Применение метода электрофореза в анализе лекарственных средств

Размещено на http://www.allbest.ru/

ГБОУ ВПО Смоленская государственная медицинская академия

Министерства Здравоохранения России

Кафедра фармацевтической химии и фармакогнозии

Курсовая работа

Применение метода электрофореза в анализе лекарственных средств

Выполнил:

студент 5 курса

заочного отделения

фармацевтического факультета

Клепча Татьяна Фёдоровна

№ зачетной книжки 08594

Обратный адрес:

РБ, г. Минск, ул. Ландера, 62/1-65

Смоленск 2014

Содержание

электрофорез анализ зональный лекарственный

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Электрокинетические явления

1.2 Электрофорез

1.2.1 Свободный (фронтальный) электрофорез

1.2.2 Электрофорез на носителях (зональный электрофорез)

1.2.2.1 Электрофорез в свободной жидкости

1.2.2.2 Электрофорез в крупнопористых носителях

1.2.2.3 Электрофорез на мелкопористых носителях

2. Практическая часть

2.1 Капиллярный электрофорез

Общие выводы

Заключение

Список используемых источников

Введение

Свойствами и анализом лекарственных веществ занимается фармацевтическая химия.

Фармацевтическая химия -- наука, которая, базируясь на общих законах химических наук, изучает многообразный круг вопросов, связанных с лекарственными веществами: их получение и химическую природу, состав и строение, влияние отдельных особенностей строения их молекул на характер действия на организм, изучает физические и химические свойства лекарственных веществ и методы контроля их качества, определяет условия хранения лекарств.

Фармацевтическая химия занимает ведущее место в комплексе смежных фармацевтических наук (технология лекарств, токсикологическая химия, фармакогнозия, экономика и организация фармацевтического дела) и является необходимым фундаментом для их понимания и знания.

В то же время фармацевтическая химия, являясь специализированной наукой, не может не опираться на знания смежных химических (неорганическая, органическая, аналитическая, физиологическая и коллоидная химия), а также медико-биологических (фармакология, физиология, биологическая химия) дисциплин.

Знание биологических дисциплин необходимо для понимания сложных физиологических процессов, происходящих в организме, в основе которых лежат химические и физические реакции. Это позволяет более рационально применять лекарственные вещества, наблюдать за их действием в организме и на основании этого изменять в необходимом направлении структуру молекул создаваемых лекарственных веществ с целью получения желаемого фармакологического эффекта. По результатам фармакологического испытания лекарственных веществ дается заключение о возможности использования их в медицинской практике.

Одна из важных задач современной химии - надежный и точный анализ органических веществ, часто близких по строению и свойствам. Без этого невозможно проведение химических, биохимических и медицинских исследований, на этом в значительной степени базируются экологические методы анализа окружающей среды, криминалистическая экспертиза, а также химическая, нефтяная, газовая, пищевая, медицинская отрасли промышленности и многие другие отрасли народного хозяйства.

Цель курсовой работы:

- изучить применение метода электрофореза в анализе лекарственных средств.

Задачи:

1. Ознакомится с методом электрофореза

2. Подробно рассмотреть разновидности метода

3. Изучить последовательность анализа методом электрофореза

4. Изучить область применения метода.

1. Обзор литературы

1.1 Электрокинетические явления

Электрокинетическими явлениями называют перемещение одной фазы относительно другой в электрическом поле и возникновение разности потенциалов при течении жидкости через пористые материалы (потенциал протекания) или при оседании частиц (потенциал оседания). Перенос коллоидных частиц в электрическом поле называется электрофорезом.

В эксперименте Ф.Ф. Рейсс погрузил в глину две стеклянные трубки, заполнил их водой и после наложения на них электрического поля наблюдал перемещение частиц глины в жидкости в направлении положительно заряженного электрода. Это был электрофорез. Таким образом, было обнаружено, что частицы имеют заряд, противоположный заряду жидкости. [1] Электрофорез применяют главным образом для разделения веществ, молекулы которых различаются по электрофоретической подвижности, т.е. отношению скорости электрофореза (скорости перемещения заряженных частиц вещества) к напряженности электрического поля, которое зависит от свойств заряженных частиц окружающей их среды. Путем изменения внешних условий (например, рН среды, температуры, силы тока, состава и концентрации буферного раствора или носителя) создают подходящие условия для разделения. Вследствие того что при разделении на молекулы действуют только электростатические силы, электрофорез считают "мягким" методом и поэтому часто применяют для работы с лабильными веществами.

Электрофорез можно проводить в растворе, но из-за неизбежного выделения теплоты и возникающей в связи с этим тепловой конвекции процесс, как правило, проводят на носителе.

Вследствие не­которых сопутствующих явлений (адсорбция, несоизмеримость размеров высокомолекулярных соединений и пор носителя) введение носителя ограничивает область применения метода.

Однако свойства носителя иногда используют для повышения эффективности разделения: например, при электрофорезе в градиенте полиакриламидного геля фракционирование осуществляется не столько за счет различной электрофоретической подвижности веществ, сколько за счет различия в их молекулярных массах.

Таким образом, мы рассмотрели и дали понятие электрокинетическим явлениям.

А также описали методику проведения данных явлений, с помощью электрофореза.

1.2 Электрофорез

Электрофорез -- это процесс направленного движения частиц, диспергированных в жидкости в постоянном электрическом поле.

