Размещено на http://www.allbest.ru/

Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича

УДК 579.222+577.151+582.282.23

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Особливості антиоксидантного захисту дріжджів Saccharomyces cerevisiae на різних фазах росту культури

03.00.04 - Біохімія

Байляк Марія Михайлівна

Чернівці - 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Прикарпатському національному університеті імені Василя Стефаника Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Лущак Володимир Іванович, Прикарпатський національний університет імені Василя Стефаника, завідувач кафедри біохімії карбонільний білок метаболізм

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Федорович Дарія Василівна, Інститут біології клітини НАН України, провідний науковий співробітник відділу молекулярної генетики і біотехнології

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Волков Роман Анатолійович, Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, завідувач кафедри молекулярної генетики та біотехнології

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії, м. Київ

Захист відбудеться 31 жовтня 2007 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої Д 76.051.05 у Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича за адресою: 58012, м. Чернівці, вул. Лесі Українки, 25, ауд. 81.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича за адресою (58012, м. Чернівці, вул. Лесі Українки, 23).

Автореферат розісланий 26 вересня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Копильчук Г.П.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Активовані форми кисню (АФК) утворюються в клітині як побічні продукти метаболізму або внаслідок дії різних зовнішніх факторів. До АФК відносять супероксидний аніон-радикал (O2*), пероксид водню (Н2О2), гідроксильний радикал (*ОН) тощо. АФК можуть викликати окисну модифікацію білків, ліпідів і нуклеїнових кислот, тому в клітині одночасно з генерацією АФК відбувається їх знешкодження цілою низкою антиоксидантів. У випадку, коли швидкість утворення АФК перевищує швидкість їх деградації, клітина зазнає оксидативного стресу (Halliwell B., Gutteridge J.M.C., 1999). З підвищеною продукцією АФК пов'язаний розвиток багатьох захворювань людини (Drцge W., 2002), старіння і апоптоз (Costa V., Moradas-Ferreira P., 2001; Madeo F. et al., 2004). Зручною моделлю для вивчення антиоксидантних систем еукаріотів слугують пекарські дріжджі Saccharomyces cerevisiae. Доведено, що за дії пероксиду водню та супероксид-аніону в клітинах дріжджів синтезуються різні набори білків (Jamieson D., 1998). Як характер, так і швидкість відповіді клітини на стрес залежать від її фізіологічного стану. Зокрема, показано, що стійкість S. cerevisiae до дії несприятливих чинників змінюється протягом їх статичного культивування (Gash А., 2002). З огляду на це, важливим є вивчення функціонування антиоксидантних механізмів S. cerevisiae на різних фазах росту їхньої культури. Відповідь S. cerevisiae на дію пероксиду водню в експоненційній фазі росту характеризується, насамперед, збільшенням синтезу ферментів, які знешкоджують Н2О2, зокрема каталази [КФ 1.11.1.6] (Godon C. et al., 1998; Lee J. et al., 1999). Каталаза, в свою чергу, може запобігати окисним пошкодженням білків при інтенсифікації продукції АФК у клітинах дріжджів під час дихання (Lushchak V., Gospodaryov D., 2005). У даній роботі ми зосередили свою увагу на вивченні ролі каталази в захисті від пероксиду водню культур S. cerevisiae, в яких клітини інтенсивно діляться (експоненційна фаза росту) і в яких поділ клітин обмежений внаслідок нестачі живильних речовин у середовищі культивування (стаціонарна фаза росту).

Зв'язок даної роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась з 2003 по 2006 рік на кафедрі біохімії Прикарпатського національного університету ім. В. Стефаника і є частиною наукової тематики кафедри „Вивчення оксидативного стресу у тварин і мікроорганізмів з метою мінімізації його шкідливої дії”, номер держреєстрації - 0106U002245.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - оцінити значення каталази в підтриманні життєздатності і функцій S. cerevisiae за оксидативного стресу, індукованого пероксидом водню в культурах на різних фазах росту. Для реалізації мети були поставлені наступні завдання:

1) вивчити вплив пероксиду водню на життєздатність клітин, активність антиоксидантних і функціонально пов'язаних з ними ферментів у різних штамів S. cerevisiae в середині експоненційної фази росту культури;

2) вивчити вплив пероксиду водню на життєздатність клітин, активність антиоксидантних і функціонально пов'язаних з ними ферментів та вміст карбонільних груп білків як показників оксидативного стресу в батьківського та ізогенного безкаталазного штамів S. cerevisiae за умов нестачі живильних речовин (стаціонарна фаза росту);

3) дослідити вплив інгібітора каталази, 3-аміно-1,2,4-триазолу, на життєздатність клітин і активність антиоксидантних ферментів S. cerevisiae під час голодування та проаналізувати характер інгібування каталаз in vivo та in vitro.

Об'єкт дослідження - відповідь антиоксидантної системи S. cerevisiae на оксидативний стрес.

Предмет дослідження - виживання клітин, активність антиоксидантних ферментів та вміст продуктів окислення білків у S. cerevisiae на різних фазах росту їх культури за дії пероксиду водню.

