Cинтез, будова і властивості багатоканальних флуоресцентних зондів на основі 1,3-діариліденкетонів, дициклопентано-[b,e]піридинів та 3 гідроксихромонів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені тараса шевченка

УДК 547.814+541.143+577.336

СИНТЕЗ, БУДОВА І ВЛАСТИВОСТІ БАГАТОКАНАЛЬНИХ

ФЛУОРЕСЦЕНТНИХ ЗОНДІВ НА ОСНОВІ 1,3-ДІАРИЛІДЕНКЕТОНІВ, ДИЦИКЛОПЕНТАНО[B,E]ПІРИДИНІВ ТА 3-ГІДРОКСИХРОМОНІВ

02.00.03 - органічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора хімічних наук

ПИВОВАРЕНКО ВАСИЛЬ ГЕОРГІЙОВИЧ

КИЇВ - 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі органічної хімії хімічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор, Єременко Ганна Михайлівна, Інститут хімії поверхні НАН України, м. Київ, провідний науковий співробітник

доктор хімічних наук, Іщенко Олександр Олександрович, Інститут органічної хімії НАН України, м. Київ, завідувач відділом кольору і будови органічних сполук

доктор хімічних наук, професор, Кутуля Лідія Антонівна, Інститут монокристалів НАН України, м. Харків, завідувач відділом оптично активних органічних сполук

Провідна установа: Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, м. Харків

Захист відбудеться “__18__”_____09_____ 2007_ р. о ____ годині в ауд. _____ хімічного корпусу на засіданні спеціалізованої вченої ради Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий “__14__” _____червня_____ 2007_ р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

д.х.н., професор І. В. Комаров

АНОТАЦІЯ

Пивоваренко В.Г. Cинтез, будова і властивості багатоканальних флуоресцентних зондів на основі 1,3-діариліденкетонів, дициклопентано-[b,e]піридинів та 3_гідроксихромонів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора хімічних наук за спеціальністю 02.00.03 - органічна хімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2007.

Ключові слова: флуоресцентні барвники, дициклопентанопіридини, кетоціаніни, 3-гідроксихромони, 3-гідроксифлавони, флавоноли, дифлавоноли. діариліденкетон флуоресцентний зонд протон

Дисертація присвячена розробці багатоканальних флуоресцентних зондів (ФЗ) на основі пойменованих вище класів барвників. Зроблено аналіз будови та механізмів роботи флуоресцентних зондів, серед яких два найбільш ефективні - внутрішньомолекулярне фотоперенесення заряду (ВФЗ) та протона (ВФП) використані при розробці нових ФЗ. Синтезовано ряд ФЗ зондів класу 1,3_діариліденкетонів. Показана висока ефективність біс-краунпохідних у роз-пізнаванні катіонів Вa²⁺ i Mg²⁺. Вперше 1,3-діариліденкетони застосовані у флуориметричному дослідженні утворення водневих зв'язків з протоно-донорами. Вивчено властивості нового класу флуоресцентних барвників - 3,5_діарилідендициклопентано[b,e]піридинів. Проявляючи емісію діапазоні 450_700 нм, ці барвники мають високі (30-80%) квантові виходи флуоресценції. На їх основі синтезовано ряд флуоресцентних рН індикаторів.

Отримано ряди похідних 3-гідроксихромону заданої структури: синтезовано барвники, що містять замісники різної донорності і мають різну планарність молекули, різну довжину хромофора або фіксовано планарне положення його фрагментів. Встановлено закономірності залежності положен-ня смуг поглинання та флуоресценції сполуки, відношення інтенсивностей смуг флуоресцентції, а також квантового виходу від будови молекули барвника. Встановлено закономірності залежності вказаних параметрів від природи молекул оточення барвника у розчині. Створені зонди застосовані у вивченні рідин гомогенної та мікрогетерогенної природи. Вперше ФЗ на основі 3-гідроксихромонів застосовано до вивчення фізико-хімічних процесів у ліпідних мембранах і показано їх значні переваги порівняно з зондами інших класів. Синтезовано широкодіапазонний флуоресцентний рН-індикатор. Розроблено, і досліджено флуорсцентний зонд для визначення концентрації аденозинтрифосфату (АТФ) у водних розчинах. Синтезовано і досліджено властивості нового класу флуоресцентних барвників - дифлавонолів, які містять у молекулі дві системи ВФП.

АННОТАЦИЯ

Пивоваренко В.Г. Синтез, строение и свойства многоканальных флуорес-центных зондов на основе 1,3-диарилиденкетонов, дициклопентано-[b,e]пиридинов и 3_гидроксихромонов. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени доктора химических наук по специальности 02.00.03 - органическая химия. - Киевский национальный универнситет имени Тараса Шевченко, Киев, 2007.

Ключевые слова: флуоресцентные красители, кетоцианины, дициклопента-нопиридины, 3-гидроксихромоны, 3-гидроксифлавоны, флавонолы, дифлавонолы.

Диссертация посвящена разработке многоканальных флуоресцентных зондов (ФЗ) на основе поименованных выше классов органических красителей. Рассмотрены строение и принципы работы флуоресцентных зондов. Два наиболее перспективных механизма - внутримолекулярный фотоперенос заряда (ВФЗ) и протона (ВФП) положены в основу разработки ФЗ. Синтезирован ряд новых ФЗ класса 1,3-диарилиденкетонов. Показана высокая эфективность их бис-краунпроизводных в распознавании катионов Вa²⁺ и Mg²⁺. Впервые 1,3-диарилиденкетоны применены в исследовании образования водородных связей с протонодонорами. Изучены свойства нового класса флуоресцентных красителей - 3,5-диарилидендициклопентано[b,e]пиридинов. Проявляя эмиссию в диапазоне 450-700 нм, эти красители имеют высокие (30-80%) квантовые выходы флуоресценции. На их основе синтезирован ряд флуоресцентных рН индикаторов. Получены ряды производных 3-гидрокси-хромона заданного строения: синтезированы красители с разной планарностью молекулы, а также с разной длиной хромофора. Установлены зависимости положения полосы поглощения и эмиссии соединений, отношения интенсив-ностей полос эмиссии, а также квантового выхода эмиссии от строения молекулы красителя. Установлены зависимости указанных параметров от природы молекул окружения в растворе. Созданные ФЗ применены в исследовании гомогенных и микрогетерогенных жидкостей. На этой основе предложено флуориметрический метод анализа содержания полярного компонента в двукомпонентной гомогенной системе жидкостей. Впервые ФЗ на основе 3-гидроксихромонов применены для изучения физико-химических процессов в липидных мембранах, где показаны их значительные преимущества в сравнении с зондами других классов. Синтезирован ФЗ, избирательно чувствительный к неспецифическим взаимодействиям в растворах и нечувствительный к наличию молекул-доноров водородной связи. Синтезирован широкодиапазонный флуоресцентный рН-индикатор. Разработан и исследован ФЗ для определения концентрации аденозинтрифосфата (АТФ) в водных растворах. Синтезирован и исследован новый класс флуоресцентных красителей - дифлавонолов, содержащих в молекуле две системы внутримоле-кулярного фотопереноса протона.