Частицы одного и того же вещества несут одинаковые по знаку заряды. В электрическом поле положительно заряженные частицы перемещаются к отрицательному электроду -- катоду, отрицательно заряженные частицы к положительному электроду -- аноду.

Движение частиц к катоду иногда называют катафорезом, к аноду -- анафорезом.

Скорость движения зависит от массы частиц, и их заряда в данных условиях, благодаря чему электрофорез позволяет разделять смеси веществ на составляющие их компоненты.



Рис. 1. Схема свободного (фронтального) электрофореза. Положение границ раздела: а -- до опыта; б -- после опыта. 1 -- электроды; 2 -- растворитель; 3 -- раствор белка.

Различают следующие виды электрофореза.

1.2.1 Свободный (фронтальный) электрофорез

В этом случае электрофорез проводят в приборах, существенной частью которых является U-образная трубка (Рис. 1). Нижнюю часть трубки заполняют испытуемым объектом, например раствором белка, на который наслаивают растворитель. В растворитель погружают электроды, соединенные с источником постоянного тока. При этом электрически заряженные частицы белка перемещаются к одному из электродов, вследствие чего граница раздела между раствором и растворителем в одном колене поднимается (восходящая граница), а в другом опускается (нисходящая граница).

Приборы для свободного электрофореза, снабженные устройством автоматической регистрации перемещения каждого компонента в исследуемом объекте, применяют при анализе дисперсных систем, выделении из них отдельных компонентов, а также при клиническом исследовании сыворотки крови. [3, 4, 9]

Таким образом, мы рассмотрели один из видов электрофореза - свободный (фронтальный) электрофорез.

Также была описана методика проведения данного метода, на примере раствора белка.

1.2.2 Электрофорез на носителях (зональный электрофорез)

В качестве носителей используют бумагу, гели крахмала, агара, полиуретанов и др. В клинических лабораториях особо широкое распространение для исследования сыворотки крови получил электрофорез на бумаге, который проводится следующим образом: на полоску специального сорта бумаги, пропитанной соответствующим буферным раствором, наносят капельку сыворотки крови. Концы полоски опускают в чашечки, заполненные данным буферным раствором и снабженные электродами. При пропускании постоянного электрического тока отдельные белки сыворотки перемещаются вдоль полоски с разными скоростями, а иногда и в разных направлениях. По истечении определенного времени пропускание тока прекращают, полоску бумаги подсушивают и обрабатывают реактивом на белок. При этом на бумажной электрофореграмме выявляются окрашенные пятна. По числу пятен судят о количестве белковых фракций, а по интенсивности окраски пятен -- о количественном содержании каждой белковой фракции в исследуемой сыворотке.

В последнее время широкое применение в исследовательской работе и в клинической диагностике находит электрофорез в тонких слоях гелей, нанесенных на стеклянные пластинки (дисковый электрофорез), а также помещенных в стеклянные трубочки.

Преимущества методов зонального электрофореза в сравнении с методами свободного электрофореза заключаются в следующем:

1. Все они значительно проще в осуществлении.

2. Необходимое количество исследуемого материала весьма мало. Например, для электрофореза на бумаге требуется 0,5--0,8 мг белка, а для электрофореза в полиакриламидном геле -- всего 100--200 мкг. В то же время свободный электрофорез даже в аппаратах для микро- или полумикроанализа требует значительных количеств сыворотки. Это является одной из причин, по которым задерживается широкое использование свободного электрофореза в повседневной работе клинических лабораторий. Благодаря малому количеству белка, требующемуся для исследования методом зонального электрофореза, появилась возможность ставить практически неограниченное число анализов белков сыворотки. Зональный электрофорез широко используется для анализа белков в педиатрической практике и при исследовании материалов с низкой концентрацией белка (например, спинномозговая и тканевая жидкости), не говоря уже о чрезвычайно широком использовании этого метода в экспериментальных исследованиях на животных. Поскольку для опытов требуются лишь очень небольшие количества исследуемого материала, можно ставить сколько угодно параллельных проб, что в значительной мере повышает точность исследования.

3. После электрофоретического разделения белковые фракции можно фиксировать в поддерживающей среде и выявить с помощью специфического окрашивания. Среди многочисленных методов окрашивания особое значение в клинических исследованиях приобрели способы выявления связанных с белками липидных и углеводных компонентов. Благодаря простоте этих методов анализ липопротеидов и гликопротеидов стал обычным в повседневной клинической практике. Он приобрел большое значение в диагностике некоторых заболеваний, а это позволило значительно продвинуться в выяснении их патогенеза. Специальные методы окрашивания помогают также обнаружить трансферрин, гаптоглобин, церулоплазмин и другие компоненты сыворотки.

4. Число фракций, на которые разделяется исходный белок при зональном электрофорезе, можно увеличить не только с помощью специальных методов окрашивания. Простая замена буферного раствора или поддерживающей среды дает тот же эффект. Например, при электрофорезе сыворотки на бумаге в буферном растворе трис-ЭДТА получается не пять, а девять белковых фракций. Еще лучшее разделение можно получить в поддерживающей среде, которая обладает эффектом молекулярного сита, например в крахмальном или полиакриламидном гелях. Малые размеры пор этих гелей задерживают миграцию высокомолекулярных белков, так как трение при этому увеличивается настолько, что даже большой электростатический заряд их молекул не может компенсировать замедляющего действия поддерживающей среды. Однако в других поддерживающих средах величина белковой молекулы мало влияет на скорость миграции, поскольку эффект увеличения трения обычно компенсируется ее большим электростатическим зарядом.

