Анализ химического состава лекарственных растительных средств: плодов амми большой, псоралеи костянковой и пастернака посевного

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность темы. В последние десятилетия отмечается значительный рост числа дерматологических заболеваний, среди которых особое место занимают витилиго, псориаз. По данным ВОЗ больные витилиго составляют от 0,5 до 4 % всего населения земного шара, а это около 40 млн. человек. Заболеваемость не зависит от пола. Псориазом страдают 2-4 % от общей численности населения. В России этот показатель также варьирует в зависимости от территории -- от 0,72 до 11,8 %. Заболевание может начаться в любом возрасте, но чаще всего бляшки появляются в период 15-25 лет. Каждый третий пациент указывает на первые симптомы до 20-летнего возраста.

Причинами кожных заболеваний служат острые и хронические инфекции, травмы, снижение уровня жизни в сочетании с ухудшающейся экологической обстановкой и неблагоприятными социальными факторами, а также применение в медицинской практике антибиотиков широкого спектра действия. Множество факторов, способствующих возникновению патологий кожи, обусловливает необходимость комплексного лечения, требующего длительного времени и достаточно дорогих синтетических препаратов, обладающих не только терапевтической активностью, но и высокой токсичностью, что ограничивает возможности их приема при продолжительном лечении. Следовательно, многие пациенты, страдающие этими заболеваниями, не могут получить адекватной терапии.

В связи с этим, заметно возрастает спрос на лекарственные средства растительного происхождения, поскольку они являются менее дорогостоящими по сравнению с продуктами химического синтеза и имеют ряд преимуществ (оказывают терапевтический эффект с наименьшим количеством противопоказаний для пациента, имеют низкую токсичность), что позволяет проводить лечение этими препаратами в различных возрастных группах в течение длительного времени.

Однако, ассортимент растительных лекарственных средств, для лечения дерматологических заболеваний в настоящее время весьма ограничен.

Перспективными, в этом отношении можно рассматривать плоды Амми большой - Бmmi mбjus, семейства Сельдерейные - Арiасеае, плоды псоралеи костянковой - Fructus Psoraleae, семейство бобовые - Fabaecae. Применение в официальной и народной медицине России, а также наличие достаточной отечественной сырьевой базы для промышленных заготовок сырья этих культивируемых растений представляет особый интерес для расширения номенклатуры лекарственных средств.

Цель и задачи. Целью данной работы является комплексное изучение научной литературы по химическому составу ЛРС (плодов амми большой, плодов псоралеи костянковой, плодов пастернака посевного) и методам контроля их качества.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

* провести углубленное изучение диагностических признаков плодов с использованием макроскопического и микроскопического анализа по сведениям научной литературы.

* провести сравнительный анализ современных физико-химических методов анализа исследовать химический состав плодов на присутствие и содержание различных групп биологически активных веществ (БАВ) в том числе кумаринов, фурокумаринов.

* изучить оптимальные условия для разработки методик количественного определения фурокумаринов методом ВЭЖХ, ГЖХ, ТСХ

* предложить методику количественного определения суммы фурокумаринов применить к оценке качества субстанции.

1. Открытие кумаринов. Изучение фармакологического действия кумаринов. Фурокумарины

Свое название кумарины получили от народного названия юн американского дерева тонка душистого (Dipteriх оdorаtа, сем. Fаbасеае)- кумарун, из плодов которого в 1820 г. Фогель впервые выделил кумарин.

К началу XX в. было выделено 26 соединений кумаринов. С развитием физико-химических методов анализа развивалась и химия кумаринов.

В 30-40-х годах 20 века центром по изучению кумаринов считалась Вена (Австрия), где под руководством Е. Шпета было проведено более 50 фундаментальных работ по выделению, изучению и разработке методов анализа кумаринов.

Начиная с 50-х годов, крупные исследования по изучению кумаринов развернулись в США, Египте, Италии.

Структура кумаринов впервые была установлена А.Г. Перкиным в 1877 году. Систематические изучения кумаринов в нашей стране начаты в 1946 году в Ботническом институте им. Комарова (г. Санкт-Петербург) под руководством профессора Т.А. Кузнецовой, написана монография «Природные кумарины и фурокумарины». В ВИЛРе известна школа Г.К. Никонова, исследования которого направлены на поиск веществ с высокой биологической активностью и создание на их основе лекарственных препаратов.