SUMMARY

Pivovarenko V.G. Synthesis, structure and properties of multi-channel fluorescence probes on the basis of 1,3-diarylideneketones, dicyclopenta[b,e]pyridines and 3_hydroxychromones. - Manuscript.

Thesis for obtaining the scientific degree of Doctor of Sciences by the speciality 02.00.03 - organic chemistry. National Taras Shevchenko University of Kyiv, Kyiv, 2007.

Key words: fluorescence probes, fluorescence dyes, dicyclopenta[b,e]pyridines, ketocyanins, 3-hydroxychromones, flavonols, diflavonols.

Development of multi-channel fluorescence probes on the basis of mentioned in the title classes of dyes was implemented. Multi-channel fluorescence probes report about the events in studied object by several channels, each presented by separate region of excitation or emission spectrum of the probe. This allows to collect the most precise and detailed information about the object. Ratiometric probes application is an example where the collecting of the data is realized using two informational channels.

After the consideration of probe constitution and mechanisms of probe functioning two of the most prospective mechanisms - an intramolecular charge transfer (ICT) and excited state intramolecular proton transfer (ESIPT) were used in the probe design. The series of new fluorescence probes from 1,3-diarylidene-cyclopentanones, diarylideneacetones and diarylidenecyclohexanones were synthesized. High efficiency of bis-crown derivatives in the recognition of Ba²⁺ and Mg²⁺ cations as well as high resolution (7000 cm^_1) of fluorescence bands of the ligand and magnesium complex was registered for them. Diarylidenecyclo-pentanones were applied in the study of hydrogen bonding interactions with proton donor molecules and for the study of polarity of separate sites of lipid membranes. A new group of fluores-cence dyes from 3,5-diarylidenedicyclopenta[b,e]pyridines was synthesized. The properties of their representatives were studied. It was shown that these dyes have high (30-70%) fluorescence quantum yields, displaying the emission in blue, green, yellow and red regions of spectrum. A series of ratiometric fluorescence pH indicators was synthesized for the measurements of pH in the range from 2 to 11.

A series of 3-hydroxychromone (3HC) derivatives of prescribed structure were synthesized. There were obtained the dyes containing substituents of different р-do-nating ability, or with different planarity of the molecule as well as with different chromophore length, or with increased chromophore rigidity. The correlations in the structure of dye molecule and the positions of absorption and emission bands, as well as the two emission bands intensity ratio, or the fluorescence quantum yield were estimated and discussed. The dependences of mentioned parameters upon the nature of microsurroundings were estimated. The synthesized dyes were applied in the study of the properties of homogeneous and microgeterogeneous liquids, including cell organelles. A method of fluorometric determination of hydrogen bond donor component in two-component homogeneous liquid together with polarity parameter as a function of dielectric constant was proposed. The 3HC probes were applied in the study of physico-chemical processes in lipid membranes, where their considerable advantages were displayed in comparison with the probes of other types. The probe with high sensitivity to non-specific interactions and no responce to hydrogen bond donors in solutions was synthesized and studied. A wide-range fluorescent pH indicator on the basis of 3,4'-dihydroxyflavone was developed and studied, as well as the probe for determination of adenosine triphosphate in aqueous solutions, in its physiological range of concentrations.

The representatives of diflavonols - a new class of dyes were synthesized, and their fluorescence properties were studied. Due to the presence of two ESIPT systems in the molecule these dyes can display single and double proton transfer phenomena giving three tautomeric forms (NN*, NT* and TT*) in S₁ state. Theoretical methods were applied in the study of structure, as well as of synchronous and consecutive processes of intramolecular double proton transfer in diflavonols. It was estimated that diflavonols have unique fluorescence properties, such as two- and three-band emission, high (50-60%) quantum yields, record sensitivity to polarity and hydrogen bond donor ability of surroundings, high Stokes shifts (6500-10000 сm^-1) and fluorescence in wide region of spectrum (450-650 nm).

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Флуоресцентний зонд (ФЗ) є пристроєм для отримання адекватної інформації про об'єкт дослідження на молекулярному та субмолеку-лярному рівнях. Функції зонда зумовлені його фізико-хімічними властивостями і прямо залежать від його хімічної будови. Більшість існуючих ФЗ є однокана-льними пристроями, які передають інформацію шляхом зміни одного парамет-ру флуоресценції. Використання одного каналу призводить до втрати важливих даних про об'єкт. Зонди, робота яких основана на явищах внутрішньомолеку-лярного фотоперенесення заряду (ВФЗ) або внутрішньомолекулярного фотопе-ренесення протона (ВФП) демонструють суттєві переваги за кількістю та аде-кватністю переданої інформації, оскільки вони здатні генерувати багатоканаль-ний сигнал. Явище ВФЗ покладене в основу найбільш ефективних зондів поля-рності та індикаторів катіонів. Число публікацій з вивчення та практичного за-стосування явищ ВФЗ та ВФП зараз стрімко зростає. 1,3-Діариліденкетони і дициклопентано[b,e]піридини є барвниками, що демонструють ВФЗ, а 3-гідрок-сихромони у розчинах здатні до ВФП. З розгляду шляхів їх синтезу, з аналізу будови та флуоресцентних властивостей окремих представників випливає, що згадані класи сполук є зручним базисом у розробці ФЗ. Проте досі у такому напрямі наукові дослідження систематично не велись.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу було виконано на кафедрі органічної хімії хімічного факультету КНУ імені Тараса Шевченка в рамках договорів міжнародного наукового співробітництва: за програмою INTAS “Crowned ketocyanine dyes as a new generation of fluorescence probes sensitive to biomembrane surface potential” (грант 96-1225) - з універси-тетом Поля Сабатьє (м. Тулуза, Франція), Вільним університетом м. Амстердам (Нідерланди) та Інститутом біохімії ім. А.В. Паладіна, за програмами міжна-родного наукового співробітництва з університетом Луї Пастера (Страсбург, Франція), з Гданським університетом (м. Гданськ, Польща), з Інститутом фізики ім. Б.І. Степанова НАН Білорусі (Мінськ). Частину роботи виконано у рамках науково-дослідної бюджетної теми кафедри № 01БФ-037-03 “Синтез та дослідження біологічно активних гетероциклічних сполук”.

Мета і завдання дослідження. Синтез багатоканальних флуоресцентних зон-дів на основі 1,3-діариліденкетонів, дициклопентано[b,e]піридинів та 3-гідрок-сихромонів. Вивчення хімічних властивостей синтезованих сполук. Встанов-лення впливу електронної та просторової будови на флуоресцентні властивості, зокрема - встановлення залежності амплітуди спектрального відгуку на зміну параметрів оточення від будови зонда. На основі встановлених закономірнос-тей - розробка шляхів направленого синтезу флуоресцентних зондів з заданими властивостями. Тестування флуоресцентних зондів заданого призначення.