Методи дослідження - мікробіологічні (культивування клітин і аналіз кривих росту культур дріжджів, оцінка життєздатності клітин у культурі), біохімічні (визначення активностей ферментів, вмісту карбонільних груп білків, визначення кінетичних характеристик ферменту), математичної статистики.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено, що каталаза бере участь у забезпеченні стійкості клітин S. cerevisiae до пероксиду водню в середині експоненційної фази росту культури і за умов голодування. Виявлено відмінність у чутливості до пероксиду водню штамів S. cerevisiae, які не мають дефектів за синтезом компонентів антиоксидантної системи. Показано, що виживання клітин різних штамів S. cerevisiae за дії Н2О2 позитивно корелює з активностями каталази та супероксиддисмутази цих штамів. Вперше виявлено чітку позитивну кореляцію між активностями каталази та супероксиддисмутази в клітинах дріжджів, підданих дії Н2О2 в середині експоненційної фази росту, що свідчить про функціональну взаємодію даних ферментів за умов оксидативного стресу. Вперше показано, що in vivo пероксид водню залежно від своєї концентрації, особливостей штаму та фази росту дріжджової культури може як інактивувати, так і активувати антиоксидантні ферменти.

Практичне значення одержаних результатів. Представлені в роботі результати поглиблюють знання про функціонування антиоксидантної системи S. cerevisiae за дії стресу, що викликається пероксидом водню. Отримані дані можна використовувати при розробці технологій промислового культивування дріжджів. Результати роботи використовуються при читанні лекцій та проведенні практичних занять з мікробіології, біохімії, молекулярної біології та курсу “Вільнорадикальні процеси в біології” на кафедрі біохімії Прикарпатського національного університету ім. В. Стефаника.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведений аналіз наукової літератури, виконана експериментальна частина роботи і статистична обробка даних. Планування роботи, аналіз та обговорення отриманого матеріалу, підготовка рукописів статей проводилися з науковим керівником і к.б.н. Семчишин Г.М. Технічну допомогу при виконанні експериментів здійснювали студенти природничого факультету Прикарпатського національного університету ім. В. Стефаника - О. Абрат, О. Вітенко і О. Побуцька.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення, висновки дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на І міжнародній конференції студентів і аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2005), VIII міжнародній науково-практичній конференції “Наука і освіта `2005” (Дніпропетровськ, 2005), ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), 6-й Парнасівській конференції “Molecular mechanisms of cellular signaling” (Краків, Польща, 2007), звітно-наукових конференціях та засіданнях кафедри біохімії Прикарпатського національного університету ім. В. Стефаника (Івано-Франківськ, 2005-2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових виданнях та 5 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, трьох розділів результатів досліджень і та їх обговорення, аналізу та узагальнення результатів дослідження, списку використаних джерел. Робота викладена на 133 сторінках машинописного тексту і містить 30 рисунків та 11 таблиць. Список літератури складається з 194 джерел і розміщений на 19 сторінках.

Основний зміст роботи

Огляд літератури

У розділі роботи подана узагальнена інформація про механізми антиоксидантного захисту S. cerevisiae та особливості регуляції антиоксидантної системи дріжджів за оксидативного стресу, спричиненого пероксидом водню. Розглянуті механізми утворення АФК у клітині та основні типи окисних пошкоджень білків, охарактеризовані структура і особливості функціонування каталаз S. cerevisiae.

Матеріали і методи досліджень

У роботі використовували наступні штами S. cerevisiae: YPH250 (дикий тип, MATa trp1-Д1 his 3-Д200 lys2-801 leu2-Д1 ade2-101 ura3-52); YTT7 (YPH250 ctt1::URA3), дефектний за цитозольною каталазою; YIT2 (YPH250 cta1::TRP1), дефектний за пероксисомною каталазою; YWT1 (YPH250 ctt1::URA3 cta1::TRP1), дефектний за цитозольною та пероксисомною каталазами; YPH250 (Дyap1) (YPH250 yap1Д::HIS3), дефектний за регуляторним білком Yap1; YPH98 (дикий тип, MATa ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1-Д1 leu-Д1); EG103 (дикий тип, MATб leu2 his3-Д1 trp1-289a ura3-52 CAL- mal); EG110 (EG103 sod2::TRP1), дефектний за Mn-СОД; EG118 (EG103 sod1::URA3), дефектний за Cu,Zn-СОД. Штами YPH250, YTT7, YIT2, YWT1, YPH250 (Дyap1) люб'язно надано професором Й. Інуе (Кіотський університет сільського господарства, Японія), EG103, EG110, EG118 - професором E.Б. Гралла (Каліфорнійський університет, Лос-Анджелес, США), YPH98 - професором M.Б. Толедано (Лабораторія біохімії і молекулярної генетики, Гіф-сюр-Іветт, Франція).

Клітини культивували при 28єС на шейкері (120 об./ хв) в живильному середовищі YPD, яке містило 1% глюкози, 2% пептону і 1% дріжджового екстракту. Приріст кількості клітин у культурі за певний проміжок часу оцінювали за зміною оптичної густини клітинної суспензії при довжині хвилі 600 нм. По досягненні культурою дріжджів середини експоненційної фази росту клітини збирали центрифугуванням і ресуспендували в 50 мМ калій-фосфатному буфері (КФБ, рН 7,0) або в свіжому живильному середовищі наведеного вище складу. Умови голодування створювали, переводячи культури в стаціонарній фазі росту в стерильну дистильовану воду на 4 доби при 28єС. Клітини інкубували з пероксидом водню протягом 30-120 хв при 28єС. Для блокування синтезу білка, культури попередньо інкубували з циклогексимідом (15 мкг/мл) протягом 60 хв (Branco M. et al., 2004). Для підрахунку кількості життєздатних клітин використовували метод серійних розведень (Мейнел Дж., Мейнел Э., 1976). Для визначення біохімічних показників клітини збирали центрифугуванням, промивали 50 мМ КФБ і руйнували на вортекс-міксері зі скляними кульками в середовищі, яке містило 50 мМ КФБ, 0,5 мМ ЕДТА і 1 мМ фенілметилсульфонілфториду, інгібітору протеаз.