5. При зональном электрофорезе разделение белковых фракций происходит очень быстро. Некоторые методы позволяют закончить всю процедуру, включая окрашивание, за 1--2 ч.

6. Прибор для зонального электрофореза имеет простое устройство и может быть изготовлен даже в небольшой мастерской. Стоимость такого самодельного или имеющегося в продаже прибора значительно ниже цены аппарата для свободного электрофореза.

7. Кроме обычного окрашивания, белки, меченные радиоактивным изотопом, после разделения зональным электрофорезом можно выявлять радиоавтографически. Большое значение имеет также тот факт, что с помощью соответствующих субстратов можно непосредственно в поддерживающей среде тестировать ферментативную активность полученных белковых фракций. Метод зонального электрофореза имеет и некоторые недостатки. С его помощью нельзя произвести прямого определения скорости миграции белков. Между исследуемыми белками и поддерживающей средой возможны нежелательные взаимодействия, в результате которых часть белка адсорбируется в среде. Адсорбция происходит сильнее всего на бумаге, менее выражена на ацетат-целлюлозной мембране и практически ничтожна в агаровом геле. [3, 5, 7]

Таким образом, был описан один из видов электрофореза - зональный электрофорез. Отмечены основные составляющие, при проведении данного метода и перечислены подвиды данного метода.

1.2.2.1 Электрофорез в свободной жидкости

Электрофорез в градиенте плотности. В качестве среды используют жидкость, стабилизированную добавлением глицерина, гликолей или сахарозы, создающих градиент плотности. Этой жидкостью, более тяжелой, чем фракционируемый раствор, заполняют внутреннюю трубку стеклянной охлаждаемой колонки. Дно трубки закрыто пористой стеклянной пластинкой. К обоим концам колонки присоединяют два электродных сосуда и проводят электрофорез.

Изоэлектрическое фокусирование. В качестве среды используют жидкость, в которой создают объединенный градиент плотности и рН. Градиент рН достигают прибавлением амфолитов, представляющих собой готовую смесь алифатических полиаминополикарбоновых кислот, или экспериментально подобранных смесей, которые при приложении электрического напряжения концентрируются в узких зонах своих изоэлектрических точек (рI). В результате в колонке создается градиент рН от 1 до 11. При электрофоретическом разделении, например смеси белков, каждый из них перемещается, пока дойдет до зоны, соответствующей его рI. Метод позволяет разделять вещества, различие в рI которых составляет до 0,02, а также определять их рI. В обоих методах полностью исключена адсорбция, что позволяет обнаруживать и количественно оценивать вещества во фракциях непосредственно после электрофореза. [5, 18]

Таким образом, мы рассмотрели основной принцип проведения электрофореза в свободной жидкости. Было отмечено, что проведения данного метода зависит от состояния среды внутренней трубки стеклянной охлаждаемой колонки.

1.2.2.2 Электрофорез на крупнопористых носителях

В качестве крупнопористых носителей применяют фильтровальную бумагу, крахмал, целлюлозу, порошкообразную пластмассу, агар-агар, ацетилцеллюлозу, стеклянный порошок.

Электрофорез в блоке. В качестве носителя используют крахмал, который формируют в виде блока, помещают на лоток, соединенный с двумя электродными сосудами, заполненными буферным раствором. Раствор исследуемого препарата замешивают на сухом крахмале и вносят в узкую поперечную траншею, сделанную в середине блока. После прекращения электрофореза блок разрезают на поперечные доли из каждой элюируют и количественно определяют исследуемое вещество. Метод применяется для разделения веществ с молекулярной массой выше 30 000, так как вещества с меньшей молекулярной массой проникают и адсорбируются внутри крахмальных зерен.

Электрофорез на колонках. Колонку заполняют суспензированным в буфере носителем. Фракционируемую смесь отрицательно заряженных веществ (что имеет место для большинства биологических материалов) наносят в колонку сверху, а положительно заряженных - снизу. Сбор фракций после электрофореза осуществляют путем последовательного элюирования буферным раствором.

Электрофорез на проточных установках. Кювета проточной установки представляет собой полую стенку, которую заполняют носителем. Электрическое поле накладывают в поперечном направлении. В кювете создают равномерный ток буферного раствора сверху вниз. Наверх кюветы в одно и то же место непрерывно подают тонкую струйку фракционируемого раствора. Под совместным влиянием электрического и гравитационного полей исходная смесь по мере спускания разделяется на расходящиеся веером компоненты. Со дна кюветы фракции собирают в серию пробирок.

Вариант этого метода на бумаге известен под названием вертикального электрофореза.

Электрофорез на бумаге. Вещество, подлежащее фракционированию, наносят на пропитанную проводящей жидкостью полоску фильтровальной бумаги на расстоянии не менее 1 см от края и не менее 2,5 см друг от друга. Бумагу подсушивают, помещают в камеру, концы погружают в кюветы с проводящей жидкостью. После пропитывания бумаги жидкостью к ее концам подключают электрический ток. По окончании электрофореза бумагу подсушивают в токе воздуха и оценивают результаты в соответствии с указаниями в статьях.