Експериментальні методи. Загальні методи синтезу, виділення, очищення ор-ганічних сполук, спектрофлуориметрія їх розчинів і аналіз залежностей струк-тура-властивості становлять основу роботи. Широковживаними є напівемпіри-чні методи квантово-хімічних розрахунків структури та властивостей сполук (АМ1 та РМ3), методи імпульсної спектрометрії ¹Н-, ¹³С-ЯМР та методи ста-ціонарної спектрофотометрії розчинів, тонкошарова хроматографія і мас-спект-рометрія. На окремих етапах роботи застосовувались квантово-хімічні розра-хунки структури та властивостей методом ab initio (базис 6-31G**, методи DFT та TDDFT, B3LYP), колонкова хроматохрафія продуктів реакції, ІЧ спектроско-пія, хромато-мас-спектрометричний аналіз сумішей, імпульсна флуориметрія нано-, піко- та фемтосекундного діапазонів, низькотемпературна спектрофото-метрія та флуориметрія, низькотемпературна спектрофотометрія і флуоримет-рія високого розділення у матрицях Шпольського (спектроскопія Шпольсько-го), електрооптична спектроскопія розчинів (спектроскопія Штарка). Пошук літературних джерел проведено з допомогою програми “Sci-Finder”. Матема-тичну обробку спектральних даних та обчислення констант стабільності комплексів здійснювали у середовищі програм “Spectral Data Lab” та “Origin”.

Наукова новизна отриманих результатів. Теоретично розроблено структуру і здійснено синтез рядів сполук класу 1,3-діариліденкетонів, дициклопентано-[b,e]піридинів (ДЦП) та 3-гідроксихромонів (3ГХ) з заданими властивостями багатоканальних флуоресцентних зондів для вивчення фізико-хімічних власти-востей рідинних середовищ. Виявлено і вивчено флуоресцентні властивості двох нових класів барвників ДЦП та дифлавонолів. Встановлено залежності спектрально-флуоресцентних властивостей синтезованих сполук від їх будови та від фізико-хімічних параметрів середовища. Виявлено шляхи керування спе-ктральними параметрами флуоресценції сполук (положенням смуг поглинання та емісії, квантовим виходом) за рахунок зміни їх будови. Методом спектроско-пії Шпольського встановлено, що донорні замісники в бічному ядрі похідних 3ГХ блокують механізм тунелювання протону, збільшуючи цим вклад механіз-му температурної активації у процесі ВФП. Розроблено шляхи хімічної модифі-кації 1,3-діариліденкетонів, ДЦП та 3ГХ у напрямках добудови в молекулах додаткових функціональних елементів флуоресцентного зонду, таких як заряд-жені групи, рецептори катіонів, ліпофільні та гідрофільні групи, групи для ковалентної іммобілізації зонду тощо. Розроблено новий шлях синтезу 4'-діал-кіламінофлавонолів, який полягає в заміщенні атома Флуору на аміногрупу. Синтезовано барвники з одним, двома, трьома та шістьма рецепторами катіо-нів: монокраун-похідні 1,3-діариліденкетону та 3-гідроксифлавону, біскраун-похідні 1,3-діариліденкетону, трискраун-похідну ДЦП, а також три- та гекса-(диметиламінометил)-похідні ДЦП. Синтезовано похідні 3ГХ, які, маючи дві системи ВФП демонструють трисмугову флуоресценцію у розчинах. На основі сполук класів ДЦП та 3ГХ розроблено ратіометричні рН індикатори для вимі-рів рН у широких межах. На основі 3ГХ розроблено зонди для вимірів поляр-ності середовища (як функції діелектричної сталої) та концентрації протонодо-нора, синтезовано йонний індикатор, максимум поглинання якого демонструє протилежно направлені зміщення при зв'язуванні з катіонами Mg²⁺ та Ba²⁺, розроблено перший високоселективний флуоресцентний зонд для визначення концентрації аденозинтрифосфату (АТФ) у водних розчинах.

Практичне значення отриманих результатів. Синтезовані зонди класу 3ГХ генерують багатоканальний сигнал у шкалах довжина хвилі - інтенсивність, внаслідок чого мають значні переваги за параметрами чутливості та адекватно-сті передачі інформації у порівнянні з іншими відомими класами. Вони дозво-лили вирішити ряд нових практичних завдань, зокрема - вимірювати концент-рацію АТФ у розчинах, визначати окремо параметри полярності і протонодо-норності (гідратованості) середовища. Синтезовані барвники володіють рядом цінних рис, які роблять їх перспективними у різних аспектах практичного застосування і ставлять на чільні місця при застосуванні у якості флуоресцент-них зондів та при створенні інших фотоелектронних молекулярних пристроїв для наукових і практичних завдань. Так, дициклопентано[b,e]піридини мають високі квантові виходи та флуоресценцію у діапазоні 450-700 нм; вони є ацидохромними сполуками як у поглинанні, так і флуоресценції. Дифлавоноли у розчинах демонструють трисмугову флуоресценцію і, поряд з високими квантовими виходами мають рекордно високу чутливість до полярності ото-чення, високі Стоксові зсуви і емісію у червоній ділянці спектра. Біс-(аза-15-краун-5)-похідна 1,3-діариліденкетону демонструє рекордно високе розділення смуг флуоресценції вільного барвника та його магнієвого комплексу. Показано, що зонди класу 3ГХ є ефективними у дослідженнях процесів у ліпідних мембранах. Смуга збудження більшості синтезованих барвників не накладається на смугу поглинання складових клітини, що є важливим у дослідженні біологічних об'єктів.

Особистий внесок здобувача в одержанні наукових результатів полягає у формулюванні загального напрямку розвитку науково-дослідної роботи та постановці завдань у окремих циклах досліджень, виконанні квантово-хімічних розрахунків, плануванні синтезів сполук, виконанні частини синтезів, встанов-ленні структури синтезованих сполук, плануванні та проведенні частини спект-рофотометричних та флуориметричних досліджень. Обробка та інтерпретація результатів, їх узагальнення і написання наукових статей, а також підготовка презентацій на наукових конференціях виконувались автором як особисто, так і разом зі співавторами публікацій.

