Визначення залежності дії ферментів від pH середовища

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Визначення залежності дії ферментів від pH середовища

1. Загальна характеристика ферментів

фермент крохмаль харчовий

Ферменти або ензими - органічні каталізатори білкової або РНК природи, які утворюються в живих організмах, здатних прискорювати перебіг хімічних реакцій в організмі. Ферменти каталізують більшість хімічних реакцій, які відбуваються у живих організмах. Вони можуть мати від одного до кількох поліпептидних ланцюгів - субодиниць. Кожен із ферментів має один або більше активних центрів, які визначають специфічність хімічної реакції, що каталізується даним ферментом. Крім активного центру деякі ферменти мають алостеричний центр, який регулює роботу активного центру. Ферментативна реакція також може регулюватися іншими молекулами, як білкової природи, так й іншими - активаторами та інгібіторами.

Всі біохімічні реакції відбуваються за участю ферментів за нормальним тиском, температурою, у слабокислому, нейтральному чи слаболужному середовищі.

Терміни «фермент» і «ензим» можна використовувати як синоніми. Але наука про ферменти називається ензимологією, а не ферментологією (ймовірно щоб не змішувати коріння слів латинської і грецької мов)

У багатьох випадках фермент не просто каталізує (прискорює) реакцію, а й уможливлює її, оскільки без участі каталізатора ця реакція взагалі не відбувається.

Ферментативні процеси суттєві відрізняються від звичайних хімічний реакцій. Їх швидкість у … разів перевищує швидкість реакцій, що відбуваються без каталізатора. Вони здійснюються за помірних температур (20…60°С), нормального тиску та в широкому діапазоні рН середовища.

Молекула ферменту після завершення реакції регенерується і вступає у взаємодію з новою молекулою субстрату. Кількість молекул субстрату, перетворюваних за 1 хв однією молекулою ферменту, становить ….

Ферменти характеризуються високою специфічністю. Ця властивість різко відрізняє їх від неорганічних каталізаторів, кожен з яких може каталізувати перетворення тисяч сполук.

У зв'язку з високою субстратною та стереохімічною селективністю ферментів у живій клітині може відбуватись одночасно безліч паралельних і послідовних реакцій. Це стає можливим завдяки тому, що ферменти локалізовані на мембранах і органелах у різних компартментах (свого роду «відсіках») клітини.

Термін «фермент» був запропонований у 17 столітті хіміком ван Гельмонтом для опису механізмів травлення. В кінці 18 - на початку 19 століття вже було відомо, що м'ясо перетравлюється шлунковим соком, а крохмаль перетворюється на цукор під дією слини. Проте механізм цих явищ був ще невідомий. В 19 столітті Луї Пастер, вивчаючи перетворення вуглеводів в етиловий спирт під дією дріжджів, дійшов до висновку, що цей процес (бродіння) каталізується якоюсь «життєвою силою», що знаходиться в дріжджовихклітинах.

Понад сто років тому терміни «фермент» і «ензим» відображали різні погляди Луї Пастера з одного боку та Марселена Бертло і Юстуса Лібіха з іншого в теоретичній суперечці про природу спиртового бродіння. Власне «ферментами» (від лат. fermentum - «закваска») називали «організовані ферменти» (тобто саме живі мікроорганізми), а термін «ензим» (від грец.?н- - «в-» і жэмз - «дріжджі», «закваска»), запропонований 1876 року В. Кюне для «неорганізованих ферментів», що секретуються клітинами, наприклад, до шлунку (пепсин) або кишечника (трипсин, амілаза). За два роки по смерті Пастера 1897 року Едуард Бюхнер опублікував роботу «Спиртове бродіння без дріжджових клітин», в якій експериментально показав, що екстракт клітин дріжджів здійснює спиртове бродіння так само, як і незруйновані дріжджові клітини 1907 року за цю роботу він був удостоєний Нобелівської премії.

