Особенности а-амилаз

Размещено на http://www.allbest.ru/

Факультет экологической медицины

Кафедра биохимии и биофизики

Дипломная работа

б-АМИЛАЗЫ

студентки V курса

Реферат

Объектом исследования являются ферментные препараты с б-амилолитической активностью.

Цель работы:

Изучить влияние различной концентрации ионов водорода в среде на активность ферментных препаратов грибного и бактериального происхождения с б-амилазной активностью. Освоить методику определения б-амилазной активности ферментных препаратов.

The abstract

Object of research are enzymes with б-amilazej activity.

The work purpose: To study action of various concentration of ions of hydrogen in the environment on activity of fermental preparations of a mushroom and bacterial origin with б-amilaze activity. To master a definition technique б-amilaze activity of fermental preparations.

Содержание

Введение

1. Kрахмал и его свойства

2. Гидролиз крахмала б-амилазами

3. Функциональные группы активных центров б-амилаз

4. Физико-химические свойства б-амилазы

4.1 Очистка и кристаллизация б-амилаз

5. Применение ферментных препаратов обладающих амилолитической активностью

6. Материалы и методы исследований

6.1 Определение амилолитической активности (АС)

7. Результаты, обсуждения

7.1 Проведение анализа б-амилолитической активности ферментного препарата Фунгамил

7.2 Проведение анализа б-амилолитической активности ферментного препарата Ликвозим-супра

Заключение

Список литературы

Введение

Амилазы - ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролитическое расщепление полисахаридов. Амилазы участвуют в процессе пищеварения у человека и животных. Амилазы используются в спиртовой промышленности, в хлебопечении и при производстве глюкозы

Изучение амилаз началось с открытия Кирхгофом в 1814 г. Препарат, полученный Кирхгофом из пшеничной муки, обладал способностью разжижать крахмальный клейстер и превращать его в сахарный сироп. Аналогичное явление автор наблюдал при смешивании крахмального клейстера с ячменным солодом.

Активное вещество в дальнейшем было выделено из солода и подверглось детальному изучению. Было обнаружено, что его действие на крахмал проходит через три стадии: разжижение, декстринизацию и осахаривание. Это привело к признанию существования в солоде двух различных компонентов, которые в дальнейшем были получены в отдельности и названы б-амилазой (декстринирующий компонент) и в-амилазой (осахаривающий компонент).

б-Амилазы широко распространены в высших растениях [3]. Наиболее важным источником амилаз являются хлебные злаки, зерно которых в проросшем состоянии (в виде солода) находит широкое применение в промышленном гидролизе крахмала. Солод из ячменя, ржи, пшеницы, овса, проса используется для осахаривания крахмала в спиртовом производстве. Одним из важнейших направлений научно-технического прогресса в отрасли является частичная и полная замена солода ферментными препаратами микробного происхождения. Создание комплексных ферментных препаратов, состоящих из б-амилаз, глюкоамилаз, протеиназ, целлюлаз, позволяет более глубоко осуществить ферментативный гидролиз углеводов (в частности, крахмала) и белков зерно-картофельного сырья и полнее сбродить сусло до основного продукта -- этилового спирта. Таким образом, дозировки каждого фермента и комплекса в целом, условия проведения ферментативного гидролиза субстрата приобретают решающее значение в эффективном применении ферментных препаратов и сокращении производственных потерь зерно-картофельного сырья.

Цель работы: Изучить влияние различных концентраций ионов водорода в среде на активность ферментных препаратов грибного и бактериального происхождения с б-амилазной активностью.

1. Kрахмал и его свойства

Крахмал является широко используемым пищевым сырьем. Исходя из чрезвычайной важности и многовековой практики его использования, следовало бы полагать, что структура и свойства этого биополимера давно и однозначно установлены. Однако, наряду с хорошо известными представлениями о структуре и физико-химических свойствах крахмала, выявлен ряд неизвестных, ответы на которые будут, по-видимому, даны в будущем. Тот факт, что крахмал состоит из двух полимеров: линейного (амилозы) и разветвленного (амилопектина) был установлен еще в 30-е годы прошлого столетия. Составные фракции крахмала, как при кислотном, так и при ферментативном гидролизе образуют только D - глюкозу. Обычно крахмал состоит на 80% из амилопектина и на 20% из амилозы. Амилоза обуславливает йодкрахмальную реакцию, легко агрегируется в растворе и вызывает выпадение осадка. Она содержит от нескольких сотен до нескольких тысяч остатков глюкозы соединенных - 1,4 - связями. Несмотря на установленный факт, что амилоза линейный полимер, возникают некоторые неясности относительно ее структуры, именно к таким может быть отнесен ограниченный гидролиз амилозы в - амилазой. Такие аномалии в структуре полимера могут явится результатом наличия незначительного количества точек ответвлений или других дефектов (частичное окисление) в структуре амилозы, возникающих в результате выделения крахмала. На рис. 1.1 показан фрагмент структуры амилозы. [3]

Рис. 1.1 Графическое изображение амилозы

В отличие от амилозы амилопектин содержит и -1,6 связи, хотя установлено, что эти связи не являются единственными точками разветвлений в структуре амилопектина. Суммарное количество -1,6 связей составляет 4 -- 5 % от общего количества связей в амилопектине было также показано наличие в амилопектине точек разветвлений, обра-зованных -1,2 и -1,3 связями, хотя было установлено, что количество -1,3 связей незна-чительно. Более подробный анализ позволил высказать точку зрения о том, что -1,6 связи являются единственными естественными точками разветвлений в молекуле амилопектина (рис 1.2). Основываясь на данных по метилированию и энзиматическому анализу Майер и Бернфельд[6] предложили ныне принятую структурную модель амилопектина (рис.2). Причем, авторами было показано, что среднее расстояние между точками разветвления в молекуле крахмала составляет восемь глюкозных остатков. Однако, тот факт, что в амилопектине установлено наличие между точками разветвления и фрагментов длиной в 2 -- 3 глюкозных остатка, указывает на то, что должны быть и участки значительно длиннее, чем восемь остатков [3]

Рис. 1.2 Фрагмент амилопектина с точкой разветвления

Рис. 1.3 Схематическое изображение строения амилопектина

Исключительно важными свойствами крахмала, как для практических, так и для научных целей, являются его растворимость и способность к кристаллизации. Мономер крахмала - глюкоза очень легко растворима в воде, а также в буферных растворах с разными значениями рH. Олигосахариды типа мальтозы, мальтотриозы и т. д. также легко растворяются и воде. Относительно конформации крахмала наиболее обоснованной теорией следует считать наличие спирали, которая может быть существенно стабилизирована образованием комплекса с йодом или другими органическими соединениями. [6]