Активність ферментів визначали в безклітинних екстрактах дріжджів спектрофотометричним методом при температурі 20±1єС. Активність супероксиддисмутази [СОД, КФ 1.15.1.1] визначали за ступенем інгібування реакції окислення кверцетину супероксид-аніоном при 406 нм (Семчишин Г.М. и др., 2004). Активність каталази визначали, реєструючи зниження поглинання світла Н2О2 при 240 нм (Aebi Н., 1984). Активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази [Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49] та активність глутатіонредуктази [ГР, КФ 1.6.4.2] визначали за зміною концентрації NАDPН при 340 нм (Lushchak V. et al., 2005). Активність ізоцитратдегідрогенази [ІДГ, КФ 1.1.1.41] визначали за зміною концентрації NАDН при 340 нм (Yang J.-H. et al., 2003). Вміст карбонільних груп білків визначали спектрофотометричним методом при 370 нм за кількістю динітрофенілгідразонів, утворених при взаємодії цих груп з 2,4-динітрофенілгідразином (Levine R.L., 2000).

Концентрацію білка визначали методом Бредфорда (Bradford М.М., 1976), використовуючи як стандарт альбумін сироватки бика. Статистичну обробку отриманих даних та аналіз кінетичних параметрів здійснювали відповідно за допомогою комп'ютерних програм “Mynova”та “Kinetics” (Brooks S.P., 1992). Дані представлено як середнє ± похибка середнього.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив пероксиду водню на виживання клітин і активність антиоксидантних ферментів S. cerеvisiae в середині експоненційної фази росту. У першій серії дослідів встановили, що за чутливістю до пероксиду водню відрізняються навіть ті штами S. сerеvisiae, які не мають дефектів за антиоксидантними ферментами (рис. 1). Найстійкішими до дії пероксиду водню виявились клітини штаму YPH250, а найменш стійкими - клітини штаму EG103.

Детоксикація Н2О2 в клітинах S. сerеvisiae здійснюється, головним чином, різними ізоферментами каталази (Ruis Н., Kцller F., 1997). Проте раніше було показано, що у S. cerevisiae каталаза не відіграє значної ролі в забезпеченні стійкості їх культури до пероксиду водню в ранній експоненційній фазі росту (Izawa S. et al., 1996). У наших експериментах знайдено, що в середині експоненційної фази за відсутності обох форм каталази життєздатність клітин дріжджів за дії Н2О2 істотно знижувалася (рис. 2). Отже, каталаза відіграє важливу роль у захисті S. cerevisiae від пероксиду водню після досягнення культурою. дріжджів середини експоненційної фази росту. Зроблений висновок підтверджується також рис. 3, який демонструє позитивну кореляцію між активністю каталази всіх досліджуваних штамів у контролі і виживанням клітин цих штамів після обробки 10 мМ Н2О2.

Для з'ясування можливого механізму адаптації дріжджів до Н2О2 в наших умовах, досліджувались активності антиоксидантних ферментів. Пероксид водню (0,25 мМ) призводив до зростання активності каталази в клітинах штамів YPH250 і YPH98 - в 3,5 і 2,0 рази відповідно, але не впливав на таку в клітинах штаму EG103 (табл. 1). Активність СОД за дії 0,25 мМ Н2О2 зросла в клітинах штаму YPH250 і не змінилася у двох інших штамів. Таким чином, досліджувані штами відрізняються за здатністю реагувати на дію Н2О2 підвищенням активності каталази і СОД. Це також може бути причиною різної чутливості їхніх клітин до Н2О2. Різниця в чутливості, в свою чергу, може залежати від генетичних особливостей, які безпосередньо не зачіпають антиоксидантну систему.

Таблиця 1 Активність каталази та СОД дріжджів S. cerevisiae в середині експоненційної фази росту за дії 0,25 мМ Н2О2 протягом 30 хв (n=3-8)

Примітки. *Вірогідно відрізняється від відповідних значень у контролі з р<0,001. ‡Представлені дані одного експерименту. ЦГ - циклогексимід.

Варто зазначити, що пероксид водню не призводив до зміни активності каталази та СОД у клітинах штаму, дефектного за геном регуляторного білка Yap1, і в клітинах штамів YPH250 та YPH98 в присутності циклогексиміду, інгібітору біосинтезу білка в еукаріотів. Отже, відповідь S. cerevisiae на дію Н2О2 в середині експоненційній фазі росту контролюється регуляторним білком Yap1 і потребує синтезу нових молекул антиоксидантних ферментів.На одержані ефекти відносно стійкості та адаптивної відповіді дріжджів на пероксид водню можуть впливати умови індукції стресу. Тому ми дослідили відповідь S. cerevisiae на дію Н2О2 за різних умов створення стресу. В експериментах, описаних вище, впливу пероксиду водню піддавались клітини ресуспендовані в 50 мМ КФБ (рН 7,0) до оптичної густини 0,1 при 600 нм. Подальші досліди проводили на клітинах штаму YPH98 за наступних умов індукції стресу: за низької (OD600 0,1) і високої (OD600 0,5) концентрації клітин в 50 мМ КФБ або середовищі YPD. Адаптивна відповідь клітин на дію низьких концентрацій Н2О2 не залежала від концентрації клітин у суспензії, але склад середовища інкубації істотно впливав на неї (рис. 4). Пероксид водню в концентраціях 0,25 і 0,50 мМ призводив до зростання активності каталази в 2-3 рази і СОД в 1,6 рази в клітинах, ресуспендованих у живильному середовищі. У клітинах, інкубованих у КФБ, ці ж концентрації Н2О2 призводили до зростання активності каталази в 1,4-2,0 рази, але не впливали на активність СОД. При вищих концентраціях Н2О2 активності каталази та СОД за всіх умов індукції стресу знижувались.

