Свободные радикалы и антиоксиданты

Размещено на http://www.allbest.ru/

Российский Государственный Медицинский Университет, Москва

Свободные радикалы и антиоксиданты

Ю. А. Владимиров

Классификация радикалов

Все радикалы, образующиеся в нашем организме, можно разделить на три категории (см. Таблицу 1).

Таблица 1. Метаболизм свободных радикалов

Образование радикалов	Удаление радикалов
Первичные радикалы Семихиноны Супероксид* Монооксид азота (NO)	Восстановители Супероксиддисмутаза* Гемоглобин*
Радикал-образующие молекулы Перекись водорода Перекиси липидов Гипохлорит Ионы Fe2+	Каталаза, пероксидазы Глутатион-пероксидаза Церрулоплазмин, ферритин, комплексоны
Вторичные радикалы Гидроксил Липидные радикалы	Ловушки радиклов Ловушки радикалов
Третичные радикалы Радикалы антиоксидантов Другие радикалы

Первичные радикалы образуются из молекул за счет реакций одноэлектронного окисления с участием металлов переменной валентности. Это компоненты дыхательной цепи, такие как радикалы убихинона (коэнзима Q), супероксид и окись азота (NO). Вторичными радикалами мы назовем те, которые образуются из перекиси водорода, липоперекисей и гипохлорита в присутствии ионов двухвалентого железа, потому что сами эти радикал-продуцирующие молекулы образуются, как правило, из первичных радикалов. Ко вторичным радикалам относится прежде всего гидроксильный радикал и, с некоторыми оговорками, липидные радикалы, участвующие в реакциях цепного окисления ненасыщенных жирнокислотных цепей липидов биологических мембран и липопротеинов плазмы крови. Наконец, в качестве третичных можно рассматривать радикалы, которые образуются при действии вторичных радикалов на молекулы антиоксидантов и других легко окисляющихся соединений.

Под метаболизмом радикалов подразумеваются реакции образования и удаления всех перечисленных радикалов. Следует подчеркнуть принципиальную разницу в биологическом действии первичных и вторичных радикалов. Первичные радикалы специально вырабатываются нашим организмом и выполняют жизненно важные функции переноса электрона в дыхательной цепи (убихинон), защиты от микроорганизмов (супероксид) и регуляции кровяного давления (окись азота), тогда как вторичные радикалы оказывают цитотоксическое действие, и как правило наносят организму большой вред. Многие болезни, как сейчас показано, развиваются именно вследствие поражающего действия вторичных радикалов [16,21,22,36,40]. Роль третичных радикалов может быть разной и будет, в частности, предметом нашего обсуждения.

Основные методы изучения реакций свободных радикалов

Как всегда в биохимии, для изучения реакций образования и удаления веществ прежде всего нужно располагать прямыми методами количественного анализа этих веществ. К сожалению, свободные радикалы обладают столь высокой реакционной способностью, что их невозможно изолировать, исследовать и количественно определять обычными биохимическими методами. Пожалуй, методы оценки свободных радикалов можно разделить на косвенные, к которым относятся методы анализа продуктов реакций, протекавших с участием свободных радикалов и ингибиторный анализ, и прямые, к которым можно отнести метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и, с некоторыми оговорками, метод хемилюминесценции. (см. таблицу 2).

Таблица 2. Методы изучения свободных радикалов и их реакций

А. Прямые методы Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) Хемилюминесценция	Б. Косвенные методы Анализ продуктов пероксидации Ингибиторный анализ

Непрямые биохимические методы

Большинство исследователей реакций свободных радикалов довольствуются косвенными методами, определяя первичные или вторичные продукты свободнорадикальных реакций, такие как коньюгированные диены или соединения, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой (см. например обзоры в книге [21]). Вторым широко-распространенным методом исследования свободнорадикальных реакций, а точнее - роли свободных радикалов в том или ином процессе, служит использование "перехватчиков" радикалов (в англоязычной литературе принят термин "scavanger"). Принцип такого ингибиторного анализа довольно прост: если какой-то процесс подавляется "перехватчиком", значит перехвтываемые радикалы участвовали в процессе. Наиболее плодотворным оказалось использование фермента супероксиддисмутазы (обычно в сочетании с каталазой), поскольку считается очевидным, что этот фермент удаляет супероксидные радикалы и только их. Менее очевидны выводы, сделанные на основе опытов с использованием "ловушек" липидных радикалов, таких как токоферол, поскольку не столь очевидно, что перехват радикалов является единственным результатов действия этих веществ.

Метод электронного парамагнитного резонанса

Хотя польза исследований, основанных на изучении молекулярных продуктов свободнорадикальных реакций и ингибиторного анализа, сомнений не вызывает, не следует пренебрегать возможностью прямого обнаружения свободнорадикальных реакций и непосредственного изучения изменения их концентрации в ходе исследуемого процесса. На сегодняшний день существует два прямых метода обнаружения радикалов: электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) и хемилюминесценция (ХЛ). Интересно, что судьбы этих методов в некотором смысле очень похожи. В химических системах дело обстояло еще сносно. Так, например, используя метод быстрого смешивания двух растворов при их непрерывном протоке, А. Н. Осипову и сотрудниками удалось наблюдать сигналы ЭПР липидных радикалов, образующихся при разложении гидроперекисей линолевой кислоты ионами Ce⁴⁺ и Fe²⁺ , правда, довольно слабые, несмотря на огромные расходы реактивов [7]. Попытки непосредственно обнаружить методом ЭПР радикалы кислорода или липидов в биологических системах оказались неудачными, поскольку стационарные концентрации большинства радикалов, таких как радикалы кислорода или липидов, в биологических системах слишком малы. Успех пришел, однако, после разработки метода спиновых ловушек. Спиновые ловушки - это молекулы, которые при взаимодействии с нестабильными радикалами образуют стабильные нитроксильные радикалы так называемые спиновые аддукты, сигналы ЭПР которых затем измеряются с целью качественного и количественного анализа соответствующих радикалов (см. в частности работы, проведенные в нашей лаборатории [6,8-11,14,58]).