Обычно крахмальные гранулы состоят из приблизительно равных частей кристаллических и аморфных участков. Во время растворения вода проникает в гелеобразные (аморфные) участки и смачивает их. Минуя при этом кристаллическую часть крахмала. Но при высоких температурах кристаллические участки постепенно растворяются, переходя, в конце концов, в растворимую фракцию. Аналогично этому, при кислотном гидролизе аморфная часть реагирует значительно быстрее, чем кристаллическая. По-видимому, при ферментативном гидролизе происходит нечто подобное, хотя нет никакой гарантии, что все виды крахмала подвержены полной энзиматической деградации. В целом, биодеградацию крахмала можно представить следующим образом: - амилаза вызывает быстрое уменьшение молекулярного веса крахмала, доводя её до низкомолекулярных декстринов. Таким образом, - амилаза, с одной стороны способствует существенному повышению растворимости продуктов гидролиза крахмала и, с другой стороны, превращает их в более легко усвояемые и сбраживаемые соединения. Дальнейший гидролиз декстринов до составного мономера глюкозы осуществляется в - амилазой и - глюкозидазой (глюкоамилаза).[6]

2. Гидролиз крахмала б-амилазами

б-Амилазы действуют на а-1,4-глюкозидные связи, расщепляют амилозу внутри ее цепи, в результате чего с большой скоростью образуются низкомолекулярные продукты гидролиза -- нормальные б-декстрины. Их дальнейший гидролиз дает мальтотриозу, мальтозу и глюкозу. Было найдено, что расщепление б-1,4-глюкозидных связей в амилозе носит случайный характер и подчиняется закону статистического распределения продуктов реакции. Расщепление более мелких фракций на последнем этапе амилолиза носит уже не случайный характер -- действие фермента направлено лишь на определенные б-1,4-глюкозидные связи. В конечном счете б-амилазы (солодовая, Asp. oryzae, Вас. subtilis, слюны, свиная панкреатическая) превращают амилозу в мальтозу и глюкозу, хотя и отмечены некоторые несущественные различия в динамике гидролиза этими ферментами указанного субстрата.

Бендецкий и Яровенко [1] по изменению вязкости и восстанавливающей способности гидролизатов крахмала оценивали действие (множественность атаки) б-амилазы Вас. subtilis на растворимый крахмал. Авторы наблюдали существенное различие вязкость -- восстанавливающая способность при кислотном и ферментативном гидролизе крахмала. Это дало основание сделать заключение, что при кислотном гидролизе деградация крахмала происходит беспорядочно, а при действии б-амилазы осуществляется множественная атака на субстрат, приводящая к образованию олигомеров на первой стадии деградации.

Разрыв цепей амилопектина осуществляется между б--1,6-глюкозидными связями. Отщепление декстринов, содержащих 15 и более глюкозидных остатков, идет с большей скоростью, в то время как конечное осахаривание существенно замедляется. Продукты гидролиза, содержащие б-1,4-глюкозидные связи, являются нормальными б-декстринами и состоят из 6--13 глюкозидных остатков. Остаточные декстрины, содержащие большое количество б-1,6-связей, обозначаются как аномальные конечные декстрины. Установлено, что б--1,6-связи не только не расщепляются б-амилазой, но и являются стерическим препятствием для гидролиза б-1,4-связей, находящихся в непосредственной близости к б-1,6-связям. На рис. 2.1 представлена схема действия б-амилаз на амилозу и амилопектин по Бернфельду[6].

Рис. 2.1 Гидролиз амилозы

3. Функциональные группы активных центров б-амилаз

Данные литературы о функциональных группах б-амилаз, ответственных за катализ, противоречивы. Основной причиной этого, по всей вероятности, можно считать тот факт, что исследователи использовали в большинстве случаев лишь химический метод идентификации -- блокирование групп специфическими реагентами. Указанный метод не является достаточно надежным критерием этой идентификации.

SH-группа, видимо, никакого участия в катализе б-амилазы не прини-мает [10]. Важная роль здесь отводится NH₂-группе в солодовой и в свиной панкреатической амилазах. ОН-группа тирозина, вероятно, не имеет особого значения при катализе свиной панкреатической амилазой. В то же время имеются указания о существенной роли этой группы в действии б-амилазы Asp. oryzae и бактериальной б-амилазы [11]. Однако к ним нужно отнестись с особой осторожностью. Здесь уместно напомнить, что ОН-группа тирозина способна образовывать с СООН-группой, находящейся в белке, достаточно прочные водо-родные связи. Вполне будет правильным также предположение, что эта группа имеет важное значение в формировании структуры каталитического центра фермента. Блокирование группы приводит к разрушению этого центра.

Было показано, что в акте катализа принимают участие имидазольная и карбоксильная группы.

4. Физико-химические свойства б-амилазы

Согласно современной классификации и номенклатуре ферментов б-амилаза получила название б -1,4-глюкан-4-глюкангидролаза, 3.2.1.1.

Роль б-амилаз при гидролизе крахмала исключительно велика. Из трех основных функций при действии на клейстеризованный крахмал (разжижение, декстринизация, осахаривание) разжижение и декстринизация зависят от б-амилаз. Они атакуют не только клейстеризованный, но и нативный крахмал, разрушая крахмальные зерна

б-Амилазы различного происхождения имеют много общих свойств: хорошо растворяются в воде или в сильно разбавленных растворах солей. Более концентрированные растворы солей (например, 20-30%-ные растворы сульфата аммония) вызывают осаждение этих ферментов. б-амилазы легко растворяются в разбавленных растворах этилового спирта, но осаждаются при его концентрации в среде свыше 60%. Белок б-амилаз обладает слабокислыми свойствами; изоэлектрическая точка ферментов колеблется в пределах рН 4,2-5,7. Молекулярная масса солодовой б-амилазы 60000, б-амилаз микроскопических грибов - 45 000-50000 [11]. Многие из известных ныне б-амилаз получены либо в высокоочищенном, либо в кристаллическом виде.

Ионы кальция оказывают стабилизирующее действие на б-амилазы. Это впервые было обнаружено Воллерштейном, затем подтверждено Накамурой. В настоящее время это явление отмечено почти для всех амилаз. Однако теоретически этот вопрос применительно к промышленному гидролизу крахмала до сих пор не разработан.[5]

Рис.4.1 б-Амилаза

4.1 Очистка и кристаллизация б-амилаз

б-амилаза Asp. orizae

Широко распространенным методом очистки и кристаллизации б-Амилазы Asp. orizae является метод Акабори и соавторов . Этот метод был несколько изменен. В основу его положено образование комплекса амилазы с риванолом (молочнокислый-2-этокси-6,9-диаминоакридин) в результате взаимодействия отрицательно заряженных групп белка с положительно заряженным остатком этокси-6,9-диаминоакридина.

Спиртоосажденный препарат фермента тщательно растирают в ступке с холодным 0,001 М раствором ацетата кальция в соотношении 1:10. Смесь экстрагируют 1,5-2 ч при частом перемешивании, затем фильтруют или центрифугируют при 6000 об/мин.

В прописи метода Акабори на этой стадии рекомендуется вносить объем 0,25 М раствора ацетата кальция. Образующийся осадок следует удалять через целит. Однако после такой обработки фильтрата не обнаружилось выпадения осадка, зато наблюдалось падение активности фермента на 10-15%. От этой стадии очистки отказались. С другой стороны, на конечных стадиях очистки и кристаллизации в ферментном препарате содержится кислая протеаза . С целью удаления протеазы следует прогревать фильтрат вытяжки и выдерживать 5 мин при 65°С; величина рН должна быть в пределах 6,2-6.7. Термическая обработка приводила к существенной инактивации б-амилазы (до 20%). Однако затем кристаллический препарат фермента был практически свободен от кислой протеазы.

