Показники ліпідного та жовчно-кислотного обмінів за експериментального медикаментозного гепатиту та їх корекція

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. На сучасному етапі розвитку медицини комплексне застосування чисельних хіміотерапевтичних засобів (антибіотиків, серцево-судинних, психотропних та нестероїдних протизапальних препаратів) часто ускладнюється медикаментозним ураженням печінки, що є результатом прямої цитотоксичної дії на гепатоцити (А.О. Буеверов, 2001; Н.В. Козлова, 2002; И.Г. Никитин, 2005; В.І. Левченко та ін., 2006).

З функціональним станом печінки в організмі ссавців тісно пов'язаний ліпідний обмін. Ліпіди є важливою структурною складовою клітинних мембран, де переважно представлені фосфоліпідами (К.Й. Гундерманн, 2002; В.А. Томчук, 2003; М.І. Цвіліховський, 2004; С.В. Хижняк та ін., 2008).

За розвитку патологічних процесів у печінці активуються процеси вільнорадикального окиснення, різко підвищується інтенсивність ліпопероксидації, що призводить до пошкодження клітинних мембран
(Н.М. Малкович, 2005; Д.О. Мельничук та ін., 2008). Якісні та кількісні перетворення ліпідної компоненти мембран обумовлюють зміни фізичних і структурно-динамічних характеристик мембранних систем уражених гепатоцитів. У результаті негативної дії вільних радикалів порушується структура мембранних білків і плазматична мембрана гепатоциту стає проникною для компонентів внутрішнього вмісту клітини. Цей процес супроводжується виходом ферментів цитозолю в кров (В.С. Камышников, 2000; Г.Б. Афонина, 2000; Г.И. Назаренко, 2002; О.В. Паламарчук, 2003; Л.Г. Калачнюк, 2009).

Запальні та дистрофічні зміни паренхіми печінки за розвитку гепатопатології призводять до значних розладів у секреції жовчі, які поглиблюються за рахунок пошкодження дрібних жовчних протоків. Поряд з цим, застій жовчі у жовчних протоках внаслідок холестазу також призводить до деструкції клітинних мембран гепатоцитів під дією жовчних кислот, для яких характерні детергентні властивості (С.П. Весельський, 2008). Проявом холестазу є підвищення в крові активності ферментів, асоційованих з мембранами біліарного полюса гепатоцитів і епітелієм жовчних протоків (У. Лейшнер, 2001; О.Я. Бабак, 2003; И.Г. Никитин та ін., 2005; Л.В. Журавлева, 2005).

Враховуючи, що фосфоліпіди є основними ліпідними компонентами клітинних мембран, які утворюють стійкі подвійні мембранні структури, у практичній гепатології останнім часом всебічно вивчаються різні аспекти прояву клінічної ефективності фосфоліпідовмісних препаратів, особливо їх протективна і репаративна дії, у відношенні мембранних структур уражених гепатоцитів (В.М. Кириленко, 1989; М.І. Цвіліховський, 2003; В.И. Черный та ін., 2005). Викликає інтерес також інтенсивність відновлювальних процесів на рівні печінки під дією лікувальних препаратів, які виготовляються на основі фосфоліпідів різної структурної організації, що визначається їх походженням: рослинним чи тваринним (Г.М. Шаяхметова, 2000; Ю.М. Степанов, 2006; В.А. Грищенко, 2009). Означені питання стали підґрунтям для проведення експериментальних досліджень, які покладено в основу цієї дисертаційної роботи.

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було дослідити показники обміну ліпідів і жовчних кислот за експериментального медикаментозного гепатиту та провести порівняльну оцінку ефективності корегування їх змін терапевтичними засобами на основі фосфоліпідів різного походження.

Для реалізації цієї мети були поставлені такі завдання:

- довести відповідність клінічних, патолого-анатомічних, гістоморфологічних і біохімічних показників розробленій моделі медикаментозного гепатиту та вивчити їх зміни при застосуванні тваринам засобів корегувальної терапії на основі фосфоліпідів різного походження;

- дослідити якісні та кількісні зміни ліпідного і фосфоліпідного спектрів еритроцитарної маси, сироватки крові, печінки та внутрішньоклітинних мембран гепатоцитів, жовчі, вмісту кишечника і калових мас у щурів за експериментального медикаментозного гепатиту та при застосуванні засобів корегувальної терапії на основі фосфоліпідів різного походження;

- дослідити жирнокислотний склад сироватки крові та печінки в щурів при експериментальному медикаментозному гепатиті і застосуванні засобів корегувальної терапії на основі фосфоліпідів різного походження;

- визначити особливості показників обміну жовчних кислот на моделі медикаментозного гепатиту в тварин з різною будовою гепатобіліарної системи та при застосуванні засобів корегувальної терапії на основі фосфоліпідів різного походження;

- дослідити стан прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в організмі щурів при експериментальному медикаментозному гепатиті та застосуванні фосфоліпідовмісних терапевтичних засобів різного походження;

- провести порівняльну оцінку корегувальної ефективності терапевтичних засобів на основі фосфоліпідів рослинного і тваринного походження щодо вищенаведених показників за розвитку в тварин експериментального медикаментозного гепатиту.

