2002]. У літературі існують експериментальні дані щодо впливу кофеїну на структурно-функціональні властивості МХ кардіоміоцитів. Мова йде за порушення структури крист, пригнічення здатності МХ окислювати сукцинат Bruyere H. et al, 1988. На кардіоміоцитах щурів було показано індукцію під дією кофеїну т. зв. мітохондріальної пори перехідної проникності (permeability transition pore, РТР) Sardao V. et al, 2002. Але вцілому дані щодо мембранних механізмів дії кофеїну, зокрема на гладенькі м'язи, в тому числі на міометрій, потребують подальшого дослідження. У статтях клінічного профілю неодноразово відмічалась залежність між вживанням вагітними кофеїну у високих концентраціях та підвищеним ризиком спонтанного аборту [Fenster Z. et al 1998; Fernandes O. et al, 1998; Koren G., 2000].

Втім, дані щодо впливу кофеїну на транспорт Са2+ в ізольованих МХ гладеньком'язових клітин практично відсутні. Зокрема, для виявлення можливої ролі цього алкалоїду в індукції РТР у МХ міометрію вбачається корисним дослідити сукупну дію кофеїну та інгібітора РТР циклоспорину А (ЦсА) [Betandier C. et al, 2004] на транспорт Са2+ у даних субклітинних структурах.

Отже, дослідження кінетичних властивостей трансмембранного обміну Са2+ у МХ міометрія, вивчення чутливості цього процесу до дії кофеїну є важливим для подальшого розвитку сучасних уявлень щодо іонних та мембранних механізмів контролю скоротливої функції матки.

Проте, необхідно відзначити, що прогрес у вивченні цих механізмів потребує вдосконалення експериментальних методів реєстрації не лише динаміки трансмембранного обміну іонів Са, але й змін у концентраціях реагентів - компонентів середовища інкубації, перш за все - АТР. На теперішній час серед розповсюджених методів визначення концентрації АТР найбільш відомим є спектрофлуориметричний метод з використанням ферменту люциферази у присутності молекулярного кисню. Даний спосіб є незручним, тому що вимагає створення спеціальних умов для проведення аналізу та наявності дорогого ферменту люциферази [T. Sakakibara, et al, 1999]. Тому перспективною є розробка нових методів, перш за все, флуоресцентних, визначення вмісту зазначеного нуклеозидтрифосфату як у водних розчинах, так і безпосередньо у МХ. Такий метод може бути корисним для подальшого вивчення спряження транспорту іонів Са з енергетичними перетвореннями, що відбуваються в цих субклітинних структурах.

Мета роботи: дослідити кінетичні закономірності трансмембранного обміну іонів Са в МХ матки щурів, його чутливість до дії кофеїну.

Головні задачі:

1. Підібрати умови для застосування Са2+-чутливого флуоресцентного зонду тетрацикліну до реєстрації акумуляції іонів Са в МХ міометрія, вивчити кінетичні властивості цього процесу.

2. Дослідити вплив кофеїну на системи активного та пасивного транспорту іонів Са в МХ міометрія.

3. Розробити флуоресцентний метод визначення концентрації АТР у водних розчинах.

1. Огляд літератури

Присвячений загальним уявленням щодо молекулярних та мембранних механізмів транспорту іонів Са в МХ. Розглянуто системи активного та пасивного транспорту Са2+ у цих субклітинних структурах, модуляцію їх активності фізіологічно-активними та фармакологічними речовинами, функціональну роль, деякі особливості транспорту Са2+ в МХ гладеньких м'язів. Розглянуто вплив кофеїну на різноманітні біохімічні процеси в клітині, особливий акцент зроблено на дослідженні ефекту кофеїну на внутрішньоклітинний гомеостаз іонів Са, зокрема - на дії алкалоїду на транспорт іонів Са у МХ гладеньких м'язів. Окрему увагу присвячено ролі кофеїну у виникненні репродуктивних патологій.

2. Методи досліджень

Фракцію МХ міометрія невагітних щурів, естрогенізованих за добу до експерименту, одержували шляхом двох послідовних центрифугувань при 1000 та 12000 g у середовищі інкубації, що містило 10 мМ HEPES (рН 7,4), 250 мМ сахарозу, 1 мМ ЕДТА. Осад ресуспендували у середовищі інкубації без ЕДТА.