После повторной фильтрации в вытяжку вносят сульфит аммония до 3/4 насыщения (55 г на 100 мл) при температуре 3-5°С. Смесь выдерживают в течение 10-15 мин и центрифугируют при 6000 - 7000 об/мин. Осадок, содержащий б-амилазу, растворяют в таком количестве 0,001 М раствора ацетата кальция, чтобы концентрация белка была в пределах 1,5-2,5%. Затем раствор подвергают диализу против дистиллированной воды до полного удаления ионов SO4, в качестве полупроницаемой мембраны используют целлофан.

Практика многократной очистки фермента подсказывает, что следующая стадия - осаждение амилазы в виде белково-риванольного комплекса весьма ответственная. Она требует тщательно диализованного белкового раствора, в противном случае будет затруднено образование комплексов и выделение б-амилазы в осадок будет неполным.

Для осаждения б-амилазы используют 1%-ный раствор риванола. Осаждение подразделяется на две операции: удаление вместе с риванолом различных примесей; собственно осаждение амилазы.

В первый период при добавлении риванола к диализованному раствору выпадает осадок темно-зеленого цвета. Риванол приливают медленно при тщательном перемешивании смеси. Появившиеся хлопья постепенно меняют окраску от темно-зеленого до серо-желтого и желтого цвета. Осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. Обычно на эту операцию расходуется раствора риванола 1,5-4,5% от объема вытяжки.

Затем к центрифугату вновь добавляют риванол, при этом появляются плотные светло-желтые хлопья. Раствор риванола приливают до прекращения образования хлопьев, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. На эту операцию расходуется от 4 до 10% раствора риванола. Осадок отделяют центрифугированием и вносят в раствор, содержащий 0,5 М ацетатный буфер (рН 5,8-6,1) и 0,001 М ацетат кальция.

От амилазы риванол отделяют адсорбцией на каолине, адсорбент вносят в среду из расчета 15-20 г на 100 мл раствора. Смесь встряхивают в течение 10-15 мин и фильтруют. Фильтрат после отделения каолина становился бесцветным или слегка окрашенным в желтый цвет.

Следующая стадия -- осаждение б-амилазы ацетоном, который добавляют до конечной концентрации 55 об.%. Осадок б-амилазы быстро растворяют в 0,02 М растворе ацетата кальция. Концентрация белка в растворе должна быть в пределах 1,5--2,0%.

Заключительная стадия очистки б-амилазы -- кристаллизация. Кристал-лизация может быть успешной лишь в том случае, если будет получен раствор белка в пересыщенном состоянии. Операция пересыщения должна проводиться плавно и мягко; в противном случае выпадает обильный аморфный осадок белка, который подавляет процесс кристаллизации.

Кристаллизацию фермента осуществляют из ацетонового раствора в ледяной бане при температуре от -2 до -4° С. Холодный ацетон осторожно приливают по стенке колбы в белковый раствор и тщательно перемешивают. При концентрации ацетона 30-35 об.% выпадает осадок кальциевых солей. Для более полного его выделения раствор выдерживают на ледяной бане ( в морозильнике ) при -2°С в течение 24 ч, затем осадок удаляют центрифугированием. К раствору фермента вновь осторожно добавляют ацетон (примерно 45-48%) так, чтобы появилась тончайшая, едва видимая муть, затем раствор помещают в морозильник при -2°С. Через 24 ч выпавший аморфный осадок отбрасывают, а в осветленный раствор снова вносят ацетон до едва уловимого помутнения; через 2--3 суток на дне и стенках колбы появляются кристаллы. Количество их возрастает через 7--10 суток выдержки при периодическом добавлении небольших порций ацетона. Однако наряду с хорошо оформленными кристаллами появляются включения полуаморфного характера.

Перекристаллизацию осуществляют в той же последовательности, что и кристаллизацию. В поле зрения микроскопа основная масса кристаллов имеет форму квадратов с четко выраженными гранями [5].

4.2 Кислотная инактивация б-амилаз

В изучении кислотной инактивации б-амилаз заслуживает особого внимания получение их в кристаллическом или высокоочищенном состоянии. Сопоставление кинетики инактивации растворов высокоочищенных ферментов с растворами неочищенных ферментов позволяет глубже представить механизм этого процесса.

Очистка и кристаллизация ферментов - весьма трудная задача. Теория кристаллизации белков с их сложной трехмерной структурой, дающая хотя бы общие представления о закономерности этих процессов, отсутствует.

При очистке и кристаллизации данного фермента обязательным является наличие в среде ионов кальция, достаточно высокое значение рН (5,5 -- 7,5), низкая температура. Последнее приобретает особо важное значение при использовании органических растворителей. Несоблюдение указанных условий приводит к полной потере ферментативной активности.

Установлено, что инактивация ферментов под действием Н⁺-ионов представляет собой результат предварительно ионизированных процессов,

глубоко затрагивающих электростатические взаимодействия в белковой молекуле ферментов [7]. Однако, несмотря на сложность процесса перехода нативного фермента в инактивированное состояние, в конечном счете в каждом элементарном акте инактивации принимает участие только молекула фермента и именно в ней происходят изменения специфической конформации, ведущие к разрушению каталитического центра.

Исходя из представлений о мономолекулярности процесса инактивации ферментов, нельзя однако без должной проверки рассматривать эту реакцию как реакцию первого порядка. Лейдлер рассматривает порядок реакции как строго экспериментальную величину, показывающую характер зависимости скорости реакции от концентрации реагирующих веществ, тогда как молекулярность реакции обозначает число молекул, вступающих в элементарную реакцию. Тем не менее, инактивация многих ферментов, в том числе и под действием Н-ионов, является реакцией первого порядка [7]. Величины К (константа скорости перехода активной формы в инактивированную) амилаз микроскопических грибов при соответствующих рН близки между собой. Солодовая б-амилаза более чувствительна к действию Н⁺ - ионов: если резкая инактивация амилаз микроскопических грибов наступает при рН 4,5, то для солодовой б-амилазы она отмечается уже при рН 5,5. Величина К солодовой амилазы в 10-30 раз выше таковой амилаз микроскопических грибов. По стабильности к б-амилазе солода близка амилаза слюны человека; что же касается амилаз Asp. usamii и Asp. batatae, то для них отмечена более высокая устойчивость к ионам водорода. Скорость кислотной инактивации б-амилаз находится в тесной взаимосвязи не только с концентрацией Н⁺ - ионов в среде, но и с наличием в ней Са²⁺ ионов.

Для сред, содержащих кальций, характерны две особенности инактивации: во-первых, чем выше концентрация Са²⁺-ионов при одном и том же рН, тем меньше К; во-вторых, чем ниже рН, тем больше необходимо Са²⁺-ионов, чтобы предотвратить кислотную инактивацию фермента. Иными словами, кислотная инактивация б-амилаз в средах, содержащих Са²⁺-ионы, подчиняется закону.

Необходимо отметить, что стабилизирующее действие ионов Са²⁺ на б-Амилазу имеет место лишь при низких концентрациях его в среде. При высоких концентрациях эффект стабилизации уменьшается. Стабилизирующее действие Са²⁺-ионов при кислотной инактивации б-Амилаз и, наоборот, инактивация в присутствии веществ, специфически связывающих кальций, свидетельствуют о том, что в основе инактивации фермента, как Н⁺-ионами, так и аддендами, лежит один и тот же механизм.