1. Матеріали і методи дослідження

Експериментальні дослідження проводились на базі наукових проблемних лабораторій кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М.Ф. Гулого, кафедри патологічної анатомії тварин, Української лабораторії якості і безпеки продукції агропромислового комплексу та віварію Національного університету біоресурсів і природокористування (НУБіП) України, а також науково-дослідної лабораторії “Фізико-хімічної біології” біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

У дослідах використовували білих лабораторних щурів (самців) 3-місячного віку з масою тіла 200-220 г та мишей (самців) лінії СВА 2-місячного віку з масою тіла 18-20 г, з яких формували три (І, II, III) дослідні і контрольну групи по десять особин у кожній. Для виконання роботи було використано 80 мишей і 200 щурів, яких утримували на стандартному раціоні віварію.

Експерименти проведені відповідно до конвенції Ради Європи щодо захисту хребетних тварин, яких використовують з науковою метою.

Медикаментозну форму токсичного гепатиту в лабораторних тварин викликали шляхом перорального застосування препарату “Диклофенак” у дозі 12,5 мг/кг маси тіла, один раз на добу, впродовж 14 діб (О.М. Литвиненко та ін., 2008). У І дослідній групі знаходились тварини без лікування. Хворим тваринам ІІ дослідної групи впродовж подальших 50 діб один раз на добу per os вводили препарат “Есенціале-форте” на основі фосфоліпідів з сої (“Ей. Наттерманн енд Сайі ГмБХ”, Німеччина) в дозі 7,1 мг/кг маси тіла, а тваринам ІІІ дослідної групи один раз на добу - 1 %-й розчин ліпосомальної форми біологічно активної добавки (БАД) FLP-MD на основі фосфоліпідів молока, яку розроблено на кафедрі біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М.Ф. Гулого НУБіП України (Д.О. Мельничук, В.А. Грищенко, 2007) в дозі 13,5 мг/кг маси тіла. До контрольної групи віднесено інтактних тварин з уведенням їм per os еквівалентного об'єму дистильованої води.

Клінічний прояв медикаментозної форми токсичного гепатиту оцінювали за такими показниками: поведінкою, апетитом, масою тіла, станом шкіри та шерстного покриву, формою живота і болючістю його стінок, консистенцією калових мас, температурою, частотою пульсу і дихання.

Для гістологічного дослідження печінки, відбір зразків матеріалу, підготовку проб та мікроскопічні дослідження проводили за загальноприйнятими методиками (О.В. Волкова, 1987; М.К. Потоцький, 2001).

У сироватці крові визначали такі біохімічні показники: концентрацію загального білка, альбуміну, сечовини та активність ферментів - аланінамінотрансферази (АлАТ, КФ 2.6.1.2), аспартатамінотрансферази (АсАТ, КФ 2.6.1.1), г-глутамілтранспептидази (ГГТП, КФ 2.3.2.2), лужної фосфатази (ЛФ, КФ 3.1.3.1) на біохімічному аналізаторі «Microlab-200» фірми «AVL» (Нідерланди). Підготовку проб і визначення біохімічних показників проводили згідно з інструкцією до приладу та використанням реактивів фірми “Lachema” (Чехія).

Дослідження ліпопротеїнового (ЛП) складу сироватки крові. ЛП високої, низької та дуже низької щільності визначали у сироватці крові модифікованим методом P. Trinder (1963) при л 492 нм на спектрофотометричному аналізаторі „Stat Fax 1904” фірми «AWARENESS TEHNOLOGY INC» (США) з використанням наборів реактивів фірми «Intero, LTD».

Дослідження ліпідного спектра еритроцитарної маси, сироватки крові, печінки та мембран гепатоцитів, вмісту кишечника і калу. Екстракцію ліпідів із зразків еритроцитарної маси, сироватки крові, гомогенату печінки та мембран гепатоцитів - мікросомальної (МК) і субмітохондріальної (CМЧ), отриманих за методом В.Е. Предтеченского (1950), вмісту кишечника і калу проводили за методом I. Folch et al. (1957). Ліпідний спектр досліджували методом тонкошарової хроматографії (В.И. Петровский, 1986) на стандартних платівках фірми «Сілуфол» (Чехія). Розділення загальних ліпідів на класи здійснювали в системі розчинників: петролейний етер-діетиловий етер-оцтова кислота (90 : 70 : 1). Окремі класи ліпідів ідентифікували з використанням маркерів фірм «Sigma» (США) і «Reanal» (Угорщина). Кількісне визначення індивідуальних ліпідних фракцій здійснювали спектрофотометрично, на спектрофотометрі СФ-46 (Росія).