Щоб детальніше з'ясувати, яку роль відіграє кожна з форм каталази у відповіді дріжджів на дію Н2О2, дослідили її активність у клітинах штамів, дефектних за різними ізоферментами каталази (табл. 2). Пероксид водню (0,5 мМ) призводив до зростання активності каталази в 2,8 рази в клітинах штаму YTT7 (Дctt1) і в 1,2 рази в клітинах штаму YIT2 (Дcta1). Таким чином, Н2О2 активує у клітинах дріжджів обидві форми каталази.

Варто зазначити, що інкубація з 0,5 мМ Н2О2 призводила до зростання активності СОД у клітинах одинарних мутантів (табл. 2) та у вихідного штаму YPH250, проте не впливала на активність цього ферменту в безкаталазного штаму YWT1 (рис. 5Б). Збільшення активності СОД за відсутності каталазної активності при дії пероксиду водню могло б викликати загибель клітини, оскільки функціонування СОД може призводити до підвищення стаціонарної концентрації Н2О2. Все це свідчить на користь твердження про узгодження функціонування каталази та СОД у клітинах живих організмів.

Таблиця 2 Активність каталази і СОД дріжджів S. cerevisiae, дефектних за цими ферментами, в середині експоненційної фазі росту за дії 0,5 мМ Н2О2 протягом 30 хв (n=3-5)

Примітки. *Вірогідно відрізняється від відповідних значень у контролі з Р<0,05. †Дані одного експерименту. НВ - не виявлена.

У S. cerevisiae наявні дві форми СОД - цитозольна Cu,Zn-СОД і мітохондріальна Mn-СОД (Gralla E.B., 1997). Для вивчення участі кожної з форм СОД в адаптації дріжджів до дії Н2О2 ми використали штами, дефектні за цими ізоферментами (табл. 2). У клітинах штаму EG110, дефектного за Mn-СОД, активність каталази і СОД за дії 0,5 мМ Н2О2 зросла майже вдвічі. У клітинах штаму EG118, дефектного за Cu,Zn-СОД, пероксид водню не викликав змін активності СОД, проте призводив до зниження активності каталази в 2,0 рази. Отримані результати дозволяють припустити, що у функціональній взаємодії каталази і СОД за дії Н2О2 в клітинах дріжджів, насамперед, бере участь Cu,Zn-СОД.

Раніше було встановлено, що Н2О2 в концентраціях 0,2-0,8 мМ індукує синтез цитозольної каталази в 14,7, Mn-СОД - в 5,9 і Cu,Zn-СОД - в 4,3 рази (Godon С. et al., 1998, Lee J. et al., 1999). У наших експериментах, як бачимо, ступінь зростання активності каталази і СОД у кілька разів нижчий, ніж рівень синтезу, який спостерігали французькі дослідники. До того ж, нами відзначене суттєве зростання активності пероксисомної каталази за даних умов, хоча змін у рівні її синтезу раніше не знаходили (Godon С. et al., 1998; Jamieson D. et al., 1994). У наших експериментах Н2О2 не впливав на активність Mn-СОД, проте в дослідженнях інших авторів інтенсивність синтезу цієї форми ферменту зростала за дії Н2О2 (Godon C. et al., 1998). Відомо, що реорганізація експресії генів і синтезу білків є одним з найбільш важливих аспектів адаптації клітин до оксидативного стресу, проте кінцевим етапом адаптивної відповіді на стрес виступає активність відповідних ферментів. Вона, в свою чергу, регулюється не тільки на рівні транскрипції і трансляції, а також багатьма іншими механізмами. Так, можна припустити, що частина молекул ферменту синтезованих de novo знаходиться в неактивній формі, але активується при раптовому збільшенні дози стресора.

На наступному етапі було досліджено, як змінюється активність каталази і СОД у клітинах штаму YPH250 за дії різних концентрацій Н2О2 (рис. 5А і 5Б). Як бачимо, найвища активність даних ферментів спостерігалася в клітинах, оброблених 0,25 мМ Н2О2. За вищих концентрацій пероксиду водню активність ферментів знижувалась. Слід зазначити, що між активністю каталази і СОД у штамі YPH250 знайдено тісну позитивну кореляцію (рис. 6А), яка свідчить про узгоджене функціонування цих ферментів у клітинах дріжджів - або про спільний механізм регуляції чи про взаємозахист від інактивації. Беручи до уваги те, що пероксид водню спричиняє карбонілювання Cu,Zn-СОД (Costa V. et al., 2002), на яку припадає до 90% загальної активності СОД (Sturz L.A. et al., 2001), зменшення активності ферменту в клітинах дріжджів після обробки високими концентраціями Н2О2 може бути пов'язане з інактивацією саме Cu,Zn-СОД. Зниження активності каталази за дії 3,5-10,0 мМ Н2О2 можна пояснити інгібуванням ферменту високими концентраціями субстрату (Семчишин Г.М. та ін., 2001). У безкаталазного штаму YWT1 за дії низьких концентрацій Н2О2 активність СОД не відрізнялася від контролю і знижувалася за дії високих концентрацій, як це спостерігалося і для батьківського штаму YPH250 (рис. 5). Водночас нами виявлено, що низький рівень виживання клітин штаму YWT1 за дії стресу, індукованого Н2О2, позитивно корелює зі зменшенням активності СОД (рис. 6Б). Це свідчить про те, що СОД, як і каталаза, бере участь у захисті клітин дріжджів від пероксиду водню в середині експоненційної фази росту.