Функціональну активність електрофоретичної Mg2+,АТР-залежної Са2+-транспортуючої системи МХ міометрія тестували в експериментах, що були виконані на фракції цих субклітинних структур, за допомою спектрофлуориметричного методу з використанням Са2+-чутливого зонду ТЦ (на приладах Hitachi MPF-4 (Японія), Signe-4 (Латвія), а також методом ЛКС (використовували прилад “ZetaSizer-3” Malvern Instrument (Великобританія). Контролем слугувало середовище інкубації з 10 мМ NaN3 або 1 мкМ СССР. Транспортний процес тестували як збільшення флуоресцентного сигналу ТЦ, яке гальмувалось у присутності NaN3 чи СССР, але було резистентним до наявності селективного інгібітора кальцієвої помпи ЕР/СР тапсигаргіну (0.1 мкМ).

Активність мітохондріальної Mg2+-залежної АТР-гідролази визначали спектрофотометрично, реєструючи процес гідролізу АТР по накопиченню Рі. При цьому контролем на неферментативний гідроліз АТР слугувало стандартне середовище інкубації, що не містило МХ.

Транспорт іонів Са у МХ міометрія вивчали за допомогою Са2+-чутливого зонду ТЦ методом флуоресцентної спектрофотометрії (умови проведення процесу - див. розділ “Результати та їх обговорення”). Акумуляцію Са2+ ініціювали внесенням аліквоти суспензії МХ у стандартне середовище інкубації, що містило (мМ): 10 HEPES (рН 7,4), 3 MgCl2, 0.01 CaCl2, 3 АТР, 3 сукцинат, 0.01 ТЦ; температура 37С.

У дослідах з використанням різноманітних ефекторів (Са2+-іонофор А-23187, протонофор СССР, кофеїн, ЦсА) ці речовини вносились також у контрольну кювету (із 10 мМ NaN3) у відповідній концентрації.

При дослідженні дії кофеїну на транспорт Са2+ у МХ попередньо було показано що дана сполука у використаних концентраціях (5 - 20 мМ) не впливає на рН середовища та практично не впливає на флуоресцентні властивості ТЦ. Досліди по вивченню впливу кофеїну на Mg2+,АТР-залежну акумуляцію іонів Са проводили у стандартному середовищі інкубації (див. вище), у якому попередньо розчиняли цю сполуку до потрібної концентрації (5 - 10 мМ). У дослідах з вивчення дії кофеїну у випадку його попередньої інкубації з МХ аліквоту суспензії цих субклітинних структур (об'єм 20 - 40 мкл) інкубували з 10 мМ кофеїном протягом 2 хв. за умов, які унеможливлювали транспортний процес (тобто за відсутності Mg2+, Ca2+ та АТР). При цьому кінцева концентрація мітохондріального білка після розведення у досліджуваному об'ємі становила 0,2 мг/мл, а концентрація кофеїну - 0.3 - 0.6 мМ. Транспортний процес у обох випадках ініціювали внесенням у середовище аліквоти суспензії МХ.

У дослідженні впливу кофеїну на пасивний вихід іонів Са з матриксу МХ кофеїн попередньо розчиняли у робочому буфері до концентрації 0.3 М. Аліквоту концентрованого розчину кофеїну об'ємом 50 - 100 мкл вносили у середовище інкубації (1,5 мл), що містило МХ, на 2 - 3 хвилині інкубації разом із азидом натрію. Кінцеві концентрації речовин після розведення становили: кофеїну - 10 - 20 мМ, азиду натрію - 10 мМ. У контрольні проби, які попередньо містили 10 мМ азид, також додавали азид та кофеїн у відповідних концентраціях у відповідний проміжок часу (на 2-3 хв. від моменту внесення МХ).

Концентрацію АТР у водному розчині визначали за допомогою флуоресцентного зонду 3-гідрокси-4'диметиламінофлавону (3ГАФ), який було синтезовано на кафедрі органічної хімії хімічного факультету Київського Національного Університету імені Тараса Шевченка та надано доцентом к.х.н. Пивоваренком В.Г.

Експериментальні дані були оброблені із застосуванням загальноприйнятих методів кінетичного аналізу із використанням програми Microcal Origin 5.0. При визначенні кінетичних параметрів аналізували саме азидчутливу компоненту флуоресцентної відповіді ТЦ. При аналізі кінетичних кривих у термінах необоротної хімічної реакції першого порядку типові значення коефіцієнту кореляції r становили 0,95 - 0,99.