Дослідження фосфоліпідного (ФЛ) складу печінки та мембран гепатоцитів. Крім зразків гомогенату печінки, підлягали дослідженню на ФЛ склад внутрішньоклітинні мембрани гепатоцитів: МК і СМЧ. ФЛ розділяли методом двовимірної тонкошарової хроматографії (V.E. Vaskovsky, 1975) на стандартних платівках фірми «Сорбфіл» (Росія) в системі розчинників: хлороформ-метанол-бензол-аміак (65 : 35 : 10 : 6) та хлороформ-метанол-бензол-оцтова кислота-дистильована вода-ацетон (70 : 30 : 10 : 5 : 1 : 4). Вміст індивідуальних ФЛ визначали за кількістю неорганічного фосфору із застосуванням молібдатного реактиву. Індивідуальні ФЛ ідентифікували за допомогою специфічних реакцій та маркерів, а їхній вміст вимірювали на спектрофотометрі Specol-ІІ фірми «Analytik Jena» (Німеччина) при л 830 нм.

Дослідження спектра жирних кислот (ЖК) у сироватці крові та печінці. Екстракцію ліпідів із гомогенатів зразків печінки та сироватки крові проводили за методом I. Folch et al. (1957). Метилування ЖК здійснювали згідно з рекомендацією W. Christive (1979). Одержані метилові етери ЖК очищали з використанням тонкошарової хроматографії на платівках фірми «Сорбфіл» (Росія), які розділяли в бензолі, у скляній хроматографічній камері, фракціонували методом газорідинної хроматографії на хроматографі «Кристал-Люкс-4000» (Росія) з капілярною колонкою SP-2560 (Supelko) на полум'яно-іонізаційному детекторі. Ідентифікацію ЖК здійснювали з використанням стандартної суміші метилових етерів.

Дослідження жовчно-кислотного спектра еритроцитарної маси, міхурової жовчі, вмісту кишечника та калу. Жовчні кислоти розділяли за допомогою методу тонкошарової хроматографії з подальшою кількісною оцінкою окремих складових на стандартних платівках фірми «Сілуфол» (Чехія) за методикою С.П. Весельського (1991). Екстрагування жовчних кислот проводили при знижених температурах (t = 3-4 °С) сумішшю етанолу з ацетоном у співвідношенні 1 : 3 та хроматографічному їх розділенні у гомогенній загальній системі розчинників для вільних та кон'югованих жовчних кислот: аміловий етер оцтової кислоти-толуол-бутанол-оцтова кислота-дистильована вода (3 : 1 : 1 : 3 : 1). Денситометричну оцінку вмісту жовчних кислот здійснювали після фарбування комплексним барвником (15 мл оцтової льодяної кислоти, 1 г фосфорно-молібденової кислоти, 1 мл концентрованої сірчаної кислоти та 5 мл 50 %-го водного розчину трихлороцтової кислоти).

Дослідження показників прооксидантно-антиоксидантної рівноваги. У сироватці крові та гомогенаті печінки досліджували: ТБК-активні продукти, активність каталази (Кат, КФ 1.11.1.6.), супероксиддисмутази (СОД, КФ 1.15.1.1), глутатіонпероксидази (ГП, КФ 1.11.1.9.), глутатіонтрансферази (ГТ, КФ 2.5.1.18), вміст відновленого глутатіону (GSН) відповідно за методами И.Д. Стальная (1977), М.И. Прохорова (1982), М.А. Королюк та ін. (1988), Е.Б. Макаренко (1988), С.Н. Власова (1990).

Експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами варіаційної статистики (М.Є. Кучеренко та ін., 2001). Розраховували значення середніх арифметичних величин (М) і помилку середньостатистичного значення (m). Для визначення вірогідних відмінностей між середніми величинами використовували критерій Ст'юдента (t). Зміни показників вважали вірогідними при р < 0,05.

2. Результати експериментальних досліджень

Експериментальне відтворення медикаментозного гепатиту. Результати клінічних досліджень свідчать про те, що відтворена форма медикаментозного гепатиту супроводжується вираженими клінічними ознаками: пригніченням загального стану, зменшенням маси тіла в середньому по групі щурів на 12,0 1,0 г і мишей - 1,0 0,05 г та розладами травлення у вигляді проносів. При цьому частота дихання, артеріального пульсу та температура тіла знаходились у межах норми. Дані клінічного прояву медикаментозного гепатиту доповнили результати патолого-анатомічних і гістоморфологічних досліджень печінки, відібраної від хворих тварин: темно-вишневий колір паренхіми, в'яла консистенція й кровонаповнення, супутня жирова дистрофія, дискомплексація печінкових балок та лімфоцитарна інфільтрація міжчасточкової сполучної тканини. У випадку застосування хворим тваринам фосфоліпідовмісних лікувальних засобів відсутні макроскопічні та гістоморфологічні (за винятком окремих клітин у стані жирової дистрофії при введенні препарату “Есенціале-форте”) зміни органа, що свідчить про відновлення структурної організації гепатоцитів під їх впливом, краще виражене при введенні БАД FLP-MD.

