Особливості пероксидазного окиснення фенольних сполук

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

УДК 547.56:577.151.4:577.152.1

Особливості пероксидазного окиснення фенольних сполук

02.00.10 - біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Осійчук Ольга Володимирівна

Київ 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України

Наукові керівники:

доктор хімічних наук, професор Давиденко Тетяна Іванівна

кандидат хімічних наук, доцент Романовська Ірина Ігорівна, Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, завідувач лабораторії фізико-хімічних основ біотехнології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Коваленко Валентина Миколаївна, Інститут фармакології та токсикології АМН України, завідувач відділу загальної токсикології

доктор хімічних наук, професор Вовк Андрій Іванович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу механізмів біоорганічних реакцій

Провідна установа Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, відділ структури і функції білка

Захист відбудеться 15 червня 2007 р. о 10-й годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02660, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02660, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

Автореферат розісланий 15 травня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

елімінація фенольний пероксидаза біоконверсія

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що фенольні сполуки, які містяться в стічних водах багатьох підприємств ряду галузей (металургійної, нафтохімічної, лакофарбової, фармацевтичної, деревопереробної та ін.) токсичні; більшість з них є канцерогенами і класифікуються як забруднюючі агенти, які становлять небезпеку для здоров'я людей та тварин.

Зараз для видалення фенольних полютантів використовуються різні методи: мікробне окиснення, адсорбція на активованому вугіллі, екстракція, окиснення озоном, хлором, електрохімічне окиснення. Однак ці методи не завжди достатньо ефективні, є дорогими і в ряді випадків сприяють утворенню побічних і навіть більш токсичних продуктів.

Перспективним є ферментативний метод дефенолізації з використанням пероксидази хрону (ПОХ) через високий ступінь видалення фенолів, утворення нерозчинних, легко відокремлюваних продуктів окиснення. Цей метод відрізняється простотою технологічного оформлення та експлуатації, відсутністю внесення додаткових домішок у процесі знефенолювання, а також можливістю проведення процесу в м'яких умовах (широкий діапазон значень рН, температур, концентрацій забруднювачів). Разом з тим, недоліком даного методу є висока вартість комерційного препарату пероксидази та одноразовість використання ферменту.

Тому є актуальним оптимізація методу елімінації фенольних сполук з використанням частково очищеної пероксидази, дослідження впливу структури фенолів на їх реакційну здатність, а також розробка методів іммобілізації ПОХ на носіях, пошук яких триває. При цьому враховується можливість одержання біокаталізаторів з новими функціональними властивостями, що забезпечує їх багаторазове використання в реакціях дефенолізації та підвищену стабільність при використанні і зберіганні.

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт у лабораторії фізико-хімічних основ біотехнології відділу медичної хімії Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України за темами: ”Разработка методов утилизации фенолов и хлорорганических пестицидов” (2003 р, № держ. реєстрації 0103U007260), ”Изучение физико-химических особенностей пероксидазного окисления фенольных соединений” (2000-2002 рр, № держ. реєстрації 0101U001080).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - дослідження впливу структури фенольних сполук та умов їх біоконверсії в присутності вільної та іммобілізованої пероксидази на ступінь їх видалення з водних розчинів.

Відповідно до поставленої мети основні завдання роботи включали:

модифікацію методу виділення пероксидази з коренів хрону і вивчення властивостей отриманого ферменту;

? вивчення та оптимізацію умов пероксидазного окиснення фенолів;

? дослідження кінетичних параметрів (К_m, V_max) пероксидазного окиснення ряду похідних фенолу (фенол, резорцин, пірокатехін, гідрохінон, пірогалол, о-, м-, п-хлорфеноли, 2,4,6-трихлорфенол, пентахлорфенол, о-, м-, п-крезоли, б-нафтол);

? аналіз продуктів ферментативного окиснення досліджуваних фенолів;

? вивчення методами QSAR і QSPR аналізу впливу структури досліджуваних фенольних сполук на ступінь їх біоконверсії і кінетичні параметри (K_m, V_max) з використанням констант Гаммета фенольних замісників, електронних параметрів, ліпофільності і параметрів форми молекул;

? розробка методів іммобілізації пероксидази з використанням як носіїв карагінану з чорноморської водорості Phyllophora nervosa, полі-N-вінілкапролактаму (ПВК) та гідратцелюлозної мембрани;

? вивчення фізико-хімічних властивостей отриманих іммобілізованих форм пероксидази: рН- і термооптимумів, рН- і термостабільності, кінетичних параметрів, стабільності при зберіганні, багаторазовості використання в реакціях видалення фенольних сполук з розчинів і стоків.

Об'єкт дослідження - пероксидаза хрону як каталізатор окиснення фенольних сполук.

Предмет дослідження - стабілізація активності пероксидази методами іммобілізації з метою дефенолізації, QSAR аналіз впливу структури фенольних полютантів на їх реакційну здатність у реакціях ферментативного окиснення.

Методи дослідження - УФ-, ІЧ-спектроскопія, мас-спектрометрія, електрофорез у ПААГ, віскозиметрія, варіаційна статистика, комп'ютерний аналіз.

Наукова новизна отриманих результатів. Проведено порівняння існуючих методів виділення пероксидази з коренів хрону, знайдено оптимальний спосіб, в подальшому модифікований, в результаті чого отримано частково очищений ферментний препарат, схожий за властивостями з комерційним препаратом ПОХ (“Sigma”, США).

Встановлено умови пероксидазного окиснення ряду похідних фенолу (фенол, резорцин, пірокатехін, гідрохінон, пірогалол, о-, м-, п-хлорфеноли, 2,4,6-трихлорфенол, пентахлорфенол, о-, м-, п-крезоли, б-нафтол). Вивчено вплив температури, рН інкубаційного середовища, співвідношення реагентів, активаторів (іони Са²⁺, Mn²⁺) і стабілізаторів активності ПОХ (БСА, ПВП, ПЕГ-6000). Досліджено тривалість інкубації, субстрат-субстратну активацію в реакціях, які каталізуються ПОХ, що приводить до максимального ступеня їх біоконверсії, залежно від структури субстрату, з утворенням нерозчинних у воді та органічних розчинниках полімерних продуктів. Проведено аналіз продуктів ферментативного окиснення досліджуваних фенольних полютантів (ІЧ-спектроскопія, мас-спектрометрія, ТШХ).

Вперше проведено QSAR аналіз, що дозволяє прогнозувати для досліджуваних ароматичних субстратів пероксидази ступінь біоконверсії залежно від їх структури, ґрунтуючись на значеннях констант Гаммета замісників фенолів та енергій граничних орбіталей (E_HUMO, E_LUMO).