Спектрофлуориметричні дослідження виконані з участю наукових груп спектроскопістів фізико-хімічного, фотохімічного та біофізичного напрямків під керівництвом д.б.н. Олександра Демченка, д.б.н., член-корр НАНУ Сергія Костеріна (Інститут біохімії ім. В.Н. Палладіна НАНУ, м. Київ), д.х.н. Андрія Дорошенка, др. хаб. Олександра Рошаля (Інститут хімії при Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна, м. Харків), др. хаб. проф. Єжі Блажейовского (Jerzy Blazejowski, кафедра фізичної хімії хімічного факульте-ту Гданського університету, м. Гданськ, Польща), проф. Іва Мелі (Yves Mely) та др. Гі Дюпортая (Guy Duportail, факультет фармації Університету Луї Пастера, Страсбург-Ілкірш, Франція), д.ф_м.н. Миколи Нємковича (Інститут фізики НАН Білорусі, Мінськ), проф. Вольфрама Бауманна (Wolfram Baumann, Інститут физичної хімії університету ім. Й. Гутенберга м. Майнц, Німеччи-на), проф. Елізабет Роу (Elisabeth Rowe, факультет біохімії та молекулярної біології Університету Медичного центру штату Канзас, Канзас Сіті, США), др. Турхана Узтюрка (Turhan Uzturk, НДІ генної інженерії та біотехнології Турецького наукового центру на Мармуровому морі TUBITAK, Гебзе-Кочайлі, Туреччина), проф. Цііса Гуйєра (Cees Gooijer, лазерний центр факультету ана-літичної хімії та прикладної спектроскопії Вільного університету Амстерда-му, Амстердам, Нідерланди), др. Сюзанни Фері-Форгес (Susanne Feri-Forges, лабораторія молекулярних взаємодій, Університет Поля Сабатьє, м. Тулуза, Франція), др. Олени Фальковської, Інститут молекулярної біофізики та Факультет хімії Університету штату Флориди, Талахассі, Флорида, США), др. Хуана Карлоса дель Валлє (Juan Carlos del Valle, Факультет прикладної фізичної хімії Вільного університету м. Мадрид, Іспанія). Переважна більшість спектрів ¹H- та ¹³C-ЯМР отримана групою д.х.н. Олександра Турова (лаборато-рія ЯМР спектроскопії хімічного факультету КНУ імені Тараса Шевченка). Автор щиро вдячний усім учасникам за плідну співпрацю.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи доповідались і обговорювались на міжнародних конференціях: XVI-XX IUPAC Symposiums on Photochemistry: July, 22-28, 1996, Helsinki, (Finland), July 19-24, 1998, Sitges, Barselona (Spain), July 22-27, 2000, Dresden (Germany), July 14-19, 2002, Budapest (Hungary), 17-22 July, 2004, Granada, (Spain); Terenin Memorial Symposium on Photochemistry and Photophysics, July, 29 -August, 02, 1996, St. Petersburg (Russia), XVIIIth and XX International Conferences on Photochemistry: Warsaw (Poland), 1997, July 27-31; Moscow (Russia), July 30 - August 4, 2001; III, VI, VII and VIII Conferences on Fluorescence Microscopy and Fluorescent Probes, July, 1999, Prague (Czech Rep.), September, 16-19, 2001, Amsterdam, (The Netherlands), August 24-27, 2003, Prague; На Україні: XVIII-XX Українські конференції з органічної хімії, Дніпропетровськ, 1998, Львів, 2000, Одеса, 2004.

Публікації. Основні результати роботи викладено в 62 публікаціях, серед яких 50 - статті у вітчизняних та зарубіжних журналах, 5 патентів України на винахід та >7 - тези доповідей на наукових конференціях.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, 5-ти розділів, висновків, списку цитованої літератури (430 посилань) і містить 186 рисунків та 36 таблиць.

Аналіз літературних даних наводиться у першому розділі і за необхідності - на початку підрозділу або в ході викладу. Загальний обсяг роботи без урахування ілюстрацій (124 стор. рисунків, 24 стор. таблиць, 50 стор. списку використаних джерел) становить 370 стор.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Оцінка перспективності застосування 1,3_діариліденкетонів, дициклопентано[b,e]піридинів та 3_гідроксихромонів у розробці флуоресцентних зондів

У першому розділі на основі зібраних літературних даних проведено аналіз будови та принципів роботи флуоресцентних зондів. Обговорено проблему збі-льшення числа каналів передавання інформації зондом. Аналіз механізмів фор-мування зондом оптичного сигналу привів до висновку, що явища внутрішньо-молекулярного фотоперенесення заряду (ВФЗ) або протона (ВФП) є найбільш зручними у розробці багатоканальних ФЗ. Відомі передставники 1,3-діарилі-денкетонів демонструють ВФЗ у полярних середовищах. Дициклопентано-[b,e]піридини мають схожу електронну будову, що вказує на перспективність обох класів сполук у розробці флуоресцентних зондів. На час початку роботи існувало лише три публікації, де описувались спектральні властивості діарилі-денкетонів (2.4 та 2.12, Схема 1). Флуоресцентні властивості дициклопентано-[b,e]піридинів були невідомими, а їх методи синтезу були недосконалими; існу-вало лише кілька публікацій з описанням синтезу їх найпростіших представ-ників (3.1, 3.2 і 3.12, Схема 2). Флуоресцентні властивості були опубліковані лише для найпростіших 3-гідроксихромонів (4.1, 4.3 та 4.8, Рис. 10). Залежність цих властивостей від будови для трьох названих класів барвників не була встановленою. Розробка ФЗ на їх основі системно не проводилась. У дисертації зроблено огляд усіх класів барвників, що демонструють ВФП. Показано, що 3_гідроксихромони, як і 1,3-діариліденкетони та дициклопентано[b,e]піридини є зручним базисом для розробки багатоканальних флуоресцентних зондів.

На основі квантово-хімічного аналізу просторової та електронної будови зроблено оцінку 1,3-діариліденкетонів як флуоресцентних бавників. Показано, що особливості їх будови дозволяють полярному оточенню значно змінювати розподіл електронної густини в молекулі, змінюючи цим різницю в енергіях ос-новного та збудженого станів, а з нею - і положення максимумів поглинання та флуоресценції. В молекулі існують три точки ефективного впливу полярних молекул на флуоресцентні властивості. Вони представлені неподіленими пара-ми електронів атомів Нітрогену ароматичних ядер та Оксигену карбонільної групи (Рис. 1). Для досягнення максимальної амплітуди флуоресцентного сиг-налу при зв'язуванні з аналітом рецептори аналіту повинні бути встановлені поблизу цих пар. Згідно до виконаних розрахунків (метод АМ1) похідні ацето-ну є планарними сполуками, тоді як для 1,3-діариліденциклопентанонів такими є лише похідні з п'ятичленними боковими ядрами. Проте, розрахована величи-на міжфрагментного кута (24є) та збільшена жорсткість молекули свідчать про перспективність 1,3-діариліденциклопентанонів у розробці ФЗ. Показано, що внаслідок стеричних перепон 1,3-діариліденциклогексанони не є плоскими, ос-кільки їх планарний стан є дестабілізованим на 3.7 ккал/моль. Величина між-фрагментного кута (44є) вказує на значне погіршення спряження в молекулі і на пов'язані з цим безвипромінювальні втрати при переході в основний стан. Такі ознаки призводять не лише до падіння молярного коефіціента екстинкції та квантового виходу флуоресценції, а й до небажаного зміщення смуг поглинан-ня і емісії барвника у короткохвильову область, що вказує на недоцільність ви-користання похідних циклогексанону у роботі. З метою перевірки теоретичних висновків виконано синтез і вивчено спектральні властивості похідних цикло-пентанону, циклогексанону та ацетону 2.4 - 2.17. Синтезовані барвники демон-струють молярні коефіціенти екстинкції біля 8·10^-4 л·моль^-1см^-1 і високу пози-тивну сольватофлуорохромію, яка у сполук 2.4, 2.6, 2.8, 2.10, 2.12, 2.14 та 2.15 досягає параметрів широковживаного зонда PRODAN, а у сполуки 2.11 переви-щує його (Рис. 2). Така властивість за наявності кількох типів рецепторів катіо-нів створила можливості для реєстрації флуоресцентної відповіді при зв'язу-ванні катіонів різного радіусу або молекул-донорів водневого зв'язку. Так, про-тонування похідних 2.6, 2.8 та 2.15 веде до гасіння емісії, тоді як катіони Mg²⁺ викликають батохромний, а катіони Ba²⁺ - гіпсохромний зсув смуги емісії. Для зондів 2.6, 2.8 та 2.15 зареєстровано рекордно високе (8000 см^_1) розділення смуг вільної і протонованої форм у спектрах поглинання, а також смуг вільного ліганда та магнієвого комплекса (Mg²⁺)₃L у спектрах флуоресценції (7000 см^_1, Рис. 3). Ці дані, поряд з простотою синтезу, емісією у червоній області спектра, високоми квантовими виходами флуоресценції та високою фотостабільністю у протонодонорних середовищах, свідчать про значні перспективи їх практич-ного використання, у тому числі й у розробці флуоресцентних зондів різного призначення.