Біохімічні показники. При дослідженні біохімічних показників крові (табл. 1) у щурів І групи було виявлено вірогідне підвищення активності відносноспецифічних для печінки ферментів: АлАТ - на 23,1 %, АсАТ - на 39,9 %, ЛФ на - 28,3 % та ГГТП в 2,1 раза за одночасного зменшення вмісту загального білка - на 13,6 % порівняно з контролем, що свідчить про деструкцію гепатоцитів, зниження інтенсивності білоксинтетичних процесів та розвиток внутрішньопечінкового холестазу. У щурів ІІ і ІІІ груп встановлено відновлення значень майже всіх досліджуваних біохімічних показників сироватки крові (за винятком АсАТ у тварин ІІ групи), що вказує на подібність механізмів репаративної дії фосфоліпідовмісних препаратів у відношенні структурно-функціонального стану клітин печінки та її жовчовивідної функції.

Таблиця 1. Біохімічні показники сироватки крові у щурів в умовах експерименту (M m, n = 10)

Примітка. Тут і далі: * - р < 0,05, дані вірогідні порівняно з їх значеннями у тварин контрольної групи.

Ліпідний склад еритроцитарної маси, сироватки крові, печінки, вмісту кишечника і калу за експериментального медикаментозного гепатиту в щурів та за умов корекції. При дослідженні ліпідного складу еритроцитарної маси у хворих щурів відмічається зниження рівня загальних ліпідів (ЗЛ) за рахунок таких фракцій, як ФЛ - на 13,9 % і вільних жирних кислот (ВЖК) - на 66,7 % та збільшення - триацилгліцеролів (ТАГ) - на 100 % порівняно з контролем (ФЛ - 0,418 ± 0,010 мкг/мг білка; ВЖК - 0,030 ± 0,003; ТАГ - 0,005 ± 0,001), що вказує на розвиток дисліпідемії, яка є ознакою структурних і метаболічних дефектів в уражених гепатоцитах. У щурів ІІ групи спостерігається відновлення вмісту ЗЛ, зменшення - ВЖК - на 63,3 % порівняно з контролем, на тлі нормалізації рівня етерифікованого холестеролу (ЕХС), холестеролу (ХС), ФЛ і ТАГ, що, ймовірно, є наслідком покращення засвоєння екзогенних ліпідів у кишечнику та інтенсивного їх утворення в гепатоцитах. Поступово відновлюються процеси етерифікації, що свідчить про підвищення ферментативної функції печінки. У щурів ІІІ групи відмічається збільшення вмісту ЗЛ, за рахунок зростання рівня ФЛ - на 24,4 %, зменшення - ВЖК на 63,3 % порівняно з контролем на тлі відновлення вмісту інших показників. Зменшення вмісту ВЖК, можливо, пов'язано з використанням їх для біосинтезу ФЛ. Збільшення вмісту ФЛ свідчить про мембранотропний ефект компонентів БАД FLP-MD.

У сироватці крові щурів І групи було встановлено (табл. 2) вірогідне зниження рівня ФЛ - на 22,1 %, ліпопротеїнів дуже низької щільності (ЛПДНЩ) - на 39,6 % та підвищення вмісту ліпопротеїнів низької щільності (ЛПНЩ) у 2,1 раза порівняно з контролем, що може бути наслідком розладів екзогенного надходження ліпідів в організм хворих тварин, порушення процесів травлення і всмоктування їх у кишечнику, а також розладами синтезу в печінці та кишечнику.

Таблиця 2. Вміст ліпідів та ліпопротеїнів у сироватці крові щурів в умовах експерименту, ммоль/л (M m, n = 10)

Ліпідний спектр сироватки крові щурів ІІ групи (табл. 2) характеризується різким підвищенням рівня ЛПНЩ у 2,3 раза порівняно з контролем, що може свідчити про недостатнє відновлення значень показників ліпідного обміну при лікуванні тварин препаратом “Есенціале-форте”. Застосування тваринам БАД FLP-MD сприяє зменшенню вмісту ЛПДНЩ - на 20,8 % і менш вираженому підвищенню ЛПНЩ порівняно з контролем, що вказує на більш інтенсивне відновлення структурно-функціональної організації клітин печінки і краще виражений репаративний ефект.

У гомогенаті печінки щурів І групи спостерігається тенденція до зменшення вмісту ЗЛ за рахунок фракцій ЕХС, ВЖК і ТАГ відповідно на 46,1, 28,1 і 34,8 % порівняно з контролем (табл. 3), що може свідчити про порушення етерифікуючої функції печінки і виснаження енергетичного потенціалу клітин.