Фотосенсибилизирующее действие веществ на клетки организмов было описано в 1900 году фотобиологом O. Raab и соавторами. В 1969 году дерматологи F. A. Ive, I. A. Magnus и J. Wilson описали клинический случай фотосенсибилизации у 10-летнего мальчика с лимфомой. Эти первые наблюдения дали предпосылки для дальнейшего активного изучения фотосенсибилизации под действием лекарственных препаратов.

Реакции кожи на действие света при сочетанном приеме лекарственных препаратов, т.е. фотосенсибилизирующее действие можно разделить на две группы симптомов:

1) фототоксические;

2) фотоаллергические.

Кроме того, доказана роль фотосенсибилизации в развитии лихеноидного кератоза, псевдопорфирии, подострой красной эритемы, пеллагры, индуцированной лекарственными препаратами. В литературе отмечается, что фототоксических агентов гораздо больше, чем фотоаллергических. Фотосенсибилизация в данном случае рассматривается как побочный эффект, а лекарственные препараты, способные ее индуцировать, называют фотосенсибилизирующими веществами (ФВ). Термин «фотосенсибилизирующее вещество» охватывает обширную группу лекарственных веществ, косметических препаратов, продуктов питания.

Фотосенсибилизирующие вещества (гр. phos, photos свет + лат. sensibilis чувствительный) -- лекарственные средства, вызывающие при резорбтивном или местном действии повышение чувствительности кожи к воздействию солнечных или искусственных ультрафиолетовых лучей.

Доброкачественный лихеноидный кератоз (син.: солитарный красный плоский лишай; базосквамозная акантома; lichen planuslike keratosis) -- солитарное доброкачественное поражение кожи, ассоциированное с выраженными воспалительными изменениями, напоминающими по внешнему виду красный плоский лишай.

Псевдопорфирия -- это синдром, имеющий клиническую и гистологическую картину поздней кожной порфирии в отсутствие нарушений обмена порфиринов. Причиной служат лекарственные средства (фуросемид, тетрациклины, налидиксовая кислота, дапсон, напроксен, пиридоксин и др.) и гемодиализ (в этом случае концентрации порфиринов могут быть слегка повышены).

Исторически с первыми ФВ человечество столкнулось еще во времена использования растительного лекарственного сырья. К группе растительных ФВ относятся некоторые препараты растительного происхождения -- бероксан, аммифурин, псорален и псоберан, которые используются для фотосенсибилизации с лечебной целью при терапии витилиго, гнездной плешивости и псориаза.

Как известно, их получают из лекарственных растений -- листьев инжира, травы амми большой и псоралии костянковой (рис.1-3), содержащих различные фурокумарины (ксантотоксин, бергаптен, псорален и др.).

Например, препарат псоберан (получают из листьев инжира) содержит смесь фурокумаринов и обладает фотосенсибилизирующей способностью (повышает чувствительность кожи к ультрафиолетовым лучам), усиливая пигментообразование в коже. При сборе листьев и плодов инжира в жаркую солнечную погоду нужно закрывать участки кожи, контактирующие с растением, чтобы не получить ожоги.

УФ-волны являются наиболее активным фактором солнечных ожогов и рака кожи. Фототоксическое действие для большинства ФВ коррелирует со способностью их молекул поглощать в ультрафиолетовой области спектра. Ультрафиолетовое излучение в диапазоне УФ-А с длиной волны 320-400 нм, а для некоторых соединений и в видимой области спектра с большей вероятностью вызывает реакции фотосенсибилизации, чем УФ-В (290-320 нм).

При обращении пациентов в аптеку с жалобами на фоточувствительность зачастую трудно отличить фототоксическую реакцию от фотоаллергической. Однако они обладают рядом отличительных характеристик. Для этого необходимо учитывать не только видимые проявления, но и выяснить у пациента лекарственный анамнез (какие лекарственные препараты принимает или принимал ранее).

Реакции, связанные с повышением светочувствительности кожи, по данным литературы отмечаются около у 1 % пациентов. Однако, отпуская подобные средства пациентам в летний период, следует напомнить о мерах предосторожности, связанных с их приемом.