Відомо, що в підтриманні окисно-відновного балансу клітин важлива роль належить ферментам, задіяним у синтезі низькомолекулярних антиоксидантів або відновних еквівалентів (Jamieson D., 1998). Такими ферментами є глутатіонредуктаза, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа та ізоцитратдегідрогеназа. Пероксид водню за всіх використаних концентрацій призводив до зниження активності вказаних вище ферментів у клітинах батьківського YPH250 і безкаталазного YWT1 штамів (щоправда, в клітинах штаму YPH250 взагалі не виявлено активності ІДГ) (табл. 3). Ці результати не узгоджуються з повідомленнями інших дослідників, які спостерігали збільшення інтенсивності синтезу чи активності ГР і Г6ФДГ за дії низьких концентрацій Н2О2 (Godon C. et al., 1998; Izawa S. et al., 1998). З іншого боку, знайдено, що ГР, Г6ФДГ та ІДГ дуже чутливі до окислення (Lushchak V., Gospodaryov D., 2005; Huang Y.C. et al., 2000). Нами виявлено чітку позитивну кореляцію між активностями каталази і Г6ФДГ (r2=0,710), каталази і ГР (r2=0,768) для дикого штаму YPH250 та між активностями СОД і Г6ФДГ (r2=0,785), СОД і ІДГ (r2=0,839) для безкаталазного штаму YWT1, клітини яких інкубували з Н2О2 різних концентрацій.

Таблиця 3 Активність ГР, Г6ФДГ і ІДГ (нмоль/(хв·мг білка)) у дріжджів S. cerevisiae YPH250 (дикий штам) і YWT1 (безкаталазний штам) в середині експоненційної фази росту за дії Н2О2 протягом 30 хв (n=4-8)

Примітка. *Значення вірогідно відрізняється від значень в контролі (без H2O2) з Р<0,05.

Можна припустити, що за стресових умов, використаних у цьому експерименті, пероксид водню чи/і продукти його метаболізму спричиняють окисні пошкодження ГР, Г6ФДГ і ІДГ, а каталаза і СОД відіграють важливу роль у захисті цих ферментів від інактивації.

Вплив пероксиду водню на антиоксидантний захист S. cerevisiae в умовах голодування. При нестачі живильних речовин у S. cerevisiae набір генів, які експресуються, суттєво змінюється, порівняно з таким при рості на багатому середовищі (Gash А.Р., 2002). Ці зміни можуть впливати на відповідь клітин на дію пероксиду водню. Наші результати свідчать про те, що каталаза відіграє важливу роль у забезпеченні стійкості культур S. сerevisiae до Н2О2 не тільки в середині експоненційної фази, але й в стаціонарній фазі росту за умов нестачі живильних речовин. Так, відсоток життєздатних клітин у дикого штаму YPH250 в умовах голодування після 30-хвилинної обробки пероксидом водню був вищим, ніж у безкаталазного штаму YWT1. Для того, щоб дослідити можливий механізм адаптації дріжджів до пероксиду водню в умовах голодування, ми вивчали вплив Н2О2 на активність СОД, ГР, Г6ФДГ і ІДГ у дикого і дефектного за каталазами штамів S. сerevisiae (табл. 4). Інкубація клітин штаму YPH250 з 0,5 мМ Н2О2 призводила до зростання активності каталази в 1,4 рази. Водночас активність СОД за даних умов знизилась в 1,4 рази, що, можливо, пояснюється її окисною інактивацією Н2О2 (Сosta V.M. et al., 2002). Активність ГР, Г6ФДГ та ІДГ у дикому штамі суттєво не змінилась, а в клітинах безкаталазного штаму знизилась приблизно в 1,5 рази внаслідок стресу, індукованого Н2О2.

Таблиця 4 Активність ферментів та вміст карбонільних груп білків у дріжджів S. cerevisiae YPH250 (дикий штам) i YWT1 (безкаталазний штам) за голодування і дії 0,5 мМ Н2О2 протягом 30 хв (n=3-7)

Примітки. *Вірогідно відрізняється від відповідних значень у контролі з Р<0,05. aBірогідно відрізняється від відповідних значень штаму YPH250 з Р<0,05. НВ - активності не виявлено.

Цей факт узгоджується з інформацією про підвищену чутливість даних ферментів до дії оксидантів (Lushchak V., Gospodaryov D., 2005; Huang Y.C. et al., 2000). До того ж, на відміну від дикого штаму, пероксид водню призводив до збільшення вмісту карбонільних груп білків у 1,4 рази в клітинах безкаталазного штаму. Отримані результати свідчать про те, що каталаза відіграє важливу роль у запобіганні окисних пошкоджень клітинних білків за дії Н2О2 в умовах голодування.

Інгібування каталаз 3-аміно-1,2,4-триазолом in vivo та in vitro. 3-аміно-1,2,4-триазол (АМТ) - інгібітор каталази, який широко використовується для вивчення функцій даного ферменту (Putnam C.D. et al., 2000). Нами показано, що при вирощуванні на середовищі з глюкозою АМТ в концентраціях нижчих 10 мМ не впливає на ріст культур дикого штаму YPH250. Це добре узгоджується з інформацією інших дослідників про те, що каталаза не є необхідною для росту S. cerеvisiae на середовищі з глюкозою.

Ступінь інгібування активності каталази АМТ у клітинах штаму YPH250 in vivo не залежав від середовища інкубації, але на нього впливали концентрація клітин та концентрація інгібітора (табл. 4).