Для электрофореза пригодны только лучшие сорта хроматографической бумаги, которые должны содержать не менее 96% альфа - целлюлозы. Бумагу предварительно подвергают хроматографической очистке подходящими растворителями. Вместо бумаги могут быть использованы полоски ацетатцеллюлозы.[3,16]

Таким образом, мы рассмотрели основной принцип проведения электрофореза на крупнопористых носителях. Необходимо отметить тот факт, что проведение метода основано от выбора носителя. Данный метод применяют для разделения веществ с молекулярной массой свыше 30000.

1.2.2.3 Электрофорез на мелкопористых носителях

На мелкопористых носителях разделение веществ на зоны идет не только в соответствии с их электрическими зарядами, но и в зависимости от молекулярной массы и формы молекул.

Электрофорез в тонком слое проводится в закрепленном толщиной 1-2 мм слое силикагеля, агара, агарозы, крахмала, полиакриламидного геля, сефадекса, целлюлозы, кизельгура, окиси алюминия, алебастра. Проводящую жидкость вводят в слой носителя или ею опрыскивают слой после его формирования. Раствор исследуемого вещества вносят на поверхность слоя или внутрь отверстий, вырезанных в слое. Электрофоретический процесс можно проводить в устройствах, предназначенных для электрофореза на бумаге.

Электрофорез в крахмальном геле. Гель готовят из гидролизованного крахмала. Горячий гель заливают в кювету глубиной 5-6 мм, которую закрывают специальной крышкой, устроенной так, что в застывшем геле остается поперечный ряд узких щелей (0,3-0,7 мм). В щели вносят кусочки фильтровальной бумаги, смоченной раствором исследуемого вещества, и проводят одномерный или двухмерный электрофорез в горизонтальных или вертикальных установках.

Преимущество горизонтального варианта - простота исполнения, вертикального - большая разрешающая сила.

Электрофорез в полиакриламидном геле. Полиакриламидный гель (ПАГ) представляет собой синтетический продукт сополимеризации акриламида и сшивающего агента, чаще всего N, N1-метиленбисакриламида.

Благодаря образованию поперечных связей между растущими соседними полиакриламидными цепями, возникающими в результате полимеризации винильных групп, такой гель имеет структуру трехмерной сетки. В отличие от природного полимера крахмала синтетический гель прозрачен, химически стабилен, инертен, устойчив к изменениям рН и температуры, нерастворим в большинстве растворителей и, наконец, в нем практически отсутствуют адсорбция и электроосмос. ПАГ готовят на буфере, в котором растворяют акриламид, сшивку и катализатор. Можно получить гель с концентрацией акриламида от 2 до 50%. Повышение концентрации геля понижает его пористость. Буферная система и состав геля определяются природой разделяемого вещества. Концентрацию (с) акриламида подбирают с учетом средней молекулярной массы (М. м.) фракционируемых веществ. [3, 5, 10]

Таким образом, было отмечено методика проведения данного вида электрофореза. Данный метод можно проводить в горизонтальных и вертикальных установках.

2. Практическая часть

2.1 Капиллярный электрофорез

Опыт современной науки показывает, что сочетание казалось-бы противоположных свойств приводит к получению новых, неожиданных результатов. Именно такое сочетание свойств воды (водных растворов электролитов) и "камня" (диоксида кремния, кварца, из которого изготовлен капилляр), позволили создать новый метод анализа, который носит название капиллярного электрофореза (КЭФ). Собственно и электрофорез и капиллярность были известны достаточно давно, но только несколько десятилетий назад удалось разработать новый метод анализа, в котором эти явления используются для разделения проб сложного состава на составляющие компоненты.

На сегодняшний день капиллярный электрофорез является одним из наиболее перспективных методов анализа, он динамично развивается и получает всё более широкое применение в различных областях химии. Простота и доступность этого метода, а также неоспоримые преимущества, которые он даёт при выполнении измерений, позволяют надеяться на динамичное развитие методического обеспечения и скорейшее включение капиллярного электрофореза в перечень физико-химических методов анализа, наиболее часто применяемых в повседневной лабораторной практике. [6, 17]

Теоретические основы капиллярного электрофореза достаточно сложны, что обусловлено использованием в этом методе свойств поверхности раздела двух фаз - жидкости и твердого тела, свойств вязкости жидкости и свойств ионной электропроводности жидкости, потому, не претендуя на академическую строгость изложения, постараемся продемонстрировать основные моменты метода капиллярного электрофореза.



Рис. 2. Схема процессов, происходящих на поверхности кварца

а) ювенильная (свежесозданная) поверхность кварца

б) образование силанольных групп на поверхности кварца

в) диссоциация силанольных групп в водном электролите

г) гидратация образовавшихся ионов

д) связывание части катионов с поверхностью, формирование двойного электрического слоя

Обратимся к процессам, происходящим на границе раздела двух фаз: внутренней поверхности кварцевого капилляра и водного раствора электролита, заполняющего капилляр. На свежеобразованной (ювенильной) поверхности плавленого кварца (SiO2) находятся главным образом силоксановые группы (рис. 2а). При контакте с парами воды или водными растворами силоксановые группы, обладающие двойными связями, оказываются неустойчивыми и, присоединяя молекулу воды, образуют силанольные группы (рис. 1б). При контакте поверхности кварца с водными растворами, силанольные группы диссоциируют с отщеплением ионов Н+ (рис. 2в). Степень диссоциации зависит от температуры и состава водного раствора, в частности от величины рН. При рН> 2,5 на поверхности кварца образуются диссоциированные силанольные группы, которые создают отрицательный поверхностный заряд.