У гомогенних рідинних середовищах зонди 2.4, 2.6, 2.8, маючи хромофори однакової будови, мало різняться між собою за спектральними характеристи-ками. В той же час у ліпідних везикулах ці сполуки відрізняються за квантови-ми виходами, напівшириною смуги, за формою спектру і положенням максиму-му у спектрі емісії, що пов'язано з неоднаковим розташуванням гідрофільних та ліпофільних груп у їх молекулах і викликаною цим різницею в орієнтації та в молекулярному оточенні зонда в мембрані. Сполуки 2.4, 2.6, 2.8 виявилися ефективними у дослідженні бінарних систем, що складаються з неполярного (толуен) та полярного протонодонорного (метанол, н-бутанол та трет-бута-нол) компонентів. При збільшенні концентрації спирту поряд з сольватохром-ним зсувом смуги флуоресценції зонда спостерігається послідовна поява двох інших смуг (Рис. 4). З урахуванням положення смуг у спектрі вони були відне-сені до емісії водневих комплексів С=О групи барвника з однією та двома молекулами або асоціатами молекул спирту. За даними титрування обчислені ефективні константи стабільності комплексів складу 1:1 та 1:2 зі вказаними спиртами.

Встановлення властивостей зондів у гомогенних розчинах дозволило викона-ти дослідження ліпідних мембран. На противагу розчинам, спектри емісії зон-дів 2.6, 2.8 та 2.14 у мембранах еритроцитів значно відрізняються за положен-ням, напівшириною, формою та інтенсивністю. Це свідчить про різну локаліза-цію і орієнтацію зондів у мембрані, коли більш гідрофільний зонд займає більш полярні сайти мембрани. З врахуванням полярності оточення здійснено розклад спектрів на компоненти та ідентифіковано три типи сайтів: неполярні, низької гідратації та високогідратовані. Титрування мембран зондами дозволило про-стежити зміну локалізації кожного зонда при зміні його концентрації, обчисли-ти константи зв'язування зонда і оцінити заселеність сайтів різної полярності.

З метою вивчення спектральних властивостей досліджено умови синтезу барвників 3.1-3.18. На основі квантово-хімічного аналізу просторової та елект-ронної будови (метод РМ3) зроблено оцінку похідних дициклопентано[b,e]-піридину (ДЦП) як флуоресцентних бавників. Показано, що внаслідок стерич-них перепон вони є непланирними сполуками (за винятком похідних, де арил - п'ятичленний гетероцикл). Проте, величина міжфрагментного кута (24є) та збільшена жорсткість молекули робить ці похідні перспективним базисом у розробці ФЗ. Рецептори аналіту мають бути розміщені у місцях його найбіль-шого впливу на флуоресцентні властивості, а саме - біля неподілених пар елек-тронів атома Нітрогену піридинового ядра та біля замісників у пара-положенні бокових ядер (Рис. 5). Місцями оптимального розміщення інших функціональ-них елементів флуоресцентного зонду є бокові ядра барвників.

Спираючись на дані ¹Н-ЯМР спектроскопії, флуоресценції та квантово-хімічного аналізу просторової будови, для синтезованих сполук встановлено Е,Е-конфігурацію, а також конформацію їх молекул у розчинах. На основі порівняння хімічних зсувів протонів для різних похідних показано, що планар-ну конформацію в розчинах мають лише ті похідні, де бокове ядро є п'яти-членним циклом. У спектрах ¹Н-ЯМР цих сполук сигнали метиленових груп зміщені у слабке поле внаслідок дезекранування кільцевими струмами бокових ядер (Рис. 6). Виплощення молекули ДЦП також веде до зменшення різниці у хімзсувах орто-протонів арильного і ариліденових замісників. З метою подальшого флуориметричного дослідження йон- та рН-сенсорних властивос-тей синтезовано три-(аза-15-краун-5)-похідну 3.17 (Схема 2), серію три- та гекса(амінометил)похідних 3.27-3.29, а також трикарбоксипохідні цього класу барвників 3.46-3.47 (Рис. 7). Шляхом алкілювання та ацилювання гідроксипо-хідних синтезовано ряди ДЦП з різною ліпофільністю молекул (Рис. 7). З три-естерів 3.41 та 3.42 отримано трикарбонові кислоти 3.46 та 3.47. Цим показано шляхи модифікації сполук з метою встановлення додаткових функціональних елементів флуоресцентного зонду.

Синтезовано EZ-ізомери 3.19-3.20 (Схема 3) і доведено їх будову. На відмі-ну від ЕЕ- та ZZ-ізомерів, у спектрах ¹Н-ЯМР EZ-ізомерів сигнали атомів заміс-ників у положеннях 2 і 6, та 3 і 5 центрального ядра не є еквівалентними. Сигнали протонів гідроксигруп значно розділені за положенням у спектрі: два з них перебувають при 12.3 та 12.4 м.ч., а ще один - при 4.6 м.ч. Сильнопольне положення останнього вказує на значне його екранування кільцевими струма-ми ароматичного залишку, що можливо для протона гідроксигрупи залишку в положенні 8. Значне зміщення сигналів двох перших протонів у слабке поле, до 12.6 м.ч., а також кольорова реакція з FeCl₃ є свідченням утворення ними внутрішньомолекулярного водневого зв'язку.

