Особливості меланогенезу в гірськокарпатських овець з кольоровою вовною

Размещено на http://www.allbest.ru/

Українська академія аграрних наук

Інститут біології тварин

УДК 636.32/.38:591.876:637.612:577.1

АВТОРЕФЕРАТ

Дисертація на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Особливості меланогенезу в гірськокарпатських овець з кольоровою вовною

03.00.04 - Біохімія

Смолянінова Оксана Олексіївна

Львів - 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент УААН, заслужений діяч науки і техніки України Макар Іван Арсентійович, Інститут біології тварин УААН, головний науковий співробітник лабораторії фізіолого-біохімічних основ вовноутворення

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Розгоні Іван Іванович, Інститут біології тварин УААН, головний науковий співробітник лабораторії клітинної інженерії шкіра вовна солемінеральний

кандидат сільськогосподарських наук, заслужений працівник сільського господарства України Чепур Валентина Кузьмівна, Одеський державний аграрний університет, професор кафедри генетики і розведення сільсько-господарських тварин

Провідна установа - Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів і кормових добавок Міністерства аграрної політики України, відділ фармакології і імунології, м. Львів

Захист дисертації відбудеться 11.04.2006 р. о__12___ годині на засіданні вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН за адресою: 79034, Львів, вул. В. Стуса, 38

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН (79034, Львів, вул. Стуса, 38)

Автореферат розісланий 09.03. 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Віщур О.І.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Серед актуальних проблем сучасної біології проблема меланогенезу займає одне з провідних положень, що зовсім закономірно, позаяк з'ясування питань, пов'язаних з пігментацією організмів, має не лише наукове, а й чимале прикладне значення, особливо для медицини та тваринництва.

Упродовж останніх десятиліть розведення овець у Карпатському регіоні виключно спрямовувалось на виробництво вовни лише білого кольору, що, природно, не могло не призвести до різкого зменшення популяції овець з кольоровою вовною. Між тим, саме кольорова вовна (особливо чорна та сіра) тут завжди була і надалі залишається ідеальною та екологічно чистою сировиною для виготовлення декоративно-художніх виробів - ліжників, килимів, технічних тканин і навіть витворів мистецтв.

У даний час в отарах овець гірських господарств народжується від 5 до 8% ягнят з кольоровою вовною. Кон'юнктура світового та внутрішнього ринку диктує доцільність розведення овець з пігментованою вовною, доказом чого є навіть той факт, що в масиві австралійських мериносів створено популяцію овець з вовною природного забарвлення.

Усе це закономірно спонукає до розгортання наукових досліджень, пов'язаних з вивченням питань меланогенезу в овець з пігментною вовною, механізмів регуляції цих процесів, прийомів селекції і розведення тварин, розроблення шляхів раціонального використання кольорової вовни. Логічно, що в даний час ця проблематика вважається актуальною, про що свідчить доволі численна бібліографія, особливо з питань регуляції біохімічних процесів у організмі овець (Moll I., 1995; Hynd P. I., 1999; Чепур В. К., 2003; Розгоні І. І., 2005), і меланогенезу зокрема, на генетичному рівні (Ильина Е. Д., Кузнецов Г. А., 1983; Алиев Г. А., Рачковский М. Л., 1984; Конюхов Б. В., 1990; Jackson I. J., 1994; Gunn T. M., 1999). Однак, є окремі відомості і про меланогенез у гірськокарпатських овець (Мартищук М. В., Гуменюк В. В., Макар І. А., 1993; Макар І. А., Гуменюк В. В., Мартищук М. В. та ін., 2004).

І все ж, найбільш вузьким місцем у цій проблематиці є брак інформації з питань кінетики меланогенезу в шкірі та вовноутворювальних структурах, тобто волосяних фолікулах, зв'язок його з активністю ключового ферменту цього процесу - тирозиназою. Ось чому це питання стало предметом наших досліджень.