Диссоциированные ионы, находящиеся как на кварцевой поверхности, так и в объёме электролита, гидратируются (рис. 2г). За счёт сил кулоновского взаимодействия, противоположно заряженные гидратированные ионы, находящиеся на поверхности и в объёме жидкости, взаимно притягиваются. Действующие при этом силы настолько велики, что ионы (часть катионов и остатки силанольных групп) частично теряют гидратирующую воду. В результате этого, первый слой катионов, непосредственно прилегающий к поверхности, теряет подвижность, связывается (рис. 2д). Поскольку "пушистые" гидратированные катионы не могут все разместиться в виде монослоя и полностью компенсировать отрицательный заряд поверхности, некоторая часть катионов, нейтрализующих отрицательный заряд, отходит в толщу раствора и образует заряд, распределённый в объеме жидкости, прилегающем к границе раздела и, в силу меньшей энергии связи с поверхностью, обладающий способностью к перемещению (рис. 3а).



Рис. 3. Формирование двойного электрического слоя (а) и ход потенциала на границе раздела кварц-электролит (б)

Несмотря на сильное кулоновское взаимодействие рекомбинации зарядов не происходит. В результате взаимодействующие системы зарядов образуют двойной электрический слой, состоящий как бы из двух изолированных друг от друга обкладок конденсатора, имеющих заряды противоположного знака. Одну из обкладок составляют отрицательно заряженные остатки силанольных групп, другая состоит из двух частей - неподвижного слоя катионов, непосредственно примыкающих к поверхности кварца, и диффузного слоя, образованного катионами, находящимися в объеме жидкости. Распределение катионов между неподвижным и диффузным слоями, а, следовательно, и толщина двойного электрического слоя зависит в первую очередь от общей концентрации электролита в растворе. Чем она выше, тем бoльшая часть положительного заряда диффузного слоя перемещается в неподвижный слой и тем меньше становится толщина диффузного слоя (рис. 3б). При концентрации бинарного однозарядного электролита 10-3...10-4 М толщина двойного электрического слоя составляет в среднем 30-50 мкм.

Свернём (мысленно) рассматриваемую поверхность в виде трубы с внутренним диаметром 50-100 мкм, тогда окажется, что практически вся жидкость, заполняющая её, будет представлять собой диффузную часть двойного электрического слоя. Трубу столь малого диаметра принято называть капилляром. Если в такой системе вдоль оси капилляра приложить электрическое поле, то в капилляре возникнет продольное движение свободных носителей электрических зарядов (разнополярных ионов) во взаимно противоположных направлениях, а поскольку в диффузной части двойного электрического слоя присутствует избыточная концентрация катионов, то число ионов, перемещающихся к катоду будет значительно больше, при этом их движение будет увлекать за собой всю остальную массу жидкости в капилляре (вследствие молекулярного сцепления и внутреннего трения). Возникает так называемый электроосмотический поток (ЭОП), направленный к катоду, который будет осуществлять пассивный перенос раствора внутри капилляра (рис. 3). [7, 12, 19]

Рис. 4. Схема процессов в кварцевом капилляре. Стрелкой показано направление электроосмотического потока.

Вследствие этого процесса в электролите, заполняющем капилляр, возникает направленное перемещение массы жидкости, которое вызвано приложенной разностью потенциалов, при этом вся масса жидкости (за малым исключением приповерхностного слоя) перемещается с одинаковой скоростью, т.е. формируется плоский профиль скоростей. Это очень важное обстоятельство, которое позволяет получить чрезвычайно высокую разрешающую способность метода, поэтому на него надо обратить особое внимание.

Минимальный состав системы, реализующей метод капиллярного электрофореза, должен иметь в своём составе следующие компоненты: кварцевый капилляр, источник высокого напряжения, устройство ввода пробы, детектор и устройство вывода информации. Дополнительные устройства позволяют автоматизировать подачу образцов, термостатировать капилляр и сделать более удобной обработку получаемой информации.

На рис. 5 представлена схема системы капиллярного электрофореза в простейшем случае. Капилляр заполняется раствором электролита, своими концами капилляр опущен в два сосуда, содержащих тот же электролит. Электролит обязательно должен обладать буферными свойствами, чтобы, с одной стороны, воспрепятствовать изменению состава раствора в приэлектродных пространствах, а с другой - стабилизировать состояние компонентов пробы в процессе анализа. В сосуды введены электроды, к которым прикладывается разность потенциалов. Под действием разности потенциалов в капилляре быстро устанавливается стационарное состояние: через него протекает электроосмотический поток (ЭОП), на который будет накладываться электромиграция катионов и анионов во взаимно противоположных направлениях.