3. Результати та їх обговорення

1. Підбір умов застосування ТЦ до реєстрації акумуляції іонів Са в МХ міометрія та вивчення кінетичних властивостей цього процесу. За даними ЛКС, збільшення ефективного діаметру МХ у середовищі інкубації, в якому відбувається акумуляція іонів Са, по відношенню до МХ у середовищі, яке не містить Са2+ або містить 10 мМ NaN3, свідчить про те, що у випадку акумуляції Са2+ відбувається набухання МХ внаслідок накопичення в них води. Внесення аліквоти суспензії МХ міометрія (кінцева концентрація - 100 мкг білка/мл) у стандартне середовище інкубації (див. “Методи досліджень”) індукувало збільшення флуоресцентної відповіді Са2+-чутливого зонду ТЦ; ця відповідь монотонно прогресувала у часі до стаціонарного значення, яке встановлювалось приблизно на 2 хв. інкубації. Ефектори, що спричиняють дисипацію мембранного потенціалу - азид натрію (10 мМ) чи СССР (1 мкМ), додані у середовище інкубації перед внесенням суспензії МХ, гальмували збільшення флуоресцентного сигналу. У подальших дослідженнях використовували саме азид- або СССР-чутливу компоненту флуоресцентної відповіді ТЦ. Чутливе до дії СССР збільшення флуоресцентної відповіді ТЦ відповідає закономірностям хімічної реакції першого порядку: маємо висококорелятивну лінеаризацію зростання СССР-чутливої флуоресцентної відповіді у часі у напівлогарифмічних координатах ln [( Imax -I)/Imax]; t (коефіцієнт кореляції r = 0.98 - 0.99). Константа швидкості збільшення флуоресцентного сигналу, яку розраховували за величиною тангенса кута нахилу лінійного графіку, становить (4,8 + 0,7) x10-2 с-1, а початкова швидкість V - 4,8 + 0,6 у.о./с (n = 8).

Як вказують наші дані, речовини, що спричиняють диссипацію Дмн+ на мітохондріальній мембрані, також викликають падіння флуоресценції Са2+-чутливого зонду за умов транзитного внесення їх у середовище інкубації. Імпульсне внесення у стандартне середовище інкубації 1мкМ СССР або 10 мМ азиду натрію на платовому значенні інтенсивності флуоресценції зонду після ініціації транспортного процесу викликає падіння флуоресцентного сигналу ТЦ. Аналіз кінетичних параметрів зменшення флуоресцентної відповіді вказує на те, що протонофор СССР індукує більш швидке її падіння, ніж азид натрію. Дійсно, значення константи швидкості k для СССР- індукованого зменшення сигналу ТЦ в два рази перевищує значення цього параметру для азид-індукованого: (8,6 ± 0,9) x 10-2 с-1 та (3,8 ± 0,2) x 10-2 с-1 відповідно. Значення початкової швидкості для СССР- та NaN3-індукованого падіння флуоресценції ТЦ становлять 8.6 ± 0.9 та 2.32 ± 0.6 у.о./c відповідно (n=3).

Виявилось, що імпульсне додавання у середовище інкубації 0,2 мкМ Са2+-іонофору А-23187 також індукувало падіння флуоресцентного сигналу ТЦ. Ми продемонстрували також, що СССР- та NaN3-чутливі складові флуоресцентної відповіді ТЦ за умов моделювання акумуляції іонів Са в МХ міометрія є нечутливими до дії тапсигаргіну (0,1 мкМ) - селективного інгібітора ЕР/СР.

Отже, вищенаведені дані вказують на те, що чутливе до гальмуючої дії протонофору СССР та азиду натрію, але резистентне до дії тапсигаргіну Mg2+,АТР-залежне оборотне збільшення флуоресцентного сигналу ТЦ віддзеркалює акумуляцію іонів Са в ізольованих МХ міометрія. Фактори дисипації мітохондріального мембранного потенціалу - протонофор СССР, азид, а також кальцієвий іонофор А-23187 індукують падіння флуоресцентної відповіді зонду, і, відповідно, вивільнення іонів Са з МХ міометрія.