З усього сказаного випливає актуальність даної теми, пошук шляхів і методів її реалізації. Отже, постановка і проведення досліджень такого роду - обґрунтовані і на часі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом наукової теми 02.04 № ДР. 0101U 003435. “Вивчити механізми вовноутворення і розробити генетико-біохімічні способи підвищення вовнової продуктивності і поліпшення якості вовни”, яка виконувалась у лабораторії фізіолого-біохімічних основ вовноутворення Інституту біології тварин УААН, де автор досліджувала особливості структури хімічного складу, фізичні показники та їх взаємозв'язок а також питання регуляції цих процесів.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було встановити зв'язок тирозиназної активності в шкірі та нагромадженням меланіну у вовні гірськокарпатських овець з руном природного забарвлення, що дало б можливість цілеспрямовано впливати на ці процеси.

Для реалізації поставленої мети вирішувались такі завдання:

1. Вивчити локалізацію та активність тирозинази в шкірі і волосяних фолікулах і нагромадження меланіну у вовні.

2. З'ясувати взаємозв'язок активності тирозинази в шкірі з накопиченням пігменту у вовноутворювальних структурах ? волосяних фолікулах.

3. З'ясувати вплив екзогенного тирозину на перебіг меланогенезу в шкірі та накопичення пігменту у вовні.

4. Дослідити вплив солемінеральної суміші, зокрема, міді, сірки та йоду на тирозиназну активність у шкірі та вміст меланіну у вовні.

5. Встановити вплив пасовищного утримування, особливо полонинного літування, на активність тирозинази в шкірі овець з кольоровою вовною (білою, сірою, чорною та коричневою).

6. Вивчити морфоструктуру вовни з природним забарвленням, її хімічний склад та фізичні параметри.

Об'єкт дослідження ? процес меланогенезу і механізми його регуляції.

Предмет дослідження ? вплив паратипових факторів на активність тирозинази в шкірі овець з кольоровою вовною, кількісне співвідношення у ній кератоз, вміст меланіну, тирозину, цистину, гексозамінів, азоту та сірки, а також на міцність та істинну довжину волокна.

Методи дослідження ? для досягнення поставленої мети використовували біохімічні, гістологічні, спектрофотометричні, фізичні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше на поголів'ї гірськокарпатських овець з вовною природного забарвлення встановлено прямий зв'язок меланогенезу з активністю ключового ферменту цього процесу - тирозиназою і з'ясовано вплив на нього паратипових факторів. У процесі росту вовни досліджено локалізацію і активність ключового ферменту - тирозинази в шкірі та в її вовноутворювальних структурах - волосяних фолікулах.

Отримано нові дані про стимулюючий вплив мінеральних елементів, зокрема міді, сірки та йоду, а також амінокислоти тирозину на активність тирозинази і перебіг меланогенезу в шкірі. З'ясовано вплив полонинного літування овець на активність тирозинази в шкірі, вміст меланіну та деяких інших компонентів у вовні, її фізичні параметри. Доказано, що меланогенез в шкірі є доволі лабільним процесом, свідченням чого є висока мінливість активності в ній тирозинази, яка може зазнавати помітних змін за відносно короткий проміжок часу, що пов'язано з нерівномірним надходженням у волосяні фолікули основного субстрату ? тирозину.

В цілому отримано нові дані, які розкривають механізми впливу різноманітних факторів (субстратних, зовнішнього середовища та ін.) на перебіг меланоутворення в гірськокарпатських овець з кольоровою вовною, що дає можливість більш предметно підійти до розробки науково обґрунтованих заходів з їх розведення та утримання.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані дані можуть бути використані в селекційно-племінній роботі з гірськокарпатськими вівцями з природним забарвленням руна, а також при розробці науково обґрунтованих заходів їх годівлі та утримання, а окрім того технології використання кольорової вовни в Карпатському регіоні та в господарствах, в яких практикується розведення каракульських овець.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно проаналізував наукову літературу за темою дисертації і виконав експериментальну частину, опрацював та провів статистичну обробку результатів, приймав участь у написанні публікацій та дисертаційної роботи. Аналіз і обговорення отриманих даних проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів досліджень. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на: Міжнародній науково-практичній конференції молодих учених та спеціалістів “Молоді учені у вирішенні проблеми аграрної науки і практики”, Львівська державна академія ветеринарної медицини імені С. З. Гжицького, Львів, 2003; звітних сесіях Інституту біології тварин УААН Львів, 2002-2004 рр.; конференції молодих учених, Львів, 2003, 2004 рр.; Міжнародній науковій конференції Інституту біології тварин УААН, присвяченій 80-річчю від дня народження професора П. З. Лагодюка, Львів, 2004; І Міжнародній науково-практичній конференції Буковинського інституту агропромислового виробництва УААН, присвяченій стану та розвитку агропромислового виробництва в межах єврорегіону “Верхній Прут”, Чернівці, 2003.