2. Функції ферментів

Ферменти є біологічними каталізаторами, вони наявні в усіх живих клітинах і сприяють перетворенню одних речовин (субстратів) на інші (продукти). Ферменти виступають в ролі каталізаторів практично в усіх біохімічних реакціях, що відбуваються в живих організмах - ними каталізується близько 4000 окремих біореакцій. Ферменти грають найважливішу роль у всіх процесах життєдіяльності, скеровуючи та регулюючи обмін речовин організму. Для ферментів характерним є те, що їх синтез та каталітична активність контролюється на генетичному рівні, а також за участю низькомолекулярних сполук-субстратів або продуктів реакції.

Подібно до всіх каталізаторів, ферменти прискорюють як пряму, так і зворотну реакцію, знижуючи енергію активації процесу. Хімічна рівновага при цьому не зсувається ні в прямий, ні в зворотний бік. Відмінність ферментів від небілкових каталізаторів полягає у їхній високій специфічності - константа дисоціації деяких субстратів з білком-ферментом може досягати менш ніж 10?10 моль/л.

Ферменти широко використовуються і в народному господарстві - у харчовій, текстильній промисловості, у фармакології.

3. Властивості ферментів

1. Висока каталітичн активність;

2. Специфічність дії ферментів. Вона буває:

абсолютна - характерна для ферментів, що каналізують лише одну реакцію і діють на один точно визначений субстрат. Наприклад, уреаза діє лише на сечовину, аргіназа - на аргінін;

групова - характерна для ферментів, що діють на різні субстрати, які мають однаковий тип зв'язку, тобто це специфічність ферментів до певного типу реакцій. Так, пепсин розщеплює білки за місцем пептидного зв'язку, естерази каналізують гідроліз сполук за місцем складно ефірного зв'язку;

3. Стереохімічна - фермент діє лише на один із оптичних ізомерів. Так, в-D-глюкозооксидаза діє лише на в-D-глюкозу.

4. Лабільність ферментів:

а) залежність дії ферментів від температури. Для кожного ферменту існує оптимальне значення температури.

За цією формулою можна визначити концентрацію активних молекул ферменту, і ця концентрація буде залежати від температури.

А' - концентрація активних молекул фермента;

А - загальна концентрація молекул ферменту;

t - абсолютна температура;

м - величина, яка характеризує дані молекули, які приймають участь у реакції;

е - основа натуральних логарифмів.

б) залежність дії ферментів від рН середовища. Для кожного ферменту існує оптимальне значення рН. В основному для більшості ферментів оптимальним значенням рН є нейтральне середовище (рН=6 - 8), але є виключення - пепсин, для цього ферменту оптимальне значення рН=2, тобто кисле середовище.

При різному значенні рН відбувається різна іонізація молекули ферменту. Також відбувається різна іонізація активного центру, і це впливає на утворення фермент субстратного комплексу.

4. Класифікація ферментів

Класифікація та номенклатура ферментів ґрунтуються на природі хімічних перетворень.

Виділяють шість головних класів ферментів:

1. Оксидоредуктази - каналізують окисно-відновні реакції.

2. Трансферази - каналізують реакції міжмолекулярного перенесення груп атомів.

3. Гідролази - каналізують реакції гідролізу.

4. Ліази - каталізують реакції гідролітичного розщеплення з утворенням подвійних зв'язків або приєднання груп за місцем подвійного зв'язку.

5. Ізомерази - каталізують реакції ізомеризації.

6. Лігази (синтетази) - каналізують реакції синтезу речовин з використанням енергії розпаду АТФ або іншого нуклеозидтрифосфату.

Серед вище зазначених класів ферментів більш детально розглянемо клас гідролаз.

Гідролази - каталізують реакції розщеплення органічних сполук за участю води. Схематично їх дію можна показати так:

R - X + HOH - R - HOH + HX

Залежно від зв'язків, які вони розщеплюють, клас гідролаз поділяють на підкласи:

Гідролази, що діють на складно ефірні зв'язки. Їх називають естеразами. До них належать ферменти ліпази і фосфатази.

