Основные способы разрушения тканей и клеток при биохимическом исследовании

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Для разрушения клеток чаще всего применяют физические методы. Большинство животных клеток разрушается сравнительно легко, однако при разрушении растительных и бактериальных клеток зачастую приходится сталкиваться со значительными трудностями, связанными с наличием клеточных стенок. Физические методы разрушения клеток подразделяются в зависимости от того, происходит ли оно под действием сил трения между клетками и твердыми веществами (растирание клеток с твердыми материалами) или гидродинамически (разрушение клеток в жидких средах).

1. Растирание клеток с твердыми материалами

В современной модификации этот метод состоит в растирании клеток с песком или абразивным порошком в ступке при помощи пестика. В настоящее время благодаря появлению более мягких способов разрушения этот метод применяется для разрушения животных клеток довольно редко, однако им по-прежнему пользуются для разрушения растительных и бактериальных клеток. Желательно, чтобы абразивные частицы были как можно более острыми и имели такой же размер, что и разрушаемые клетки. Недостаток метода заключается в том, что при разрушении клеток может нарушаться структура наиболее крупных органелл, таких, например, как хлоропласты.

Хорошие результаты дает продавливание клеток, смешанных с абразивными частицами, через пресс Хьюза. Влажные клетки с абразивными частицами помещают в трубку при температуре около --5°С, а затем однократным ударом по поршню, создающим скачкообразное изменение давления, проталкивают клеточную массу через узкое отверстие диаметром около 0,25 мм. Модификацией этого метода является продавливание клеток при температуре --25°С; роль абразивных частиц выполняют в этом случае кристаллы льда. Чтобы добиться максимального разрушения бактериальных клеток, приходится иногда повышать давление до 5,5-107 Па.

Клетки бактерий можно разрушать также и путем механического встряхивания суспензий частиц с абразивным порошком с частотой 300--3000 колебаний в минуту при помощи встряхивателя Микля, в который добавляются мелкие стеклянные бусинки диаметром от 50 до 500 мкм. Однако возникающая при встряхивании сильная вибрация часто вызывает разрушение клеточных органелл.

2. Разрушение клеток в жидких средах

Разрушение клеток, находящихся в суспензии, происходит либо при вращении лопастей или поршня (блендеры), либо при поступательном движении вверх и вниз поршня или шаров (гомогенизаторы). Блендеры, как правило, имеют режущие лопасти, вращающиеся с большой скоростью. Количество и конструкция этих лопастей бывают разными, но все они обычно заострены под прямым углом друг к другу, а форма их обеспечивает хорошее перемешивание содержимого сосуда. Суспензию клеток помещают в специальный стакан, который имеет по всей высоте раструбы и в поперечном сечении выглядит как клеверный лист. Для поддержания низкой температуры в процессе гомогенизации стакан помещают в лед. Благодаря особому расположению лопастей и конструкции стакана в ходе фракционирования возникают гидродинамические силы. Метод достаточно универсален и широко применяется для фракционирования клеток, однако следует иметь в виду, что при быстром вращении лопастей гомогенизаторов возникают некоторые нежелательные эффекты.

Большинство гомогенизаторов представляют собой прибор, состоящий из пестика с ручным (гомогенизаторы Даунса и Тёнбрэка) или механическим (гомогенизатор Поттера--Эльвегёйма) приводом, который вращается или движется вверх и вниз в стеклянном цилиндрическом сосуде. Необходимо следить за тем, чтобы зазор между пестиком и стенками сосуда оставался постоянным, так как скорость разрушения клеток зависит не только от скорости вращения пестика, но и от соотношения между радиусами пестика и сосуда. Сосуд закрепляется неподвижно, -- поэтому скорость вращения суспензии изменяется от минимальной у его стенок до максимальной у поверхности пестика; следовательно, чем меньше расстояние между этими поверхностями, тем выше градиент скорости. Возникающие при высоких скоростях силы достаточны для разрушения довольно тонких мембран животных клеток; растительные и бактериальные клетки при этом не разрушаются.

Эффективность гомогенизации в значительной степени зависит от наличия в измельчаемом материале сосудистой и соединительной ткани, для удаления которой ткань перед гомогенизацией пропускают через специальную мясорубку с отверстиями диаметром 0,88 мм8. Полиморфоядерные лейкоциты разрушаются более мягкими методами-- при помощи пипетки. Эозинофилы разрушают путем быстрого пропускания под давлением через мелкорешетчатое сито. Разрушение клеток с помощью высокого давления. Этот метод применяется в основном для разрушения микробных клеток. Для этой цели пользуются специальными прессами, например френч-прессом (French Pressure), в котором создается давление до 10,4-107 Па.

Суспензию клеток загружают в камеру из нержавеющей стали при закрытом положении игольчатого клапана, посредством которого камера сообщается с внешней средой. Затем камеру переворачивают, открывают клапан и поршнем вытесняют из камеры воздух, после чего клапан снова закрывают, а камеру возвращают в исходное положение и устанавливают на неподвижном основании. С помощью гидравлического пресса создается требуемое давление на поршень; по достижении в камере определенного давления игольчатый клапан немного открывается, давление в камере несколько уменьшается, и в этот момент клетки лопаются. Вытекающую из выходного отверстия камеры клеточную массу собирают при открытом положении игольчатого клапана, поддерживая в камере постоянное давление. К сожалению, неизвестно, какие именно силы возникают в камере и как им противостоят клетки и клеточные компоненты.