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 7 наукових праць, монографія (у співавторстві)., 6 статей у фахових виданнях (з них - 2 одноосібні), тези.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 127 сторінках комп'ютерного набору і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків, списку використаної літератури - 252 джерела, з них 179 ? латиною. Робота містить 17 таблиць, 5 діаграм і 9 фото, які розташовані на 30 сторінках.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи досліджень. За темою дисертаційної роботи виконано чотири серії дослідів на гірськокарпатських вівцях з кольоровою (природного забарвлення) вовною, які утримувались у приватному господарстві села Річка Косівського району Івано-Франківської області. Дослідження проводились у лабораторії фізіолого-біохімічних основ вовноутворення Інституту біології тварин УААН.

Перша серія дослідів присвячена питанням локалізації та активності тирозинази у шкірі, накопиченню меланіну у вовні, а також дослідженню її макроструктури, хімічного складу та фізичних показників. Досліди проведено на 6-місячних ярках з вовною чорного та темно-коричневого забарвлення. Об'єктом досліджень слугували шкіра і вовна, зразки яких відбирали при постановці овець на дослід та в час його закінчення.

Друга серія дослідів була присвячена вивченню впливу тирозину, як основного субстрату тирозинази, на процес меланогенезу і накопичення меланіну у вовні. Для цього за принципом аналогів було підібрано дві групи 12-місячних ярок (по три голови в кожній) чорного окрасу, які упродовж 60-ти днів перебували за однакових умов утримання. Вівці контрольної групи отримували раціон, збалансований за поживними речовинами та енергією згідно з існуючими нормами годівлі (Калашников А.П., 1985), а дослідної ? додатково до основного раціону в складі комбікорму одержували тирозин із розрахунку 500мг на голову на добу. У шкірі (зразки одержували методом біопсії) визначали активність тирозинази, а у вовні - вміст меланіну, тирозину, сірки, цистину та гексозамінів; з фізичних показників досліджували справжню довжину і міцність волокон.

У третій серії дослідів вивчали вплив аліментарних факторів, зокрема згодовування добавки мінеральних елементів, на активність тирозинази в шкірі овець, накопичення пігменту в їх вовновому покриві, а ще вміст тирозину, сірки цистину, гексозамінів, співвідношення кератоз, а також параметри фізичних показників вовнових волокон. За принципом аналогів було сформовано дві групи 6-місячних ярок з кольоровою вовною. У кожній групі перебувало по три голови тварин чорного і три - темно-коричневого забарвлення. Дослідна група, додатково до основного раціону, збалансованого за поживними речовинами, одержувала суміш солей (сірчанокислий натрій, вуглекисла мідь та йодистий калій) у кількості відповідно 4 г, 1,5 мг та 1 мг на голову на добу. Добавку мінеральних речовин тваринам згодовували у складі комбікорму з розрахунку 100 г на голову на добу. Вибір саме таких мінеральних елементів обумовлений важливістю їх для процесів вовноутворення, в тому числі і меланогенезу. Дослід тривав 120 днів, а об'єктом досліджень слугували шкіра та вовна, зразки яких відбирали у тварин на початку та в кінці досліду.

У четвертій серії дослідів вивчали вплив пасовищного утримання (полонинного літування) на меланогенез в організмі повновікових вівцематок. Дослід, тривалістю 200 днів, було проведено на матках з білим (контроль), чорним, сірим і коричневим окрасами руна.

Зразки шкіри та вовни для досліджень відбирали під час весняної стрижки овець та перед вигоном їх на пасовища (початок травня), а також під час постановки їх на зимово-стійлове утримання (жовтень). У шкірі досліджували активність тирозинази, у вовні ? накопичення меланіну, вміст тирозину, загальної сірки, цистину та гексозамінів. Із фізичних показників досліджували справжню довжину та міцність волокон.