З літератури відомо, що іони Mg є ефекторами Са2+-уніпортеру МХ багатьох тканин [Bernardi P. et al, 1999]. Тому важливим є дослідження закономірностей впливу цих іонів на кінетику акумуляції Са2+. За нашими даними, залежність константи швидкості k накопичення іонів Са в МХ міометрія від концентрації Mg2+ має куполоподібний характер: при відсутності іонів Мg у середовищі інкубації акумуляція Са2+ у МХ не відбувається зовсім, а із збільшенням концентрації Mg2+ до 5 мМ значення k зростає; але подальше збільшення концентрації Mg2+ до 10 мМ призводить до повного гальмування накопичення іонів Са.

Оскільки Са2+-акумулююча система МХ міометрія характеризується абсолютною субстратною специфічністю до АТР [Kosterin et al, 1994], то важливим є дослідження концентраційної залежності впливу цього нуклеозидтрифосфату на накопичення іонів Са МХ. У відсутності АТР у середовищі інкубації транспортний процес не відбувався зовсім. Із зростанням концентрації АТР від 0 до 3 мМ значення константи (k) акумуляції іонів Са збільшувалось.

Відсутність сукцинату, на відміну від АТР, суттєво не позначилась на кінетичних параметрах транспорту Са2+. Так, в присутності 3 мМ сукцинату значення константи швидкості транспортного процесу становило (4,0 ± 0,4) x10-2 с-1, тоді як при мінімальній концентрації сукцинату - 30 мкМ, значення k зменшилось лише до (3,7 ± 0,2) x10-2 с-1.

Отже, нами доведено, що Mg2+,АТР - залежна СССР- та азид-чутлива, але нечутлива до дії тапсигаргіну зміна інтенсивності флуоресценції Са2+- чутливого зонду ТЦ у середовищі інкубації, що містить МХ міометрію, віддзеркалює акумуляцію іонів Са у цих субклітинних структурах. Показано, що ефектори, які дисипують мембранний потенціал на внутрішній мітохондріальній мембрані (протонофор, азид натрію), а також кальцієвий іонофор А-23187 не тільки пригнічують флуоресцентний сигнал ТЦ, але й індукують його падіння. Накопичення іонів Са у МХ міометрія є практично нечутливим до присутності сукцинату, але суттєво чутливим до зміни концентрації іонів Mg та АТР у середовищі інкубації.

2. Дослідження впливу кофеїну на системи активного та пасивного транспорту іонів Са в МХ міометрія. У дослідах, виконаних на МХ печінки та серцевого м'яза було показано пригнічення клітинного дихання та акумуляції Са2+, продемонстровано зміну структури внутрішньої мітохондріальної мембрани та індукцію РТР під дією кофеїну [Bruyere H et al, 1988; de la Cruz M. Et al, 1988; Sardao V. et al, 2002]. Приймаючи до уваги, що цей алкалоїд здатен змінювати структурно-функціональні властивості МХ, на другому етапі наших досліджень ми вивчили кінетичні закономірності впливу даної речовини на транспорт іонів Са в МХ міометрія. Ми знайшли, що внесення у стандартне середовище інкубації (див. “Методи досліджень”) кофеїну у концентрації 5, 10, 15 та 20 мМ призводило до прогресуючого, в залежності від концентрації цієї речовини, гальмування Mg2+,АТР-залежного накопичення іонів Са відносно контрольної кінетичної кривої. Кофеїн не тільки дозозалежно зменшує платовий рівень накопичення Са2+ у МХ його вплив виявляється також і у зниженні такого кінетичного параметру, як константа швидкості k: значення k за наявності 20 мМ кофеїну дорівнює (2,1 + 0,4) x10-2 с-1, тоді як у стандартному середовищі інкубації (без кофеїну) значення k становило (4,5 + 0,3) x10-2 с-1. Таким чином, ця величина у середньому в 2 рази менша, ніж у контролі. Константа інгібування кофеїном транспорту Са2+ у МХ (І0.5) становить 10.41 1.81 мМ (n = 7).