Проведено аналіз кількісного зв'язку (QSPR) між структурою фенолів та їх реакційною здатністю (V_max, K_m) в реакціях пероксидазного окиснення, з використанням розширеного набору структурних параметрів, що описують форму молекули фенольної сполуки (асферичність, моменти інерції), її електронну структуру (E_HOMO, E_LUMO, парціальний заряд фенольного атома кисню, сумарна електронегативність атомів, дипольний момент) і ліпофільність.

Вперше розроблено методи іммобілізації пероксидази включенням її в гелі карагінану з чорноморської водорості Phyllophora nervosa і полі-N-вінілкапролактаму, в гідратцелюлозну мембрану ”Діацелл” і ковалентного зв'язування з нею. В результаті отримано ферментні препарати з високим збереженням пероксидазної активності і стабільності при зберіганні.

Вивчено властивості іммобілізованих препаратів ПОХ: рН- і термооптимуми, рН- і термостабільність, кінетичні параметри, стабільність при зберіганні, можливість функціонування в середовищі органічних розчинників, багаторазовість застосування в реакціях окиснення фенольних полютантів.

Встановлено розширення рН-профіля активності іммобілізованих форм ПОХ в область кислих (на 1,0-1,5 од. рН) і лужних значень (на 2,0-4,0 од. рН), розширення термооптимуму (на 5-20 єС), поряд з збільшенням рН-, термостабільності і кратності використання.

Показано можливість ефективного видалення фенольних сполук (60 - 100 %) з розчинів з використанням іммобілізованих препаратів частково очищеної ПОХ (концентрації фенолів від 0,25 мМ до 150,0-200,0 мМ у порівнянні з вільним ферментом (концентрації фенолів 0,1-1,0 мМ).

Практичне значення отриманих результатів. Показано, що виділена за модифікованим нами методом частково очищена ПОХ з високим ступенем ефективності каталізує окиснення ряду похідних фенолу з утворенням нерозчинних у воді та органічних розчинниках полімерних продуктів.

Встановлено, що ефективність біоконверсії фенольних сполук частково очищеною ПОХ і комерційним препаратом ПОХ (“Sigma”, США) є подібною: спектральний ступінь чистоти ферменту (RZ) істотно не впливає на ступінь біоконверсії досліджуваних субстратів, що підвищує економічність даного методу їх елімінації.

Отримані методами QSAR і PLS QSPR статистичні моделі дозволяють з достатньою надійністю прогнозувати ступінь біоконверсії фенольних сполук і кінетичні параметри (K_m, V_max) реакції їх окиснення, для яких відсутня відповідна експериментальна інформація.

На основі запропонованих методів іммобілізації пероксидази в гелі карагінану і ПВК, а також зшивкою з гідратцелюлозною мембраною з використанням перйодату натрію отримані високоактивні і стабільні ферментні препарати багаторазового використання (карагінан - до 7 разів, мембрана - до 22 разів) в реакціях окиснення фенолів як в водних, так і в органічних середовищах.

Використання напівпроникної гідратцелюлозної мембрани ”Діацелл” для відокремлення водного розчину пероксидази від водних розчинів фенольних токсикантів (фенол, о-, м-, п- хлорфеноли) дозволило розробити новий спосіб багаторазового застосування біокаталізатора в реакціях дефенолізації.

Запропонований ферментативний метод видалення фенолів, апробований на модельних розчинах і стічних водах Одеського ЗАТ “ТеплоСервіс”.

Особистий внесок здобувача. Виділення пероксидази з коренів хрону, вивчення фізико-хімічних властивостей частково очищеного ферменту, оптимізація умов пероксидазного окиснення фенольних сполук, кінетичний аналіз, одержання іммобілізованих форм ПОХ, спектрофотометричні, реологічні дослідження, аналіз спектральних даних, обробка отриманих результатів проведені безпосередньо здобувачем.

QSAR аналіз впливу структури фенольних сполук на ступінь їх ферментативної конверсії і QSPR аналіз реакційної здатності субстратів ПОХ проведені під керівництвом зав. лаб. теоретичної хімії, д.х.н., Кузьміна В. Є. Електрофорез препарату пероксидази проведений на кафедрі генетики біологічного факультету ОНУ ім. І. І. Мечникова під керівництвом к.б.н., доц. Топтікова В. А. Постановка завдань, аналіз, обговорення результатів досліджень і висновків на їх основі проведені разом з керівниками д.х.н., проф. Давиденко Т.І. і зав. лаб. фізико-хімічних основ біотехнології к.х.н., доц. Романовською І.І.

Апробація результатів роботи. Результати роботи були представлені на Міжнародній конференції студентів і аспірантів, присвяченій 75-річчю від дня народження академіка О.В. Богатського “Сучасні напрямки розвитку хімії” (Одеса, Україна, 2004); Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених “Вчені майбутнього”, (Одеса, Україна, 2005); конференції-конкурсі робіт молодих вчених, присвяченій 100-річчю від дня народження М.Ф. Гулого “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології-2005” (Київ, Україна, 2005); VIII конференції молодих вчених та студентів-хіміків Південного регіону України (Одеса, Україна, 2005); I Всеукраїнській конференції студентів, аспірантів та молодих вчених з хімії та хімічної технології (Київ, Україна, 2006); Міжнародній науковій конференції “Сучасний стан і перспективи розвитку мікробіології і біотехнології” (Мінськ, Білорусія, 2006); III Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Біотехнологія. Освіта. Наука. Практика” (Харків, Україна, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових статей, 3 патенти і тези 13 доповідей міжнародних та українських наукових конференцій.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури (розділ 1), матеріалів і методів експерименту (розділ 2), обговорення результатів (розділи 3-5), висновків, списку літератури (248 джерел) і додатків. Робота представлена на 158 сторінках, містить 1 схему, 37 рисунків і 23 таблиці.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Виділення пероксидази з коренів хрону проводили за методом Баха. Концентрацію виділеного ферменту визначали спектрофотометрично, використовуючи відповідний коефіцієнт молярного поглинання. Активність пероксидази визначали спектрофотометрично по реакції окиснення пірогалолу. Визначення фракційного складу препаратів пероксидази (частково очищеної і комерційної) досліджували методом електрофорезу на апараті Helicon (Росія) у системі Леммлі в 15-%-ному ПААГ. Визначення білка у ферментному препараті проводили за методом Лоурі в модифікації Хартрі.

Визначення фенольних сполук проводили спектрофотометрично за 4-аміноантипіриновим методом, а також використовуючи відповідні коефіцієнти молярної екстинції фенолів.

Аналіз продуктів ферментативного окиснення досліджуваних фенолів проводили методами ІЧ-спектроскопії, мас-спектрометрії і ТШХ.

Розрахунки енергій граничних орбіталей фенолів проведені напівемпіричним методом PM3 за допомогою trial-версії програми HyperChem 6.0. Параметри, що відображають електронну структуру молекули, розраховані з використанням методу вирівнювання электронегативностей Джоллі-Перрі.