Фотосенсибилизирующее действие способны оказывать не только лекарственные препараты, но и некоторые продукты, которые содержат вещества, способствующие повышению светочувствительности:

· пищевые продукты, содержащие фурокумарины и родственные им вещества (например, инжир, грейпфрут и некоторые другие цитрусовые, корень петрушки, укроп);

· овощи и фрукты, богатые каротиноидами (морковь, пастернак);

· некоторые лекарственные официнальные и неофицинальные растения, особенно из семейства рутовых и зонтичных (дудник лекарственный, морковь дикая, амми зубная, листья инжира, трава донника лекарственного, трава клевера, гинко белоба, зеленая пшеница, ячмень, горчица,лук зеленый,чеснок, агава).

Впервые в 1991 году предупредили о возможном негативном эффекте сочетания цитрусовых и некоторых лекарственных препаратов доктор Девид Бейли совместно с сотрудниками института Лоусона (Lawson Health Research Institute).

Однако именно группа учёных из университета Северной Каролины под руководством Паула Уоткинса в 2006г. определила, что грейпфрутовый сок содержит вещества фуранокумарины, которые подавляют действие фермента кишечника CYP 3A.

Позже в 2008 г. та же группа канадских ученых под руководством Девида Бейли выявили 17 лекарственных препаратов, которые не сочетаемы с фуранокумаринами. За последние 4 года количество лекарств увеличилось до 85. Самое страшное, что 43 препарата из них могут привести к летальному исходу.

Также следует помнить, что фотосенсибилизирующим действием обладают и растения, содержащие антрагликозиды, например зверобой продырявленный. Поэтому летом следует воздержаться от их применения или применять с осторожностью.

Кроме того, способствует фотосенсибилизации и употребление куриных яиц. Конечно, такой широкий перечень продуктов не следует исключать из рациона в летний период, однако необходимо учитывать этот фактор при приеме препаратов, содержащих ФВ, либо при наличии хронических кожных заболеваний (экземы, псориаза, аллергического дерматита, системной красной волчанки).

2. Классификация

Кумарины - фенольные соединения с общей формулой С6 - С3, в основе которых лежит бензо-б-пирона (цис-орто-коричная кислота).

Химическая классификация кумаринов предложена в 1938 г. Е.Шпетом дополнена отечественными учеными Г.К. Никоновым и Г.А. Кузнецовой.

В зависимости от своей химической структуры, все кумарины делят на 7 групп:

Собственно кумарины: кумарин, изокумарин, дигидрокумарин и их гликозиды:

Рис. 1. Кумарин

2. Окси-, метокси- (алкокси-) и метилендиоксикумарины:

Рис. 2. Умбеллиферон

Эти соединения широко распространены в растениях семейства сельдерейных, рутовых (с.Apiaceae, Fabaceae, c. Hippocastanaceae: (дягель лекарственный, пастернак посевной, плоды и семена обладает противоопухолевой амми большая, каштана конского, псоралея костянковая).

3. Фурокумарины, или кумарон-альфа-пироны.

Образуются в результате конденсации кольца фурана и ядра кумарина. В зависимости от места конденсации подразделяются на группы:

А) производные псоралена, т.е. фурокумарины, фурановое ядро которых сконденсировано с кумарином в 6,7-положении (псорален, ксантотоксин, бергаптен, изопимпинеллин);

Рис. 3. фуро- 2',3' - 6, 7-кумарин или 6, 7-фурокумарин (Псорален)

Содержится в плодах псоралеи костянковой (Psoralea drupacea, c. Fabaceae) и в листьях инжира, с. тутовых (Ficus carica, с. Moraceae) К производным псоралена относятся его метоксипроизводные:

Рис. 4. Ксантотоксин

Рис. 5. Изопимпинеллин

Ксантотоксин, бергаптен, изопимпинеллин выделены из плодов амми большой (Ammi major,) и пастернака посевного (Pastinaca sativa); пеуцеданин - из корней горичника Мориссона (Peucedanum morisonii,) c. Apiaceae

Б) производные ангелицина, т.е. фурокумарина, фурановое ядро которого сконденсировано с кумарином в 7,8-положении : например, ангелицин, атамантин

Рис. 6. 7,8-фурокумарин или фуро-2131:7,8-кумарин (ангелицин)

Содержится в плодах псоралеи костянковой (Psoralea drupacea, c. Fabaceae) и пастернака посевного (Pastinaca sativa, c. Apiaceae)

4. Пиранокумарины, или хроменопироны.