Як виявилось, інгібуюча дія кофеїну на накопичення іонів Са має місце і за умов його попередньої інкубації із фракцією МХ. Так, при попередній інкубації аліквоти суспензії МХ (20 - 40 мкл) з 10 мМ кофеїном протягом 2-х хвилин за умов, що унеможливлюють акумуляцію Са2+ у МХ (відсутність АТР, іонів Mg та Са), та наступного розведення аліквоти у стандартному середовищі інкубації (залишкові концентрації кофеїну після розведення становили 0,3 - 0,6 мМ) спостерігалось зниження як платового (у часі) рівня накопичення іонів Са так і величини константи швидкості k цього процесу відносно контрольних кривих, одержаних у випадку непреінкубованих МХ у стандартному середовищі інкубації та у середовищі інкубації, що містило 0,6 мМ кофеїн. Значення константи швидкості k накопичення Са2+ для контрольних умов, тобто у стандартному середовищі інкубації та у середовищі, що містило 0.6 мМ кофеїн, становили (4,4 ± 0,2)x10-2 с-1, та (4,1 ± 0,3)x10-2 с-1 відповідно (n = 4). Тоді, як величина k для процессу накопичення Са2+ преінкубованими МХ знизилась до (1,4 ± 0,1) x10-2 с-1. Отже, можна припустити, що мішенню інгібуючої дії кофеїну на транспорт Са2+ в МХ не є уніпортер. Скоріш за все під дією алкалоїду збільшується проникність внутрішньої мітохондріальної мембрани для Са2+. Дійсно, як виявилось, кофеїн активує індукований азидомазидом натрію (10 мМ) пасивний вихід іонів Са з мітохондріального матриксу, (рис. 9, А). Транзитне додавання азиду разом з 20 мМ кофеїном викликає швидке і практично повне вивільнення іонів Са, флуоресцентна відповідь ТЦ при цьому спадає майже до нульових значень. Можна бачити, що кофеїн впливає на кінетичні параметри азид-індукованого виходу іонів Са з МХ: значення константи швидкості k виходу іонів Са із МХ за наявності 20 мМ кофеїну дорівнює (5,8 + 0,5) x 10-2 с-1. Ця величина у середньому в 1,5 рази більша, ніж у контролі: значення константи виходу Са2+ у відсутності кофеїну становило (3,8 + 0,3) x10-2 сек-1 (n = 6).

Треба відзначити, що у наших дослідах, виконаних разом з к.б.н. Г.В. Данилович, було показано, що кофеїн у концентрації 5 - 20 мМ інгібує Н+-АТРазу мітохондрій міометрія, яка, як відомо, бере участь у створенні мітохондріального мембранного потенціалу [Литошенко А.Я., 2001].Тому не можна виключати і того, що свій внесок у зменшення накопичення іонів Са у МХ може робити і гальмування кофеїном активності Н+-АТРази.

З літературних даних відомо, що кофеїн індукує мітохондріальну пору перехідної проникності у кардіоміоцитах, пригнічуючи накопичення іонів Са2+ у МХ цих клітин [Sardao V. et al, 2002]. Тому для дослідження можливої участі кофеїну в індукції РТР у МХ міометрію ми вивчали сукупний вплив кофеїну та інгібітора РТР ЦсА. Ми знайшли, що додавання 5 мкМ ЦсА в стандартне середовище інкубації, що містить МХ міометрію, забезпечує невелике, у середньому на 25 - 30 %, збільшення платового рівня акумуляції іонів Са відносно контрольної величини. В той же час, ЦсА (50 мкМ), доданий у середовище інкубації, не впливає на пасивний вихід іонів Са, що був викликаний додаванням NaN3. За умов сукупної присутності ЦсА (5 мкМ) та кофеїну (20 мМ) у середовищі інкубації інгібуючий ефект кофеїну на накопичення Са2+ не зникає, але спостерігається відсутність активуючої дії ЦсА на цей процес (рис. 12). Інгібування накопичення Са2+ на 30 - 35 % відносно контрольних умов (k = (4,8 ± 0,7)x10-2 с-1 та вповільнення кінетики цього процесу відбувається під дією кофеїну як у відсутності ЦсА (k = 2,1 ± 0,1)x10-2 с-1), так і за його присутності (k = (4,8 ± 0,7)x10-2 с-1).

Таким чином, наші дані свідчать, що гальмуюча дія кофеїну на накопичення Са2+ у МХ міометрія запобігає стимулюючому ефекту ЦсА на цей процес. Оскільки гальмуючий ефект кофеїну на накопичення Са2+ у МХ міометрія спостерігається також і в присутності ЦсА, то можна припустити, що у механізмі цього ефекту не задіяна індукція РТР.