Рис. 5. Схема системы капиллярного электрофореза

Как правило, в приборах капиллярного электрофореза ЭОП направлен от входного конца капилляра к детектору поэтому, при использовании кварцевого капилляра, разность потенциалов устанавливают таким образом, что входной конец капилляра имеет положительную полярность (анод), а детектор устанавливается вблизи катода. Если теперь в капилляр со стороны анода ввести небольшой объем раствора пробы, то ЭОП будет переносить зону пробы к катоду, и она некоторое время будет находиться в капилляре под воздействием электрического поля высокой напряженности. В течение этого времени компоненты пробы, имеющие заряды и отличающиеся от компонентов рабочего буфера, будут перемещаться в соответствии с присущими им электрическими подвижностями, специфичными для каждого компонента. Катионные компоненты пробы, двигаясь к катоду, будут обгонять электроосмотический поток. Скорость их движения будет складываться из скорости ЭОП и скорости электромиграции, поэтому на выходе капилляра катионные компоненты будут появляться первыми и тем раньше, чем больше электрическая подвижность данного иона. Нейтральные компоненты пробы будут перемещаться только под действием ЭОП, и появятся на выходе, когда его достигнет зона пробы. Анионные компоненты перемещаются к аноду с различными скоростями. Некоторые из них, медленно мигрирующие, будут появляться вблизи детектора после выхода ЭОП, а те, чья скорость миграции по абсолютной величине превышает скорость ЭОП, рано или поздно выйдут из капилляра в прианодное пространство.

Если время нахождения пробы в капилляре (которое можно регулировать длиной капилляра, скоростью ЭОП или приложенной разностью потенциалов) достаточно, то на выходе капилляра вблизи катода формируются зоны раствора, в которых находятся индивидуальные компоненты пробы. Происходит, таким образом, разделение исходной смеси. Если теперь с помощью детектора зарегистрировать появление компонентов на выходе из капилляра, то полученная запись будет называться электрофореграммой и может служить основой для качественного и количественного анализа смеси. Описанный вариант анализа носит название капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ). В этом варианте могут определяться катионные компоненты проб и некоторые медленно мигрирующие анионы. Однако главные анионы, определяющие минеральный состав воды, зарегистрировать таким способом невозможно. [8, 12]

Анализ анионов методом капиллярного электрофореза

Для того чтобы методом КЗЭ можно было определять анионные компоненты проб, необходимо изменить полярность прикладываемого напряжения. Однако в этом случае изменится не только направление миграции анионов, но также направление ЭОП и он будет препятствовать перемещению в сторону детектора медленно мигрирующих анионов. Для изменения направления ЭОП необходимо модифицировать поверхность кварцевого капилляра таким образом, чтобы знаки зарядов двойного электрического слоя поменялись на обратные, и направление ЭОП совпадало с направлением перемещения анионов. Это достигается введением в рабочий буферный раствор катионного поверхностно-активного вещества, например, бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ). Катион ЦТАБ активно сорбируется на кварцевой поверхности, занимая при достаточной его концентрации, все вакансии в ближайшем к поверхности слое. Поверхность как бы "ощетинивается" длинными цетильными (С16Н33-) цепочками. при дальнейшей промывке рабочим буферным раствором поверхность сорбирует еще один слой поверхностно-активного катиона, ориентированного аммонийным концом наружу (сорбция "щетка в щетку"). В результате первая обкладка двойного электрического слоя становится положительно заряженнной, а вторая (в том числе и диффузная её часть) приобретает отрицательный заряд, и теперь ЭОП снова перемещается в направлении от входного конца капилляра к детектору.

Аналогичными свойствами по модификации поверхности капилляра обладают и другие буферные растворы, например, приготовленный на основе 2-[N-Циклогексиламино] этан-сульфоновой кислоты с модификатором электроосмотического потока в гидроксильной форме (тетрадецетилтриметил аммония гидроксид) и т.п.

В системах капиллярного электрофореза наиболее часто применяется фотометрическое детектирование, в котором используется одна ила несколько длин волн, обычно лежащих в ультрафиолетовой области спектра. Соответственно отклик детектора будет наблюдаться только в том случае, когда определяемый компонент имеет заметное поглощение на длине волны детектирования. Это - прямое детектирование. Электрофореграмма будет представлять собой набор положительных пиков, возвышающихся над базовой линией.

Однако, анионы, растворенные в воде, зарегистрировать таким простым способом не удается, т.к. они не обладают собственным поглощением в указанном спектральном диапазоне. В этом случае применяется косвенное детектирование, суть которого состоит в том, что ведущий электролит готовится с добавкой вещества, поглощающего свет на длине волны детектирования. В случае определения анионов добавка также должна быть анионом, например, это может быть хромат-ион. Вследствие того, что ионная сила ведущего электролита в процессе разделения остается постоянной, в зоне, где находится непоглощающий ион, эквивалентно уменьшается концентрация поглощающего иона. В этом случае на электрофореграмме будут наблюдаться обратные (отрицательные) пики, площади которых пропорциональны концентрациям определяемых ионов. В дальнейшем, при компьютерной обработке результатов измерений, график "переворачивается" и приобретает вид, удобный для рассмотрения, с положительно расположенными пиками.

Таким образом, вариант зонного капиллярного электрофореза с модификацией поверхности капилляра и непрямым детектированием позволяет анализировать компоненты, которые в условиях проведения анализа находятся в форме анионов. [13]

Метод анализа - капиллярный электрофорез - на сегодняшний день является одним из наиболее перспективных и высокоэффективных методов разделения и анализа сложных смесей на составляющие компоненты и находит всё более широкое применение - особенно в зарубежной практике, в том числе и лекарственных средств. Метод характеризуется экспрессностью, микрообъемами анализируемого раствора, отсутствием колонки и твёрдого сорбента, проблем с его "старением" (в отличие от ВЭЖХ), физической и химической деструкции и любого неспецифического связывания с ним компонентов пробы, а также практически не требуется органических растворителей.

Метод капиллярного электрофореза (КЭФ) основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля за счёт подачи высокого напряжения к концам капилляра.