Результати досліджень та їх обговорення. Перспективним напрямком очищення природних і стічних вод від органічних забруднювачів - фенольних сполук, є використання ферментів рослинного походження, здатних каталізувати їх окиснення в присутності пероксиду водню, перетворюючи в малотоксичні та нетоксичні продукти. Пероксидаза з коренів хрону має ряд унікальних властивостей: стабільність, високу активність в широкому діапазоні зовнішніх умов, велику низку органічних субстратів як аліфатичної, так і ароматичної природи. Використання окиснювальної здатності пероксидази для доочищення промислових і комунальних стічних вод від фенолів є досить ефективним. Висока вартість комерційних препаратів пероксидази сприяла розгляду нами можливості використання для окиснення фенолів частково очищеної пероксидази хрону.

З використанням модифікованого нами методу Баха, виділено пероксидазу з коренів хрону. В результаті було отримано гетерогенний згідно з даними електрофорезу ферментний препарат з М. м. 40 кДа (рис. 1), з спектральним показником чистоти RZ (А₄₀₃/А₂₈₀) 1,0, активністю 100 од/мг (по пірогалолу). Вивчення біохімічних властивостей виділеного ферменту (RZ, активність, рН-, термооптимум), зберігання та порівняння отриманих характеристик з аналогічними даними комерційного препарату ПОХ (“Sigma”, RZ = 2,7) свідчить про досить близькі властивості препаратів ферменту, за винятком ступеня чистоти, термінів зберігання та вартості, яка для частково очищеної ПОХ є значно нижчою ніж для комерційної.

Важливо встановити, наскільки ефективність процесу дефенолізації, що каталізується частково очищеною пероксидазою, залежить від ряду факторів: рН, температури інкубаційного середовища, концентрації реагентів, присутності стабілізаторів і часу проведення реакції. Нами показано, що максимальний ступінь біоконверсії (24,5 - 100 %) фенольних полютантів (фенол, резорцин, пірокатехін, гідрохінон, пірогалол, о-, м-, п-хлорфеноли, 2,4,6-трихлорфенол, пентахлорфенол, о-, м-, п-крезоли, б-нафтол) спостерігається в діапазоні їх концентрацій 0,1-1,0 мМ при мольному співвідношенні ароматичний субстрат:пероксид водню 1:1, активності ПОХ 0,2-2,0 од/мг, рН інкубаційного середовища 4,0-7,5, температурі 10-45 С, часу інкубації 30-60 хв. Використання як стабілізаторів пероксидазної активності сироваткового альбуміну бика (САБ), поліетиленгліколю (ПЕГ-6000) і полі-N-вінілпіролідону (ПВП, М. м. 2 ·10⁶ Да), веде до підвищення стабільності ферменту і, як наслідок, збільшення ступеня біоконверсії досліджуваних фенольних сполук на 10-22 %.

Встановлено, що підвищити ступінь біоконверсії фенолів, що повільно окиснюються (фенол, о-, м-, п-крезоли, о-, м-, п-хлорфеноли, 2,4,6-трихлорфенол, пентахлорфенол), можна, застосовуючи метод субстрат-субстратної активації з використанням субстратів ПОХ. Такими субстратами були похідні хіноліну, які дозволяють підвищити трансформацію фенольних токсикантів з 20,4-80, 4 % до 60, 5-100 % (табл. 1).

Таблиця 1

Вплив похідних хіноліну на біоконверсію фенолів, що повільно окиснюються

Фенольна сполука	Ступінь біоконверсії фенолів, що повільно окиснюються, в присутності сполук, що окиснюються швидко %
	-	8-гідрокси-хінолін- 3-сульфо-кислота	8-гідрокси-хінолін- 5-сульфо-кислота	5,7-дибром-8-гідрокси-хінолін	2,4-дигідрокси-хінолін
фенол	80,4	95,2	97,3	100	100
п-крезол	78,1	96,0	97,0	100	100
м-крезол	76,5	95,1	95,2	100	100
резорцин	75,0	90,1	91,6	95,0	97,2
о-хлорфенол	68,1	90,0	94,4	92,7	97,6
м-хлорфенол	25,2	60,7	63,1	64,9	70,1
п-хлорфенол	71,0	93,0	96,4	100	100
2,4,6-трихлорфенол	62,0	85,3	88,1	92,6	95,3
пентахлорфенол	20,4	60,5	65,3	69,0	74,3

Умови: ([похідні хіноліну] = 0,5 мМ, [фенольний субстрат]=1,0 мМ, [Н₂О₂]=1,0 мМ, активність ПОХ 1,0 од/мг, рН 7,0, t = 37 єС, ф = 1 ч)

Встановлено, що ефективність біоконверсії фенольних сполук частково очищеною ПОХ з RZ=1,0 і комерційною ПОХ з RZ=2,7 (“Sigma”, США) є подібною і для багатьох субстратів досить високою - 80,4 % - 98,9 % (фенол, о-, м-, п-крезоли, пірокатехін, гідрохінон, п-хлорфенол, 2,4,6-трихлорфенол, б-нафтол), на відміну від м-хлорфенолу та пентахлорфенолу, що трансформуються на 26,0 % і 24,5 %, відповідно. Крім того, деякі феноли (о-, п-нітрофеноли) взагалі не піддаються ферментативному окисненню через неможливість утворення феноксильних радикалів.

Таким чином, спектральний ступінь чистоти ферменту не чинить істотного впливу на ступінь біоконверсії досліджуваних субстратів

Досліджено залежності початкових швидкостей реакції пероксидазного окиснення фенольних субстратів від їх початкових концентрацій (0,075-2,4 мМ) при різних концентраціях пероксиду водню (0,01-0,3 мМ) при 20 єС у середовищі 0,016 М Na-фосфатного буферного розчину (рН 7,0). В усіх випадках залежності описуються рівнянням Міхаеліса-Ментен, лінеаризація яких в координатах Хейнса дозволяє обчислити кінетичні параметри (K_m, V_max) реакції окиснення субстратів, що використовувались.

В результаті пероксидазного окиснення досліджуваних фенолів спостерігається утворення темно-забарвлених полімерних продуктів, нерозчинних у воді та органічних розчинниках, що являють собою поліоксифенілени, що підтверджено методами ІЧ-спектроскопії і мас-спектрометрії.

Слід зазначити, що ефективність біоконверсії фенолів, а отже, і кінетичні параметри ферментативної реакції залежать не тільки від умов її проведення, але й від структури фенольного субстрату.

Опис кількісних співвідношень між структурою та активністю (QSAR) при дослідженні хімічної і біохімічної конверсії фенольних сполук протягом останніх років є актуальним напрямком у ферментативному каталізі.

У зв'язку з цим проведено позаекспериментальний скринінг з використанням QSAR моделей, заснованих на структурних параметрах фенолів, для прогнозу їх реакційної здатності в реакціях пероксидазного окиснення.