Отже, на підставі аналізу наведених вище даних, можна стверджувати, що інгібуюча дія кофеїну на акумуляцію іонів Са в МХ міометрію виявляється не через безпосередній вплив на уніпортер, але, скоріше за все, шляхом порушення бар'єрної функції внутрішньої мітохондріальної мембрани щодо іонів Са, що і спричиняє стимуляцію їх пасивного вивільнення (рис. 9). Але таке порушення бар'єрної функції мембрани не пов'язане із активацією РТР, оскільки інгібітор пори ЦсА не виявляє ніякого ефекту на виникнення цього порушення.

3. Розробка флуоресцентного методу визначення концентрації АТР у водних розчинах. Прогрес у вивченні кінетичних та енергетичних аспектів трансмембранного обміну іонів Са потребує вдосконалення експериментальних методів реєстрації змін у концентраціях компонентів середовища інкубації, перш за все АТР. Відсутність зручного флуоресцентного методу кількісного визначення АТР спонукала нас до пошуку зонду, який би у простих умовах взаємодіяв із цим нуклеозидтрифосфатом, змінюючи при цьому свої флуориметричні характеристики, що дало б можливість визначати концентрацію АТР. Такий зонд -3-гідрокси-4-диметиламінофлавон (3ГАФ) було синтезовано доцентом кафедри органічної хімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка Пивоваренком В.Г.

Смуга збудження флуоресценції 3ГАФ у водному розчині знаходиться на 405 нм. Нами вперше було показано, що при взаємодії даного зонду з АТР відбувається зсув цієї смуги до 475-480 нм, що свідчить про утворення стабільного комплексу між 3ГАФ та АТР. Положення максимуму випромінювання флуоресценції при цьому не змінюється. Цей ефект є високоспецифічним для АТР і не відтворюється у присутності інших нуклеозидфосфатів, за виключенням ІТФ. Збільшення концентрації АТР у середовищі інкубації призводить до збільшення концентрації комплексу 3ГАФ-АТР, та відповідно, до зростання інтенсивності випромінювання флуоресценції при збудженні на 480 нм. Цей ефект був використаний нами для розробки методу кількісного визначення АТР у водному розчині. Для побудови калібровальної кривої використовували водний розчин (I), що містив 250 мМ сахарозу, 10 мМ HEPES (рН 7,4) та 5 мкМ зонду 3ГАФ та розчин (II), що містив 250 мМ сахарозу, 10 мМ HEPES (рН 7,4), 5 мкМ зонду 3ГАФ і 40 мМ АТР. Задану концентрацію у аналітичному розчині (III) отримували шляхом додавання до 1,5 мл розчину (I) аліквоти розчину (II). Після цього реєстрували спектри емісії флуоресценції 3 ГАФ у розчині (III).

Інтенсивність емісії флуоресценції вимірювали на довжині хвилі 540 нм. Числові дані відношення інтенсивностей емісії при збудженні на 480 нм та 405 нм (I480/I405) наносили на графік. Як можна бачити з рис.14, в діапазоні концентрацій 10-4 - 3x10-3 маємо лінійну залежність відносного параметра I480/I405 від lg [АТР], що дає можливість використовувати зазначену лінійність у якості калібровочного графіку.Похибка методу становить не більше 10 %.

Отже, розроблений нами метод можна використовувати для визначення концентрації АТР у водному розчині.

Висновки

кофеїн мітохондрія аденозинтрифосфат мембранний

На теперішній час доведена важлива роль мітохондрій у контролі внутрішньоклітинної концентрації іонів Са, у тому числі в гладеньких м'язах. У даній роботі, виконаній із використанням Са2+-чутливого флуоресцентного зонду тетрацикліну, були досліджені кінетичні закономірності транспорту іонів Са в ізольованих мітохондріях міометрія невагітних щурів, вивчено вплив кофеїну на цей процес.

Наші дані свідчать, що протонофор- та азид-чутливі складові збільшення флуоресцентного сигналу тетрацикліну, які є резистентними до тапсигаргіну, характеризують Mg2+,АТР-залежну оборотну акумуляцію іонів Са в мітохондріях. Кінетика акумуляції Са2+ задовольняє закономірностям реакції першого порядку (константа швидкості k становить (4,8 ± 0,7) x10-2 с-1).