Гідролази, що діють на глікозидні сполуки. До цього підкласу належать ферменти, що каталізують гідролітичне розщеплення оліго- і полісахаридів та інших сполук із глікозидними зв'язками. Цей підклас поділяється на олігази та поліази. До олігаз належать в-фруктофуранозидаза (сахараза), б-глюкопіранозидаза (мальтаза), в-галактопіранозтдаза (лактаза), в-глюкопіранозидаза (целобіаза).

До поліаз належать амілази (б, в та глюко-), інулаза та целюлоза. Слід зазначити, що б-амілаза гідролізує розщеплення крохмалю невпорядковано, при цьому утворюються низькомлярні декстрини (у більшій кількості) і мальтоза (у меншій кількості). Фермент б-амілаза чутлива до рН середовища, при рН 3,3 вона інактивується.

Гідролази, що діють на пептидні зв'язки (пептид-гідролази). Це протеолітичні ферменти, що каталізують гідролітичне розщеплення пептидних зв'язків у молекулах білків і пептидах. Вони діють за такою схемою:

R - CO - NH - + O > R - COOH + + N

Цей підклас поділяється на пептидази (аміно - та карбокси-) та протеїнази (пепсин, трипсин, хімотрипсин).

Гідролази, що діють на С-N-звязки, відмінні від пептидних зв'язків. Ферменти цього підкласу мають важливе значення в утворенні кінцевих продуктів азотистого обміну. Наприклад фермент уреаза (карбамід-амідогідролаза) розщеплює сечовину:

N - CO - N + O > C + 2 N

5. Хід роботи

У конічну колбу місткістю 50 - 100 мл вносять піпеткою 20 мл 1,0%-го розчину крохмалю і занурюють у водяну баню з температурою 30°С (+0,2°С). Загальний об'єм реакційної суміші завжди має дорівнювати 30 мл, і якщо на аналіз беруть менше 10 мл ферментного розчину, то об'єм, якого не достає, доповнюють дистильованою водою, яку приливають перед додаванням ферментного розчину.

Через 10 хв витримування в бані у колбу вносять ферментний розчин при ретельному перемішуванні і точно за секундоміром відмічають час. За початок реакції беруть час, коли з піпетки виллється половина вмісту. Через кожну хвилину (або частіше) після початку реакції скляною паличкою відбирають краплину рідини і на білій порцеляновій пластинці з'єднують її з раніше нанесеною краплиною робочого розчину йоду.

Реакція розщеплення крохмалю вважається закінченою, коли йод перестане давати зміну забарвлення при зєднанні з краплиною дослідної рідини (протягом перших 10 с).

Час, за який проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, може становити від 3 до 20 хв, але надійніші результати отримують у межах від 5 до 15 хв.

Примітка. Якщо час зникнення забарвлення менше 3 хв, то визначення повторюють з меншою кількістю розчину фермента, наприклад - 2 мл. У цьому разі в пробірку чи колбу з 20 мл крохмалю вносять 8 мл дистильованої води. Під час аналізу дуже активних препаратів концентрації розчинів роблять меншими (0,1 г в 200 або 500 мл).

Якщо час зникнення забарвлення становить більше 20 хв, то готують розчин більшої концентрації, наприклад 1:50 чи 1:100, а рідину можна не розбавляти зовсім.

У разі зникнення забарвлення в межах 3 - 5 хв проби відбирають кожні 15 с; 5 - 10 хв - кожні 30 с; а понад 10 хв - кожну хвилину.

Скляну паличку після кожної проб промивають дистильованою водою і витирають чистим некрохмаленим рушником.

Розрахунок АЗ проводять за формулою:

АЗ

де 0,2 - кількість крохмалю в реакційній суміші, г; 60 - коефіцієнт перерахунку на 1 год; а - кількість ферментного препарату, введеного в реакційну суміш, грами повітряно-сухої речовини або мілілітри рідинних об'єктів; t - час, за який пройшло розщеплення крохмалю до нездатних знебарвлюватися йодом продуктів, хв; 1 - перерахунок на 1 г повітряно-сухого препарату або 1 мл розчину.

Принцип методу ґрунтується на гідролізі 1,0%-го буферного розчину крохмалю під впливом амілолитичних ферментів, кінець реакції контролюють візуально за йодною пробою, За часом, протягом якого проходить розщеплення крохмалю до продуктів, що не забарвлюються йодом, визначається амілолітична активність препарату.

6. Загальні відомості про крохмаль

Крохмаль (лат. Amylum) - суміш природних полісахаридів загальної формули (С₆Н₁₀О₅)_n у вигляді зерен різної форми, розмірів та властивостей (сипкість, здатність до набрякання), які залежать від виду рослин, з яких вони отримані (бульб картоплі, зерен пшениці, кукурудзи, рису). К. складається з полісахаридів амілози та амілопектину, які побудовані із залишків Д-глюкопіранози, поєднаних б-1,4, - глюкозидними зв'язками, а в місцях розгалуження глюкозидні залишки поєднані з головним ланцюгом б-1,6 - зв'язками. Макромолекули амілози (водорозчинний полісахарид) мають лінійну будову або слаборозгалужені ланцюги (рис. 1а), що складаються з 200-1000 залишків Д-глюкози, а макромолекули амілопектину дуже розгалужені (рис. 1б) і мають 600-6000 залишків Д-глюкози.

Рис. 1. Схема будови макромолекул амілози (а) та амілопектину (б)

Ділянки ланцюгів амілози та амілопектину наведені на рис. 2 і 3.

Рис. 2. Ділянка ланцюга макромолекули амілази

Рис. 3. Ділянка ланцюга макромолекули амілопектину з точкою розгалуження

Полісахариди амілози та амілопектину можна розділити, використовуючи їх властивості. Так, амілоза краще розчиняється в гарячій воді, розбавлених лугах, здатна утворювати комплекси з н-бутанолом, циклогексанолом, ізоаміловим спиртом та осаджуватись із дисперсій К. дихлоретаном, тетрахлоркарбоном та іншими розчинниками. Амілоза й амілопектин полідисперсні за молекулярною масою. Співвідношення їх у різних рослин різне. У середньому К. містить 25% амілози та 75% амілопектину. Але завдяки селекції на сьогодні отримують промислові сорти кукурудзи із вмістом 55-75% амілози, а К. воскоподібної кукурудзи містить більше 95% амілопектину.

К. і отримані з нього амілаза й амілопектин - білі речовини, нерозчинні в холодній воді, спирті, етері. Після руйнування зовнішньої оболонки зерен К. (методом диспергування) вони набрякають у холодній воді з утворенням гідрогелю. У теплій воді зерна К. руйнуються з утворенням клейстеру, що проходить у три стадії. Спочатку зерна К. набрякають (стадія оборотна), при подальшому підвищенні температури об'єм зерен збільшується в декілька сотен разів з одночасним підвищенням в'язкості розчину (стадія необоротна); нарешті, розчинні полісахариди К. витягаються водою, зерна втрачають форму, перетворюються на мішечки, суспендовані в розчині. Із крохмального клейстеру (розчину) при тривалому зберіганні амілоза випадає в осад (ретроградація). Розчини К. оптично активні [б]_двід 180 до 210?. К. забарвлюється йодом у синій колір, амілоза - в інтенсивно синій, а амілопектин - у червоно-фіолетовий. При нагріванні до 70 ?С і вище колір зникає, а при охолодженні знову з'являється.

К. широко використовується в різних галузях промисловості: харчовій, бродильній (для отримання спиртів, гліцерину, деяких кислот та інших продуктів), текстильній, паперовій, у виробництві декстринів, клеїв, у мікробіології й фармації (для виробництва антибіотиків, вітамінів та інших продуктів). При виготовленні ліків, особливо гранул, таблеток найчастіше використовують картопляний К. як розпушувальний компонент. У складі таблеток К. утворює систему капілярів, через які легко проникає вода. Він добре набрякає, поглинаючи до 29% води, в той час як кукурудзяний та рисовий К. набрякають до 5-6%. Найкращу розпушувальну дію має картопляний К., висушений при температурі 45 ?С та доданий до готових гранул. Крім розпушувальних властивостей, у виробництві таблеток К. використовується як склеювальний компонент (5-20% розчин), а висушений - як ковзний компонент або як допоміжна речовина в процесі дражирування. К. має гідрофілізуючі властивості й утримує вологу в гранулах. Завдяки сипкості й здатності прилипати до шкіри, поглинати вологу і шкірний жир, використовується в присипках і пудрах. Крім того, К. може використовуватись як складовий компонент багатьох мазей і паст.

Існують модифіковані К. Згідно з визначенням Експертної комісії з харчових добавок ВООЗ - це «харчові К., в яких одна або більше первинних характеристик змінені шляхом відповідної обробки одним із фізичних, хімічних, біохімічних або комбінованих процесів». Нативні К. здатні до утворення клейстерів, які мають недоліки: чутливість до дії температур, схильність до синерезису, недостатньо стабільні при зберіганні. Тому їх піддають цільовим змінам. Модифікація К. дає можливість: знижувати або підвищувати температуру їх клейстеризації; знижувати або підвищувати в'язкість клейстеру; підвищувати розчинність у холодній воді; прояву емульгуючих властивостей; знижувати схильність до ретроградації; підвищувати стійкість до синерезису, впливу кислот, високих температур та циклів розморожування - заморожування. Деякі модифіковані К. отримують шляхом значних змін їх природних властивостей (набухаючі, термічно розщеплені, рідинно киплячі та ін.). Модифікований (видозмінений) К. одержують шляхом м'якого кислотного або ферментного гідролізу із звичайного крохмалю. При швидкому нагріванні відбувається розщеплення гігантської молекули на низькомолекулярні полісахариди, які називаються декстринами:

(С₆Н₁₀О₅)_n>(С₆Н₁₀О₅)_n> С₁₂Н₂₂О₁₁> С₆Н₁₂О₆

крохмаль, декстрин, мальтоза, глюкоза.

Декстрини у воді розчиняються краще, ніж крохмаль, а в концентрації до 50% утворюють в'язкі розчини консистенції мазевих основ. Особливістю розчинів декстринів є те, що вони мають постійну в'язкість. Широкого застосування набув декстрин (Мол. м. 60 000±10 000) у формі 6% розчину як кровозамінник. Декстрини різної молекулярної маси входять до складу мазевих основ. К., модифіковані кислотами, характеризуються значно меншою в'язкістю клейстеризованих розчинів у нагрітому стані, але після охолодження утворюють міцні драглі. Модифіковані К. мало відрізняються за складом від природного К., але позбавлені запаху, мають інший колір, властивість до розсипчастості тощо. Модифіковані К. не мають жодного стосунку до генної інженерії. К. розчинний отримують при тривалому контакті з водою або слабкою кислотою (відбувається розщеплення зв'язків у місцях розгалужень ланцюгів амілопектину і утворення розчинного продукту у воді); використовується як індикатор у хімічному аналізі, рідше - як клей (10% розчин). К. ненабрякаючий має етерифіковані гідроксильні групи внаслідок дії тетраметилацетиленодисечовини. Це білий, без запаху порошок, який не набрякає і не розчиняється у воді, застосовується з метою запобігання склеюванню гумових виробів, напр., рукавиць хірургічних; входить до складу багатьох лікувальних і косметичних пудр, а також як ковзна речовина при виробництві таблеток і гранул. К. кукурудзяний або амілопектиновий - очищений та гідролітично оброблений - використовується для виготовлення кровозамінного препарату Волекам, а також у паперовій промисловості. К. набрякаючий - використовується в харчовій промисловості, при бурінні свердловин та виробництві клею. Окиснені К. отримують обробкою перекисом водню, калію перманганатом та ін. Таким К. властива підвищена прозорість розчину, висока стабільність, знижена в'язкість. Використовується у виробництві тканин. К. ацетатний - використовується як загусник та структуроутворювач. К. катіонний - використовують при очищенні стічних вод та в паперовій промисловості.К. фосфатний - використовується в харчовій промисловості. Карбоксиметилкрохмаль - зі ступенем заміщення 0,1 і вище, в холодній воді утворює стійкі клейстери; використовується як загусник, стабілізатор, структуроутворювач нехарчових та харчових продуктів.

Амілази (грец. бmylon - крохмаль) - ферменти класу гідролаз, які забезпечують гідроліз б-1,4 - глікозидних зв'язків у молекулах полісахаридів - глікогену, крохмалю. А. належать до підкласу гідролаз глікозидів, що розривають зв'язки між залишками б-глюкопіранози шляхом приєднання за місцем розриву елементів води. Гідроліз глікозидних зв'язків може відбуватися у різних місцях полісахаридного ланцюга, внаслідок чого утворюються різні продукти гідролізу - глюкоза, олігосахариди, дисахариди. Виділяють 3 типи А.: a-амілаза - виявляють у тварин, рослин, у т.ч. в мікроорганізмах, у реакціях за її участю утворюються переважно декстрини; в-амілаза - типова для вищих рослин, каталізує утворення мальтози й високомолекулярних декстринів; глюкоамілаза - міститься в крові тварин, плісневих грибах, бактеріях і каталізує утворення глюкози й декстринів. А. мають абсолютну групову субстратну специфічність, тобто забезпечують гідроліз різних субстратів, що мають однакову будову, складаються із залишків б-D-глюкопіранози, сполучених б-1,4 - глікозидним зв'язком. Здебільшого гідроліз полісахаридів відбувається при одночасній участі різних А. Усі ферменти цього підкласу є металопротеїнами, містять іони Zn2+ і Са2+. До складу активних центрів входять залишки гістидину, тирозину, аспарагінової та глутамінової кислот. Фізіологічна роль А. у рослин полягає в мобілізації запасів полісахаридів у клітинах. У тварин і людини А. беруть участь у процесах травлення; містяться у слині й соку підшлункової залози.

7. Використання амілази в харчовій промисловості

Використання ферментів в виробництві крохмалю дозволяє контролювати глибину його гідролізу і отримувати продукцію з бажаними властивостями: в'язкістю, осмотичним тиском, стійкістю до кристалізації. Гідроліз каталізується ферментами трьох різновидів: ендоамілазами, екзоамілазами і б - 1,6 - глюкозидазами.

Ендоамілази - це б-амілази. Які розщеплюють б - 1,4 - глюкозидні зв'язки амілазі і амілопектині з утворенням олігосахаридів з різної довжини ланцюгами і б-конфігурацією при С1 атомі глюкози. Для зрідження крохмалю при високій температурі використовують термостабільні б-амілази. Наприклад амілази Bacillus licheniformis температурний оптимум лежить при 92 . Для зрідження крохмаль диспергують у воді при нагріванні, для зменшення в'язкості і для запобігання осіданню крохмалю при охолодженні проводять частковий його гідроліз. При одностадійному розрідженні фермент добавляють на самому початку, до приготування суспензії, яке проводять при 150 на протязі 5 хвилин, після чого гідроліз ведуть 2 години при 95 .

При кисло-ферментному зрідженні фермент після желатинування крохмалю, викликаного нагріванням.

Сиропи, що добувають з крохмалю, містять багато мальтози (40-50%). Знаходять застосування в виробництві карамелі і заморожених десертів.

Размещено на Allbest.ru