Вперше вивчено флуоресцентні властивості сполук класу ДЦП (Рис. 8). ЕZ-Конформери не є люмінофорами, тоді як ZZ-конформери у всіх типах органіч-них розчинників мають високі (30-80%) квантові виходи емісії. Планарна кон-формація молекул 3.9 та 3.10 у розчинах веде до збільшення квантових виходів емісії. Амінопохідні 4.5 4.6 та 4.17 володіють вираженою сольватохромією, особливо у спиртах, що є результатом утворення внутрішньомолекулярного водневого зв'язку з протонодонором. Максимуми поглинання ДЦП лежать на межі УФ та видимого діапазонів, а максимуми емісії, в залежності від будови сполуки та природи розчинника перебувають при 450-600 нм. Стоксові зсуви смуг емісії коливаються у межах від 2500 до 6500 см^-1 і мають вищі значення при зростанні р-донорності бокових ядер, або при зменшенні планарності сполуки, а також при утворенні водневого зв'язку з протонодонором.

Досліджено прототропні перетворення сполук 3.1-3.10 спектрометричними методами (Рис. 9-10). Протоновані форми 3.1-3.10, хоч і мають дещо нижчі ква-нтові виходи емісії, здатні до флуоресценії, що є рідкісним явищем, яке надає можливості для створення ратіометричних рН індикаторів на основі цих спо-лук. Смуги поглинання та емісії при протонуванні зміщуються батохромно на 3500-5500 см^-1, потрапляючи у жовту та червону ділянки спектру. Положення максимумів поглинання та емісії, а також основність барвника можна змінюва-ти у широких межах шляхом уведення донорних (сполуки 3.4-3.6 ) або акцеп-торних груп у бічні ядра. Так само можна регулювати рК_а цих індикаторів у межах рН від 2 до 10 (Рис. 9d). Порівняно з іншими похідними піридину подіб-ної будови, ДЦП мають приблизно на дві одиниці нижчі значення рК_а. Іншою аномалією є те, що у S₀ та S₁ станах вони демонструють близькі значення рК_а (Рис. 9d), Обидві аномалії можуть бути пояснені збільшеними просторовими перешкодами при протонуванні атома Нітрогену дициклопентанопіридинів.

Шляхом квантово-хімічних розрахунків проведено конформаційний аналіз 3ГХ із замісниками різного ефективного об'єму у положенні 2. Отримані резу-льтати свідчать, що у 2-арил-3ГХ міжфрагментний кут складає ~27є. Лише у випадку п'ятичленних циклів молекула 3ГХ займає плоску конформацію, що, як і збільшення ступеня конденсованості молекули, має привести до зростання квантового виходу емісії. Наявність електронодонорів у боковому ядрі має збі-льшити спектральну чутливість сполуки до полярності середовища. Замісник у положенні 5 хромонового ядра, блокуючи доступ до неподіленої пари електро-нів карбонільної групи може ліквідувати спектральну чутливість сполуки до молекул-донорів водневого зв'язку, зберігши при цьому чутливість до неспеци-фічних взаємодій у розчинах (Рис. 11). На основі проведеного теоретичного аналізу спрогнозовано структури серії барвників для подальшого вивчення їх флуоресцентних та сенсорних властивостей (Рис. 12). Виконано практичне порівняння ефективності шляхів синтезу 3ГХ і показано, що окисна циклізація 2-гідроксихалконів (Схема 4, п.1) є найбільш універсальним і зручним шляхом. Але при застосуванні до синтезу діалкіламінопохідних 3ГХ усі методи не завж-ди є продуктивними. Для подолання цієї проблеми розроблено і застосовано методику нуклеофільного заміщення атома Флуору на діалкіламіногрупу у 3ГХ (Схема 4, п.4). Цей шлях виявився ефективним у багатьох аспектах. Найперше, він спростив синтез діалкіламінопохідних 3ГХ складної будови і дозволив на основі однієї флуоропохідної отримувати ряд діалкіламіно-3ГХ.

Досліджено залежність спектральних властивостей від таких параметрів будови молекули 3ГХ як планарність, довжина хромофору, наявність та поло-ження донорних замісників, ступінь конденсованості тощо. Встановлено, що електронодонорні групи в боковому ядрі та збільшення довжини хромофору ведуть до батохромного зсуву смуг поглинання та флуоресценції (Рис. 13). Електронодонори в ядрі хромона та зменшення планарності молекули дають гіпсохромне зміщення смуги поглинання та емісії N*-форми, що є результатом зменшення вкладу орбіталей бокового ядра в електронних переходах S₀>S₁ та S₀<S₁. Найвищі квантові виходи емісії мають найбільш планарні сполуки 4.1a, 4.2, 4.4-4.4f. Аннелювання ароматичного ядра в положення 5,6, 6,7 або 7,8 хромона веде до зростання молярного коефіціента екстинкції та квантового виходу емісії, проте суттєво не змінює положення смуг поглинання та емісії сполуки (Рис. 14). Відношення інтенсивностей смуг емісії таутомерних форм (I_N*/I_T*) росте при збільшенні довжини хромофору та електронодонорності замісника в боковому ядрі, що є результатом зближення N* і T* станів за енергією. Донорний замісник у ядрі хромона створює протилежний ефект: збільшуючи основність атома Оксигену О-4, він стабілізує Т*-форму барвника. Встановлені закономірності були використані при створенні флуоресцентних зондів для прикладних завдань: одночасного визначення полярності та концен-трації протонодонора у розчині, аналізу двокомпонентних сумішей розчинни-ків, флуориметричного визначення рН визначення АТФ тощо.

Досліджено залежність спектральних властивостей характерних представ-ників 3ГХ від параметрів розчинника (макроскопічної та мікроскопічної поляр-ності, протонодонорності, основності тощо). Встановлено, що всі синтезовані сполуки володіють позитивною сольватохромією як у поглинанні, так і в емісії (Рис. 13а). Найбільші сольватохромні зсуви демонструє N* форма сполук, при-чому цей ефект росте при збільшенні довжини хромофору або електроно-донорності замісника у боковому ядрі. Квантові виходи емісії для ряду сполук 4.1a, 4.2, 4.3b, 4.4b та 4.5 мало змінюються зі зміною полярності розчинника.

Показано, що параметром, найбільш чутливим до полярності середовища є відношення інтенсивностей смуг емісії таутомерів I_N*/I_T*, для якого зареєстро-вано логарифмічну залежність від функції діелектричної сталої (Рис. 13-15). Рекордно високу чутливість мають сполуки 4.4-4.4f. Як наслідок, вони можуть бути сенсорами у середовищах з E_T(30) <39 і працювати в парі з 4.2, яка най-більш ефективно працює у полярних середовищах (E_T(30) >36). На основі ана-лізу властивостей 3ГХ створено серію високочутливих сенсорів полярності середовища 4.1а, 4.3b-4.3f, 4.2, 4.4-4-4f зі збільшеною яскравістю флуоресцен-ції, смуга поглинання яких розташована у межах 340-460 нм, а смуги емісії - у межах 410-650 нм. Характерною і практично цінною властивістю барвників 4.1-4.13 є високі Стоксові зсуви смуг емісії, які для N*-форми коливаються в межах 2000-7200 см^-1, а для Т*-форми - від 7000 до 12000 см^_1. Причиною цього є явища ВФЗ (для N*-форми) та ВФП - для Т*-форми.