Образованы в результате конденсации кольца пирана и ядра кумарина.

В зависимости от места конденсации подразделяются на 3 группы:

а) производные 5,6-пиранокумарина;

б) производные 6,7-пиранокумарина;

в) производные 7,8-пиранокумарина.

Рис. 7. Виснадин (2,21-диметил-31-бутирил-41-ацетил-7,8-пиранокумарин)

Содержится в корневищах и корнях вздутоплодника сибирского (Phlojodicarus sibiricus) и укропа огородного (Anethum graveolens) c. Apiaceae.

5. 3,4-бензокумарины - образуются в результате конденсации в положении 3,4 бензольного кольца и ядра кумарина.

Соединения, образовавшиеся в результате конденсации кумарина с бензольным кольцом в положении 3,4, например, эллаговая кислота

Занимает промежуточное положение между кумаринами и оксибензойными кислотами.

Эллаговая кислота является структурным элементом гидролзуемых дубильных веществ.

Содержится в растениях сем. розоцветных (кровохлебка лекарственная - Sanguisorba officinalis; лапчатка прямостоячая - Potentilla erecta)

Рис. 8. Эллаговая кислота

6. Бензофуранокумарины или Куместаны (куместролы).

Кумарины, содержащие систему бензофурана, сконденсированную с кумарином в 3,4-положениях:

Рис. 9. Куместрол

Куместролы выделены из различных видов клевера сем. Бобовых.

7. Некоторые другие более сложные конденсированные производные кумарина (афлатоксин), пока в медицине не используются.

3. Физико-химические свойства

Выделенные в индивидуальном состоянии кумарины - кристаллические вещества или аморфные, бесцветные или слегка желтоватые. Кумарины хорошо растворимы в органических растворителях: хлороформе, этиловом эфире, этиловом спирте, жирах и жирных маслах. В воде кумарины, в большинстве случаев, нерастворимы. Гликозиды растворяются, как правило, в воде и практически нерастворимы в органических растворителях. Кумарины хорошо растворяются в водных растворителях щелочей (особенно при нагревании) за счет образования солей оксикоричных кислот. При нагревании до 100 градусов кумарины возгоняться в виде игольчатых кристаллов.

Многие кумарины проявляют очень характерную флуоресценцию при УФ возбуждении в нейтральных спиртовых растворах, в растворах щелочей и концентрированной серной кислоте в видимой области спектра. Особенно этим отличаются производные умбеллиферона, проявляя ярко-голубую флуоресценцию. В щелочной среде флуоресценция наиболее интенсивная, при подкислении флуоресценция становится менее интенсивной и характер флуоресценции меняется.

В электронных спектрах поглощения кумаринов наблюдаются характеристические частоты. В области выше 200 нм имеется две полосы поглощения - соответственно 210-270 и 290-350 нм. Характеристичность этих спектров поглощения обусловлена хромоформом, включающий в себя сопряженные между собой б-пироновое и бензольное кольцо.

Кумарины имеют характерные спектры поглощения в инфракрасной области. В кумаринах, как и в б-пиронах, плюсы валентных колебаний карбонильной группы лежат в области 1750-1700 см в минус первой степени, обусловленные колебаниями двойных ароматических связей.

Наряду с УФ и ИК спектроскопией огромное значение за последние годы приобрели ЯМР спектры высокого разрешения. ЯМР спектроскопия, как и другие физические методы исследования, используется в структурно-химических целях и базируется на корреляциях между спектрами и строением, установленным на соединениях с известной структурой. Анализ спектров позволяет определить тип замещения кумаринового ядра. (рис.6)Масс-спектры возникают вследствие диссоциативной ионизации при бомбардировку молекул электронами. При бомбардировке химических соединений электронами с энергией, достаточной для ионизации этих соединений, т.е. лишь немного превышающей ионизационный потенциал, в спектрах наблюдаются молекулярные ионы.

С увеличением энергии электронов возрастает степень ионизации и молекулярные ионы, приобретая избыток энергии, могут образовывать осколочные ионы. Метод масс-спектроскопии применяется для количественного и качественного анализа и установления строения органических соединений. Установлено, что не у всех кумариновых соединений хорошо проявляется молекулярный ион. Масс-спектры кумаринов характеризуются интенсивным пиком молекулярного иона (М), а также пиками М = 28 и М =2*28, отвечающими однократной и двукратной потере СО.