Таблиця 3. Ліпідний спектр гомогенату печінки в щурів при медикаментозному гепатиті та за різних способів корекції, мг/100 г сирої тканини (М ± m, n = 10)

У випадку застосування препарату “Есенціале-форте”, у печінці щурів спостерігається відновлення рівня як ЗЛ, так і окремих ліпідних фракцій, що може бути пов'язано з поліпшенням засвоєння екзогенних ліпідів корму, стимулюванням їх ендогенного синтезу в гепатоцитах та поліпшенням ферментативної функції печінки.

При лікуванні щурів ІІІ групи БАД FLP-MD у гомогенаті печінки спостерігається тенденція до підвищення вмісту ЗЛ на тлі вірогідного зростання рівня ФЛ - на 24,5 % порівняно з контролем, що, ймовірно, вказує на більш інтенсивне відновлення структурної організації мембран гепатоцитів. Підвищення рівня ЕХС - на 28,3 % порівняно з контролем може свідчити про виражене стимулювання компонентами БАД FLP-MD ферментативної та етерифікуючої функцій печінки.

При дослідженні ФЛ-складу гомогенату печінки у щурів І групи виявлено зменшення вмісту більшості фракцій (табл. 4): фосфатидилетаноламіну (ФЕ), фосфатидилхоліну (ФХ), сфінгомієліну (СМ), фосфатидилсерину (ФС) відповідно на 24,5; 18,1; 18,3 та 6,2 % (р < 0,05) порівняно з контролем, внаслідок ймовірного порушення їх синтезу, що може призводити до глибоких змін структурно-функціонального стану біомембран.

У щурів ІІ групи також спостерігається у гомогенаті печінки вірогідно нижчий вміст: ФЕ, ФХ, лізофосфатидилетаноламіну (ЛФЕ) і лізофосфатидилхоліну (ЛФХ) відповідно на 13,2; 12,2; 7,6 і 10,7 % (р < 0,05) та вірогідно вищий рівень фосфатидної кислоти (ФК) - на 33,1 % порівняно з контролем, що проявляється на тлі відновлення кількісних характеристик інших класів ФЛ, і може вказувати на розвиток компенсаторних процесів в організмі тварин у період клінічного одужання, спрямованих на відновлення ФЛ-організації мембран гепатоцитів. У щурів ІІІ групи спостерігається вірогідне зростання рівня таких фракцій ФЛ, як ФЕ, ФХ, СМ і ФК відповідно на 38,5; 13,9; 24,0 і 25,5 % порівняно з контролем, що свідчить про достатнє забезпечення організму хворих тварин дефіцитними класами ФЛ, які необхідні для швидкого відновлення патологічно змінених мембранних структур клітин печінки.

Таблиця 4. Вміст фосфоліпідів у печінці щурів за експериментальних умов, мг/100 г сирої тканини (М ± m, n = 10)

При дослідженні ЛП-спектра вмісту кишечника в щурів І групи спостерігається зменшення вмісту ЗЛ за рахунок ФЛ та ЕХС відповідно на 17,8 і 41,3 % (контроль ФЛ - 144,55 ± 3,54 мкг/мг білка; ЕХС - 14,18 ± 0,53), а також виявляється зростання - ТАГ на 16,6 % порівняно з контролем (ТАГ - 62,05 ± 1,28), що підтверджує наявність порушення обміну ліпідів в їх організмі. У щурів ІІ групи у вмісті кишечника відмічається зростання рівня ФЛ і ВЖК (контроль ВЖК - 43,70 ± 1,73) відповідно на 33,1 і 23,3 % та вірогідне зменшення - ТАГ на 23,2 % порівняно з контролем, що може бути наслідком ефективного всмоктування екзогенних ліпідів препарату в кишечнику. У щурів ІІІ групи спостерігається підвищення у вмісті кишечника рівня ФЛ, ХС (контроль ХС - 37,38 ± 1,62), ЕХС і ВЖК відповідно на 74,2; 17,4; 29,8 і 41,3 % та зменшення - ТАГ - на 16,0 % порівняно з контролем, що, можливо, пов'язано з жовчогінним ефектом БАД FLP-MD.

При дослідженні ЛП-спектра калу у щурів І групи відмічається зростання рівня ФЛ, ВЖК і ТАГ відповідно на 27,0; 33,3 і 96,8 % (контроль ФЛ - 4,8 ± 0,10 мкг/мг білка; ВЖК - 2,7 ± 0,10; ТАГ - 3,1 ± 0,10), а також зниження - ЕХС на 43,8 % порівняно з контролем (ЕХС - 1,6 ± 0,07), що може свідчити про порушення процесів гідролізу та засвоєння екзогенних жирів. При застосуванні препарату “Есенціале-форте” спостерігається зменшення вмісту ХС (контроль ХС - 5,4 ± 0,10), ЕХС відповідно на 13,0 і 25,0 % за одночасного збільшення вмісту ТАГ - на 16,1 % порівняно з контролем. У калі щурів ІІІ групи встановлено зниження рівня ФЛ, ЕХС, ВЖК відповідно на 39,6; 31,3 і 18,5 %, а також зростання - ТАГ на 25,8 % порівняно з контролем, що, можливо, пояснюється поліпшенням ентерогепатичної циркуляції ліпідних фракцій та інтенсивним їх використанням для ендогенного синтезу ліпідів, необхідних для швидкого відновлення пошкодженої структури клітин.