Досліджено 41 фенольний субстрат; навчальна вибірка представлена 13 фенолами. Як цільовий параметр QSAR аналізу використано значення ступеня біоконверсії (Y₅, %) похідних фенолу.

На початковому етапі роботи побудовано QSAR рівняння на основі значень констант Гаммета (у) фенольних замісників. Використовуючи метод лінійної регресії (MLR) отримано рівняння, статистичні характеристики якого не є цілком задовільними (R = 0,88; S = 0,42). Крім того, дана модель не дозволяє прогнозувати ступінь біоконверсії для поліциклічних фенольних сполук, а також для молекул, що містять складні замісники в ароматичному кільці, для яких немає табличних значень констант.

Тому для побудови більш адекватних співвідношень на наступному етапі QSAR дослідження як структурні параметри використані розрахункові значення енергій вищої зайнятої (HOMO) і нижчої вакантної молекулярної орбіталі (LUMO) фенолів.

В результаті проведених досліджень методом MLR побудовано двопараметрове рівняння:

lg (Y₅) = 26,4 + 1,7 E (LUMO) + 2,8 E (HOMO)

Отримана залежність) задовільно описує співвідношення структура - ступінь біоконверсії фенолів (R = 0,93; S = 0,33). Згідно до отриманих результатів встановлено, що, чим нижче значення енергії граничних орбіталей (HOMO і LUMO) фенолів, тим менше ступінь їх біоконверсії. Так, електроноакцепторні замісники в ароматичному ядрі істотно знижують, а електронодонорні підвищують реакційну здатність фенолів у розглянутій реакції.

Використовуючи отримане співвідношення, здійснено прогноз ступеня біоконверсії для сполук вибірки, що прогнозувалась, результат якого перевірений експериментально. Видно, що спостерігається задовільна відповідність прогнозованих і експериментальних значень ступеня біоконверсії фенолів (табл. 2).



Таблиця 2

Спостережені і прогнозовані значення ступеня біоконверсії фенолів, що грунтуються на енергіях граничних орбіталей (HOMO і LUMO)

№ п/п	Сполука	Yспос. (%)	Yпрог. (%)
1		-	>95
2		-	>95
3		-	58
4		66	57
5		1?10-1	1?10-1
6		-	1·10-1
7		1?10-4	1?10-4
8		-	1?10-7

Враховуючи кінетичні параметри пероксидазного каталізу (V_max, K_m) на основі набору структурних дескрипторів, що описують форму молекули фенольної сполуки, її електронну структуру та ліпофільність (використання як структурних дескрипторів значень констант Гаммета та енергій HOMO і LUMO субстратів не дозволяють одержати задовільне QSPR рівняння), та застосувавши cтатистичний метод часткових найменших квадратів (PLS), проведено аналіз кількісного зв'язку між структурою фенолів і їх реакційною здатністю. Отримані методом PLS статистичні моделі є цілком адекватними (для моделі по V_max : R = 0,91; Q² = 0,74; S = 0,86; для моделі по K_m^-1: R = 0,96; Q² = 0,90; S = 0,52). З отриманих результатів обчислено внески дескрипторів у зміну досліджуваної властивості для моделі по K_m: характеристики електронної структури - 66 %, параметри форми - 34 %, а для V_max - внесок у зміну параметрів електронної структури зростає до 83 % .

З метою аналізу прогностичних можливостей PLS моделей для них досліджено "області компетентності" (ОК) у просторі латентних змінних T₁-T₂, обчислених у ході побудови PLS - рівняння. Прогноз для нових молекул більш надійний тоді, коли вони розташовані в областях простору структурних ознак, близьких до аналогічних областей молекул навчальної вибірки. Таким чином, в область компетенції моделі потрапляють всі сполуки, які перебувають на відстані R+3у від центру, тобто найбільш надійні прогнози для молекул, що перебувають поблизу від центру.

Таким чином, знайдено структурні характеристики фенольних субстратів, що визначають їх реакційну здатність у реакціях пероксидазного окиснення. Отримані методами QSAR і PLS QSPR моделі дозволяють з достатньою надійністю прогнозувати ступінь біоконверсії, величини K_m і V_max для нових фенольних субстратів. Аналіз ОК дає можливість оцінити надійність прогнозу в кожному конкретному випадку. Існуючі обмеження пероксидазного методу дефенолізації, такі як швидка інактивація ферменту, труднощі відділення від реакційної суміші та однократність використання, долаються одержанням іммобілізованих форм ПОХ з новими функціональними властивостями, багаторазовістю застосування, підвищеною стабільністю при використанні і зберіганні. З метою розробки методів іммобілізації ПОХ обрано матриці природного походження - карагінан з чорноморської водорості Phyllophora nervosa і синтетичні - полі-N-вінілкапролактам (ПВК) та гідратцелюлозна мембрана ”Діацелл”.

Карагінани (сульфатні полісахариди червоних морських водоростей) і полі-N-вінілкапролактам знаходять широке застосування в різних галузях промисловості внаслідок відсутності токсичності, різностороньої біологічної активності, термооборотності і гелеутворюючих властивостей.

При розробці методу іммобілізації пероксидази в гель карагінану з Phyllophora nervosa визначено, що міцні гранули правильної сферичної форми, діаметром 2,5 мм, утворюються при використанні 5 %-ного водного розчину карагінану і 20 %-ного розчину СаСl₂ як стабілізатора гранулоутворення.

Іммобілізацію ПОХ у ПВК проводили термопластифікацією водного розчину ПВК (8,0-10,0 %), що містив фермент (10,0-25,0 од/мг), у розчині фенольної сполуки (50,0-150,0 мМ) як стабілізатора гранулоутворення, в присутності ПЕГ (10,0 %) при 37-40 єС. В результаті утворюються гранули, що містять включений фермент і фенол. Таким чином, даний метод іммобілізації дозволяє включати у ПВК одночасно фермент і фенольний субстрат, що трансформується у присутності пероксиду водню.

Взаємодія пероксидази з карагінаном і ПВК підтверджена за зсувом максимуму поглинання в області Соре для ПОХ з 403 нм до 408 нм і 410 нм, що вказує на існування взаємодії між простетичною групою ферменту та носіями. Зміна в'язкісних характеристик полімерів при додаванні ПОХ і стабілізаторів свідчить про конформаційні зміни і компактизацію білкових молекул і може бути обумовлена як механічним включенням ферменту в сітку полімерів, так і утворенням іонного зв'язку між сульфатними групами карагінану та зарядженими групами білка, а також водневого зв'язку між карбонільною групою полі-N-вінілкапролактаму і гідроксильними групами білкових молекул ферменту. При включенні пероксидази у гель полісахариду зберігається 94,0-94,6 % вихідної активності при вмісті 0,6ч0,8 мг ПОХ/мг носія. Максимальна активність іммобілізованої у ПВК пероксидази спостерігається при масовому співвідношенні ПОХ:ПВК 0,05:1, додавання ПЕГ сприяє її зростанню в 1,7 рази та становить 76,3 %. Очевидно, збільшення в'язкості середовища при додаванні ПЕГ перешкоджає виходу ферменту в розчин з гранул ПВК, крім того, водорозчинні полімери є стабілізаторами ферментативної активності ПОХ.