Шляхом квантово-хімічних розрахунків геометрії, ентальпії та ентропії утворення комплексів сполуки 4.8 з донорами (метанол) та акцепторами (ДМСО) водневого зв'язку, а також спорідненності основних атомів сполуки 4.8 до протону встановлено найбільш імовірні структури цих комплексів у основному і збудженому станах (Рис. 16). Особливості будови комплексів TD1 та TA1 пояснюють протилежні зміщення максимумів емісії Т* форми при збільшенні концентрації донора та акцептора ВЗ у розчині. На основі аналізу отриманих для сполук 4.3 та 4.8 даних розроблено метод визначення вмісту протонодонорного компонента у двокомпонентній суміші (Рис. 15) за чотирма параметрами спектру емісії зонду: за положенням максимумів емісії таутомер-них форм (н_N*, н_T*) та за їх інтенсивністю (І_N*, І_T*). Водночас ці параметри від-творюють полярність середовища як функцію діелектричної сталої (-1)/(2+1), оскільки остання перебуває у прямо пропорційній залежності з сумою н_N*+н_T*.

Методом електрооптичної спектрометрії виміряно дипольні моменти зон-дів 4.1m, 4.6, 4.8 та 4.9 у основному S₀ та збудженому (Франк-Кондонівському S₁) станах (відповідно _g та _e^FC, Табл. 1). Величини дипольних моментів _g і _e^FC зменшуються для вивчених сполук у наступній послідовності: 4.9 > 4.6 4.8, що може бути результатом часткової компенсації гідроксигрупою у сполу-ках 4.6 та 4.8 негативного заряду карбонільної групи в S₀ стані та зменшення ступеня перенесення заряду з аміногрупи у S₁^FC стані. Близькі значення диполь-них моментів для двох останніх сполук свідчать про несуттєвий вплив алкіль-них замісників атома Нітрогену на загальну поляризацію молекули. Метокси-похідна 4.1m має найнижчі значення _g та _e^FC, що пов'язано з відсутністю у сполуки 4.1m потужного донора - діалкіламіногрупи. Як наслідок, поляризація молекули здійснюється за участю електронних орбіталей, локалізованих на іншій частині молекули. Порівняння величин та кутів розподілення дипольних моментів у S₀ та S₁^FC станах дозволило у значній мірі уточнити картину поляризації 3ГХ з різним типом заміщення. Зокрема, показано, що 4'-аміноза- міщені похідні за типом поляризації та за природою електронних переходів суттєво відрізняються від інших сполук даного класу, утворюючи окрему спектральну групу. При їх збудженні (перехід S₀>S₁) задіяні переважно орбіталі бокового та піронового ядер, тоді як за відсутності 4'-аміногрупи у переході S₀>S₁ задіяні електрони на орбіталях ядра хромона.

Шляхом низькотемпературної спектроскопії Шпольського (матриця криста-лічного н-октану, 4-20 К) досліджено природу механізмів прямого та зворот-ного ВФП у 3ГХ та утворення ними водневих зв'язків з протонодонорами. На основі вимірів часів ВФП для сполук 4.1, 4.1m та 4.1f (Рис. 17) встановлено незалежність швидкості ВФП від температури у межах 4-20 К і зроблено вис-новок, що у похідних 3ГХ цей процес відбувається за механізмом тунелювання. Встановлено, що донорні замісники у бічному ядрі суттєво сповільнюють ВФП, що є результатом збільшення основності атомів Оксигену О-3 та О-4 і викликаного цим збільшення ширини бар'єра ВФП. Отже, за звичайних умов процес ВФП слід розглядати як такий, що відбувається за комбінованим механізмом тунелювання та температурної активації, і вклад механізму тунелювання протону зменшується при появі електронодонорів у бічному ядрі.

У спектрах Шпольського зареєстровано і пояснено ізотопний ефект зсуву лі-ній збудження та флуоресценції при заміні протію на дейтерій у гідроксигрупі сполук 4.1, 4.1m та 4.1f. Вдвічі більша маса атома D веде до нижчого в 2^-1/2 рази розташування коливальних рівнів одного й того ж типу у порівнянні з протієм. Оскільки у S₁ стані коливальні рівні розташовані тісніше, це приводить до зміщення смуги збудження дейтеропохідного у бік коротких хвиль, а смуги емісії - у довгохвильовий бік. Фуранові похідні 4.1f, 4.2 та 4.2n, порівняно з флавонолом 4.1 завжди мають подвійну кількість ліній у низькотемпературних спектрах збудження та емісії, що може бути результатом заселення двох нерів-ноцінних за енергіями конформацій, де кути між ядрами хромона та бокового замісника складають 0 та 180є.

Синтезовано широкодіапазонний флуоресцентний рН-індикатор 4.2am для вимірювань рН у межах від 2 до 10 (Рис. 18). Наявність основних груп біля групи 4ґ-ОН зсуває її рК_а до значення 4.4. Депротонування груп N(CH₃)₂, та 3-ОН відбувається при рН 7-10. Індикатор 4.2am не утворює агрегатів у водних розчинах у широких межах рН і генерує ратіометричний сигнал як у спектрах збудження, так і емісії. В останньому випадку виміри рН можливі в двох окремих діапазонах: рН>7 та рН<7.

Спрогнозовано структуру і синтезовано зонд 4.3b, чутливий лише до неспецифічних взаємодій у розчинах і нечутливий до донорів водневого зв'язку. Це є наслідком блокування доступу донорів ВЗ до неподілених електронних пар атомів Оксигену молекули 4.3b. На противагу до зонду 4.3b його прототип 4.3, як і більшість 3ГХ, має високу чутливість до молекул-донорів ВЗ і внаслідок цього утворює дві окремі залежності у координатах lg(I_N*/I_T*) = f() одна з яких належить донорам ВЗ (Рис. 14).

Синтезовано і досліджено флуоресцентний сенсор 4.6 катіонів різного радіусу (Рис. 19). Наявність у молекулі двох різнотипних рецепторів, розташованих біля протилежних кінців диполя хромофору спричиняє різні зміни у спектрах поглинання і емісії при зв'язуванні катіонів цими рецепторами. Як наслідок, спектральні зміщення смуг сенсора 4.6 мають протилежний характер для катіонів Mg²⁺ та Ba²⁺ у сухому ацетонітрилі, оскільки послідовність їх зв'язування рецепторами є протилежною.