Инактивирующее действие аддендов позволяет отнести б-амилазы к группе истинных металлоферментов [2]. Доказательством того, что б-амилазы относятся к числу истинных металлоферментов, является также существенное различие в скорости их биосинтеза при наличии или отсутствии в среде кальция. Хамада, Ямамото Фукумото, выращивая микробные клетки Вас. subtilis, нашли, что кальций в значительной степени способствует увеличению образования б-амилазы. Наконец, об б-амилазах как истинных металлоферментах говорит факт строгой стехиометричности соотношений атомов кальция и белка этих ферментов.

Оикава и Маеда установили, что во время диализа раствора кристаллической б-амилазы Asp. oryzae против 0,02 М раствора ацетата натрия молярное отношение кальция к амилазе быстро понижалось от 10 до 1, в то время как ферментативная активность не снижалась, а даже наблюдалось незначительное ее увеличение. Неизменным оставалось оптическое вращение. Дальнейший диализ не приводил к изменению этих показателей. Внесение ЭДТА·Na₂ в раствор фермен-та вызвало снижение содержания кальция, уменьшение ферментативной активности и быстрое увеличение левого вращения. По окончании диализа б-амилаза содержала 0,21 г-атом кальция на 1 г-моль фермента, а активность составляла 30% от максимальной величины. Была отмечена необратимая инактивация фермента. Это позволило сделать вывод, что она имела не прямой, а косвенный характер, как результат удаления кальция. То же самое отмечено для кислотоустойчивой б-амилазы Asp. niger, Asp. awamori [7].

Хью, Фишер, Штейн пришли к выводу, что на 1 моль б-амилазы Asp. oryzae и б-Амилазы слюны человека приходится 1 атом кальция, на 1 моль б-амилазы Вас. subtilis -- 4 атома кальция. Удаление указанных атомов сопровождается потерей ферментативной активности. Инактивация б-амилазы Asp. oryzae становится необратимой. Внесением кальция в раствор б-амилазы слюны человека и б-амилазы Вас. subtilis удалось количественно восстановить активность этих ферментов. Интереснее всего то, что, подобрав мягкие условия электродиализа, Штейн, Хью, Фишер получили кристаллическую активную б-амилазу слюны человека, свободную от кальция. [8]

Используя электродиализ, Иманичи получил бактериальную б-амилазу, свободную от кальция. Однако фермент был весьма чувствителен к воздействию температуры и мочевины. Чтобы полностью восстановить фермент в нативное состояние, необходимо присутствие в среде, по крайней мере, 4--5 атомов кальция на 1 моль фермента.

Заслуживает особого интереса тот факт, что удаление кальция происходит с двумя различными скоростями: в первый период снижение содержания кальция до 1 г-атома на 1 г-моль фермента идет быстро, во второй -- удаление последнего г-атома идет весьма медленно.

Следовательно, последний атом кальция наиболее прочно связан в белке фермента. Однако эта прочность для амилаз различного происхождения весьма различна и уменьшается в такой последовательности: б-амилаза Asp. oryzae > б-амилаза Вас. subtilis > б-амилаза слюны человека, б-амилаза свиной поджелудочной железы > б-амилаза ячменного солода.

Удаление последнего атома кальция ведет к глубоким конформационным изменениям в ферменте, близким или идентичным по своему характеру к денатурации белков. Убедительным подтверждением этому является увеличение левого оптического вращения, появление ранее замаскированных SH-групп, возрастание вязкости, изменение полярографической волны [8].

Согласно упомянутым исследованиям роль кальция в молекуле фермента заключается в создании между белком и металлом уплотненной структуры. Металл "сшивает" функциональные группы, расположенные на отдельных участках полипептидной цепи молекулы фермента, и образует внутримолекулярную поперечную связь, которая, очевидно, принимает участие в формировании третичной структуры фермента и, следовательно, его каталитического центра. Эта связь придает в целом молекуле фермента достаточно высокую прочность. Штейн, Хью, Фишер считают, что кальций можно представить как "замочный шип" в цельной молекулярной структуре фермента. Следовательно, кальций Са²⁺ апофермент б-Амилазы можно представить как типичный клешневидный комплекс.

Как было отмечено выше, внесение Са²⁺-ионов в раствор не влияет на активность б-амилазы. Более того, удаление ионов данного металла, не связанных с белком фермента, вызывает некоторое увеличение его активности. Следовательно, Са²⁺-ион оказывает только стабилизирующее влияние на конформацию молекулы фермента и его активный центр. Этот ион не является непосредственным компонентом активного центра амилаз и вряд ли имеет какое-либо значение в образовании фермент-субстратного комплекса.

Кальций играет роль фактора, предохраняющего б-амилазы от расщепления протеолитическими ферментами. Кристаллическая б-амилаза слюны человека, свиной поджелудочной железы, Вас. subtilis, Asp. oryzae сохраняют в полной мере активность при инкубации с большими количествами трипсина, химотрипсина, субтилизина, пепсина, папаина. Напротив, при одновременном действии протеаз и реагентов, специфически связывающих кальций, амилазы легко инактивируются и расщепляются. Данный факт свидетельствует о том, что стабилизирующее действие кальция не ограничивается активным центром, а распространяется на всю конформацию белковой молекулы фермента. Удаление кальция обусловливает создание рыхлой структуры фермента, доступной протеолизу.

5. Применение ферментных препаратов обладающих амилолитической активностью

В настоящее время проблеме применения микробных ферментов в перерабатывающих отраслях промышленности продолжают уделять все большее внимание ученые и производственники во многих странах мира. По прогнозам специалистов, использование ферментных препаратов (ФП) микробного происхождения в промышленности имеет устойчивую тенденцию к увеличению, при этом 2/3 текущего объема составляют ферменты для пищевой промышленности, а их основная доля приходится на спиртовую отрасль.

В спиртовой промышленности, перерабатывающей крахмалистое сырье, широко применяются ферменты гидролитического расщепления крахмала. Для этой цели используется зерновой солод и ферментные препараты микробного происхождения. Применяемый в спиртовом производстве зерновой солод осуществляет гидролиз крахмала до сбраживаемых углеводов и является источником азотистого питания для дрожжей и при осахаривании крахмалистого сырья производит частичную деструкцию его клеточных стенок и белковых веществ.

Однако при применении солода из-за ограниченной возможности создания достаточно высокой концентрации ферментов скорость осахаривания и протеолиза сырья остается низкой, что затрудняет интенсификацию процесса брожения. Эффективная замена солода ферментами микробного происхождения является важной задачей. Опытом работы спиртовых заводов в последние 20 лет показано, что применение ферментных препаратов экономически оправдано: интенсифицируется процесс осахаривания крахмала, повышается степень использования сырья, стабилизируются техноло Бактериальная б-амилазы, образующая при гидролизе крахмала декстрины с различной степенью полимеризации. Источниками бактериальной б-амилазы являются ферментные препараты: амилосубтилин - отечественного производства, БАН - компании "Ново Нордиск" и др., с оптимальной температурой действия 60-70°С. и рН 5,5-7,0, синтезируемые Ваcillus subtilis. Наиболее интересными и перспективными перпаратами являются ФП термостабильной а-амилазы: амилолихотерм отечественного производства, термамил - компании "Ново Нордиск", зимаджунт - "Энде Индустриал Корпорейшн" и другие, получаемые глубинным культивированием бактерий Bacillus Licheniformis. Оптимальная температура действия этих ферментных препаратов 85 - 95°С., рН - 6,0 - 7,0.