Оптимізовано умови включення фенолу в структуру ПВК, що приводять до високого ступеня його зв'язування (83,5-100 %); при цьому отримано препарати у вигляді оформлених, стійких гранул сферичної форми.

При вивченні залежності пероксидазної активності отриманих препаратів від рН і температури інкубаційного середовища можна відзначити розширення рН- і термопрофілей активності іммобілізованих ферментів (рис. 1). Ці дані, а також підвищення рН-стабільності і термостабільності препаратів можна пояснити створенням більш сприятливого рН-мікрооточення ферменту в результаті іммобілізації, а також стабілізуючим ефектом полімерних матриць, що утруднюють теплові конформаційні переходи білкової молекули ферменту.

Рис. 1 Залежність каталітичної активності (А) вільної та іммобілізованої ПОХ від рН і температури інкубаційного середовища (1 - вільна ПОХ; 2 - ПОХ, іммобілізована у ПВК; 3 - ПОХ, іммобілізована в карагінан)

Визначено кінетичні параметри реакції окиснення пірогалолу, що каталізується іммобілізованою в карагінан ПОХ; відзначено збільшення значень K_m для іммобілізованої ПОХ (K_m (по пірогалолу) - 2,72; K_m (по Н₂О₂) - 1,01 мМ) у порівнянні з K_m для вільного ферменту (2,32; 0,43 мМ, відповідно), що обумовлено локальним збільшенням концентрації субстратів у мікрооточенні ферменту і, як наслідок, інгібування ПОХ, а також утрудненою дифузією субстратів і продуктів реакції в порах носія, що сприяє зниженню швидкості ферментативної реакції. Отримані іммобілізовані в карагінан і ПВК препарати пероксидази кількісно зберігають активність в умовах низьких температур (0-4 єС) протягом 8-ми та 10-ти місяців, відповідно. Препарат іммобілізованої в карагінан ПОХ каталізує окиснення фенолу, п-хлорфенолу і п-крезолу, віднесених до особливо небезпечних забруднювачів навколишнього середовища, що містяться в стічних водах більшості підприємств (0,25-100,0 мМ), в 1,3-2,6 рази ефективніше в порівнянні з вільним ферментом (табл. 3); при цьому кратність використання зв'язаного ферменту досягає 5-7 разів.

При додаванні пероксиду водню в інкубаційну суміш, що містить гранули ПВК з іммобілізованою в них пероксидазою, які стабілізовані фенолом, п-крезолом і п-хлорфенолом, ступінь біоконверсії останніх у діапазоні більш високих концентрацій (25,0-150,0 мМ) в 1,4-2,4 рази перевершує таку в порівнянні з вільним ферментом.

В результаті ферментативного окиснення фенолів спостерігається утворення полімерних продуктів темно-коричневого кольору, що концентруються в гранулах носіїв.

Таблиця 3

Окиснення фенольних сполук, що каталізується ПОХ, іммобілізованою в карагінан з Phyllophora nervosa

Концентрація фенолів, мМ	Ступінь біоконверсії, %
	фенол	п-хлорфенол	п-крезол
	вільн. ПОХ	іммоб.ПОХ	вільн. ПОХ	іммоб.ПОХ	вільн. ПОХ	іммоб. ПОХ
0,25	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0
0,5	100	100,0	89,1	96,3	100,0	100,0
1,0	61,2	82,0	49,4	68,0	74,7	95,0
10,0	44,0	71,1	24,0	54,4	49,9	72,8
50,0	28,4	52,0	13,4	24,2	30,7	56,1
100,0	11,6	25,8	7,2	18,1	13,0	33,2



Умови: [субстрат] : [Н₂О₂] = 1:1; активність ПОХ 0,20-25,0 од/мг; t = 20 єС; рН 7,0; ф = 1 ч

Розроблені методи іммобілізації ПОХ з використанням полісахаридного носія - гідратцелюлозної мембрани “Діацелл”.

Дана мембрана являє собою напівпроникну плівку з розміром пор 0,4 мкм, широко використовується в апаратах для гемодіалізу, характеризується добрими розділяючими властивостями, технологічністю одержання, механічною міцністю у водних середовищах, стійкістю при різних значеннях рН та економічністю.

Перший спосіб іммобілізації ПОХ з використанням напівпроникної мембрани полягає в тому, що водний розчин ензиму відокремлюється від водних розчинів фенольного субстрату та окисника мембраною, яка легко їх пропускає, але непроникна для молекул ферменту. Встановлено, що феноли і пероксид водню вільно дифундують через гідратцелюлозну мембрану, не сорбуючись на ній; у мембрані у формі мішечка залишаються фермент і нерозчинні полімерні продукти окиснення фенолів. Видалену мембрану використовують багаторазово (4-7 разів), поміщаючи в нові розчини фенолів з додаванням окисника.

Введення в реакційну суміш, що містить феноли, іонів Са²⁺ і Мn²⁺ (1,0 мМ) дозволяє збільшити як ефективність видалення фенолу, о-, м, п-хлорфенолів, у середньому на 10-20 %, так і кратність використання біокаталізатора до 7-10-ти разів.

Додаткове введення САБ, ПВП і ПЕГ-6000 в діалізну мембрану з ферментом приводить до 7, 16 і 22-кратного використання пероксидази, відповідно.

Запропонований ферментативний метод видалення фенолів успішно апробований на стічних водах Одеського ЗАТ “ТеплоСервіс”.

Другий метод іммобілізації ПОХ з використанням гідратцелюлозної мембрани полягає в перйодатному окисненні полісахаридного носія. В результаті отримано ковалентно іммобілізовані ферментні препарати частково очищеної і комерційної ПОХ з кількісним зв'язуванням введеного в реакцію білка і збереженням 88 % ферментативної активності при масовому співвідношенні фермент:носій 0,2:1.

Отримано стабільні препарати, про що свідчить розширення рН- і термопрофілів активності ферменту, підвищення рН- і термостабільності, що пов'язано з утворенням міцної сполуки ПОХ з мембраною, що утруднює конформаційну рухливість білка, у тому числі його розгортання. Одержані препарати кількісно зберігають активність протягом 1,5 років.

Препарат іммобілізованої частково очищеної ПОХ має високу каталітичну активність у середовищі органічних розчинників; так, у середовищі етанолу, метанолу та ацетону іммобілізований фермент в 10-20 разів перевершує по активності вільний .