Метод хемилюминесценции

Довольно похожая ситуация сложилась и с применением хемилюминесценции. Реакции рекомбинации радикалов супероксида, гидроксила и липидных радикалов сопровождаются очень слабым свечением, которое первоначально было названо "сверхслабым свечением" [23] ("ultra-weak luminescence") и которое следует называть вероятно собственной ("intrinsic") или не активированной ("non-enhanced") хемилюминесценцией (см. обзор [42]). Изучение этой хемилюминесценции внесло большой вклад в изучение процессов цепного (или перекисного) окисления липидов в биологических мембранах (см. обзоры [22,40,41,48]), но и тут низкая интенсивность сигнала стала одним из существенных препятствий в применении этого метода. В связи с этим получили широкое применение так называемые активаторы хемилюминесценции [49] (по-английски - enhancers, т.е. "усилители"). Наиболее известны химические активаторы, вступающие с определенными радикалами в реакции, сопровождающиеся свечением: это люцигенин, дающий свечение с радикалами супероксида, и люминол, дающий мощное свечение в присутствии радикалов гидроксила. Для изучения свободнорадикальных реакций при цепном окислении липидов нами был предложен целый ряд физических активаторов хемилюминесценции, таких как краситель родамин Ж [15,45], комплекс европия с тетрациклином [38,52,53] и некоторые лазерные красители, производные кумарина [17,28]. Физические активаторы (по-английски sensitizers - "сенсибилизаторы") не вступают в реакцию с радикалами, но увеличивают квантовый выход хемилюминесценции за счет переноса энергии электронного возбуждения от молекул-продуктов реакции на активатор [20].

В таблице 3 приведены некоторые активаторы хемилюминесценции, сопровождающей цепное окисление липидов.

Таблица 3. Активаторы хемилюминесценции, сопровождающей цепное окисление липидов.

Активатор	Коффициент усиления * (число раз)	Литератрута
Люминол	70	Биофизика 17: 702-705, 1972
Европий-тетрациклин	1120	Биофизика 25:923-924, 1980
Родамин	37	Free Rad.Biol.Med. 12:43-52, 1992
Кумарин С-525	1650	Free Rad.Biol.Med. 18:739-745, 1995
Нильский синий	7	Биофизика. 40:531-535, 1995

* - отношение интенсивности хемилюминесценции в присутствии активатора к интенсивности в его отсутствие.

Изучение кинетики реакций

Реакции с участием свободных радикалов, в особенности реакции цепного окисления, отличаются большой сложностью и протекают через ряд последовательных стадий. В изучении механизма цепных реакций основную роль сыграло исследование кинетики процессов; при этом измерение кинетики хемилюминесценции позволяет непосредственно видеть изменение во времени концентрации радикалов, ведущих цепи окисления [1,22,40,48]. Параллельное измерение хемилюминесценции, окисления ионов двухвалентного железа и накопления продуктов реакции в суспензиях митохондрий [31,40,48,57] и фосфолипидных везикул (липосом) [17,37] позволило экспериментально определить константы скоростей основных реакций цепного окисления: инициирования, продолжения, разветвления и обрыва цепей [40,44]. Проверка правильности определения констант, а также и схемы самих реакций заключается в математическом моделировании кинетики реакций. Оно включает в себя три стадии [44]:

Составление упрощенной системы химических уравнений, описывающих процесс.

Составление системы дифференциальных уравнений, описывающих изменение во времени концентраций всех промежуточных и конечных продуктов реакции.

Решение системы дифференциальных уравнений методами численного интегрирования (с использованием компьютера)

Построение кривых изменения во времени концентраций участников реакции и хемилюминесценции и сравнение этих кривых с экспериментальными.

Полученные результаты подтвердили схему реакций цепного окисления липидов [40,44], которую мы рассмотрим несколько позже.

Первичные радикалы

Первичное образование супероксида фагоцитами

Основным источником первичных радикалов в нашем организме служат клетки-фагоциты, т. е. гранулоциты и моноциты крови, а также тканевые макрофаги. Для борьбы с бактериями эти клетки образуют супероксидные радикалы

НАДФН + 2О₂ НАДФ⁺ + 2(*О₂^-),

которые затем превращаются в перекись водорода и гипохлорит.

2(*О₂) Н₂О₂ + О₂

Н2О2 + Cl^- H₂O + ClO^-

Образование всех этих веществ, называемых активными формами кислорода, может изучаться путем регистрации хемилюминесценции в присутствии люминола или люцигенина. Люцигенин более специфичен, хемилюминесценция в его присутствии определяется концентрацией супероксидных радикалов. Хемилюминесценция люминола наблюдается, только если наряду с супероксидными радикалами в среде образуются радикалы гидроксила. Гипохлорит также вызывает хемилюминесценцию при наличии люминола в среде, которая может многократно усиливаться, если наряду с гипохлоритом в системе имеется перекись водорода [1].



Рис. 1. Хемилюминесценция клеток крови в присутствии люминола после действия на кровь электрических импульсов разного напряжения (цифры около кривых, Вольты).