Оскільки характер інгібування каталази in vivo може залежати від проникнення АМТ у клітину, нами було досліджено, як впливає АМТ на активність каталази в препаратах зруй-нованих клітин S. cerevisiae. Пероксисомна форма каталази in vitro виявилася чутливішою до АМТ, ніж цитозольна.

Таблиця 5 Інгібування активності каталази (%) S. cerevisiae YPH250, інкубованих з АМТ протягом 24 год при 28єС за різної концентрації клітин у 50 мМ КФБ (рН 7,0) і 0,9% NaCl

Примітка. Представлено дані типового експерименту. НВ - не визначали.

В експериментах на тваринах було показано що інгібування каталази амінотриазолом призводить до розвитку оксидативного стресу (Bagnyukova T.V. et al., 2005). Тому нами було проаналі-зовано, як впливає інгібування каталази 10 мМ АМТ на вміст карбонільних груп білків та активність СОД і ГР у клітинах штаму YPH250, ресуспендованих в 0,9% NaCl (табл. 6). Активність СОД і вміст білкових карбонілів не змінилися при інкубації дріжджів з АМТ, проте активність глутатіонредуктази зросла в 1,4 рази. Це може свідчити про індукцію додаткових захисних механізмів, направлених на компенсацію функцій каталази, коли фермент заінгібований.

Таблиця 6 Активність ферментів та вміст карбонільних груп білків у дріжджів S. cerevisiae YPH250, інкубованих з 10 мМ АМТ протягом 24 год

Примітка. *Вірогідно відрізняється від відповідних контрольних значень з Р<0,05, n=4-5.

Підсумовуючи отримані дані, можна дійти висновку, що здатність клітин S. cerevisiae виживати за дії пероксиду водню залежить від потужності їхніх антиоксидантних систем. На антиоксидантний потенціал клітини, у свою чергу, впливають її генетичні особливості, умови культивування та індукції оксидативного стресу, фаза росту культури тощо. Важлива роль у забезпеченні стійкості клітин до пероксиду водню як у середині експоненційної фази росту, так і за умов голодування належить каталазі. Пероксид водню залежно від концентрації та особливостей штаму може викликати як активацію, так й інактивацію антиоксидантних ферментів у дріжджів S. сerevisiae (рис. 1).

Рис. 9. Шляхи функціонування каталази в клітинах S. cerevisiae за дії оксидативного стресу, індукованого Н2О2.

За низьких концентрацій Н2О2 спричиняє адаптивну активацію каталази і/чи СОД, а за високих - зниження активності даних та деяких інших антиоксидантних ферментів. Активація антиоксидантних ферментів дозволяє клітині відновити внутрішньоклітинний гомеостаз і збільшує її шанси вижити за наступного сильнішого стресу. З іншого боку, ступінь інактивації ГР, Г6ФДГ і ІДГ суттєво залежить від активності каталази, що свідчить про те, що in vivo каталази, ймовірно, запобігають окисним пошкодженням цих білків у клітинах дріжджів, підданих дії пероксиду водню у вибраних нами умовах.

Висновки

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і вирішення окремих аспектів проблеми захисту дріжджів S. cerevisiae від оксидативного стресу, спричиненого пероксидом водню. Виявлено, що відповідь S. cerevisiae на дію Н2О2 залежить як від способу індукції стресу, так і від генетичних і фізіологічних особливостей штамів. Отримані результати поглиблюють знання про роль каталази в захисті S. cerevisiae від пероксиду водню в експоненційній фазі росту культури і за умов голодування.

1. Відповідь S. cerevisiae в середині експоненційної фази росту на оксидативний стрес, індукований 0,25-0,5 мМ Н2О2, полягає в збільшенні активності каталази та супероксиддисмутази, проте величина цього ефекту залежить від штаму і блокується циклогексимідом, інгібітором біосинтезу білка. Відмінності в активності каталази і супероксиддисмутази в дріжджів дикого типу зумовлюють різну чутливість їхніх клітин до високих концентрацій пероксиду водню. У відповіді S. cerevisiae на дію пероксиду водню беруть участь обидва ізоферменти каталази та Cu,Zn-вмісна, але не Mn-вмісна супероксиддисмутаза.

2. Модифікація активності каталази і супероксиддисмутази в клітинах S. cerevisiae за дії оксидативного стресу залежить від умов його індукції, а саме: від складу середовища інкубації, концентрації і часу обробки пероксидом водню, кількості клітин у суспензії. Так, у клітинах штаму YPH98, ресуспендованих у середовищі з 1% глюкозою, за дії 0,25 мМ і 0,5 мМ Н2О2 протягом 30 хв активність каталази зростає в 2-3 рази і СОД в 1,6 рази, а при індукції стресу в 50 мМ калій-фосфатному буфері активується тільки каталаза - в 1,4-2,0 рази.

3. Пероксид водню за високих концентрацій призводить до інактивації антиоксидантних та пов'язаних з ними ферментів у клітинах S. cerevisiae в середині експоненційної фази росту. Узгоджене функціонування каталази і супероксиддисмутази за цих умов знижує ймовірність окисних пошкоджень захисних білків.

4. У середині експоненційної фази росту культури відсоток життєздатних клітин дикого YPH250 та безкаталазного YWT1 штамів після обробки 5 мМ Н2О2 протягом 30 хв становить 52 і 20%, а за голодування - 82 і 48% відповідно. Отже, каталаза забезпечує стійкість S. cerevisiae до пероксиду водню в даних умовах.