Отриманий ферментний препарат каталізує окиснення фенолу, п-крезолу і п-хлорфенолу в діапазоні високих концентрацій (0,25-200,0 мМ) в 1,4-6,7 разів ефективніше в порівнянні з вільним ферментом з утворенням полімерних продуктів, які адсорбуються на поверхні гідратцелюлозної мембрани. При цьому кратність використання отриманого біокаталізатора в реакції окиснення фенолу становить 22 рази, причому після 7 циклів застосування фермент повністю зберігає активність.

Таким чином, в результаті іммобілізації пероксидази з використанням карагінану, полі-N-вінілкапролактаму і гідратцелюлозної мембрани отримано ферментні препарати з високим збереженням пероксидазної активності. Ці ферментні препарати стабільні при зберіганні і можуть багаторазово використовуватись в реакціях дефенолізації.

ВИСНОВКИ

В дисертації встановлена залежність ефективності пероксидазного окиснення фенольних сполук від умов проведення реакції та структури полютантів. Проведено QSAR і QSPR аналіз реакційної здатності фенолів в реакціях ферментативної конверсії. На основі запропонованих методів іммобілізації пероксидази отримані високоактивні і стабільні ферментні препарати багаторазового використання в реакціях окиснення фенолів як в водних, так і в органічних середовищах.

1. Встановлено, що модифікація методу Баха дозволяє отримати частково очищений препарат пероксидази, подібний за кількісним складом білкових фракцій та основними біохімічними властивостями до комерційного, але який відрізняється більшою економічністю (у 25 разів дешевший).

2. Оптимізовано умови окиснення фенолу, о-, м-, п-хлорфенолів, що каталізується частково очищеною ПОХ. Показано стабілізуючу дію іонів Са²⁺, Mn²⁺, водорозчинних полімерів (ПВП, ПЕГ-6000) і білка (САБ), на активність пероксидази, що сприяє подвищенню ступеня біоконверсії досліджуваних фенольних полютантів у середньому на 10-22 %. Показано, що даний метод дозволяє трансформувати різні похідні фенолу у концентраціях 0,1-1,0 мМ із ступенем ефективності 28-100 %, який залежить від природи субстрату, замісників та їх розташування у бензольному кільці.

3. Встановлено, що продуктами пероксидазного окиснення досліджуваних фенолів є поліоксифенілени, які нерозчинні у воді та органічних розчинниках (діетиловому ефірі, спирті, ацетоні, хлороформі, бензолі).

4. Встановлено, що використання похідних хіноліну, що швидко окиснюються в реакціях пероксидазного окиснення фенолів, що окиснюються повільно (фенол, о-, м-крезоли, резорцин, о-, м-, п-хлорфеноли, 2,4,6-трихлорфенол, пентахлорфенол), сприяє підвищенню ступеня біоконверсії останніх з 20,4-80,4 % до 60,5-100 % з утворенням легкоосаджуваних полімерних осадів.

5. Методами QSAR і PLS QSPR аналізу отримано статистичні моделі, які дозволяють з достатньою надійністю прогнозувати ступінь і швидкість трансформації нових фенольних субстратів ПОХ.

6. Іммобілізацією пероксидази методом включення її в гелі карагінану з чорноморської водорості Phyllophora nervosa і полі-N-вінілкапролактаму, а також фізичною іммобілізацією та за допомогою хімічного зв'язування з гідратцелюлозною мембраною ”Діацелл” отримано іммобілізовані препарати з високим збереженням пероксидазної активності (94,6 % - при використанні карагінану, 76,3 % - ПВК, 88,0 % - мембрани), стабільні при зберіганні (8, 10, 18 місяців, відповідно) та можливістю багаторазового використання (карагінан - до 7 разів, мембрана - до 22 разів) в реакціях окиснення фенольних токсикантів як в водних, так і в органічних середовищах.

7. Іммобілізація ПОХ на досліджуваних носіях дозволяє стабілізувати фермент в області кислих і лужних значень (розширення рН-оптимуму на 1,0-1,5 і 2,0-4,0 од. рН, відповідно) поряд з розширенням термооптимуму (на 5-20 єС) і збільшенням рН- і термостабільності.

8. Метод включення ПОХ в гідратцелюлозну мембрану успішно апробований для елімінації фенольних полютантів (конверсія фенолу - 94,5 %, о-, п-крезолів - 100 %) на стічних водах ЗАТ “ТеплоСервіс”.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Давиденко Т.И., Севастьянов О.В., Осейчук О.В., Брусиловский Ю.Э. Пероксидазное окисление фенолов // Доповіді НАН України. - 2004. - № 6. - С. 154-158.

2. Давиденко Т.И., Романовская И.И., Севастьянов О.В., Осейчук О.В. Окисление хлорфенолов с использованием пероксидазы хрена // Химия и технология воды. - 2004. - Т. 26, № 6. - С. 582-591.

3. Davidenko T.I., Romanovskaya I.I., Oseychuk O.V. Peroxidase oxidation of phenols // Appl. Biochem. Microbiol. - 2004. - V. 40, № 6. - P. 542-546.

4. Давиденко Т.И., Романовская И.И., Осейчук О.В., Декина С.С. Структура и образование комплексов включения фенолов в поли-N-винилкапролактам // Доповіді НАН України. - 2005. - № 9. - С. 145-150.

5. Декина С.С., Осейчук О.В. Иммобилизация пероксидазы в каррагинан из Phyllophora nervosa // Вісник ОНУ. - 2005. - Т. 10, № 9. - С. 120-126.

6. Романовская И.И., Осейчук О.В., Севастьянов О.В., Давиденко Т.И. Иммобилизация пероксидазы в поли-N-винилкапролактам // Вісник ОНУ. - 2005. - Т. 10, № 8. - С. 49-54.

7. Осейчук О.В., Романовская И.И., Севастьянов О.В. Исследование условий трансформации фенола и его монохлорзамещенных производных, катализируемое пероксидазой // Химия и технология воды. - 2006. - Т. 28, № 5. - С. 505-512.

8. Осійчук О.В., Севастьянов О.В. Розробка методу іммобілізації пероксидази в полі-N- вінілкапролактам // Досягнення біології та медицини. - 2006. - № 2. - С. 13-16.

9. Романовская И.И., Муратов Е.Н., Кузьмин В.Е., Осейчук О.В., Артеменко А.Г., Андронати С.А. Анализ влияния структуры фенольных соединений на степень их ферментативной конверсии // Доповіді НАН України. - 2006. - № 9. - С. 161-166.

10. Романовская И.И., Кузьмин В.Е., Осейчук О.В., Муратов Е.Н., Артеменко А.Г., Андронати С.А. QSPR анализ реакционной способности субстратов пероксидазы // Вісник ОНУ. - 2006. - Т.11,№ 5. - С. 69-77.