Локалізацію ключового ферменту меланогенезу - тирозинази (КФ 1.14.18.1) в шкірі досліджували гістохімічно за методом Б. Беккера та ін. (1935), а меланін за методом Н. А. Діамідової (1957) використовуючи при цьому мікроскоп ЛОМО з вмонтованою відеокамерою і програмним забезпеченням “Меd. Can.”. Загальну активність ферменту визначали за методом Лоурі (1951) у нашій частковій модифікації. Вміст меланіну в вовні визначали ваговим методом, тирозин ? колориметрично за Л. А. Гольдшмідтом (1957), сірки кількісним методом Макара та співавт. (1984), цистину за методом Фоліна-Марензі в модифікації Н. Цана і К. Траумана (1954), вміст гексозамінів за Н. П. Боасом (1953), а макроструктуру (кількісне співвідношення кератоз) вовни за методом Макара та співавторів (1968), в основу якого покладено метод М. С. Корфілда (1958). Фізичні показники вовни, зокрема справжню довжину та міцність (розривне зусилля) визначали за методом В. В. Калініна та ін. (1970). Статистичну обробку цифрових даних здійснювали за І. А. Ойвіним (1960).

Результати досліджень

Локалізація тирозинази в шкірі та волосяних фолікулах. Про локалізацію цього ензиму в шкірі ми судимо за інтенсивністю та місцем розташування меланіну, який, як відомо, є продуктом функціональної діяльності меланоцитів. На підставі одержаних даних констатуємо, що активність тирозинази завжди фіксується рівномірно по усьому епідермісу, ? від його базального до рогового шару що, зрозуміло, забезпечує достатню рівномірність розподілу пігменту в середині кожного кератиноциту. З цього випливає, що епідермальні меланоцити базального шару через свої відростки ніби “вприскують” темні зернята меланіну у верхні шари шкіри, допоки вся кількість пігменту не виявиться у зроговілому шарі. При цьому важливо зауважити, що число меланоцитів на одиницю поверхні шкіри в різних її ділянках може бути неоднаковим, хоч завжди на одній і тій же зоні незалежно від кольору шкіри воно, як правило, є однаковим. Це в принципі підтверджує загальновизнане положення про те, що відмінності в кольорі шкіри залежать не від числа меланоцитів, а від вмісту в них меланіну. І справді, у чорній шкірі гранул меланіну більше, до того ж вони порівняно більші за розміром. У результаті епідермальний шар зафарбований в інтенсивний чорний колір.

Встановлено, також, що ключовий фермент меланогенезу ? тирозиназа локалізована в усіх структурних компонентах волосяного фолікула: його цибулині, зовнішній та внутрішній кореневих піхвах, а також у сполучнотканинній сумці. В інтактній шкірі вона розташована рівномірно по усьому епідермісу - від його базального до зроговілого шарів. Гранули пігменту розташовані безпосередньо як у шкірі, так і у волосяних фолікулах.

Локалізація меланіну в стержні волоса. Меланінові гранули, які визначають колір волокон, слід розглядати як результат взаємодії меланоцитів волосяного фолікула з кератиноцитами. Гранули меланіну в стержні зрілого вовнового волокна розподіляються в будь-якому з трьох його шарів: лускатому (кутикулі), корковому (кортексі) і серцевинному (мозковому). І все ж, судячи з локалізації пігментних зерен, найбільша кількість його міститься в корковому та серцевинному шарах, що створює враження суцільного чорного (темного) фону. Можна стверджувати, що в процесі диференціювання клітини кортексу дозріваючого волоса ущільнюються, фіксуючи при цьому гранули меланіну між його філаментами, тобто макро- і мікрофібрилами. Паракортикальні клітини, на відміну від ортокортикальних, коркового шару, містять більше гранул, які, до речі, є і в темних і чорних шерстинках, як правило, овальної форми, а сама поверхність їх ? дрібнозерниста і покрита тонкою мембраноподібною осміофільною речовиною. Це і є еумеланін. Гранули світлих шерстинок значно менші, еліпсоподібної, або паличкоподібної форми. Поверхня їх їз своєрідними заглиблиннями. Очевидно, це можуть бути феомеланіни.

Колір вовни в залежності від активності тирозинази в шкірі. Встановлено прямолінійну залежність між цими показниками: в міру підвищення активності ферменту в шкірі процес накопичення пігменту в вовні зростає (рис.1).