Грибная б-амилазы, обладающая эндоамилазной способностью к гидролизу крахмала с образованием растворимых декстринов, олигосахаридов и мальтозы, с оптимумом действия 45 -- 55°С. и рН 4,8 -- 5,5. Источники: амилоризин, амилопротооризин -- отечественного производства, фунгамил -- компании "Ново Нордиск" и другие; продуцент Aspergillus oryzae. фунгамил амилазный ферментный водород

В настоящее время многие наши спиртзаводы используют для ферментативной обработки крахмалсодержащего сырья концентрированные ферментные препараты амилолитического действия. Несмотря на высокое качество ферментных препаратов и удобство их применения, в ряде случаев имеются сложности по правильному их использованию в технологическом производстве. Поэтому важной задачей является на основе анализа работы заводов и данных лабораторных исследований определять технологические возможности применения новых ферментных препаратов для повышения эффективности биотехнологических процессов переработки крахмалсодержащего сырья и технологий их применения. При выделении и очистке ферментов сложно добиться полного сохранения ферментативного комплекса в концентрированном препарате. Это подтверждается биохимическими показателями импортных высокоактивных ферментных препаратов, которые представляют собой в основном препарат одного фермента с определенным оптимумом действия и специфичностью, редко - двух и более. Поэтому применение концентрированных ферментных препаратов требует точного соблюдения технологий их применения, которая разрабатывается на основе биохимических и технологических характеристик препарата в каждом конкретном случае. При использовании концентрированных ферментных препаратов в производственных условиях необходимо учитывать физико-химические показатели производства (рН и минеральный состав воды, рН и температура замеса и сусла, длительность стадий ферментативной обработки крахмалсодержащего сырья). В настоящее время уже накоплен научный и практический опыт применения этих ферментных препаратов.

Одним из перспективных препаратов, широко применяемых на заводах, работающих по механико-ферментативной схеме подготовки сырья, является препарат бактериальной термостабильной а-амилазы. Препарат гидролизует внутренние а-1,4-гидролизные связи крахмала и продуктов его последовательного расщепления, что приводит к быстрому снижению вязкости клейстеризованного крахмала, тем самым обеспечивая подготовку сусла к действию глюкоамилазы. Конечными продуктами действия являются декстрины и олигосахариды. Максимальная эффективность их действия находится в интервале температур 80 - 95°С и значении рН 5.0 - 8.0. Препараты обладают высокой термостабильностью: термостатирование при температуре 95°С в течение 1 часа приводит к потере 40 % от исходной активности, температура полной инактивации - выше 105 - 110°С.

Высокая термостабильность и оптимум действия этих ФП способствуют снижению расхода препаратов для разжижения крахмала зернового сырья в спиртовом производстве. Нормы расхода термостабильных препаратов по амилолитической активности соответствуют 0,2 - 0,3 ед. АС/г крахмала, против 1,0 - 1,5 ед АС/г для мезофильных амилаз. Уровень активности определяется по ГОСТ при 30°С.

Так, например, на некоторых спиртзаводах переработка крахмалистого сырья осуществляется по схеме так называемого мягкого разваривания, когда основная гидродинамическая и ферментативная обработка происходит при температуре 80 - 95°С - оптимальной для действия термостабильной амилазы. В этой зоне температур амилазная активность при разжижении крахмала зернового затора возрастает у термостабильных амилаз в 4--9 раз и составляет от 1,2 до 2,9 ед АС/г крахмала, в то время как у мезафильных амилаз (в связи с их термолабильностью) этот показатель падает и составляет только 0,4 ед АС/г крахмала при 80°С, а при 90-95°С- фермент полностью инактивируется. Поэтому эта схема наиболее эффективна при использовании ФП термостабильной а-амилазы (амилолихотерм, термамил, зимаджунт и др.) Важен не только температурный режим гидродинамической обработки, но и рН водномучной суспензии, при котором происходит разжижение и клейстеризация крахмала. Обычно он находится в интервале 5,5-6,5 и также соответствует оптимальным пределам действия этих ферменов. В результате крахмал хорошо декстринизируется, вязкость снижается, сусло разжижается и отличается хорошей подвижностью. В настоящее время появились новые ферментные препараты, выдерживающие и более низкие значения рН.

6. Материалы и методы исследований

6.1 Определение амилолитической активности (АС)

Метод основан на способности крахмала и декстринов различной молекулярной массы, образующихся в результате гидролиза крахмала ферментными препаратами с б-амилазной активностью образовывать комплексы с йодом различной интенсивности окрашивания.

Амилолитическая активность характеризует способность амилолитических ферментов катализировать гидролиз крахмала до декстринов и выражается числом единиц указанных ферментов в 1 г препарата.

За единицу амилолитической активности (АС) принята способность фермента при определенных значениях температуры, рН и времени действия, катализировать до декстринов различной молекулярной массы 1 г крахмала, что составляет 30% крахмала, введенного в реакцию.[4]

Определение амилолитической активности ферменных препаратов Ликвозим Супра и Фунгамил.

Эксперимент проводился согласно методике описанной в ГОСТ 20264.4-89 при температуре 30°С для ферментного препарата Фунгамил и при температуре 70°С для ферментного препарата Ликвозим Супра.

1.Ферментные препараты

Фунгамил - это препарат б-амилазы грибного происхождения, который продуцируется штамом Aspergillus oryzae. Фунгамил гидролизует 1,4 б -глюкозидные связи амилозы и амилопектина крахмала с образованием мальтозы и декстринов.

Ликвозим Супра - это препарат б-амилазы бактериального происхождения, который продуцируется штаммом Вас. Subtilis. Ликвозим Супра гидролизует 1,4 б -глюкозидные связи амилозы и амилопектина крахмала с образованием мальтозы и декстринов.

2. Аппаратура, материалы, реактивы:

Весы лабораторные общего назначения не ниже второго класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Колориметр фотоэлектрический лабораторный (фотоэлектроколориметр) по ГОСТ 12083, обеспечивающий измерения в интервалах длин волн 434-450 нм и 630-670 нм с погрешностью ± 1% абс (по коэффициенту пропускания) или 0,01 Д (по оптической плотности) или спектрофотометр.

Прибор для измерения рН среды в диапазоне 0 - 14 с погрешностью ± 0,1 рН.

Термостат или ультратермостат, обеспечивающий температуру нагрева (30,0 ± 0,2)°С.

Баня водяная.

Мешалка магнитная.

Термометры по ГОСТ 215 с пределами измерений 0 - 100°С и ценой деления не более 0,01°С.

Холодильник бытовой.

Сухожаровой шкаф.

Стаканчики для взвешивания по ГОСТ 25336.

Стаканы вместимостью от 100 до 2000 типа Кн по ГОСТ 25336.