Фрагментация кумарина под действием электронного удара может быть представлена следующей схемой:

Рис. 10

В циклической системе кумарина, состоящего из бензольного и гетероциклического б-пиронового цикла, заложены возможности для разнообразных химических реакций. Одним из самых характерных свойств кумаринов как лактонов является их специфическое отношение к щелочи (с кислотами и аммиаком кумарины не взаимодействуют). При действии горячей разбавленной щелочи кумарины медленно гидролизуются, при этом образуются желтые растворы солей кумариновой кислоты (цис-, орто-оксикоричной). При подкислении щелочных растворов или насыщении их СО2 регенерируются кумарины в неизменном состоянии:

Рис. 11. Белый осадок

При взаимодействии солей диазония с кумаринами в слабощелочной среде группа ArNa ступает в 6-положениекумариновой системы, т.е. в пара-положение к фенольному гидроксилу цис-, орто-оксикоричной кислоты образуя оранжевую или фиолетовую окраску:

Рис. 12

Некоторые кумарины димеризуются под действием ультрафиолетового света, образуя циклобутановые структуры по следующему типу:

Рис. 13

4. Методы выделения

Для выделения различных по строению и свойствам производных кумарина из растительного сырья используют преимущественно органические растворители: метиловый и этиловый спирты, хлороформ, этиловый и петролейные эфиры.

Наиболее исчерпывающая экстракция кумаринов как свободных, так и связанных (гликозидов) достигается этиловым спиртом. [3] Получаемый после отгонки спирта густой экстракт чаще всего последовательно обрабатывается растворителями: хлороформом, этиловым эфиром и др.[2] Агликоны из смеси возможно отделить с помощью неполярных растворителей (хлороформ, бензол, эфиры).

Часто сырье предварительно очищают от липофильных веществ петролейным эфиром, а затем кумарины экстрагируют хлороформом, этиловым или метиловым спиртами.

Кумарины как малополярные ненасыщенные соединения хорошо сорбируются гидрофильными сорбентами, что также используется для очистки и разделения смеси кумаринов на отдельные компоненты. Для этой цели применяют алюминия оксид, силикагель, реже полиамид и сефадексы.

Для очистки кумаринов от сопутствующих веществ возможно использование метода омыления.

С целью отделения кумаринов от сопутствующих веществ часто сконцентрированный экстракт из растительного сырья обрабатывают 0,5 %-ным водным раствором КОН для удаления кислых и фенольных компонентов. Затем экстракт обрабатывается 5 %-ным водно-спиртовым раствором КОН в течение 1/2--1 ч. При этом кумарины образуют соли кумариновых кислот. Одновременно происходят и другие реакции, а именно: омыление жиров и других сложных эфиров. Индифферентные составные части экстракта (стерины, спирты, углеводороды и др.) удаляются обработкой этиловым эфиром щелочного раствора, разбавленного предварительно 6--8- кратным количеством воды. Водно-щелочной раствор подкисляется разбавленной НС1. При этом освобождаются органические кислоты, а присутствующие кумариновые кислоты переходят с отщеплением элементов воды в кумарины. Смесь кислот и кумаринов извлекается этиловым эфиром (многократное повторное встряхивание). Кислые составные части из лактонной фракции можно удалить добавлением по каплям 0,5 %-ной водной щелочи в раствор, в которые они переходят, в то время как нейтральные кумарины как более устойчивые по отношению к разбавленной щелочи остаются в эти ловом эфире.

Поэтапно выделения кумаринов выглядит так:

1. Экстракцию ЛРС органическим растворителем (эфиром) получают сумму кумаринов и балластных веществ.

2. Эфирный слой отделяют, отработанное сырьё выбрасывают.

3. Полученное эфирное извлечение обрабатывают 0,5% водным раствором КОН для очистки от фенолов и кислот.

4. Затем это же извлечение обрабатывают 10% спиртовым раствором КОН. Происходит разрыв лактонного кольца и образуются кумарины, которые переходят в водный слой. А в органическом растворителе остаются балластные вещества (смолы, стерины, спирты), органическую фазу выбрасывают.