5. Стрес, індукований 0,5 мМ Н2О2 в умовах голодування, призводить до збільшення вмісту карбонільних груп білків і зниження активності глутатіонредуктази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, ізоцитратдегідрогенази в 1,4 рази в безкаталазного штаму YWT1, проте не впливає на ці показники та викликає зростання активності каталази в 1,5 рази в дикого штаму YPH250. Отже, за голодування каталаза запобігає окисленню клітинних білків за дії пероксиду водню.

6. Ступінь інгібування каталази 3-аміно-1,2,4-триазолом in vivo й in vitro залежить від концентрації інгібітора та часу інкубації. Пероксисомна форма каталази in vitro чутливіша до дії АМТ, ніж цитозольна. Зниження активності каталази S. cerevisiae YPH250, інкубованих з 10 мМ АМТ в 0,9% NaCl, на 65% супроводжується збільшенням активності глутатіонредуктази в 1,4 рази, що свідчить про індукцію компенсаторних механізмів.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Байляк М.М., Абрат О.Б., Семчишин Г.М., Лущак В.І. Виживання і антиоксидантний захист дріжджів Saccharomyces cerevisiae за умов голодування і оксидативного стресу // Укр. біохім. журн. - 2005. - Т. 77, № 4. - С. 97-102.

Дисертант здійснювала всі етапи моделювання умов голодування і оксидативного стресу, визначала всі показники, статистично обробила дані та брала участь у написанні рукопису статті.

2. Байляк М.М., Семчишин Г.М., Лущак В.І. Участь каталази та супероксиддисмутази у відповіді на дію пероксиду водню дріжджів Saccharomyces cerevisiae в експоненційній фазі росту // Укр. біохім. журн. - 2006. - Т. 78, № 2. - С. 79-85.

Планування, експериментальна частина роботи, а також статична обробка даних та написання рукопису статті здійснені дисертантом.

3. Байляк М.М., Семчишин Г.М., Лущак В.И. Влияние перекиси водорода на активность антиоксидантных ферментов Saccharomyces cerevisiae зависит от особенностей штаммов // Биохимия (Москва). - 2006. - Т. 71, № 9. - С. 1243-1252.

Дисертант запланувала роботу, здійснювала моделювання умов оксидативного стресу, визначала всі показники, статистично обробила дані та брала участь у написанні рукопису статті.

4. Bayliak М.М., Semchyshyn Н.M., Lushchak V.I. Possible accumulation of non-active molecules of catalase and superoxide dismutase in S. cerevisiae cells under hydrogen peroxide induced stress // Central European Journal of Biology. - 2007. - Vol. 2, N 3. - P. 326-336.

Дисертант запланувала роботу, здійснювала моделювання умов оксидативного стресу, визначала всі показники, статистично обробила дані.

5. Байляк М.М. Вивчення ролі каталаз в стійкості Saccharomyces cerevisiae до пероксиду водню в умовах голодування // VIII Міжнародна науково-практична конференція „Наука і освіта '2005”. - Дніпропетровськ, 2005. - С. 67-69.

6. Абрат О.Б., Байляк М.М. Відповідь Saccharomyces cerevisiae на дію пероксиду водню в умовах голодування // Тези доп. Першої Міжнарод. конф. студ. і аспір. „Молодь і поступ біології”. - Львів: СПОЛОМ. - 2005. - С. 3.

7. Байляк М.М., Абрат О.Б. Активність ферментів в експоненційних культур безкаталазного штаму Saccharomyces cerevisiae за дії Н2О2 // Тези доп. Першої Міжнарод. конф. студ. і аспір. „Молодь і поступ біології”. - Львів: СПОЛОМ. - 2005. - С. 3.

8. Байляк М.М. Роль каталази в адаптації Saccharomyces cerevisiae до пероксиду водню в середині експоненційної фази росту // Матеріали ІХ Укр. біохім. з'їзду. - Т. 1. - Харків, 2006. - С. 98.

9. Bayliak М., Semchyshyn Н., Lushchak V. Possible accumulation of non-active molecules of catalase and superoxide dismutase in Saccharomyces cerevisiae under mild oxidative stress // 6th Parnas conf. - Krakow (Poland): Acta Biochim. Polon. - Vol. 54, N2. - 2007. - P. 31.

Анотація

Байляк М.М. Особливості антиоксидантного захисту дріжджів Saccharomyces cerevisiae на різних фазах росту культури. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Чернівецький національний університет ім. Ю. Федьковича, Чернівці, 2007.

Дисертація присвячена проблемі захисту дріжджів S. cerevisiae на різних фазах росту культури від оксидативного стресу, викликаного пероксидом водню. Виявлено, що виживання клітин S. cerevisiae за дії Н2О2 в середині експоненційної фази росту залежить від їх каталазної активності. Стійкість S. cerevisiae до пероксиду водню в цих умовах забезпечують як цитозольна, так і пероксисомна форми каталази. Пероксид водню в концентраціях 0,25-0,5 мМ призводив до зростання активності каталази та СОД у клітинах дикого типу. Даний ефект блокувався циклогексимідом. За дії вищих концентрацій пероксиду водню активності антиоксидантних ферментів знижувалися. У клітинах, оброблених Н2О2, активність СОД позитивно корелювала з активністю каталази. Висловлено припущення, що каталаза і СОД беруть участь у захисті один одного та інших ферментів від інактивації при обробці клітин S. cerevisiae Н2О2 в експоненційній фазі росту.