Колбы типа Кн вместимостью от 100 до 2000 мл по ГОСТ 25336.

Колбы мерные наливные 1 или 2 исполнения вместимостью 100, 200, 250 и 1000 см³ по ГОСТ 1770.

Колба мерная с притертой крышкой вместимостью 200 мл.

Бюкс с притертой крышкой,

Воронки типа В по ГОСТ 25336.

Пипетки 1,2 и 3-го исполнения вместимостью от 0,5 до 20 мл по ГОСТ 20292.

Пипетки автоматические вместимостью от 0,01 до 1 мл

Пробирки П1-21-200, или П1-16-150, или П2-19-180, или П2-16-1501(180) по ГОСТ 25336.

Бюретка типа №1; 1,2 или 3 го исполнения по ГОСТ 20292.

Эксикатор по ГОСТ 25336.

Секундомер по ГОСТ 5072.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Крахмал растворимый по ГОСТ 10163.

Кислота лимонная, раствор молярной концентрацией вещества эквивалента 0,1 моль/л .

Натрий фосфорнокислый вузамещенный 12-водный по ГОСТ 4172, раствор молярной концентрацией 1/15 моль/л .

Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4172, раствор молярной концентрации 1/15моль/л.

К-та соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрацией вещества эквивалента 0,1 моль/л . Приготовленный по ГОСТ 4232.

Йод.

Йодистый калий.

Вода дистиллированная.

Примечания:

1 Все реактивы должны быть квалификации ч.(чистый), х.ч.(химически чистый) или ч.д.а.(чистый для анализа).

2 Допускается использование импортной посуды и приборов с метрологическими характеристиками и реактивов с квалификацией не ниже отечественных.

Подготовка к анализу.

Приготовление растворов крахмала с концентрацией 1%(субстрата) (100 ± 0,01)г. 1,18 г. крахмала, взятого с учетом влажности помещения, засыпают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 25 мл дистиллированной воды, помещают в колбу в кипящую водяную баню не менее чем на 10-15минут, непрерывно перемешивая содержимое до полного растворения крахмала. После этого содержимое колбы охлаждают, добавляют 10 мл ацетатного буферного раствора (для препаратов грибного происхождения), фосфатного буферного раствора (для препаратов из дрожжевых микроорганизмов). Объем жидкости доводят до метки дистиллированной водой и содержимое колбы перемешивают, раствор должен быть прозрачный. Раствор крахмала готовят в день проведения анализа.

Приготовление фосфатного буферного раствора.

Смешивают растворы фосфорнокислого натрия и фосфорнокислого калия. Измеряют величину рН. В случае отклонения рН буфера от требуемого, соответствующими растворами доводят его до нормы.

Приготовление основного йода.

0,50 г йода и 5,00 г йодистого калия растворяют в бюксе с притертой крышкой в небольшом количестве воды, содержимое перемешивают на магнитной мешалке при плотно закрытой крышке бюксы.

Раствор после полного растворения йода переносят в мерную колбу с притертой крышкой вместимостью 200 мл и объем доводят дистиллированной водой до метки

Основной раствор йода хранят в течение одного месяца в склянке из темного стекла с притертой пробкой

Приготовление рабочего раствора йода

2 см основного раствора йода разводят раствором соляной кислоты с концентрацией 0.1 моль/л при анализе препаратов грибного происхождения и концентрацией 0.5 моль/л для препаратов бактериального происхождения с предполагаемой активностью больше 50 ед/мл в мерной колбе вместимостью 100 мл,перед употреблением рабочего раствора проверяют его оптическую плотность в диапазоне волн 434 - 450 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10мм.

Оптическая плотность рабочего раствора йода должна быть равна (0,220 ± 0,01) в случае отклонения в рабочий раствор добавляют несколько капель соляной кислоты или йода

Приготовление основного раствора очищенного ферментного
препарата 0,1 - 1,00 г исследуемого препарата (в зависимости от предполагаемой активности) растворяют в небольшом количестве воды, при необходимости тщательно растирая стеклянной палочкой, количество переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Препараты с нерастворимыми наполнителями фильтруют. Раствор хранят в течение суток при температуре от двух до 6°С.

Приготовление рабочего раствора очищенных ферментных препаратов.

Рабочий раствор готовят в соответствии с таблицей 1 из основного раствора для навески 0.1 г, разбавляя его дистиллированной водой так, что бы в 5 мл рабочего раствора содержалось масса ферментов, обеспечивающая в принятых условиях гидролиз крахмала от 20 до 60%.

Таблица 1. Приготовление рабочего раствора очищенных ферментных препаратов

Амилолитическая активность (АС) ед/г (предполагаемая)	масса ферментного препарата в 5 мл	Объем основного р-ра, необходимый для вторичного разбавления, см і	Общий объем р-ра, мл
от 20 до 80 включ	5	50	50
»80»150»	2	20	50
»150»300»	1	10	50
»300»700»	0,5	5	50
»700»1200»	0,25	10	200
»1200»2500»	0.125	5	200
»2500»5000	0,05	2	200
свыше 5000	0.025	1	200

Для анализа две параллельные навески препарата и из каждой делают одно разведение, которое анализирует не мене трех раз. Рабочий раствор ферментного препарата непосредственно перед определением

Приготовление основного раствора из воздушно-сухой культуры гриба 5г исследуемой воздушно сухой культуры гриба, предварительно растертой в ступке, переносят в коническую колбу вместимостью 25 мл, добавляют 90 мл дистиллированной воды и 10 мл ацетатного буфера буферного раствора с Ph4,7. Смесь выдерживают в течение одного часа в термостате при температуре (30.0±0.2) периодически перемешивая и затем фильтруют. Фильтрат используют в качестве основного раствора. Фильтрат хранят в течение суток при температуре от 2 до 6°С.

Приготовление рабочего раствора из воздушно сухой культуры гриба.

Рабочий раствор готовят из основного раствора, разбавляя его в соответствии с таблицей 2.

Таблица 2. Приготовление рабочего раствора из воздушно сухой культуры гриба.

Амилолитическая активность (АС) ед/г (предполагаемая)	масса ферментного препарата в 5 мл	объем основного р-ра, необходимый для вторичного разбавления, мл	Общий объем р-ра, мл
от 5 до 15 включ	37,5	15	100
»15»50»	10	4	100
»50»100»	2,5	1	100
»100»150»	1,25	1	200
»150»300»	0,625	0,5	200

Приготовление основного раствора культуральной жидкости бактериального происхождения: в мерную колбу вместимостью 100 мл наливают 90 мл дистиллированной воды и вносят 1см испытуемой культуральной жидкости, объем доводят до метки дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 100 мл в соответствии с таблицей 3.