Ліпідний і фосфоліпідний склад внутрішньоклітинних мембран гепатоцитів при медикаментозному гепатиті та застосуванні засобів корегувальної терапії. Ліпідний спектр МК мембран гепатоцитів у щурів I групи характеризується зменшенням умісту ЗЛ, ФЛ - на 18,6 % (контроль ФЛ - 0,430 ± 0,030 мкг/мг білка), за одночасного зростання рівня ВЖК - на 100 % порівняно з контролем (ВЖК - 0,040 ± 0,006). У препаратах СМЧ мембран гепатоцитів при відсутності змін умісту ЗЛ відмічається вірогідне підвищення - ВЖК на 30,4 % порівняно з контролем (ВЖК - 0,115 ± 0,003 мкг/мг білка), що може вказувати на токсичне ураження печінки, яке, як відомо з літератури (В.И. Кузнєцов та ін., 2004; С.В. Хижняк та ін., 2008), супроводжується підвищенням інтенсивності пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) у мембранних структурах клітин за розвитку мембранопатії.

У щурів ІІ групи відмічається тенденція до підвищення вмісту ФЛ у МК мембранах та вірогідне зменшення - ХС на 20,0 % порівняно з контролем (ХС - 0,100 ± 0,006). Зниження рівня ХС у мембранах сприяє зменшенню їх ригідності. У СМЧ мембран гепатоцитів у щурів ІІ групи відмічається відновлення всіх досліджуваних показників.

У щурів ІІІ групи в МК фракції мембран відмічається зростання рівня ФЛ - на 20,9 % порівняно з контролем. Підвищення рівня ФЛ стабілізує утворення гідропероксидів мембранних ліпідів. У СМЧ мембран гепатоцитів у щурів ІІІ групи спостерігається вірогідне зростання рівня ФЛ - на 19,0 % (контроль ФЛ - 1,000 ± 0,050), зниження вмісту ХС - на 11,8 % порівняно з контролем (ХС - 0,340 ± 0,010), що може свідчити про більш інтенсивне відновлення їх ліпідної компоненти.

У результаті проведеного дослідження ФЛ-спектра СМЧ мембран гепатоцитів у щурів І групи відмічається тенденція до зниження рівня ФХ, ФЕ і СМ, вірогідне зменшення вмісту ФС та КЛ відповідно на 20,8 і 22,4 % (контроль ФС - 26,5 ± 2,8 мкг/мг білка; КЛ - 37,9 ± 2,8), а також збільшення - ФІ на 23,0 % (контроль ФІ - 12,6 ± 1,1), а в препаратах МК мембран гепатоцитів встановлено підвищення рівня ФІ - на 54,7 % порівняно з контролем (ФІ - 14,8 ± 1,8 мкг/мг білка), що може вказувати на недостатнє відновлення пошкодженої структури зазначених мембран.

У щурів ІІ групи відмічається відновлення вмісту основних класів ФЛ до контрольних значень у СМЧ мембран, поряд із цим вірогідно зростає рівень ФС і ФІ відповідно на 61,5 і 63,5 % та ФС - на 36,2 % у МК мембранах порівняно з контролем (ФС - 28,7 ± 2,8), що свідчить про мобілізацію факторів стимулювання репаративних процесів у пошкоджених клітинах за дії препарату “Есенціале-форте”. При застосуванні БАД FLP-MD відмічається тенденція до зростання рівня загальних фосфоліпідів (ЗФЛ) у МК фракції, а в препаратах СМЧ мембран гепатоцитів рівень цієї фракції зазнає вірогідного підвищення на 31,0 % відносно контролю (ЗФЛ - 474,8 ± 33,8). Вміст ЗФЛ у препаратах СМЧ мембран вищий, ніж при застосуванні препарату “Есенціале-форте”. Поряд із цим, у щурів ІІІ групи у СМЧ мембран гепатоцитів встановлено вірогідне збільшення вмісту ФХ, ФЕ, СМ, ФС, ФІ відповідно на 26,9; 35,4; 47,2; 56,2 і 48,4 % порівняно з контролем (ФХ - 226,4 ± 19,7; ФЕ - 138,8 ± 9,9; СМ - 31,8 ± 3,8). Такі зміни можуть супроводжуватись достатньо швидким розвитком відновлювальних процесів у мембранних структурах печінки.