Протонофор СССР, азид та Са2+-іонофор А-23187 стимулювали пасивне вивільнення іонів Са із мітохондрій за умов попереднього енергозалежного накопичення цього катіону в них. Протонофор здатний більш ефективно, ніж азид, індукувати вивільнення Са2+ із цих субклітинних структур: значення k становлять (8,6 ± 0,8) x10-2 та (3,8 ± 0,2) x10-2 с-1 відповідно.

Величина константи швидкості k акумуляції іонів Са у мітохондріях куполоподібно залежить від концентрації іонів Mg (оптимальне значення - 3 - 5 мМ) та збільшується із зростанням концентрації АТР (до 3 мМ), але практично не залежить від концентрації сукцинату (до 3 мМ) у середовищі інкубації.

Кофеїн, внесений у середовище інкубації, дозозалежно гальмує акумуляцію іонів Са (значення константи інгібування І0.5 становить 10,4 ± 1,8 мМ) та Н+-АТРазну активність в мітохондріях, зменшуючи як платовий (у часі) рівень акумуляції катіону, так і величину константи швидкості цього процесу. У випадку попередньої інкубації мітохондрій з кофеїном при відсутності реагентів, що забезпечують транспортний процес (Са2+, Mg2+, АТР) також спостерігається пригнічення акумуляції іонів Са. Кофеїн стимулює пасивне вивільнення іонів Са з мітохондрій, які попередньо були навантажені цим катіоном у енергозалежному процесі.

Циклоспорин А (5 мкМ) стимулює на (30 %) акумуляцію іонів Са в мітохондріях, але не впливає на їх пасивний вихід із цих субклітинних структур. На фоні пригнічуючої дії кофеїну (20 мМ) на акумуляцію іонів Са стимулюючий ефект циклоспорину А (5 мкМ) не спостерігається.

Із використанням флуоресцентного зонду 3-гідрокси 4-диметиламінофлавону розроблено метод визначення концентрації АТР у водних розчинах.

Література

Вадзюк О.Б., Борисова Л.А., Тітус О.В., Костерін С.О. Чутлива до СССР зміна флуоресценції тетрацикліну за умов моделювання Mg2+, АТР-залежного транспорту іонів Са в мітохондріях гладенького м'яза.// УБЖ. - 2003. - т.75, N4.- С. 64-74.

Вадзюк О.Б., Костерін С.О. Вплив кофеїну на азидчутливе Mg2+, АТР-залежне збільшення флуоресцентної відповіді тетрацикліну при моделюванні акумуляції іонів Са в мітохондріях.// УБЖ. - 2003. - т. 75, N6.- С. 47 - 55.

Вадзюк О.Б. Вплив кофеїну та ЦсА на трансмембранний обмін іонів Са в мітохондріях гладенького м'яза.// УБЖ. - 2005. - т.77, N2.- С. 77-82.

Pivovarenko V.P., Vadzyuk O.B., Kosterin S.O. Fluorometric detection of adenosine triphosphate with 3-hydroxy-4'(dimethylamino)flavone in aqueos solutions.// Journal of Fluorescence.- V.16, N 1. - Р.9 - 15.

Патент на винахід N 75448 UA, 7МПК, GO 21/64, GO1N 33/52, C07D 311/30, C07D221/06. Спосіб флуориметричного визначення концентрації аденозин-5'-трифосфату (АТР) у розчині/ Пивоваренко В.Г., Вадзюк О.Б., Костерін С.О. Заявл. 15.03.2004, Опубл. 17.04.2006, Бюл. N 4.

Vadzyuk O.B. CCCP- and azide-sensitive Ca2+ accumulation in myocytes and the effect of caffeine on this process//. - International Congress “Physiology and Biophysics of the Smiito Muscle”. - 2003.-Р.377.

Вадзюк О.Б. Влияние кофеина на Mg2+,АТР-зависимое накопление ионов Са митохондриями миоцитов матки// 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых. - Сборник тезисов.-2003.-Р.313.

Вадзюк О.Б. Вплив кофеїну на СССР- та NaN3-чутливу Mg2+,АТР-залежну систему акумуляції іонів Са в клітинах міометрію.// Конференція-конкурс робіт молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології”. - Київ. - 2003. - Р.8

Размещено на Allbest.ru