Встановлено, що каталаза частково запобігає окисним пошкодженням білків, зокрема деяких антиоксидантних ферментів, і необхідна для забезпечення стійкості S. cerevisiae за дії Н2О2 в умовах нестачі живильних речовин. Зроблено висновок про важливу роль каталази в захисті S. cerevisiae за дії пероксиду водню в середині експоненційної фази росту і за умов голодування. Захист каталазою клітин дріжджів від дії Н2О2 здійснюється узгоджено з іншими антиоксидантними ферментами.

Ключові слова: пекарські дріжджі, Saccharomyces cerevisiae, пероксид водню, каталаза, супероксиддисмутаза (СОД), експоненційна фаза росту, голодування.

Аннотация

Байляк М.М. Особенности антиоксидантной защиты дрожжей Saccharomyces cerevisiae на разных фазах роста культуры. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. - биохимия. - Черновицкий национальный университет им. Ю. Федьковича, Черновцы, 2007.

Диссертация посвящена проблеме защиты дрожжей S. cerevisiae от действия окислительного стресса, индуцированного перекисью водорода, на разных фазах роста их культуры. Установлено, что как цитозольная, так и пероксисомальная формы каталазы обеспечивают стойкость культур S. cerevisiae к перекиси водорода в середине экспоненциальной фазы роста. Штаммы дрожжей, не имеющие дефектов по компонентам антиоксидантной защиты, отличались чувствительностью к перекиси водорода. Обнаружено, что выживаемость клеток различных штаммов, обработанных перекисью водорода, зависит от их каталазной активности. Четкая связь также найдена между выживаемостью клеток и активностью СОД бескаталазного штамма при действии перекиси водорода. В концентрациях 0,25-0,5 мМ перекись водорода приводила к увеличению активности каталазы в 1,5-3,0 раза и СОД в 1,5-2,0 раза в клетках дикого типа, причем данный эффект блокировался циклогексимидом. Показано, что при действии перекиси водорода активируются обе формы каталазы и Cu,Zn-CОД. Высокие концентрации Н2О2 приводили к снижению активностей антиоксидантных и связанных с ними ферментов. В клетках, обработанных перекисью водорода разных концентраций, активность каталазы положительно коррелировала с активностью СОД, что свидетельствует о согласованном функционировании данных ферментов при действии стресса. Положительная корреляционная связь найдена между активностями каталазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, каталазы и глутатионредуктазы, а также между активностями СОД и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, СОД и изоцитратдегидрогеназы. Сделан вывод о том, что in vivo перекись водорода или же продукты ее метаболизма способствуют окислению глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы и изоцитратдегидрогеназы, а каталаза и СОД играют важную роль в защите этих ферментов от инактивации.

Выживаемость клеток бескаталазного штамма дрожжей была значительно ниже, чем у исходного, при действии перекиси водорода в условиях голодания. Вследствие инкубации клеток с 0,5 мМ Н2О2 содержание карбонильных групп белков в клетках исходного штамма не изменилось, а дефектного - увеличилось в 1,4 раза. Это может свидетельствувать о том, что в условиях голодания каталаза принимает участие в защите клеточных белков от окислительной модификации. Частичное ингибирование каталазы 3-амино-1,2,4-триазолом в условиях голодания не приводило к увеличению содержания карбонильных групп белков в клетках дикого штамма, но сопровождалось возрастанием активности глутатионредуктазы. В экспериментах in vitro показано, что пероксисомальная каталаза более чувствительна к действию 3-амино-1,2,4-триазола, чем цитозольная.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что каталаза является важным фактором клеточного ответа на действие перекиси водорода. Защита каталазой клеток S. сerevisiae от стрессорного действия перекиси водорода осуществляется координировано с другими антиоксидантными ферментами.

Ключевые слова: пекарские дрожжи, Saccharomyces cerevisiae, перекись водорода, каталаза, супероксиддисмутаза (СОД), экспоненциальная фаза роста, голодание.

Summary

Bayliak M.M. Peculiarities of antioxidant defense of yeast Saccharomyces cerevisiae at different phases of growth. - Manuscript.

The thesis for the candidate's degree in speciality 03.00.04. - Biochemistry. - Chernivtsi National Unisersity named after Yu. Fed'kovych, Chernivtsi, 2007.

The thesis is devoted to the problem of protection of the yeast S. cerevisiae at different phases of growth against oxidative stress induced by hydrogen peroxide. It has been shown that survival of yeast cells treated with Н2О2 at middle exponential phase depends on catalase activity. Тhe resistance of S. cerevisiae сеlls to Н2О2 is provided by both peroxisomal and cytosolic catalases. Hydrogen peroxide at concentrations of 0.25-0.50 mM increased catalase and SOD activities in wide-type cells. This effect was cancelled by cycloheximide, an inhibitor of protein synthesis in eukaryotes. At higher concentrations Н2О2 decreased antioxidant enzyme activities. In cells treated with different Н2О2 concentrations catalase activity correlated positively with SOD activity. It has been supposed that catalase and SOD play an important role in protection of each other and some enzymes against inactivation in exponentially grown S. cerevisiae under Н2О2-stress.

It was found that catalase plays an important role in resistance of S. cerevisiae under starvation and can prevent oxidative modification of some antioxidant and associated enzymes at cell treatment with Н2О2.

It was concluded that catalase play an important role in antioxidant defense of S. cerevisiae treated with Н2О2 in middle exponential phase and under starvation. Protecting of yeast cells against Н2О2 is coordinated by catalase with other antioxidant enzymes.

Key words: baker's yeast, Saccharomyces cerevisiae, hydrogen peroxide, catalase, superoxide dismutase (SOD), exponential growth phase, starvation.

Размещено на Allbest.ru