Жирнокислотний склад сироватки крові та печінки при експериментальному медикаментозному гепатиті у щурів і застосуванні корегувальної терапії на основі фосфоліпідів різного походження. Результати дослідження жирнокислотного складу сироватки крові та печінки у щурів І групи свідчать про зниження сумарного вмісту ненасичених ЖК за одночасного підвищення - насичених, що може свідчити про деструктивні зміни гепатоцитів (З.М. Даценко, 2002, Л.Г. Калачнюк, 2007). Співвідношення сумарної величини 6/3 ЖК у сироватці крові тварин І групи переважає його значення у контролі та становить 5,0 (контроль 4,9), у печінці 12,9 (контроль 7,8), що підтверджує наявність запального процесу в їх організмі. У випадку застосування препарату “Есенціале-форте” в сироватці крові та печінці відмічається зниження рівня насичених та підвищення - моно- і поліненасичених ЖК, співвідношення сумарної величини 6/3 ЖК у сироватці крові становить 4,5 (контроль 5,0), у печінці при застосуванні обох фосфоліпідовмісних засобів має однакове значення - 6,8 (контроль 7,8). Застосування щурам БАД FLP-MD супроводжується більш вираженим зниженням у сироватці крові та печінці рівня насичених ЖК за одночасного підвищення - моно- і поліненасичених, у тому числі есенційних ЖК, з відновленням умісту в сироватці крові протизапальних факторів - співвідношення сумарної величини 6/3 ЖК становить 5,0 (контроль 5,0).

Показники обміну жовчних кислот при експериментальному медикаментозному гепатиті у тварин з різною будовою гепатобіліарної системи та застосуванні засобів корегувальної терапії. Результати дослідження жовчно-кислотного складу еритроцитарної маси у щурів І групи (табл. 5) свідчать про зростання рівня таурохолевої (ТХК) кислоти на 22,5 %, сумарної фракції таурохено- і тауродезоксихолевої (ТХДХК + ТДХК) кислот - на 16,4 % та холевої (ХК) кислоти - на 28,6 %, сумарної фракції хено- і дезоксихолевої (ХДХК + ДХК) кислот - на 59,1 %, зниження - сумарної фракції глікохено- і глікодезоксихолевої (ГХДХК + ГДХК) кислот - на 15,0 % порівняно з контролем, що може бути наслідком порушення жовчовидільної функції печінки за розвитку експериментального гепатиту.

При застосуванні препарату “Есенціале-форте” відмічається вірогідне зниження в еритроцитарній масі рівня ТХК, ХК, сумарних фракцій ТХДХК + ТДХК і ГХДХК + ГДХК відповідно на 26,8; 14,3; 21,8 і 35,0 % та відновлення - ГХК, ХК і сумарної фракції ХДХК + ДХК порівняно з контролем, що може свідчити про позитивний вплив цього препарату на жовчоутворну і жовчовидільну функції печінки. У щурів ІІІ групи встановлено вірогідне зменшення в еритроцитарній масі вмісту ТХК, ГХК, ХК сумарних фракцій ТХДХК + ТДХК, ГХДХК + ГДХК і ХДХК + ДХК відповідно на 36,6; 35,7; 20,0; 41,8; 45,0 і 13,6 % порівняно з контролем, що доводить позитивний вплив компонентів БАД FLP-MD на ентерогепатичну циркуляцію жовчних кислот і, як наслідок, виявляє жовчогінний ефект дії.

Таблиця 5. Концентрація жовчних кислот в еритроцитах щурів при медикаментозному гепатиті та за різних способів корекції, мкг/мг білка (М ± m, n = 10)

Жовчно-кислотний спектр умісту порожньої кишки і калу в тварин І групи (табл. 6, 7) характеризуються вірогідним зниженням рівня усіх досліджуваних фракцій жовчних кислот, що може свідчити про порушення синтетичної та кон'югуючої функцій печінки, розвиток внутрішньопечінкового холестазу.

Таблиця 6. Рівень жовчних кислот у вмісті порожньої кишки щурів за умов моделі гепатиту та різних способів корекції, мкг/мг білка (М ± m, n = 10)

При застосуванні препарату “Есенціале-форте” у вмісті порожньої кишки відмічається відновлення рівня всіх видів жовчних кислот, що доводить його позитивний вплив на жовчоутворну та жовчовидільну функції печінки.

У щурів ІІІ групи спостерігається зростання у вмісті порожньої кишки рівня таких жовчних кислот, як ХК та сумарних фракцій ГХДХК + ГДХК і ХДХК + ДХК відповідно на 27,5; 50,3 і 58,6 % порівняно з контролем.