На рисунке 1 в качестве примера показана хемилюминесценция клеток крови при действии на кровь кратковременных электрических импульсов, вызывающих увеличение проницаемости клеточных мембран и стимуляцию выделения клетками активных форм кислорода. Такие же “хемилюминесцентные ответы” можно получить, если добавить к лейкоцитам крови суспензию бактерий, изолированные оболочки дрожжевых клеток, кристаллы кварца или сульфата бария, а также определенные химические соединения; все эти агенты получили собирательное название “стимулов”. Стимулированная ХЛ клеток в присутствии люминола - ценный показатель функционального состояния фагоцитов крови и тканей, их способности производить при необходимости активные формы кислорода, т.е. выполнять свою защитную функцию [26]. Эта способность обычно усиливается при возникновении в организме очагов воспаления (например, после инфаркта миокарда) и в ряде других случаев. Наоборот, при длительном недостатке кислорода, связанном с общим ослаблением организма, активность фагоцитов и ХЛ-ответы снижаются [25,26,50]. Некоторые результаты таких исследований даны в качестве примера на рис. 2 и 3.

Рис. 2. Амплитуда ХЛ лейкоцитов, стимулированных латексом.

Объяснения в тексте.

Рис. 3. Хемилюминесценция цельной крови, осажденной на сульфате бария

Объяснения в тексте.

Можно видеть, что при затяжных хронических заболеваниях свечение клеток снижалось, тогда как при возникновении или обострении воспалительного процесса у больных происходило резкое увеличение активности клеток-фагоцитов. Так встречает организм инфекционную опасность - усиливается способность фагоцитов выделять активные формы кислорода для борьбы с чужеродными микроорганизмами.

Механизм активации фагоцитов при возникновении в организме очагов воспаления включает в себя как изменение свойств этих клеток в условиях целого организма, так и активацию уже готовых клеток, которую можно назвать “предстимуляцией” (priming).

В последние время механизмы регуляции активности фагоцитов привлекают все большее внимание в частности потому, что эти клетки не только борются с микробами, но и участвуют в регуляции кровяного давления, выделяя окись азота.

Оказалось, что важную роль в увеличении потенции клеток играет внутриклеточный кальций. При инкубации клеток с кальциевым ионофором происходит их предстимуляция (priming), т. е. 2-3 кратное увеличение продукции активных форм кислорода в ответ на добавление стимула. Г. И. Клебановым и сотрудниками в нашей лаборатории было показано, что предстимуляцию вызывают продукты перекисного окисления липидов [34]. Позднее в наших исследованиях было показано, что увеличение потенции фагоцитов может быть вызвано также в результате облучения клеток светом гелий-неонового лазера, причем как в присутствии, так и в отсутствии экзогенных фотосенсибилизаторов [47]. В последнем случае эффект был существенно разным у разных групп больных людей. Недавно было показано, что это строго коррелирует с количеством гематопорфирина в плазме крови больных: чем больше гематопорфирина, тем выше была эффективность лазерного облучения. Эти наблюдения позволили дать объяснение известному терапевтическому действию лазерного облучения крови, которое проявляется в расслаблении стенок кровеносных сосудов (вазодилатации) и повышении антибактериальных свойств крови. Наше объяснение состоит в том, что под действием лазерного облучения происходит фотосенсибилизированное гематопорфирином перекисное окисление липидов в плазме крови и мембранах клеток и образующиеся продукты липопероксидации вызывают priming фагоцитов крови. Клетки начинают выделять больше активных форм кислорода, что усиливает их антибактериальное действие и образование окиси азота, что вызывает вазодилатацию. радикал биохимический электронный метаболизм

Метаболизм супероксидного радикала

Дальнейшие превращения супероксидного радикала могут пойти по разному пути (см. рис. 4 ). В норме (на рисунке эти процессы выделены пунктирной рамкой) супероксид под действием фермента супероксид-дисмутазы (СОД) превращается в перекись водорода (2), которая используется в частности для синтеза гипохлорита (3) или же разлагается нерадикальным путем под действием двух других защитных ферментов: каталазы и глутатион-пероксидазы (4). При недостаточной активности супероксиддисмутазы возможны другие, нежелательные реакции супероксида. Взаимодействуя с окисью азота, супероксид образует весьма токсическое соединение - пероксинитрит (5), который может повреждать клетки эндотелия и нарушать регуляцию кровяного давления. В присутствии ионов негемового железа супероксид восстанавливает трехвалентное железо (6) до двухвалентного (7), которое весьма токсично, т. к. разлагает перекиси липидов (8), перекись водорода (9) и гипохлорит (10) с образованием весьма активных вторичных радикалов липидов и гидроксила, к чему мы вернемся позже. Все это указывает на важнейшую роль супероксиддисмутазы в качестве антирадикального защитного фермента.

Инактивация и фотореактивация СОД

К сожалению, этот фермент может инактивироваться в очагах патологии. В работе, проведенной совместно с О. А. Азизовой и Е. А. Горбатенковой, нами было показано, что Cu-Mn-СОД довольно быстро инактивируется при сравнительно небольшом снижении рН (до рН 5.9-6.0). Нами было обнаружено интересное явление фотореактивации этого фермента под действием интенсивного (лазерного) облучения [5,46]. Исследования, проведенные на СОД и медных комплексах гистидина методами спектрофотометрии и ЭПР позволили предположить следующую схему действия низких рН и света на СОД [4,46].

При низких значениях рН происходит протонирование гистидина 61, входящего в активный центр фермента, в результате чего разрывается связь азота имидазольного кольца с ионом цинка и фермент инактивируется (там же). Повышение рН или освещение приводят к депротонированию гистидинового остатка и восстановлению ферментативной активности. По-видимому, фотореактивация СОД может внести вклад в хорошо известное терапевтическое действие лазерного облучения крови и ран [33].