5. Водно-щелочной слой подкисляют разбавленной НСl. Происходит замыкание лактонного кольца, образуются кумарины, которые экстрагируют органическим растворителем.

6. Органический слой отгоняют - получают сумму кумаринов, которую разделяют хроматографически.

Существенными недостатками этого метода являются возможность образования вторичных продуктов распада кумаринов, дегидратации и изомеризации некоторых оксикумаринов.

Дальнейшие операции, как правило, направлены на разделение суммы кумаринов и выделение индивидуальных соединений. В ранних исследованиях использовались кристаллизация, фракционная перегонка или сублимация в высоком вакууме. Однако многие кумарины обладают сходной растворимостью в органических растворителях, поэтому даже многократная перекристаллизация не позволяет достичь надежного результата.

Поэтому дальнейшее развитие химии кумаринов привело к использованию для этих целей различных видов хроматографии, лишенных вышеуказанных недостатков.

В качестве сорбента при хроматографировании кумаринов чаще всего используются оксид алюминия и силикагель. Кумарины хорошо элюируются с колонки смесью петролейного эфира с хлороформом, бензолом, смесью бензола с этилацетатом, смесью бензола с метиловым спиртом (в различных соотношениях) и др. Эфирные масла, глицериды, стероиды и тритерпены обычно появляются в первых фракциях элюата, затем следуют кумарины. Кумарины на колонке и в элюатах обнаруживаются по флуоресценции в УФ свете. Проведение хроматографического разделения кумаринов на колонке облегчается применением бумажной и тонкослойной хроматографии для качественного анализа элюатов. Методы бумажной и тонкослойной хроматографии позволяют быстро устанавливать однородность элюата, обнаружив даже незначительные количества примесей.

Заключение

фармакологический кумарин фотосенсибилизирующий лекарственный

Информационно-аналитическими исследованиями показана необходимость проведения всесторонних исследований химического состава плодов амми большой, псоралеи костянковой, пастернака посевного и разработки современных методик идентификации и количественного определения фурокумаринов и кумаринов.

На основании макро- и микроскопического анализа установлены диагностически значимые признаки плодов амми большой, псоралеи костянковой, пастернака посевного.

Методом ВЭЖХ, ГЖХ, ТСХ с использованием достоверных образцов охарактеризован качественный состав и количественное содержание суммы основных фурокумаринов (псорален, бергаптен, изопимпинеллин, ксантотоксин) и количественное содержание кумаринов в плодах амми большой, псоралеи костянковой, пастернака посевного.

ТСХ методом охарактеризован компонентный состав кумаринов.

С учетом современных требований к растительному сырью, разработаны критерии подлинности и нормы содержания БАВ в плодах амми большой. Подобраны условия анализа фурокумаринов в растительном сырье, которые позволили разработать сквозную методику стандартизации от растительного сырья к лекарственному средству.

Список литературы

Журнал «Провизор», 2010 г., выпуск № 13.

Лекарственные растения и лекарственное растительное сырье, содержащие флавоноиды, кумарины, хромоны: Учеб.-методич. пособие для вузов / Коренская Н.М., Ивановская Н.П., Измалкова И.Е. - В.: Полиграфический центр Воронежского государственного университета, 2007 - 80с.

Фармакогнозия. Электронное учебное пособие / Е.И. Гришина, И.С. Погодин, Е.А. Лукша - Омск, 2008 - 187с.

Ложкин, А.В. Природные кумарины: методы выделения и анализа /А.В. Ложкин, Е.И. Сакалян // Хим. - фарм. журн. - т.40, №6 - 2006 - с 47 - 57.

Арзамасцев, А.П. Фармацевтическая химия - М.:Гэотар-мед, 2004. - 635с.

Разработка методики количественного определения ксантотоксина в плодах Амми большой/ О.Б. Николаева, Т.Б. Шемерянкина, Т.А. Сокольская и др. // Тезисы докладов VII Международного симпозиума по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты- М., 2009. - С.191

Хроматографические методы анализа. Учеб.-мет. пособие / Гиндуллина Т.М., Дубова Н.М. - Т.: Томский политехнический университет, 2010 - 82с.

Коноплёва, М.М. Фармакогнозия: Природные биологически активные вещества - Витебск 2007. - 272с.

Размещено на Allbest.ru