11. Романовська І.І., Осійчук О.В. Фізико-хімічні дослідження іммобілізованого на гідратцелюлозній мембрані препарату пероксидази хрону // Медична хімія. - 2006. - № 6. - С. 55-61.

12. Пат. 8115, Україна, МПК 7 С 02F 1/12 Спосіб доочищення стічних вод / Т.І. Давиденко, О.В Осейчук, О.В Севастьянов, І І. Романовська (Україна). - Заявка № 200500560; Заявл. 21.01.2005; Опубл. 15.07.2005. - Бюл. № 7.

13. Пат. 13852, Україна, МПК С 02F 7/00 Спосіб одержання і трансформації фенолів / Романовська І.І., Осійчук О.В., Севастьянов О.В. (Україна). - Заявка № 200510410; Заявл. 04. 11. 2005; Опубл. 17. 04. 2006. - Бюл. № 4.

14. Пат. 03555, Україна, МПК С 12N 11/00 Спосіб іммобілізації пероксидази / Осійчук О.В., Романовська І.І., Севастьянов О.В. (Україна). - Заявка № 200603555; Заявл. 03. 04. 2006; Опубл.16.10.2006. - Бюл. № 10.

15. Осейчук О.В. Ферментативное окисление фенолов. // Міжнародна конференція студентів та аспірантів, присвячена 75-річчю з дня народження академіка О.В. Богатського “The modern ways of chemistry development”. - Одеса, 2004. - 83.

16. Осейчук О.В., Романовская И.И. Окисление фенола и его хлорпроизводных, катализируемое пероксидазой хрена. // Конф.-конкурс робіт молодих учених, присвяченої 100-річчю від Дня народження М.Ф. Гулого „Актуальні проблеми біохімії та біотехнології”. - Киев, 2005. - С. 35.

17. Декина С.С., Осейчук О.В., Романовская И.И. Иммобилизация пероксидазы в каррагинан из Phyllophora nervosa // Конф.-конкурс робіт молодих учених, присвяченої 100-річчю від Дня народження М.Ф. Гулого „Актуальні проблеми біохімії та біотехнології”. - Киев, 2005. - С. 10.

18. Осійчук О.В., Романовська І.І., Декіна С.С. Включення пероксидази хрону в полі-N-вінілкапролактам. // Міжн. наук.-практ. конф. молодих вчених „Вчені майбутнього”. - Одеса, 2005. - С. 49-50.

19. Осейчук О.В., Романовская И.И. Окисление фенола, катализируемое пероксидазой, иммобилизованной в поли-N-винилкапролактам. // VIII Конференція молодих учених та студентів-хіміков Південного регіону України. - Одесса, 2005. - С. 69.

20. Осейчук О.В., Романовская И.И., Севастьянов О.В. Окисление фенолов, катализируемое пероксидазой, заключенной в диализную мембрану. // Научно-практ. конф. „Экологическая безопасность продукции и окружающей среды - потребность общества”. - Судак, 2005. - С. 138-139.

21. Романовская И.И., Осейчук О.В., Севастьянов О.В. Поли-N-винилкапролактам - перспективная матрица для включения биологически активних соединений. // Международная научно-практическая конференция ”Обращение с отходами - проблемы и решения XXI века” Сб. научн. статей. - Одесса, 2005. - С. 213-217.

22. Осейчук О.В., Романовская И.И. QSAR анализ влияния структуры фенолов на их биоконверсию. // Международная научно-практическая конференция “Наука и образование - 2006”. - Мурманск, 2006. - С. 643-644.

23. Осейчук О.В., Романовская И.И. Иммобилизация пероксидазы на гидратцеллюлозной мембране. // I Всеукраїнська конференція студентів, аспірантів та молодих вчених з хімії та хімічної технології. - Киев, 2006. - С. 189.

24. Осейчук О.В., Романовская И.И. Разработка метода ковалентной иммобилизации пероксидазы хрена. // Международная научная конференция “Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии”. - Минск, 2006. - С. 228-230.

25. Осейчук О.В., Романовская И.И., Муратов Е.Н., Кузьмин В.Е., Артеменко А.Г. Изучение влияния свойств фенольных соединений на скорость их биоконверсии методом QSAR анализа. // “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2006”. - Киев, 2006. - С. 35-36.

26. Осейчук О.В., Артеменко А.Г., Муратов Е.Н., Кузьмин В.Е. Количественный анализ взаимосвязей структура-реакционная способность субстратов пероксидазы. // III Всеукраинская научно-практическая конференция с международным участием. “Биотехнология. Образование. Наука. Практика”. - Харьков, 2006. С. 36-37.

27. Осейчук О.В., Муратов Е.Н., Артеменко А.Г. Изучение свойств пероксидазы и реакционной способности ее субстратов. // IX Конференція молодих учених та студентів-хіміків Південного регіону України. - Одеса, 2006. - С. 23.

АНОТАЦІЇ

Осійчук О. В. Особливості пероксидазного окиснення фенольних сполук. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганiчна хімія. Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена вивченню елімінації фенольних полютантів з розчинів з використанням пероксидази хрону. У рамках виконання роботи виділено пероксидазу з коренів хрону, вивчено біохімічні властивості частково очищеного ферментного препарату. Оптимізовані умови пероксидазного окиснення ряду фенольних сполук (рН інкубаційного середовища 4,0-7,5, температура 20-45 єС, мольне співвідношення полютант : окисник 1:1(1,5), активність ПОХ 0,25 - 2,0 од/мг, час інкубації 30 - 60 хв). Встановлено, що іони Са²⁺, Mn²⁺, водорозчинні полімери (ПВП, ПЕГ-6000) і САБ стабілізують активність пероксидази, що сприяє підвищенню ступеня біоконверсії досліджуваних фенольних полютантів (фенол, пірокатехін, гідрохінон, резорцин, пірогалол, о-, м-, п-крезоли, о-, м-, п-хлорфеноли, 2,4,6-трихлорфенол, пентахлорфенол, б-нафтол).

Застосувавши метод субстрат-субстратної активації, вдалося значно (з 20,4-80,4 % до 60,5-100 %) підвищити ступінь біоконверсії фенолів, що окиснюються повільно, використовуючи субстрати ПОХ, що швидко окиснюються: 8-гідроксихінолін-3-сульфокислоту, 8-гідроксихінолін-5-сульфокислоту, 5,7-дибром-8-гідроксихінолін, 2,4-дигідроксихінолін.

В результаті пероксидазного окиснення досліджуваних фенолів спостерігалося утворення темно-забарвлених полімерних продуктів - поліоксифеніленів, нерозчинних у воді та органічних розчинниках.

Використовуючи значення ступеня біоконверсії та кінетичних параметрів (V_max, K_m) методами QSAR і PLS QSPR аналізу отримано статистичні моделі, що дозволяють прогнозувати ступінь трансформації і реакційну здатність нових фенольних субстратів на основі набору структурних параметрів, що описують форму молекули фенольної сполуки, її електронну структуру та ліпофільність.