Зареєстровано і досліджено ефект появи нової смуги у спектрі збудження флуоресценції зонду 4.8 при додаванні у розчин аденозин трифосфату (АТФ, Рис. 20). Ефект створюється при рН 7 лише аніоном АТФ і є наслідком утворення асоціатів зонд-АТФ, у яких поляризована молекула зонду має певну орієнтацію у електростатичному полі АТФ. Інші нуклеотиди та поліаніони (аденозин ди- та монофосфати тощо) не викликають подібних спектральних змін (Рис. 20b). На цій основі розроблено метод визначення АТФ у розчинах, у межах його фізіологічних концентрацій.

Показано, що мультипараметричні зонди 4.6 та 4.8 є ефективними у дослід-женнях хемо- та термотропних перетворень ліпідних мембран. Висока чутли-вість зондів до змін гідратованості та в'язкості середовища дозволяє встанови-ти не лише точки фазових переходів ліпідного бішару, але й описати зміни характеристик оточення зонду, а реалізація принципу багатоканальності у при-йомі інформації дозволяє судити про локалізацію зонду у об'єкті. Так, збільшення концентрації етанолу веде до росту протонодонорності та зменшен-ня в'язкості оточення, про що свідчить збільшення інтенсивності емісії N* форми та зменшення загальної інтенсивності емісії. Збільшення концентрації холестерину створює протилежні ефекти (Рис. 21).

Зареєстровано і досліджено явище утворення впорядкованих структур молекул буфера HEPES на поверхні бішару везикул аніонного ліпіду ЯЖФГ (яєчний фосфатидилгліцерин), у середовищі яких спостерігається дисоціація зонда 4.8 навіть при рН?7 (Рис. 22). Цвіттеріонна природа молекул HEPES ве-де до їх взаємодії з негативно зарядженою поверхнею везикули та до впорядко-ваної орієнтації на поверхні. Основні атоми Нірогену молекули HEPES утворю-ють МВЗ з гідроксигрупою 4.8, фіксуючи молекулу 4.8 в електростатичному полі створеного шару і викликаючи її дисоціацію. Утворення аніону сполуки 4.8 підтверджено вимірами часів згасання емісії барвника у водному розчині та у везикулах, розміщених у фосфат-цитрат-боратному буфері (ФЦББ) або в HEPES. Лише у випадку системи ліпід-HEPES при рН 7.0 зареєстровано складову, яка має час життя 4·10^-9 с і відноситься до емісії аніону. У випадку системи ліпід-ФЦББ таку складову емісії зареєствровано лише при рН>9.

Синтезовано перші флуоресцентні зонди на основі 3ГХ 4.11-4.13 з фіксованою локалізацією та орієнтацією в ліпідній мембрані (Рис. 23). Вивчено їх спектральні властивості в розчинниках різної полярності та в ліпідних везикулах, створених з нейтральних та аніонних ліпідів. Різний рівень гасіння для 4.11, 4.12 та 4.13 парамагнітними сполуками свідчить, що ці зонди мають фіксовану локалізацію і орієнтацію в ліпідному бішарі, тоді як сполука 4.8 змінює глибину свого розташування в широких межах.

Проведено аналіз можливостей збільшення числа каналів передавання інформації шляхом генерації третьої смуги у спектрі емісії зонду. Спрогнозо-вано структуру барвників - дифлавонолів, які мають дві системи ВФП у моле-кулі і внаслідок цього в збудженому стані можуть утворювати три таутомерні форми: NN*, NT* і ТТ* (Схема 5). На підставі такого припущення здійснено синтез барвників 5.1 - 5.3. Вперше досліджено їх флуоресцентні властивості у розчинах за температур 77 і 298 К. Порівняно з хромонами 4.1 та 4.3 макси-муми у спектрах поглинання сполук 5.1 - 5.3 зміщені батохромно на 30-50 нм і лежать на межі УФ та видимого діапазонів (Табл. 2-3). Донорні замісники у 5.3 порівняно з 5.1 викликають батохромний зсув максимуму на 40-90 нм. Барвни-ки 5.1-5.3 мають два еквівалентні крос-кон'юговані хромофори, внаслідок чого кількість смуг у їх спектрах поглинання є збільшеною (Рис. 22). Дифлавонол 5.3, маючи у 1.5 рази більший молярний коефіціент екстинкції, ніж флавонол 4.3, проявляє високі (>50%) квантові виходи емісії у апротонних розчинниках (Табл 3). Усі барвники демонструють багатосмугову емісію у розчинах і проявляють високу чутливість до полярності і протонодонорності середовища, змінюючи інтенсивність та положення смуг у спектрах емісії.

Важливим питанням є встановлення природи смуг у спектрах емісії дифлавонолів. Шляхом застосування квантово-хімічних розрахунків (ab initio: базис 6-31G**, методи DFT і TDDFT, B3LYP) досліджено процеси синхрон-ного (СП) та послідовного перенесення двох протонів (ПП) у дифлавонолі 5.1 та флавонолі 4.1 в основному (S₀) та збуджених (S₁, S₂ та S₃) станах (Рис. 24). За цими даними, хоча СП у стані S₁ та S₂ і ПП у стані S₂ є екзотермічними проце-сами, найбільший виграш енергії спостерігається при перенесенні лише одного протона у стані S₁, що вказує на реалізацію даного механізму у випадку спо-луки 5.1, як мінімум у неполярному середовищі. В таких умовах смуги у спект-рах емісії 5.1 (спектри збудження яких співпадають зі спектром поглинання), слід віднести до NN* і NT* форм. Добре виражену позитивну сольватохромію демонструє короткохвильова смуга емісії, в той час як довгохвильова смуга і смуга поглинання є менш чутливими до полярності оточення. Введення елект-ронодонорів (діалкіламіногруп) в бокові ядра дифлавонолів радикально збіль-шує їх сольватохромію: для NN*-форми сполуки 5.3 вона є вищою, ніж для 3-гідроксихромону 4.3 (Рис. 25). Параметром, найбільш чутливим до зміни полярності середовища, є відношення інтенсивностей двох смуг емісії, яке за величиною для 5.3 змінюється на 4 порядки при переході від н-пентану до дихлорометану (Табл 3). Чутливість барвників 5.1-5.3 до протонодонорів проявляється у шкалі загальної інтенсивності флуоресценції: у спиртах квантовий вихід флуоресценції падає на 2-3 порядки і становить частки відсотків. У спиртах при 298 К довгохвильова смуга 5.1 має кілька складових, а її максимум зміщений від 602 до 562 нм (Табл. 2). Оскільки спектр емісії у 0.01 М етоксиді натрію має таке ж положення, смугу було віднесено до аніонних форм сполуки (AA* або AТ*). Барвники 5.1-5.3 мають смуги емісії у червоній ділянці спектру і високі (6500-8500 см^-1) Стоксові зсуви, що є цінним у багатьох аспектах практичного використання. Високі Стоксові зсуви є результатом фотохімічних явищ: ВФЗ (для форми NN*) та ВФП (для форм NТ* і ТТ*).