Рис. 1. Взаємозв'язок активності тирозинази в шкірі з вмістом меланіну в вовні (n=3)

Примітка. Статистично вірогідні різниці між вівцями з білим і кольоровим руном: * р<0,05;

***р<0,001; статистично вірогідні різниці між чорними і кольоровими вівцями:*/ р<0,05.

Отже, найвищою активністю тирозинази відзначається шкіра овець з вовною чорного забарвлення (р<0,05); порівняно найнижчою - сірого (р<0,001). Тварини з вовновим покривом коричневого кольору займають проміжне положення (р<0,001). У шкірі білих овець тирозиназа також проявляє свою активність, проте вона є на порядок нижчою, до того ж локалізована лише в епідермальних меланоцитах. Найбільша кількість меланіну ? у чорній вовні (7,5%, на суху речовину), дещо менша ? у коричневій (6,8%) і найменша ? у сірій (3,2%) (р<0,05). У білій вовні меланін відсутній.

Щодо кількісних величин цього пігменту в макроструктурах вовнового волокна, то нам вдалось розділити його на окремі компоненти, за допомогою методу фракціонування вовни, на так звані кератози. Виявлено, що найбільше меланіну спостерігається в альфа-кератозі, до того ж в остьових волокнах. Що стосується бета-кератози, то її пігмент, очевидно, перейшов у розчин під час фракціонування вовнового волокна, У гамма-кератозі меланіну значно менше, ніж в альфа, причому однаково, як в ості, так і в пуху.

Структура і фізико-хімічні показники кольорової вовни. Встановлено відмінності між білою та кольоровою вовною за її структурною організацією та фізико-хімічними параметрами (табл.1).

Таблиця 1 Порівняльна характеристика макроструктури, хімічного складу та фізичних показників білої і чорної вовни (М±m, n = 3)

Примітка. Статистично вірогідні різниці між білою і чорною вовною:***р<0,001.

Як видно з наведених даних, інтактне волокно овець чорного забарвлення, насамперед характеризується порівняно більшим розміром кутикулярного шару, тобто кутикули, що загалом є закономірним явищем. Біла вовна характеризується вищими показниками кристалічної частини, альфа-кератози. З інших змін досліджуваних показників на увагу заслуговує порівняно більший вміст сірки (р<0,001), цистину та гексозамінів у білій вовні. Саме ці показники і визначають фізичні параметри вовни, зокрема, її міцність, а отже і якість. І справді, міцність вовни у тварин цієї групи виявилась більшою (8,9 км проти 8,2 км). З цього випливає, що наявність пігменту у вовновому волокні не впливає на його міцність. Що до таких показників, як справжня довжина та товщина волокон, то вони практично виявились однаковими в овець обох порівнювальних груп.

Вплив екзогенного тирозину на активність тирозинази в шкірі, вміст меланіну та тирозину у вовні. З'ясувалось, що меланогенез у шкірі овець є доволі лабільним процесом, свідченням чого є висока мінливість у ній активності тирозинази. Вона може зазнавати досить помітних змін за відносно короткий проміжок часу (60 днів), що, очевидно, пов'язано з нерівномірним надходженням у волосяні фолікули основного субстрату ? тирозину. З наведених даних випливає, що тирозиназна активність у шкірі усіх тварин за період досліду знизилась, проте у тварин дослідної групи цей спад був набагато меншим, ніж у тварин контрольної групи (р<0,001). Що стосується меланіну вовни, то його вміст змінювався дещо інакше: подібно тирозиназі він зменшився у контролі, і суттєво зріс (майже у два рази) у дослідних овець (р<0,01). Вважаємо, що таке збільшення пігменту в вовні овець дослідної групи відбувається виключно за рахунок впливу тирозину (табл.2).

Таблиця 2 Активність тирозинази в шкірі, вміст меланіну та тирозину в вовні з облікової площі шкіри (М±m, n = 3)

Примітка. Статистична вірогідність різниць між початком і кінцем досліду:*р<0,05; р<0,025; **р<0,01; ***р<0,001; статистична вірогідність у кінці досліду між тваринами контрольної і дослідної груп: †р<0,05; ††р<0,01; †††р<0,001.