Реакции окиси азота

В последнее время большое внимание привлекает еще один первичный радикал - окись азота, синтезируемая клетками эндотелия и принимающая участие в регуляции тонуса стенок кровеносных сосудов и кровяного давления. По-видимому, один из естественных путей удаления избытка этого высокоактивного соединения - это его связывания гемоглобином и последующее окисление. NO-комплексы гемоглобина удобно изучать методом ЭПР, поскольку они обладают характерными сигналами при температуре жидкого азота. В исследованиях, проведенных А. Н. Осиповым и Г. Е. Борисенко в нашей лаборатории методом низкотемпературной ЭПР-спектроскопии и спиновых ловушек, было обнаружено, что NO-комплексы гемоглобина обладают светочувствительностью и распадаются с выделением окиси азота [39]. Заманчиво предположить, что механизм фоторелаксации (расслабление стенок кровеносных сосудов под действием сильного света) и терапевтического действия лазерного облучения крови (которое тоже отчасти связано с сосудорасширяющим действием облучения) также связано с фотохимическим освобождением окиси азота из комплексов с гемсодержащими белками.

Вторичные радикалы.

Роль ионов железа.

Вторичные радикалы - это радикалы гидроксила и липидов, образуются при разложении перекиси водорода и липидных перекисей под действием ионов двухвалентного железа.

HOOH + Fe²⁺ Fe³⁺ + HO- + HO* (hydroxyl radical)

LOOH + Fe²⁺ Fe³⁺ + HO- + LO* (lipoxyl radical)

LO* + LH LOH + L * ;

L* + O₂ LOO *

Вопрос о возможных путях образования ферро-ионов в живой клетке и плазме крови - это тема отдельного разговора. По-видимому, что существует по меньшей мере три пути образования двухвалентного железа:

Восстановление супероксидным радикалом трехвалентного железа в клеточных депо, таких как ферритин,

восстановление и выход железа, входящего в состав цепи переноса электронов (возможно, также с участием супероксида) и

высвобождение ионов железа при разрушении гемоглобина перекисью водорода и гипохлоритом, а также возможно в ходе аутоокисления гемоглобина.

Образование гидроксил- радикала

В настоящее время описаны три основные реакции образования свободных радикалов под действием ионов двухвалентного железа. Первое - это реакция разложения перекиси водорода (известная как реакция Фентона). В результате её образуются радикалы гидроксила, которые можно зарегистрировать методом спиновых ловушек. Вторую реакцию открыл А. Н. Осипов и сотрудники в нашей лаборатории, используя методы спиновых ловушек и хемилюминесценции [11]. Это реакция разложения гипохлорита под действием ионов двухвалентного железа (реакция 10 на рис. 4).

Рис. 4. Метаболизм супероксидного радикала в норме и патологии.

В пунктирной рамке приведены реакции двух первичных радикалов в условиях нормального метаболизма. Окись азота служит одним из внутриклеточных регуляторов, а в условиях организма входит в состав фактора расслабления сосудистых стенок, вырабатываемого эндотелием (1). Супероксидный радикал под действием фермента супероксиддисмутазы (СОД) превращается в перекись водорода (2), которая служит источником гипохлорита - эффективного бактерицидного фактора, выделяемого фагоцитами (3). Избыток перекиси водорода разлагается (4) ферментами каталазой и глутатион-пероксидазой ( в присутствии восстановленного глутатиона).

Недостаточная активность супероксиддисмутазы может привести к увеличению концентрации супероксидного радикала и ряду нежелательных последствий.

В реакции супероксида и окиси азота образуется токсическое соединение - пероксинитрит (5), способное разрушать клетки стенок сосудов. Супероксид может восстанавливать трехвалентное железо (в частности, депонированного в ферритине) до двухвалентного (6-7). Последнее обладает выраженным цитотоксическим действием благодаря реакциям с перекисью водорода (8), гипохлоритом (9) и перекисями липидов (10). В этих реакциях образуются высокоактивные вторичные радикалы.

Сигналы ЭПР спинового аддукта, образуемого при этом в присутствии спиновой ловушки фенилбутилнитрона (ФБН), оказались идентичными сигналам, которые наблюдаются в реакции Фентона. Выход гидроксильных радикалов в расчете на один моль добавленного железа в реакции Осипова оказался в несколько раз выше, чем при разложении перекиси водорода.

Гидроксильные радикалы, как известно, способны вызывать повреждение нуклеиновых кислот, инактивацию ферментов и запуск цепной реакции перекисного окисления липидов, в силу чего обладают сильнейшим мутагенным и цитотоксическим действием.

Цепное окисление липидов

В липид-содержащих системах, таких как биологические мембраны и липопротеины крови, ионы двухвалентного железа образуют радикалы при взаимодействии с гидроперекисями ненасыщенных жирных кислот. Эти радикалы дают начало новым цепям окисления, и таким образом в присутствии ионов железа реакция цепного окисления становится разветвленной и скорость ее многократно возрастает.

Реакции, в которых принимают участие вторичные радикалы гидроксила и липидов обладают разрушительным действием и приводят к развитию большого числа так называемых дегенеративных болезней, или болезней пожилого возраста, включая атеросклероз, диабет, гипертонию, раковую болезнь, иммунные нарушения, катаракту, артриты и другие. Естественно, что организм стремится предотвратить образование вторичных радикалов как в водной так и в липидной фазах, используя целую систему защиты, включающую ферменты, соединения, связывающие железо, восстановители гидроперекисей и ловушки радикалов. Все эти соединения, тем или иным способом тормозящие накопление продуктов пероксидации, носят общее название антиоксидантов.

Антиоксиданты

Основные типы антиоксидантов

По определению, антиоксиданты - это соединения, которые препятствуют образованию свободных радикалов и таким образом предотвращают развитие болезней, вызываемых повреждением свободными радикалами структур наших клеток [43].

Антиоксидантами называют многие как водорастворимые, так и гидрофобные соединения, действие которых в конце концов приводит к снижению скорости образования свободных радикалов и уменьшению концентрации продуктов реакций, протекающих с участием радикалов.

На рис. 5 приведены защитные системы клеток, препятствующие образованию вторичных (гидроксильных) радикалов в водной фазе; на рис. 6 - агенты, тормозящие образование вторичных (липидных) радикалов в гидрофобной фазе биологических мембран и липопротеинов. Рассмотрим эти схемы подробнее.

Рис. 5. Водорастворимые антиоксиданты.

1 - 4 - реакции супероксидного радикала, приводящие к образованию гидроксильного радикала в водной среде. 1 - 2 - восстановление трехвалентного железа до двухвалентного. 3 - разложение перекиси водорода (реакция Фентона). Альтернативнапя реакция взаимодействия ионов железа с гипохлоритом на схеме не показана. 4 - реакции гидроксильного радикала, в том числе инициирование цепного окисления липидов (см. рис. 6). 5 - удаление супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода, катализируемое супероксиддисмутазой. 6 - 7 - удаление перекиси водорода каталазой (6) и пероксидазами (7). 8 - связывание ионов железа комплексонами.

Реакции 5 - 8 - приводят к торможению образования радикалов гидроксила. Набранные полужирным шрифтом соединения являются антиоксидантами.

Первично образуемый супероксид, как уже говорилось, способен восстанавливать ионы трехвалентного железа (рис. 5, реакция 1) из депо и различных комплексов (исключая гемовое железо) с образованием ионов Fe2+ (2). Последнее может реагировать с перекисью водорода (реакция 3) или гипохлоритом (на схеме не показано) с образованием гидроксильного радикала. Радикал гидроксила оказывает повреждающее действие на многие компоненты клетки и, в частности, способен инициировать цепное окисление (пероксидацию) липидов в биологических мембранах и липопротеинах (6).

Супероксиддисмутаза тормозит развитие этих событий, поскольку удаляет супероксидный радикал из системы (реакция 5) с образованием перекиси водорода, которая в свою очередь удаляется благодаря активности каталазы (6) и пероксидаз (7), в первую очередь глутатион-пероксидазы. Экспериментально показано, что в очень многих системах комбинация СОД + каталаза снижают уровень продуктов пероксидации липидов и предотвращают другие последствия действия свободных радикалов.

С другой стороны, торможение образования вторичных радикалов может быть достигнуто связыванием и удалением ионов железа (8). В модельных системах это могут осуществлять такие комплексоны, как ЭДТА или десферриоксамин (известный также под названием "десферал"). В живых клетках это же может осуществляться другими соединениями, из которых наиболее изучен дипептид карнозин, к чему мы еще вернемся. Все перечисленные соединения (СОД, каталаза, глутатион-пероксидаза + восстановленный глутатион, соединения, связывающие железо) могут в соответствующих условиях снижать уровень образования вторичных радикалов и пероксидацию липидов, а потому относятся к категории антиоксидантов.

Этим дело не исчерпывается. Даже если гидроксильные радикалы образовались и запустились реакции цепного окисления липидов, еще не все потеряно для клетки и организма, т. к вступает в строй новая система антиоксидантов.



Рис. 6. Антиоксиданты в липидной фазе мембран и липопротеинов

1 - инициирование цепного окисления липидов радикалами гидроксила. 2 и 3 - реакции продолжения цепи окисления липидов. 4 - реакция разветвления цепи ионами двухвалентного железа (разложение гидроперекиси липида с образованием липоксильного радикала). 5 - 7 - реакции обрыва цепей в результате “перехвата” радикалов, ведущих цепи окисления, молекулами антиоксидантов - “ловушек” радикалов. 8 - удаление гидроперекисей липидов за счет их восстановления тиоловыми соединениями, в частности, восстановленным глутатионом; эта реакция катализируется ферментом глутатион-пероксидазой. Удаление гидроперекисей предотвращает разветвление цепей и тем резко тормозит процесс пероксидации липидов. 9 - связывание ионов железа комплексонами, которое также препятствует разветвлению цепей.

Все соединения, обведенные рамкой, тормозят свободно-радикальное окисление (пероксидацию) липидов и таким образом служат антиоксидантами.

Схематически реакции липидной пероксидации и участки действия антиоксидантов приведены на рис. 6. Появление свободных радикалов в липидной фазе мембран приводит к инициированию цепной реакции (стадия 1 на рис. 6), которая развивается благодаря чередующимся реакциям продолжения цепи (2 и 3). В присутствии двухвалентного железа происходит разложение гидроперекисей (4), сопровождающееся образованием радикалов, дающих начало новым цепям окисления. Наиболее радикальный способ торможения цепных реакций заключается в связывании ("захвате") радикалов, ведущих цепи окисления, которое способны осуществлять такие восстановители, как фенол и его производные. Синтезировано и изолировано из живых объектов множество подобных соединений, называемых "ловушками радикалов", "ингибиторами свободнорадикальных реакций", "липидными антиоксидантами", которые резко тормозят реакции липидной пероксидации в весьма низких концентрациях. Менее радикальный (в прямом и переносном смысле) путь торможения пероксидации липидов заключается в предотвращении процесса разветвления цепей за счет либо удаления гидроперекисей (реакция 8 на рис. 6), либо связывания железа (реакция 9). Удаление гидроперекисей ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов биологических мембран происходит, по-видимому, в результате комбинированного действия фермента фосфолипазы А₂, отщепляющей окисленную жирную кислоту от фосфолипида (благодаря чему она выходит из липидного слоя мембран в окружающую водную среду), и глутатион-пероксидазы, которая восстанавливает гидроперекись до спирта за счет окисления глутатиона. Лимитирующей стадией последнего процесса в клетках обычно служит концентрация глутатиона, снижение которой, как правило, сопровождается активацией липидной пероксидации [21]. Опять-таки, все перечисленные соединения (ловушки радикалов, соединения связывающие железо, глутатион) могут быть названы антиоксидантами: их действие сходно, хотя они вступают в разные реакции.

Изучение активности антиоксидантов путем измерения кинетики хемилюминесценции

Существует много методов измерения активности естественных и синтетических антиоксидантов. В наших исследованиях в качестве основного метода использовалось измерение кинетики неактивированной хемилюминесценции, сопровождающей цепное окисление липидов, инициированное ионами Fe²⁺ в суспензиях митохондрий печени крысы [2,3,18,29,30,55,56], желточных липопротеидов [27,32,54] или фосфолипидных липосом. В качестве критериев действия антиоксидантов брали увеличение длительности латентного периода перед развитием медленной вспышки ХЛ, амплитуду или светосумму этой вcпышки. Была оценена относительная антиоксидантная активность стероидов, тироксина, дигидро- и дигидроксипиридинов, глицерофосфолипидов (там же), [12], и целого ряда других антиоксидантов (см. обзоры [42] и [44]).

Комплексоны

В перечисленных случаях антиоксиданты действовали в основном как ловушки радикалов. Существует однако другая группа антиоксидантов, которые тоже снижают образование радикалов, однако совершенно иным способом, а именно, связывая ионы железа, которые участвуют в реакциях новообразования радикалов из перекисей. К таким соединениям относятся ЭДТА, орто- и особенно пирофосфаты [19], десферриоксамин (десферал) [35] , антибиотик тетрациклин [13] и некоторые другие комплексоны. В среде, содержащей молекулярный кислород, все эти соединения, связывая двухвалентное железо, ускоряют его аутоокисление. И хотя в этих реакциях железо удаляется, при этом образуются супероксидные радикалы, что тоже не очень хорошо. Все же супероксидные радикалы, вероятно, меньшее зло по сравнению с самим двухвалентным железом, продуцирующим в присутствии гипохлорита или перекисей гидроксильные и липидные радикалы, гораздо более опасные. Характерно, что ферментные системы самого организма: церрулоплазмин плазмы крови и клеточный ферритин, призванные окислять двухвалентное железо, делают это без образования каких бы то ни было радикалов [51].

К природным соединениям, способным связывать ионы двухвалентного железа, относится карнозин (?-аланил-гистидин). Этот дипептид содержится в мышечной ткани в миллимолярных концентрациях, и вот уже более полувека интригует исследователей, потому что его благоприятное воздействие на многие процессы жизнедеятельности доказано, а механизм этого действия непонятен. В последние годы появились сообщения об антиоксидантном действии карнозина, но молекулярный механизм этого действия оставался предметом дискуссии. После обсуждения этой проблемы с С. Е. Севериным, нами была исследована кинетика хемилюминесценции, сопровождающей перекисное окисление суспензии липидов, к которым добавляли ионы двухвалентного железа и разные концентрации карнозина [24]. В противоположность антиоксидантам-ловушкам радикалов, таким как ?-токоферол или бутилированный гидрокситолуол, карнозин не увеличивал, а уменьшал латентный период перед наступлением медленной вспышки ХЛ; в этом отношении он действовал аналогично уменьшению концентрации вводимого железа. Был сделан вывод, что антиоксидантное действие карнозина имеет иную природу, чем действие ловушек радикалов и основано на связывании им ионов двухвалентного железа (там же). Половинное связывание железа наблюдалось при концентрации карнозина 2,3 мМ, что примерно на порядок величины меньше концентрации этого дипептида в мышечных клетках. Таким образом, антиоксидантные свойства карнозина могут быть объяснены тем, что связывая ионы железа, он препятствует образованию вторичных радикалов в биологических системах.

Таким же действием на кинетику ХЛ обладали и другие соединения, связывающие ионы железа: ЭДТА и десферал (данные в печати).

Изучение механизма действия антиоксидантов методом математического моделирования кинетики пероксидации липидов

В последнее время механизм действия антиоксидантов изучается в нашей лаборатории путем сопоставления кинетических кривых хемилюминесценции с результатами математического моделирования процесса [44]. С помощью специально разработанной компьютерной программы для математического моделирования кинетики сложных систем реакций моделировали кинетику цепного окисления липидов при различных гипотетических схемах действия антиоксидантов-ловушек радикалов. Общим для всех схем было хорошо доказанное образование радикалов антиоксиданта (In*) при его взаимодействии с радикалами, ведущими цепи окисления (LO₂*):

LO₂* + InH LOOH + In* ;

Но дальнейшая судьба этого радикала может быть разной. При моделировании процесса с использованием трех гипотетических схем, составленных с учетом литературных данных и высказываний разных авторов (см. таблицу 4), оказалось, что результаты, соответствующие опытам с ?-токоферолом, могут быть получены только при использовании Схемы 2, согласно которой радикал антиоксиданта вступает в реакцию с гидроперекисями липида, давая новые липидные радикалы.