Таблица3. Приготовление основного раствора культуральной жидкости бактериального происхождения

амилолитическая активность (АС) культуральной жидкости ед/г (предполагаемая)	объем культуральной жидкости в 5 мл раб. р-ра, мл.	объем основного р-ра, необходимый для вторичного разбавления, мл
от 10 до 25 включ	0,01	20
»25»50»	0,005	10
»50»75»	0,003-0,0035	6,0-7,0
»75»100»	0,0025	5
»100»125»	0,002	4
»125»150»	0,0015	3
свыше 150	0,00125	2,5

При анализе культур бактериального происхождения предполагаемой активностью 50 - 159 ед/см³ берут разведение фермента обеспечивающие гидролиз крахмала от 0,02 до 0,04 г.[4]

Проведение анализа. Берут две пробирки, наливают в каждую по 10 мл раствора крахмала (субстрата) и ставят в термостат или водяную баню с температурой (30 ± 0,2°С) на 5-10 минут, затем не вынимая пробирок из термостата наливают в первую 10 мл дистиллированной воды (контрольная пробирка), во вторую 10 мл рабочего раствора анализируемого продукта (опытная). Смеси быстро перемешивают в термостате в течение 10 мин.

Затем из каждой пробирки отбирают по 0,1 мл раствора, переносят в колбы с предварительно налитыми 10 мл рабочего раствора йода. Содержимое колб перемешивают, полученные растворы получают следующую окраску: контрольный раствор - синий цвет, опытный - фиолетовый различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизированного крахмала, через 5-10минут после смешивания определяют оптическую плотность растворов фотоэлектрическим колориметром в диапазоне длин волн 630-670 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм контрольным раствором является дистиллированная вода[4].

7.Результаты, обсуждения

7.1 Проведение анализа б-амилолитической активности ферментного препарата Фунгамил

Берут две пробирки, наливают в каждую по 10 мл раствора крахмала (субстрата) и ставят в термостат или водяную баню с температурой (30 ± 0,2°С) на 5-10 минут, затем, не вынимая пробирок из термостата, наливают в первую 10 мл дистиллированной воды (контрольная пробирка), во вторую 10 мл рабочего раствора анализируемого продукта (опытная). Смеси быстро перемешивают в термостате в течение 10 мин.

Затем из каждой пробирки отбирают по 0,1 мл раствора, переносят в колбы с предварительно налитыми 10 мл рабочего раствора йода. Содержимое колб перемешивают, полученные растворы получают следующую окраску: контрольный раствор - синий цвет, опытный - фиолетовый различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизированного крахмала, через 5-10минут после смешивания определяют оптическую плотность растворов фотоэлектрическим колориметром в диапазоне длин волн 630-670 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм контрольным раствором является дистиллированная вода[4].

Обработка результатов:

Массу прогидролизированного крахмала (m) в граммах вычисляют по формуле:

m = (D1 - D2) х 0,1 : D1

D1 - оптическая плотность контрольного раствора

D2 - оптическая плотность опытного раствора

0,1 - масса крахмала взятая для анализа, в граммах

Если масса прогидролизированного крахмала меньше 0,02 г или больше 0,07 г анализ повторяют, подбирая другое разведение.

Амилолитическую активность (АС) в единицах на грамм (ед/г) для препаратов грибного происхождения происхождения вычисляют по формуле:

АС = (7,264 х m - 0,03766) х 1000 : m1

m - масса прогидролизованного крахмала в граммах

m1 - масса ферментного препарата, содержащаяся в 5 мл рабочего раствора, в миллиграммах

7,264 - коэффициент расчетного уравнения, полученный при математической обработке экспериментальных данных зависимости массы прогидролизированного крахмала от массы фермента, взятого для анализа в пересчете на 1 час действия фермента.

0,03766 - коэффициент расчетного уравнения, полученный при математической обработке экспериментальных данных зависимости массы прогидролизированного крахмала от массы фермента, взятого для анализа в пересчете на 1 час действия фермента.

За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов определения активностей, полученных при анализе двух параллельных навесок препарата, отностительное допустимое расхождение между которыми не должно превышать 5%. Результат округляют до первого значения десятичного знака. Предел возможных значений относительной погрешности измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 составляет 5%.

Результаты анализа:

Таблица 4. Активность б-амилазы при температуре 30°С. рН=3,5

разведения	Показания ФЭК, л = 670нм	масса прогидролизованного крахмала, г (среднее значение)	активность	среднее арифметическое
k	0,805/ 0,815
1 : 30000	0,202	0,075062	3045530	3021317
1 : 30000	0,211	0,073951	2997104

Таблица 5. Активность б-амилазы при температуре 30°С. рН=4,0

разведения	Показания ФЭК, л = 670нм	масса прогидролизованного крахмала, г	активность	среднее арифметическое
k	0,827 / 0,818
1 : 40000	0,125	0,084812
1 : 40000	0,119	0,085541
1 : 60000	0,215	0,073876	5987709	6024779
1 : 60000	0,208	0,074727	6061849

Таблица 6. Активность б-амилазы при температуре 30° С. рН=5,1

разведения	Показания ФЭК, л = 670нм	масса прогидролизованного крахмала, г	активность	среднее арифметическое
k	0,736 / 0,87
1 : 80000	0,27	0,066376	7111935	6750092
1 : 80000	0,32	0,060149	6388248
1 : 100000	0,365	0,054545	7171164	7098795
1 : 100000	0,373	0,053549	7026426
1 : 120000	0,410	0,048941	7628420	7584999
1 : 120000	0,414	0,048443	7541578

Таблица 7. Активность б-амилазы при температуре 30° С. рН=6,0

разведения	Показания ФЭК, л = 670нм	масса прогидролизованного крахмала, г	активность	среднее арифметическое
k	0,779 / 0,747
1 : 60000	0,285	0,062647	5008932	5100327
1 : 60000	0,269	0,064744	5191722
1 : 80000	0,369	0,051638	5399046	5513290
1 : 80000	0,354	0,053604	5627534
1 : 100000	0,448	0,041284	5244598	5406444
1 : 100000	0,431	0,043512	5568289

Таблица 8. Активность б-амилазы при температуре 30° С. рН=6,5

разведения	Показания ФЭК, л = 670нм	масса прогидролизованного крахмала, г	активность	среднее арифметическое
k	0,805 / 0,774
1 : 60000	0,365	0,0537975	4237498	4320252
1 : 60000	0,35	0,0556962	4403007
1 : 80000	0,482	0,0389873	3928705	4281790
1: 80000	0,434	0,0450633	4634876
1 : 100000	0,487	0,0383544	4818932	5186729
1 : 100000	0,447	0,0434177	5554527

Таблица 9. Активность б-амилазы при температуре 30° С. рН=6,8

разведения	Показания ФЭК, л = 670нм	масса прогидролизованного крахмала, г	активность	среднее арифметическое
k	0,817 / 0,760
1 : 40000	0,396	0,049746	2589571
1 : 40000	0,386	0,051015	2663317	2626444
1 : 60000	0,516	0,034518	2556925
1 : 60000	0,505	0,035914	2678606	2617765
1 : 80000	0,605	0,023223	2096551
1 : 80000	0,559	0,029061	2775016	2435783

Таблица 10. Активность б-амилазы при температуре 30° С. рН=7,0

разведения	Показания ФЭК, л = 670нм	масса прогидролизованного крахмала, г	активность	среднее арифметическое
k	0,826 / 0,775
1 : 20000	0,342	0,05725	1512816	1556400
	0,318	0...

Подобные документы

• Отбор и изучение методик определения ионов Ва2+, SO42 - экспериментальное определение ионов Ва2+, SO42-

  Определение ионов Ва2+ с диметилсульфоназо-ДАЛ, с арсеназо III. Определение содержания ионов бария косвенным фотометрическим методом. Определение сульфатов кинетическим турбидиметрическим методом. Расчёт содержания ионов бария и сульфат-ионов в растворе.
  