Розроблено методи іммобілізації пероксидази з використанням як носіїв карагінану з чорноморської водорості Phyllophora nervosa, полі-N-вінілкапролактаму і гідратцелюлозної мембрани ”Діацелл”; отримано високоактивні (збереження 94,6 %, 76,3 %, 88,0 % активності, відповідно) та стабільні ферментні препарати (кількісне збереження активності протягом 8-ми, 10-ти, 18-ти місяців, відповідно), багаторазового використання (карагінан - до 7 разів, мембрана - до 22 разів) в реакціях окиснення фенолів як в водних, так і в органічних середовищах.

Запропоновано метод іммобілізації ПОХ шляхом включення в мембрану, який успішно апробований для елімінації фенольних полютантів (фенол - 94,5 % конверсії, о-, п-крезоли - 100 % конверсії) на стічних водах Одеського ЗАТ “ТеплоСервіс”.

Ключові слова: пероксидаза, окиснення фенолів, QSAR аналіз, іммобілізація, карагінан, полі-N-вінілкапролактам, гідратцелюлозна мембрана.

Осейчук О.В. Особенности пероксидазного окисления фенольных соединений. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2007.

Диссертация посвящена изучению элиминации фенольных поллютантов из растворов с использованием пероксидазы хрена. В рамках выполнения работы по модифицированному нами методу Баха получен гетерогенный по данным электрофореза в ПААГ частично очищенный препарат пероксидазы из корней хрена, сравнимый по биохимическим свойствам и характеристикам белкового состава, но отличающийся большей экономичностью по сравнению с коммерческим препаратом ПОХ (“Sigma”, США).

Оптимизированы условия пероксидазного окисления ряда фенольных соединений (рН инкубационной среды 4,0-7,5, температура 20-45 єС, мольное соотношение поллютант : окислитель 1 : 1(1,5), активность ПОХ 0,25 - 2,0 ед/мг, время инкубации 30 - 60 мин). Установлено, что ионы Са²⁺, Mn²⁺, водорастворимые полимеры (ПВП, ПЭГ-6000) и БСА стабилизируют активность пероксидазы, что способствует повышению степени биоконверсии исследуемых фенольных поллютантов (фенол, пирокатехин, гидрохинон, резорцин, пирогаллол, о-, м-, п-крезолы, о-, м-, п-хлорфенолы, 2,4,6-трихлорфенол, пентахлорфенол, б-нафтол).

Установлено, что эффективность биоконверсии фенольных соединений частично очищенной ПОХ и коммерческим препаратом ПОХ является сравнимой: спектральная степень чистоты фермента (RZ) не оказывает существенного влияния на степень биоконверсии исследуемых субстратов, что повышает экономичность данного метода их элиминации.

Применив метод субстрат-субстратной активации, удалось значительно (с 20,4-80,4 % до 60,5-100 %) повысить степень биоконверсии медленно окисляемых фенолов, используя быстроокисляемые субстраты ПОХ: 8-гидроксихинолин-3-сульфокислоту, 8-гидроксихинолин-5-сульфокислоту, 5,7-дибром-8-гидроксихинолин, 2,4-дигидроксихинолин.

В результате пероксидазного окисления исследуемых фенолов наблюдалось образование темно-окрашенных полимерных продуктов - полиоксифениленов, нерастворимых в воде и органических растворителях.

С использованием значений степени биоконверсии и кинетических параметров (V_max, K_m) методами QSAR и PLS QSPR анализа получены статистические модели, позволяющие прогнозировать степень трансформации и реакционную способность новых фенольных субстратов на основе набора структурных параметров, описывающих форму молекулы фенольного соединения (асферичность, моменты инерции), ее электронную структуру (E_HOMO, E_LUMO, парциальный заряд фенольного атома кислорода, суммарная электроотрицательность атомов, дипольный момент) и липофильность.

В результате иммобилизации пероксидазы включением в гели каррагинана из черноморской водоросли Phyllophora nervosa, поли-N-винилкапролактама а также сшивкой с гидратцеллюлозной мембраной с использованием периодата натрия, получены высокоактивные (сохранение 94,6 %, 76,3 %, 88,0 % активности, соответственно) и стабильные ферментные препараты частично очищенной и коммерческой ПОХ (количественное сохранение активности на протяжении 8-ми, 10-ти, 18-ти месяцев, соответственно), многократного использования (каррагинан - до 7 раз, мембрана - до 22 раз) в реакциях окисления фенолов как в водных, так и в органических средах.

Иммобилизация ПОХ на исследуемых носителях способствовала стабилизации фермента в области кислых и щелочных значений (расширение рН-оптимума на 1,0-1,5 и 2,0-4,0 ед. рН, соответственно) наряду с расширением термооптимума (на 5-20 єС) и увеличением рН- и термостабильности.

Использование полупроницаемой гидратцеллюлозной мембраны ”Диацелл” для отделения водного раствора пероксидазы от водных растворов фенольных токсикантов позволило разработать новый метод многократного применения биокатализатора в реакциях дефенолизации.

Предложенный метод иммобилизации ПОХ успешно апробирован для элиминации фенольных поллютантов (фенол - 94,5 % конверсии, о-, п-крезолы - 100 % конверсии) на сточных водах ЗАО “ТеплоСервис”.

Ключевые слова: пероксидаза, окисление фенолов, QSAR анализ, иммобилизация, каррагинан, поли-N-винилкапролактам, гидратцеллюлозная мембрана.



Oseychuk O.V. Features of peroxidative oxidation of the phenolic compounds. - Manuscript.

Dissertation for the candidate of biological sciences degree in speciality 02.00.10 - bioorganic chemistry. Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry of NAS of Ukraine, Kyiv, 2007.

Dissertation is dedicated to the phenolic pollutants elimination from solutions with usage of horseradish peroxidase (HRP). In the bounds of the work the peroxidase from horseradish roots was isolated, the biochemical properties of the partially purified enzyme were studied. The conditions of the phenolic compounds series peroxidative oxidation were optimized (pH of incubation medium 4,0-7,5; temperature 20-45 єC; phenols concentrations 0,1-1,0 mM; hydrogen peroxide concentration 0,1-1,5 mM; HRP activity 0,25-2,0 U/mg; time of incubation 30-60 min). It was determined , that Ca²⁺ and Mn²⁺ ions, water soluble polymers (PVP, PEG-6000) and BSA exerts stabilizing action on peroxidase activity, promoting the enhancement of the bioconversion degree of phenolic pollutants studied (phenol, pyrocathechol, hydroquinone, resorcinol, pyrogallol, o-, m-, p-cresols, o-, m-, p-chlorophenols, 2,4,6-trichlorophenol, pentachlorophenol, б-naphtol).

...