Таблица 4. Схемы реакций взаимодействия антиоксиданта с липидными радикалами

Схема 1	Схема 2	Схема 3

Это приводит к замедлению процесса без уменьшения общего содержания радикалов в системе, что и наблюдается по хемилюминесценции [29]. Другие схемы не согласуются с экспериментом.

В самое последнее время, сравнивая экспериментальные данные, полученные с использованием разных антиоксидантов, с результатами математического моделирования, мы пытаемся найти константы скоростей реакций антиоксидантов с радикалами (что делали другими способами и раньше) и константы скорости радикалов антиоксидантов с пероксидами липидов (что раньше не делалось). Предварительные результаты этих исследований описаны в работе [29].

Литература

1. Arnhold J., Panasenko O. M., Schiller J., Arnold K., Vladimirov Yu. A., Sergienko V. I. // Z. Naturforsch. - 1996. - 51., - C. 386-394.

2. Гукасов В. М., Владимиров Ю. А., Сейфулло Р. Д., Сергеев П. В. // Биофизика - 1974. - 19., - C. 763-764.

3. Гукасов В. М., Сергеев П. В., Сейфулло Р. Д., Владимиров Ю. А. // Бюлл. Экспер. биол. и медицины - 1974. - 11., - C. 54-56.

4. Горбатенкова Е. А., Азизова О. А., Парамонов Н. В., Владимиров Ю. А. // ДоклАН;299(4)P995-1000|. - 1988. -

5. Горбатенкова Е. А., Азизова О. А., Владимиров Ю. А. // Биофизика - 1988. - ?()., - C. 717-718.

6. Осипов А. Н., Азизова О. А., Владимиров Ю. А. // Успехи биологической химии - 1990. - 31., - C. 180-208.

7. Осипов А. Н., Моравский А. П., Шувалов В. Ф., Азизова О. А., Владимиров Ю. А. // Биофизика - 1980. - 25(2)., - C. 234-238.

8. Осипов А. Н., Савов В. М., Зубарев В. Е., Азизова О. А., Владимиров Ю. А. // Биофизика - 1981. - 26(2)., - C. 193-197.

9. Осипов А. Н., Савов В. М., Яхъяев А. В., Зубарев В. Е., Азизова О. А., Каган В. Е., Козлов Ю. П., Владимиров Ю. А. // Биофизика - 1983. - 28(2)., - C. 204-206.

10. Осипов А. Н., Савов В. М., Яхъяев А. В., Зубарев В. Е., Азизова О. А., Каган В. Е., Владимиров Ю. А. // Биофизика - 1984. - 29(4)., - C. 533-536.

11. Осипов А. Н., Якутова Э. Ш., Владимиров Ю. А. // Биофизика - 1993. - 38(3)., - C. 390-396.

12. Епанчицева О. М., Парфенов Э. А., Смирнов Л. Д., Владимиров Ю. А. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1992. - (in press)

13. Петренко Ю. М., Титов В. Ю., Владимиров Ю. А. // Антибиотики и химиотерапия - 1995. - 40(2)., - C. 3-8.

14. Азизова О. А., Осипов А. Н., Савов В. М., Зубарев В. Е., Каган В. Е., Владимиров Ю. А. // Биофизика - 1984. - 29(5)., - C. 766-769.

15. Атанаев Т. Б., Калинин В. В., Шерстнев М. П., Владимиров Ю. А. // Биофизика - 1990. - 35(2)., - C. 269-272.

16. Deev A. I., Vladimirov Yu. A., Aitmagambetov M. T., Kabatchenko A. N., Sitartchuk I. A. //Eye lens membranes and aging - Ред. Vrensen G. F. J. M., Clauwaert J. . EURAGE, ?,1991, C. 247-259.

17. Driomina E. S., Sharov V. S., Vladimirov Yu. A. // Free Rad. Biol. Med. - 1993. - 15., - C. 239-247.

18. Владимиров Ю. А., Гусаков В. М., Федоров В. К., Сергеев П. В. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1977. - 5., - C. 558-560.

19. Владимиров Ю. А., Оленев В. И., Суслова Т. Б., Потапенко А. Я. // В. сб. |. "Итоги. науки. и. техники. ". Сер. Биофизика. ;5()p56-117|. - 1972. -

20. Владимиров Ю. А., Потапенко А. Я. // Физико-химические основы фотобиологических процессов, Высшая школа, Москва,1984

21. Владимиров Ю. А., Азизова О. А., Деев А. И., Козлов А. В., Осипов А. Н., Рощупкин Д. И. // - Ред. ВИНИТИ, Москва,1992, C. 3-250.

22. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. // Перекисное окисление липидов в биологических мембранах, Наука, Москва,1972

23. Владимиров Ю. А., Литвин Ф. Ф. // Биофизика - 1959. - 4(5)., - C. 601-605.

24. Владимиров Ю. А., Болдырев . ., Деев . ., Северин . ., Ли . . // Биофизика - 1988. - 33(1)., - C. 140-145.

25. Владимиров Ю. А., Шерстнев . . //Биофизические методы диагностики - Ред. Лопухин . ., Владимиров . . . Труды 2-го Московского Медицинского института, Москва,1990, C. 3-40.

26. Владимиров Ю. А., Шерстнев М. П. // Хемилюминесценция клеток животных, ВИНИТИ.Итоги науки и техники,сер.Биофизика,т.24, Москва,1989, 1 c.