  контрольная работа [21,4 K], добавлен 01.06.2015
  

• Химическое исследование снежного покрова в г. Рязани

  Принципы отбора проб. Источники поступления загрязнений. Азот и его соединения. Кальций, магний, хлор, сульфат-ион. Определение ионов: водорода, аммония, нитрит-ионов, хлорид-ионов, Ca2+. Результаты химического анализа снежного покрова в г. Рязань.
  
  курсовая работа [224,5 K], добавлен 15.03.2015
  

• Инновационный путь развития технологии создания новых лекарственных средств

  Методы молекулярного моделирования в основе направленного поиска лекарственных средств. Описание модели квантово-химическими расчетами. Определение биологической активности по модели. Характеристика биологической активности при помощи программы PASS.
  
  дипломная работа [5,8 M], добавлен 14.11.2010
  

• Методы определения активности катализаторов

  Возникновение и развитие катализа, его роль и значение, сферы использования. Факторы, определяющие скорость химического превращения. Методы определения активности катализаторов в определенном каталитическом процессе, их преимущества и недостатки.
  
  реферат [1,6 M], добавлен 14.04.2011
  

• Нейрогуморальная регуляция осмотического давления. Буферные растворы

  Регуляция осмотического давления в организме. Ионное произведение воды. Определение водородного показателя и молярной концентрации ионов водорода. Обеспечение буферных растворов. Значение активной реакции среды. Ферменты класса оксидоредуктаз, гликолиз.
  
  контрольная работа [1008,5 K], добавлен 08.07.2011
  

• Влияние добавок на устойчивость пероксида водорода в водных растворах

  Изучение влияния веществ на процесс разложения пероксида водорода в водных растворах. Воздействие различных химических катализаторов на скорость разложения пероксида водорода. Действие твина-80 на разложение пероксида водорода при различных температурах.
  
  реферат [562,1 K], добавлен 18.01.2011
  

• Производство аммиака

  Исследование свойств аммиака как нитрида водорода, бесцветного газа с резким запахом и изучение физико-химических основ его синтеза. Определение активности катализатора синтеза аммиака, расчет материального и теплового баланса цикла синтеза аммиака.
  
  курсовая работа [267,4 K], добавлен 27.07.2011
  

• Тест-системы для индикации ионов тяжёлых металлов в объектах окружающей среды

  Характеристика, классификация и химические основы тест-систем. Средства и приёмы анализа различных объектов окружающей среды с использованием тест-систем. Определение ионов кобальта колориметрическим методом из растворов, концентрации ионов меди.
  
  дипломная работа [304,6 K], добавлен 30.05.2007
  

• Изучение свойств водорода

  Положение водорода в периодической системе химических элементов и особенности строения его атома. Свойства газа, распространенность и нахождение в природе. Химические реакции получения водорода в промышленности и лабораторным путем и способы применения.
  
  презентация [2,2 M], добавлен 13.02.2011
  

• Структура молекулы воды и ее ионов

  Свойства воды как наиболее распространенного химического соединения. Структура молекулы воды и атома водорода. Анализ изменения свойств воды под воздействием различных факторов. Схема модели гидроксила, иона гидроксония и молекул перекиси водорода.
  
  реферат [347,0 K], добавлен 06.10.2010
  

• Определение ионов хлорида цинка, хлорида железа, хлорида натрия

  Инструментальные методы решения задач химического анализа. Определение ионов Zn2+, Fe3+, Na+: роданильный, пламенно-фотометрический методы; потенциометрическое, кондуктометрическое титрование; люминесцентный анализ. Нефелометрическое определение Cl-ионов.
  
  курсовая работа [120,7 K], добавлен 08.07.2015
  

• Изучение физико-химических свойств сорбентов на основе природных цеолитов

  Модификация природных цеолитов нерастворимыми комплексами и органическими соединениями. Реакции ионного обмена на цеолитах. Определение статической обменной емкости сильнокислого катионита, сорбционной способности ионов при различной кислотности.
  
  курсовая работа [123,4 K], добавлен 15.10.2012
  

• Кислотно-основное титрование (нейтрализация)

  Возможность применения кислотно-основного титрования. Постепенное изменение концентрации ионов водорода. Индикаторы, обладающие свойством отдавать протоны. Проведение титрования сильных кислот сильным основанием, слабых кислот сильным основанием.
  
  реферат [54,3 K], добавлен 04.04.2014
  

• Активность. Порядок реакций

  Связи между активностями компонентов в растворе. Уравнение Дюгема-Маргулиса. Методы определения активности и порядка химической реакции. Необратимые реакции первого, второго и третьего порядков. Уравнение стандартного состояния для растворённого вещества.
  
  лекция [425,7 K], добавлен 28.02.2009
  

• Изучение процесса восстановления серебра в водных растворах

  Особенности получения наночастиц серебра методом химического восстановления в растворах. Принцип радиационно-химического восстановления ионов металлов в водных растворах. Образование золей металла. Изучение влияния рН на величину плазмонного пика.
  
  курсовая работа [270,7 K], добавлен 11.12.2008
  

• Изучение основных закономерностей протекания химических реакций

  Рассмотрение превращения энергии (выделение, поглощение), тепловых эффектов, скорости протекания химических гомогенных и гетерогенных реакций. Определение зависимости скорости взаимодействия веществ (молекул, ионов) от их концентрации и температуры.
  
  реферат [26,7 K], добавлен 27.02.2010
  

• Протонирование, гидратация и фотокаталитическая активность слоистого перовскитоподобного оксида K2La2Ti3O10

  Структура слоистых перовскитоподобных оксидов. Факторы, влияющие на процесс фотокатализа. Калибровка стеклянного электрода. Выбор оптимальной скорости добавления кислоты. Определение фотокаталитической активности. Сканирующая электронная микроскопия.
  
  дипломная работа [1,8 M], добавлен 28.07.2014
  

• Влияние добавок катионных ядов на каталитическую активность скелетного никеля в реакциях жидкофазной гидрогенизации малеата натрия

  Исследование характера дезактивации скелетного никелевого катализатора катионными каталитическими ядами (нитратом ртути(II) и нитратом свинца(II)) и установление возможной обратимости данного процесса в растворах гидроксида натрия различной концентрации.
  
  магистерская работа [778,4 K], добавлен 16.05.2015
  

• Протонирование, гидратация и фотокаталитическая активность слоистого перовскитоподобного оксида K2La2Ti3O10

  Исследование устойчивости слоистого оксида K2La2Ti3O10 к замещению межслоевых катионов калия на протоны в водном растворе. Определение диапазона pH, в котором проходит обмен K+ на H+ , фотокаталитической активности образцов с разной степенью замещения.
  
  дипломная работа [7,1 M], добавлен 28.07.2014
  

• Ингибирование ферментативной активности

  Характеристика обратимого (конкурентного, неконкурентного и бесконкурентного), необратимого (формирование стабильного комплекса ингибитора с ферментом) и аллостерического (конформационные изменения в молекуле фермента) ингибирования ферментной активности.
  
  реферат [372,9 K], добавлен 31.05.2010
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам