Исходя из данных концентрации белка, полученных при помощи метода Брэдфорд рассчитываем количество образца для измерения карбоангидразной активности (табл. 8 и 9).

Измерение КП-активности для белка РsbР проводим по схеме описанной в табл.8, для белка РsbQ - в табл. 9. Также измеряем КА-активность для ФС-2, чтобы сравнить её с активностью белков. Результаты измерения КП-активности отражены на рис.13.

Табл. 8. Схема измерения КП-активности белка PsbP

Табл. 9. Схема измерения КП-активности белка PsbQ

Рис.13. КА-активность ФС-2, КП-активность белков PsbPи PsbQ в присутствии или отсутствии ионов металлов.(на графике есть неправильные данные PsbQ+Ca, +Zn, +Mg!!!)

Ранее было показано, что КП-активность белка PsbP увеличивалась в присутствии Mn2+ (Шитов с соавт., 2009). Однако, в этой работе белок PsbP содержал Mn в своём составе и осталось неясным, будет ли обладать КП-активностью этот белок, если удалить ионы Mn из белка. В нашей работе был получен образец белка PsbP, не содержащего ионов металлов в своём составе (для этого проводился диализ в присутствии ЭДТА). Нами было выяснено, что обработанный ЭДТА белок не обладал КП-активностью, но добавление ионов Mn2+ вызывало появление КП-активности этого белка. Как было показано ранее, также ведёт себя белок PsbO (Шитов с соавт., 2009). Ионы Ca2+ и Mg2+ и даже Cu2+ ещё более значительно увеличивали КП-активность белка PsbP, максимальное значение зафиксировано в опыте с ионами Mg2+ (83,29). Эти данные свидетельствуют о возможном сродстве белка PsbP к ионам двухвалентных металлов. Это предположение подтверждается результатамими, опубликованными ранее в иностранных научных статьях. Пока непонятно, насколько специфично действие определённых металлов на КП-активность PsbP и как связано это явление с механизмом функционирования и сборки ФС-2.Все эти вопросы требуют дальнейшего исследования.

В присутствии ионов Zn2+ КП-активность PsbP не проявлялась. Пока непонятно, с чем может быть связан этот результат. Возможно, играет какую-то роль неспособность ионов цинка проявлять степень окисления больше двух (как Mn), или этот ион имеет размеры, которые не подходят для мест связывания на белковой молекуле. Для решения этоих вопросов требуются дополнительные исследования.

Белок PsbQ, лишённый металлов, в отличии от белка PsbP, обладал КП-активностью, которая была сравнима с КА-активностью ФС-2. В присутствии Mn2+ и Ca2+ его КП-активность увеличивалась примерно в 3 раза. Резкое увеличение КП-активности наблюдалось с ионами Zn2+(94.77). Присутствие ионов Mg2+ и Сu2+ не приводило к увеличению КП-активности. Эти данные свидетельствуют о большем сродстве PsbQ к ионам Mn2+, Ca2+ и особенно Zn2+. Подтверждением этого сродства могут быть данные о важности белков PsbPи PsbQдля сохранения ионов Caи Cl в составе ВОК ФС-2. Косвенным подтверждением сродства Zn к PsbQ может являться тот факт, что в ФС-2 ранее обнаруживали присутствие ионов Zn2+ (Шитов с соавт., 2009).Однако, пока непонятна роль этого связывания в функционировании ФС-2. Необходимо отметить, что ионы цинка могут связываться не только с PsbQ, но и с другими белками, которые входят в состав выделенной нами фракции белка PsbQ.Для подтверждения связывания ионов Zn (а также Caи Mn), необходимо дальше очистить эту фракцию с применением других физико-химических методов (например, катионнообменной хроматографии) с целью получения белка PsbQв чистом виде и проведения аналогичных экспериментов с КП-активностью.

Так как ионы Zn2+ и Ca2+ обладали наибольшим влиянием на КП-активность, необходимо было определить зависимость активности от концентрации этих ионов (рис.14).

Из графиков видно, что зависимости КП-активности PsbQ от концентраций разных ионовзначительно отличаются. На графике концентрационной зависимости для ионов Zn2+ прослеживается пик активности (94,8 ед. W-A/мг белка при 200 мкМ Zn), а в присутствии высоких концентраций (1мМ) КП-активность уменьшается. Ионы Ca2+ действуют иначе, активность линейно возрастает по мере увеличения концентрации иона. По-видимому, это связано с различной природой взаимодействий этих ионов с белком. Причины различий в действии этих металлов пока не ясны и этот вопрос требует дальнейшего изучения.Наличие оптимума концентрации двухвалентного металла характерно для металлоферментов (в том числе и карбоангидраз) и это может быть либо признаком того, что белок PsbQявляется карбоангидразой нового класса, либо признаком присутствия посторонней карбоангидразы во фракции белка PsbQ.В любом случае, эта работа ещё не завершена и поставленные нами вопросы требуют дальнейшего исследования.

Заключение

В настоящее время наличие карбоангидразной активности в ФС-2 высших растений (горох, шпинат, пшеница, кукуруза) показано многими исследователями и не должно вызывать сомнений. Но пока неясно, какова природа носителя карбоангидразной активности в ФС-2. Им может быть один (или несколько) из известных белков ФС-2, обладающий неизвестной ранее функцией (карбоангидразной активностью), или неизвестный белок.Принимая во внимание значимость карбоангидразной активности для функционирования донорной стороны ФС-2, особое внимание было уделено исследованию карбоангидразной активности внешних водорастворимых белков водоокисляющего комплекса. В данной работе впервые был проведен анализ действия ионов двухвалентных металлов на карбоангидразоподобную активность белков РsbРи РsbQпо отдельности.

Было выяснено, что белок PsbPне обладал КП-активностью пока к нему не добавляли ионы двухвалентных металлов. Особенно эффективным активатором КП-активности оказался ион Mg2+, несколько менее эффективными - ионы Ca, Cu, Mn. Вопрос о специфичности ионов металлов в активации КП-активности PsbP пока остаётся открытым.

Было показано, что очищенный от ионов металлов белок PsbQобладал КП-активностью, которая сильно возрастала в присутствии ионов Zn2+, в присутствии ионов Caи Mn КП-активность увеличивалась с в два раза меньшей эффективностью. Также было выявлено, что Zn и Ca по-разному влияют на увеличение КП-активности, что может свидетельствовать о разной природе взаимодействий ионов этих металлов с белком PsbQ. Природу этих взаимодействий необходимо более тщательно исследовать, поскольку это важно для понимания закономерностей функционирования фотосистемы 2. В силу актуальности этой тематики, эта работа требует продолжения.

Роль обнаруженных носителейкарбоангидразной активности, находящихся в люменальной части ФС-2, в непосредственной близости к ВОК, может быть важна для фотосинтетического окисления воды, подобно функциональной активности карбоангидразы cah3, обнаруженной ранее в составе «ядерного» комплекса ФС-2 клеток C. reinhardtii и необходимой (наряду с анионом бикарбоната) для формирования, стабилизации и функционирования Mn2+-содержащего водоокисляющего комплекса (Villarejoetal., 2002;Shutovaetal., 2008).

Выводы

1. Фрагменты тилакоидных мембран хлоропластов, обогащенных фотосистемой 2, выделенные из листьев гороха, обладали хорошей фотохимической активностью и по своему белковому составу соответствовали препаратам фотосистемы 2, описанным ранее в научной литературе.

2. Выбранные нами методы и подходы позволили выделить изолированные фракции белков PsbPи PsbQс сохранением их КП-активности.

3.Выявлено, что изолированный и очищенный от металлов белок PsbP не обладал карбоангидразоподобной активностью. Эта активность проявлялась только в присутствии ионов двухвалентных металлов, таких как Mn2+, Ca2+, Mg2+, Cu2+. Ионы Zn2+не вызывали увеличения КП-активности.

4. Белок РsbQобладал КП-активностью без добавления ионов двухвалентных металлов. Однако, его активность значительно возрастала в присутствии ионов Zn2+, Ca2+ и Mn2+.Было выяснено, что ионы Zn2+и Ca2+ по-разному воздействуют на карбоангидразоподобную активность белка PsbQ.

Список литературы

1. Antal T. K., Venediktov P. S., Konev Yu. N., Matorin D. N., Hapter R., and Rubin A. B. (1998) Assessment of Vertical Profiles of Phytoplankton Photosynthetic Activity by the Fluorescence Method

2. Arnon D.I. (1949) Copper Enzymes in Isolated Chloroplasts.Polyphenoloxidase in Beta vulgaris.Plant Physiology 24, 1-15.

3. Arun K. Shanker (2008) Trace elements: Nutritional benefits, environmental contamination and health; 21 Modeofaction and toxicity of trace elements,Edited by M.N.V. Prasad

4. Barber J. (2002)P680: what is it and where is it?, Bioelectrochemistry. Jan;55(1-2):135-8.

5. Barber J., Chapman D.J. and Telfer A. (1987) Characterization of a PSII reaction center isolated from the chloroplasts of Pisum sativum. FEBS Lett. v.220, p.67-73.

6. Basics G. H. Krause E. Weis (1991) Сhlorophyll fluorescence and photosynthesis

7. Bradford M. M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding

8. Dai X., Yu Y., Zhang R., Yu X., He P. and Xu C. (2001) Relationship among Photosystem II carbonic anhydrase, extrinsic polypeptides and manganese cluster. Chinese Science Bulletin46, 406-408.

9. Guskov A., Kern J., Gabdulkhakov A., Broser M., Zouni A., Saenger W. (2009) Cyanobacterial photosystem II at 2.9 A resolution: role of quinones, lipids, channels and chloride. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 334-342.

10. Kang D., Gho Y.S., Suh M. and Kang C. (2002) Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.Bulletin of the Korean Chemical Society23, 1511-1512.

11. Khristin M.S., Ignatova L.K., Rudenko N.N., Ivanov B.N. and Klimov V.V. (2004) Photosystem II associated carbonic anhydrase activity in higher plants is situated in core complex. FEBS Letters577, 305-308.

12. Klimov V.V., Allakhverdiev S.I., Shuvalov V.A. and Krasnovsky A.A. (1982) Effect of extraction and re-addition of manganese on light reactions of photosystem-II preparations.FEBS Letters148, 307-312.

13. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature227, 680-685.

14. Lu Y.K. and Stemler A.J. (2007) Differing responses of the two forms of photosystem II carbonic anhydrase to chloride, cations, and pH.Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1767, 633-638.

15. Lu Y.K., Theg S.M. and Stemler A.J. (2005) Carbonic anhydrase activity of the photosystem II OEC33 protein from pea.Plant and Cell Physiology 46, 1944-1953.

16. McConnell I.L., Badger M.R., Wydrzynski T. and Hillier W. (2007) A quantitative assessment of the carbonic anhydrase activity in photosystem II.Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1767, 639-647.

17. Moroney J.V., Ma Y., Frey W.D., Fusilier K.A., Pham T.T., Simms T.A., DiMario R.J., Yang J.and Mukherjee B. (2011) The carbonic anhydrase isoforms of Chlamydomonas reinhardtii: intracellular location, expression, and physiological roles. Photosynthesis Research109, 133-149.

18. Moskvin O.V., Razguljayeva A.Y., Shutova T.V., Khristin M.S., Ivanov B.N. and Klimov V.V. (1999) Carbonic anhydrase activity of different Photosystem II preparations. In: Garab G. (ed.) Photosynthesis: Mechanism and Effects, Vol. 2, pp. 1201-1204. Kluver Academic Publishers, Dordrecht.

19. Renger G. (1992) Energy transfer and trapping in photosystem II. -In: Topics in photosynthesis, the photosystems: structure, functions and molecular biology. (ed.: Barber J.), Elsevier, Amsterdam, 45-99.

20. Muh F., Glockner C., Hellmich J., Zouni A., (2012) Light-induced quinone reduction in photosystem II. Biochimica et Biophysica Acta 1817, 44-65.

21. Rudenko N.N., Ignatova L.K. and Ivanov B.N. (2007) Multiple sources of carbonic anhydrase activity in pea thylakoids: soluble and membrane-bound forms. Photosynthesis Research 91, 81-89.

22. Shutova T., Nikitina J., Deikus G., Andersson B., Klimov V. and Samuelsson G. (2005) Structural dynamics of the manganese-stabilizing protein-effect of pH, calcium, and manganese. Biochemistry44, 15182-15192.

23. Stemler A. (1986) Carbonic anhydrase associated with thylakoids and Photosystem II particles from maize. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics850, 97-107.

24. Villarejo A., Shutova T., Moskvin O., Forssen M., Klimov V.V. and Samuelsson G. (2002) A photosystem II-associated carbonic anhydrase regulates the efficiency of photosynthetic oxygen evolution. EMBO Journal21, 1930-1938.

25. Wilbur K.M. and Anderson N.G. (1948) Electrometric and colorimetric determination of carbonic anhydrase.The Journal of Biological Chemistry176, 147-154.

26. Гольцев В.Н., Каладжи М.Х., Кузманова М.А., Аллахвердиев С.И.(2014). Переменная и замедленная флуоресценция хлорофилла a - теоретические основы и практическое приложение в исследовании растений . Ижеск-Москва: Институт компьютерных исследований.