27. Владимиров Ю. А., Шерстнев М. П., Азимбаев Т. К. // Биофизика - 1992. - 37(6)., - C. 1041-1048.

28. Владимиров Ю. А., Шерстнев М. П., Азимбаев Т. К. // Биофизика - 1995. - 40(2)., - C. 323-327.

29. Владимиров Ю. А., Тафельштейн Э. Е., Козлов Ю. П. // ДАН СССР - 1969. - 188., - C. 1163-1165.

30. Владимиров Ю. А., Сергеев П. В., Сейфулло Р. Д., Руднев Ю. Н. // Молекулярная биология - 1973. - 7., - C. 247-253.

31. Владимиров Ю. А., Суслова Т. Б., Оленев В. И. // Биофизика - 1969. - 14., - C. 836-845.

32. Рубене Д. Я., Шаров В. С., Оленев В. И., Тирзит , Дубур Г. Я., Владимиров Ю. А. // Журн. Физ. Хим. - 1981. - 15(2)., - C. 511-512.

33. Ромм А. Р., Шерстнев М. П., Волков В. В., Владимиров Ю. А. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1986. - 102(10)., - C. 426-428.

34. Koval'chuk L. V., Klebanov G. I., Ribarov S. R., Kreinina M. V., Aptsiauri N. E., Gankowskaya L. W., Karaseva M. V., Shuikina E. E., Vladimirov Yu. A. // Biomed. Sci. - 1991. - 2., - C. 221-231.

35. Kozlov A. V., Egorov D. Y., Vladimirov Yu. A., Azizova O. A. // Russian J. Phys. Chem. - 1990. - 64., - C. 225-227.

36. Panasenko O. M., Azizova O. A., Vladimirov Yu. A. // - Ред. Soviet Med.Rev.B, 1992, C. 1-76.

37. Sharov V. S., Driomina E. S., Vladimirov Yu. A. // J. Biolumin. Chemilumin. - 1994. - (in press).,

38. Sharov V. S., Kazamanov V. A., Vladimirov Yu. A. // Free Rad. Biol. Med. - 1989. - 7., - C. 237-242.

39. Борисенко Г. Г., Осипов А. Н., Казаринов К. Д., Владимиров Ю. А. // Биохимия - 1997. - 62(6)., - C. 774-780.

40. Vladimirov Yu. A. //Free Radicals, Aging, and Degenerative Diseases - Ред. Johnson J. E.,Jr., Walford R., Harman D., Miquel J. . Allan R.Liss,Inc., New York,1986, C. 141-195.

41. Vladimirov Yu. A. // - Ред. Soviet Med.Rev.B, 1987, C. 51-127.

42. Vladimirov Yu. A. //Free radicals in the environment, medicine and toxicology - Ред. Nohl H., Esterbauer H., Rice-Evans C. . Richelieu Press, London,1994, C. 345-373.

43. Vladimirov Yu. A. //Free radicals. A practical approach - Ред. Punchard N. A. and Kelly,F.J.. Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo,1996, C. 65-82.

44. Vladimirov Yu. A. //ISNA - Ред. Paker L.. ISNA, NY,1996, C. 125-241.

45. Vladimirov Yu. A., Atanayev T. B., Sherstnev M. P. // Free Rad. Biol. Med. - 1992. - 12., - C. 43-52.

46. Vladimirov Yu. A., Gorbatenkova E. A., Paramonov N. V., Azizova O. A. // Free Radic. Biol. Med. - 1988. - 5., - C. 281-286.

47. Vladimirov Yu. A., Klebanov G. I., Osipov A. I. // 12th International Congress on Photobiology. September 1-6,1996,Vienna,Austria - 1998. -

48. Vladimirov Yu. A., Olenev V. I., Suslova T. B., Cheremisina Z. P. // Adv. Lipid Res. - 1980. - 17., - C. 173-249.

49. Vladimirov Yu. A., Putvinsky A. V. // Journal of Physical Chemical Biology & Medicine - 1992. - 1., - C. 10-18.

50. Vladimirov Yu. A., Sherstnev M. P. // Soviet Med. Rev. B - 1992. - 2(5)., - C. 1-43.

51. Vol'nova T. V., Panasenko O. M., Zarechneva N., Azizova O. A., Vladimirov Yu. A. // Biologicheskie membrany - 1990. - 7(2)., - C. 141-148.

52. Шаров В. С., Владимиров Ю. А. // Биофизика - 1982. - 27(2)., - C. 327-329.

53. Шаров В. С., Суслова Т. Б., Деев А. И., Владимиров Ю. А. // Биофизика - 1980. - 25(5)., - C. 923-924.

54. Шерстнев М. П., Клебанов Г. И., Владимиров Ю. А. // Журн. Физ. Хим. - 1985. - 59(9)., - C. 2283-2286.

55. Сергеев П. В., Владимиров Ю. А., Сейфулло Р. Д., Денисов Ю. П., Руднев Ю. Н. // Вопр. мед. химии - 1974. - 20., - C. 359-362.

56. Сергеев П. В., Федоров В. К., Гукасов В. М., Владимиров Ю. А. // Бюлл. экспер. биологии и медицины - 1977. - 6., - C. 680-683.

57. Суслова Т. Б., Оленев В. И., Корчагина М. В., Владимиров Ю. А. // Биофизика - 1970. - 15., - C. 622-628.

58. Яхъяев А. В., Осипов А. Н., Азизова О. А., Коркина Л. Г., Величковский Б. Т., Владимиров Ю. А. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1985. - 99(4)., - C. 443-445.

Размещено на Allbest.ru

...