3. Разрушение с помощью ультразвука

Клетки можно разрушить также с помощью высокочастотных ультразвуковых колебаний. Механизм такого разрушения окончательно не выяснен, однако установлено, что при обработке клеточных суспензий ультразвуком в среде создается высокочастотное изменение давления. Основным недостатком данного метода является то, что в процессе обработки ультразвуком выделяется значительное количество тепла. Чтобы избежать разогревания, сосуд с суспензией помещают в лед; конструкция сосуда такова, что жидкость непрерывно циркулирует и охлаждается у стенок. Некоторые сосуды помещают в холодильные камеры; однако далеко не всегда удается устранить местное нагревание.

4. Прочие методы

К ним относятся: разрушение клеток методом осмотического шока, переваривание клеточных стенок ферментами, например лизоцимом, и сложными ферментными препаратами, выделенными из улиток и содержащими целлюлазу, хитиназу и липазу. Для разрушения клеток некоторых видов успешно применяют замораживание и оттаивание, автолиз и обработку органическими растворителями, такими, как этилацетат и толуол.

Как мы уже говорили, в большинстве случаев разрушение клеток сопровождается выделением тепла. Ввиду того, что при высоких температурах многие ферменты инактивируются, все процедуры по разрушению клеток и выделению клеточных органелл следует проводить при пониженных температурах. Для этого все работы проводят в холодных комнатах при температуре около 0°С или охлаждают клеточные суспензии с помощью льда. Следует отметить, что некоторые ферменты неустойчивы к холоду и при охлаждении также теряют свою активность.

При гомогенизации разного рода биологических тканей возникает множество частных проблем, которые разрешаются в основном путем проб и ошибок. Достаточную воспроизводимость результатов можно получить лишь при тщательном контроле за такими параметрами, как температура, продолжительность и скорость разрушения клеток, а также применяемое рабочее давление. Идеальным считается такой гомогенат, который легко поддается дальнейшему фракционированию.

5. Способы осаждения белков

клеточный абразивный гомогенизатор ультразвук

Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора.

Обратимое осаждение.

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.

Высаливание. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором - глобулиновая фракция.

Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка.

Реактивы:

1) неразведенный яичный белок;

2) насыщенный раствор сульфата аммония;

3) NaOH, 10% раствор,

4) CuSO4, 1% раствор;

5) дистиллированная вода;

6) сульфат аммония в порошке.

Ход определения. В пробирку наливают 30 капель неразведенного яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор пока не прекратится растворение соли, при этом выпадает осадок - глобулины.

Необратимое осаждение белков.

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.

Осаждение при кипячении.

Белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-60 градусов С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую глобулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку частицы белка при этом наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами - в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором - отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе.

Реактивы:

1) яичный белок, 1% раствор;

2) уксусная кислота, 1% и 10% растворы;

3) NaOH, 10% раствор.

Ход определения. В 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель раствора яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипячения, при этом раствор мутнеет, но т.к. частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (его изоэлектрическая точка 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно; во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипячения. Белок выпадает в осадок, т.к. его раствор приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в растворе); в 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, т.к. в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в растворе); в 4-ю пробирку наливают 1 каплю раствора NaOH, нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд белка увеличивается.

Осаждение концентрированными минеральными кислотами.

Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислоты выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная кислота.

Реактивы:

1) яичный белок,1% раствор;

2) концентрированная серная кислота;

3) концентрированная хлористоводородная кислота;

4) концентрированная азотная кислота.

Ход определения. В три пробирки наливают по 5 капель концентрированной серной, хлористоводородной и азотной кислот. затем, наклонив пробирку под углом 45 градусов, осторожно по стенке наслаивают такой же объем яичного белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной кислотами, в пробирке с азотной кислотой растворения белка не происходит.

Осаждение органическими кислотами.

Трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой кислотой пользуются при определении белка в моче.

Реактивы:

1) яичный белок, 1% раствор;

2) трихлоруксусная кислота, 10% раствор;

3) сульфосалициловая кислота, 10% раствор.

Ход определения. В две пробирки вносят по 5 капель раствора белка. В одну из них прибавляют 2 капли сульфосалициловой кислоты, а в другую - 5 капель трихлоруксусной кислоты. В пробирках выпадает осадок белка.

Осаждение белка солями тяжелых металлов.

Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.

Реактивы:

1) яичный белок, 1% раствор;

2) сульфат меди, 10% раствор;

3) ацетат свинца, 5% раствор;

4) нитрат серебра, 5% раствор.

Ход определения. В три пробирки вносят по 5 капель белка. В первую добавляют 1 каплю ацетата свинца, в третью - 1 каплю нитрата серебра. Во всех пробирках выпадает осадок. Затем в первую пробирку добавляют 10 капель нитрата серебра - растворения осадка нет.

Осаждение органическими растворителями.

Теперь уже вполне определенно известно, что большинство молекул ферментов имеют полярные группы, являющиеся внешними по отношению к молекуле. Добавление органических растворителей к водным растворам белков будет понижать диэлектрическую постоянную смеси, создавая среду, которая больше отличается от полярной поверхности молекул фермента. Как свидетельствует теория растворимости, это ведет к снижению растворимости белков. Однако, поскольку молекулы ферментов имеют внутренние гидрофобные аминокислотные остатки и поэтому относительно свободно могут свертываться, то альтернативно добавлению органических растворителей они принимают новую, неактивную форму с экспонированием в окружающую среду гидрофобных группировок. Повреждение таких молекул при изменении их формы и последующая денатурация тем больше, чем выше температура. Это приводит к необходимости использовать для фракционирования большинства ферментов с помощью органических осадителей низкие температуры (часто ниже 0° С).

Размещено на Allbest.ru