Наиболее распространёнными вариантами метода КЭФ являются: капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) и мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ).

КЗЭ - метод разделения, реализуемый в капиллярах и основанный на различии в электрокинетических подвижностях заряженных частиц как в водных, так и в неводных электролитах.

МЭКХ - вариант капиллярного электрофореза, который позволяет проводить разделение соединений ионного и нейтрального характера при использовании поверхностно-активных веществ (ПАВ). Разделение электронейтральных соединений осуществляется благодаря введению в состав ведущего электролита поверхностно-активных веществ мицеллообразователей. Чаще всего используют анионный ПАВ (например, додецилсульфат натрия - ДДСН) в концентрациях, превышающих критическую концентрацию мицелообразования, что приводит к формированию так называемой "псевдостационарной фазы", и аналиты распределяются между мицеллой и буферным электролитом согласно их гидрофобности.Метод капиллярного электрофореза характеризуется высокой эффективностью (более сотни тысяч теоретических тарелок). Это объясняется прежде всего уникальным свойством ЭОП в кварцевом капилляре, который заключается в формировании плоского профиля потока (в отличие от параболического в ВЭЖХ), не вызывающий при движении зон компонентов практически их уширения. Очень высокая эффективность разделения позволяет широко применять метод для выявления не только близких по строению веществ (белков, пептидов, аминокислот, наркотиков, витаминов, красителей и др.), но и для контроля качества, технологического контроля, идентификации лекарственных препаратов, исследования фармакокинетики.

Эффективность, выраженная числом теоретических тарелок, может быть определена непосредственно из электрофореграммы.

К снижению эффективности могут привести ряд факторов: увеличение зоны вводимой пробы (определяемая длительность ввода); образование температурного градиента (за счёт разницы температуры в центре капилляра и на внутренней стенке капилляра). Возникающий вследствие этого градиент вязкости приводит к тому, что вещество у стенки перемещается медленнее, чем в центре, что вызывает уширение полос и снижение эффективности; адсорбция на стенках капилляра, приводящая к искажению формы пиков (появление хвостов), и другие факторы. Все эти параметры управляются путём создания оптимальной схемы разделения.

Основным способом детектирования в системах капиллярного электрофореза ("Капель - 103 Р", "Капель - 104 Т", "Капель - 103 РТ", "Капель - 104 М", "Капель - 105", "Капель - 105 М") отечественного производителя - фирмы "Люмекс", является фотометрический .

Особенностью фотометрического детектирования разделённых аналитов в условиях кварцевого капилляра является малая толщина слоя (что обусловлено внутренним диаметром капилляра), а также - введением очень малых объёмов проб (~2-10 нл).

Чувствительность метода КЭФ с УФ-детектированием может быть существенно повышена за счёт концентрирования образца непосредственно в капилляре. Одним из наиболее общих подходов к увеличени концентрационной чувствительности в КЭФ является приём стекинга. Концентрирование образца происходит, когда ионы аналитов пересекают границу, которая отделяет зону низкой проводимости раствора и высокой - ведущего электролита. В случае если проба образца имеет значительно более низкую проводимость (за счёт разбавления водой или буфером), чем ведущий электролит, в зоне образца возникает относительно высокое электрическое поле. Аналиты внутри зоны образца движутся с более высокой скоростью, и, замедляясь на границе с зоной ведущего электролита, концентрируются. Стекинг образца применяется только к заряженным аналитам.

Чувствительность метода КЭФ с УФ-детектированием может быть также повышена за счет увеличения длины оптического пути при использовании капилляров с расширенным световым путем. Существует несколько способов: зону детектирования выполняют в форме пузырька, возрастание чувствительности в 3-5 раз; используют капилляры Z-формы, увеличение чувствительности в 20-40 раз.

Важной задачей любого сепарационного метода является селективность разделения компонентов пробы. Повышение селективности разделения в КЭФ может быть обеспечено за счёт изменения рН ведущего электролита, изменения напряжения, температурного режима в системе, введения в состав буферного раствора макроциклов, органических растворителей и др.

Применение метода капиллярного электрофореза при аналитических исследованиях.

Капиллярный электрофорез как новый и быстро развивающийся метод широко применяется в фармацевтической практике лекарственных средств, в том числе и в биологических средах с целью идентификации и количественного анализа. Используются преимущественно кварцевые капилляры и УФ-детекторы. Однако находят применение в зарубежной практике и электрохимическое детектирование, амперометрические детекторы типа "отражающая стенка" с электродами из углеродного волокна, меди, вольт-амперометрические детекторы, а также масс-спектроскопия, лазерная флюоресценция.

Капиллярный электрофорез применяется и при определении нелетучих примесей в лекарственных веществах и составляет конкуренцию методу ВЭЖХ, отличаясь очень высокой эффективностью и сводя к минимуму размытие пиков. Как правило, метод используется для анализа водных растворов (буферные растворы), с добавлением ПАВ, либо не содержащих ПАВ. В отдельных работах показаны возможности использования неводного капиллярного электрофореза.

Использование сепарационного метода анализа позволяет эффективно решать вопросы стандартизации лекарственных препаратов сложного состава. Была изучена возможность применения капиллярного электрофореза для качественного обнаружения и количественного определения бутоконазола нитрата в лекарственном препарате и биологических жидкостях. Проведена сравнительная оценка фармакокинетических параметров, противогрибковой активности и мукоадгезивных свойств бутоконазола нитрата. Методика использована для изучения накопления бутоконазола в сыворотке крови.

Проведено изучение возможности анализа доксициклина в моче капиллярным электрофорезом с использованием отечественного прибора "Нанофор-1". Методика характеризуется высокой воспроизводимостью и достаточной чувствительностью (граница обнаружения - 5 мкг/мл мочи).

Фоминым А.Н. с соавторами показана возможность идентификации ряда азотсодержащих соединений основного характера в присутствии соэкстрактивных веществ мочи и крови методом капиллярного электрофореза "Капель-105" по электрофоретическим спектрам. Установлено, что на количественные характеристики исследуемых соединений не оказывают существенного влияния компоненты мочи и крови. [6, 7, 15]

Таким образом, в практической части курсовой был рассмотрен метод электрофореза - капиллярный электрофорез, который основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля за счет подачи высокого напряжения к концам капилляра. Данным методом был проведен анализ анионов. Также данный метод используется для анализа водных растворов.

Общие выводы

В ходе проведенной работы над курсовой работой были рассмотрены поставленные задачи:

- ознакомились с методом электрофореза;

- рассмотрели подробно фронтальный, зональный и капиллярный методы электрофореза;

- изучили последовательность анализа лекарственных средств методом электрофореза;

- изучили область применения метода.

Заключение

В курсовой работе всесторонне изучен метод электрофореза для анализа лекарственных средств. Электрофорез -- это процесс направленного движения частиц, диспергированных в жидкости в постоянном электрическом поле. Частицы одного и того же вещества несут одинаковые по знаку заряды. В электрическом поле положительно заряженные частицы перемещаются к отрицательному электроду -- катоду, отрицательно заряженные частицы к положительному электроду -- аноду. Различают фронтальный, зональный и капиллярнэлектрофорез. Электрофорез занимает сейчас центральное место среди методов исследования белков и нуклеиновых кислот. В современной научной литературе редко можно встретить статью, в которой бы на той или иной стадии фракционирования или характеристики этих биополимеров не был использован электрофорез. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности. На сегодняшний день электрофорез является одним из наиболее перспективных и высокоэффективных методов разделения и анализа сложных смесей на составляющие компоненты и получает все более широкое применение в различных областях химии. Создается огромное количество лекарственных препаратов и для каждого из них нужен наиболее точный метод анализа, для того чтобы предупредить поступление на фармацевтический рынок некачественных препаратов.

Список используемых источников

1. Арзамасцев А.П., Сенов П.Л. Стандартные образцы лекарственных веществ. М.: "Медицина", 1978. - 248 с.

2. Арзамасцев А.П., Яскина Д.С. Ультрафиолетовые и инфракрасные спектры лекарственных веществ. М.: "Медицина", 1975. - 151 с.

3. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 ч. / В.Г. Беликов. - Пятигорск, 2003. - 720 с.

4. "Большая советская энциклопедия", Б.А. Введенский, издательство Б.С.Э., Москва, 1995 г.

5. Государственная фармакопея; Общие методы анализа; Москва "Медицина", 1987 г.

6. Государственная фармакопея Российской Федерации / 12 - издание. - "Издательство "НЦЭСМП", 2008. - 704 с.

7. Г.А. Мелентьева, Л.А. Антонова; Фармацевтическая химия; Москва "Медицина", 1985г.

8. Глазков И.Н. Определение органических примесей в фармацевтических препаратах / И.Н. Глазков, Н.Л. Бочкарёва, И.А. Ревельский // Журн. аналит. химии. - 2005. - №24.

9. Дорохова Е.Н., Прохорова Г.В. Аналитическая химия. Физико-химические методы анализа. - М.: Высшая школа, 1991

10. Использование метода капиллярного электрофореза для изучения фармакокинетики бутоконазола нитрата / С.П. Сенченко [и др.] // Хим.-фармац. журн. - 2009. - №11. - С. 7-10.

11. Каменцев Я.С. Основы метода капиллярного электрофореза. Аппаратурное оформление в области применения / Я.С. Каменцев, Н.В. Комарова // Журн. "Аналитика и контроль". - 2002. Т. 6. - №1. - С. 13-18.

12. Комарова Н.В. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза "Капель". - Санкт-Петербург: ООО "Веда", 2006. - 212 с.

13. Ларская К.С. Разработка способов анализа бутоконазола нитрата в лекарственном препарате и биологических жидкостях: Автореф. дис... канд. фарм. наук. - Пятигорск, 2012. - 23 с.

14. Основы аналитической химии. В 2 кн. Кн. 2. Методы химического анализа: Учеб. для вузов/ Под ред. Ю.А.Золотова. - 2-е изд. - М.: Высш. шк.; 2002. - 494

15. Отто М. Современные методы аналитической химии. / М. Отто. - М.: Техносфера, 2006. - 416 с.

16. Фармацевтическая химия; изд. "Медицина"; Ленинградское отделение, 1986г

17. Фармацевтический анализ лекарственных средств; под. ред. В.А. Шапаловой; Харьков ИМП "Рубикон", 1995

18. Черноглазов В.Н. Развитие капиллярного электрофореза и его аппаратурного оформления / В.Н. Черноглазов, П.Н. Нестеренко // Рос. хим. журн. - 1996. - №1. - С. 100-110.

Размещено на Allbest.ru

...