Жовчно-кислотний склад калу в тварин ІІ групи характеризується вірогідним зменшенням умісту ТХК і сумарної фракції ТХДХК + ТДХК відповідно на 33,1 і 31,0 % та відновленням рівня інших жовчних кислот порівняно з контролем, що може вказувати на збереження в їх організмі пулу перших та поліпшення ентерогепатичної циркуляції останніх. Водночас у щурів ІІІ групи спостерігається зростання у вмісті порожньої кишки рівня сумарної фракції ХДХК + ДХК - на 58,6 %, зменшення вмісту в калі ТХК і сумарної фракції ТХДХК + ТДХК відповідно на 21,9 і 26,1 % на фоні збільшення - сумарної фракції ХДХК + ДХК (на 24,3 %), а також тенденція до підвищення рівня інших фракцій жовчних кислот порівняно з контролем. Зазначене може свідчити про вияв жовчогінного ефекту БАД FLP-MD, позитивний вплив її компонентів на холатоутворну, кон'югуючу і етерифікуючу функції печінки, у тому числі поліпшення ентерогепатичної циркуляції жовчних кислот.

Таблиця 7. Вміст жовчних кислот у калі щурів за умов моделювання гепатиту та різних способів корекції, мкг/г калових мас (М ± m, n = 10)

Результати дослідження жовчно-кислотного спектра міхурової жовчі у мишей, хворих на експериментальний медикаментозний гепатит, свідчать про підвищення вмісту більшості досліджуваних фракцій жовчних кислот порівняно з контролем, що, ймовірно, пов'язано з розвитком у цих тварин внутрішньопечінкового холестазу. У мишей ІІ групи при застосуванні препарату “Есенціале-форте” виявлено істотне зниження рівня більшості жовчних кислот у міхуровій жовчі, особливо кон'югованих з гліцином і таурином, що пояснюється недостатнім відновленням кон'югуючої функції печінки. При застосуванні тваринам ІІІ групи БАД FLP-MD, у міхуровій жовчі встановлено вірогідне підвищення вмісту кон'югованих фракцій жовчних кислот поряд із відновленням рівня первинних, що, ймовірно, характеризує більш швидку репарацію пошкоджених гепатоцитів та поліпшення ентерогепатичної циркуляції цих сполук.

При дослідженні кількісних змін жовчно-кислотного спектра вмісту порожньої кишки у мишей, хворих на експериментальний медикаментозний гепатит, встановлено зниження рівня всіх фракцій жовчних кислот, що пояснюється суттєвими розладами синтетичної, кон'югуючої й елімінаційної функцій печінки і розвитком внутрішньопечінкового холестазу. У вмісті порожньої кишки мишей при застосуванні препарату “Есенціале-форте” відмічається підвищення рівня жовчних кислот, окрім первинних, рівень яких знижується, що може свідчити про недостатнє відновлення жовчоутворної функції печінки та ентерогепатичної циркуляції жовчних кислот з ймовірною компенсаторною активацією засвоєння останніх у кишечнику. Водночас у мишей ІІІ групи при застосуванні БАД FLP-MD у вмісті порожньої кишки встановлено вірогідне зниження рівня ТХК і ГХК жовчних кислот, що характеризує поліпшення їх ентерогепатичної циркуляції та збереженість для організму.

Показники прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в організмі щурів при експериментальному медикаментозному гепатиті та застосуванні засобів корегувальної терапії на основі фосфоліпідів різного походження. При дослідженні показників прооксидантно-антиоксидантної рівноваги у щурів І групи в сироватці крові (табл. 8) відмічається зростання концентрації ТБК-активних продуктів у 3,1 раза з одночасним зменшенням активності ГП - на 29,8 %, ГТ - на 41,4 % та концентрації GSН - на 91,1 % щодо контролю.

У щурів ІІ групи у сироватці крові встановлено збільшення концентрації ТБК-активних продуктів, активності СОД і Кат відповідно на 76,2, 10,8 % і в 2,1 раза. Проте зменшується концентрація GSН та активність ГП і ГТ відповідно на 33,3; 25,4 і 45,6 % порівняно з контролем, що може свідчити про недостатнє відновлення прооксидантно-антиоксидантної рівноваги в їх організмі. За умов застосування щурам ІІІ групи БАД FLP-MD у сироватці крові відмічається менш виражене підвищення концентрації ТБК-активних продуктів - на 40,5 %, відновлення активності СОД та збільшення - Кат на 92,9 %, зниження активності ГП і ГТ на 27,7 і 31,4 % відповідно, що може вказувати на активацію компенсаторних механізмів, спрямованих на зменшення інтенсивності утворення органічних пероксидів у реакціях вільнорадикального окиснення ліпідів за цієї патології.

Таблиця 8. Показники ПОЛ і АОЗ у сироватці крові щурів в умовах експерименту (M m, n = 10)

У печінці щурів І групи (табл. 9) відмічається зниження вмісту ТБК-активних продуктів - на 10,2 % поряд зі зменшенням активності СОД - на 22,6 % та суттєвим - умісту GSН - на 86,1 % порівняно з контролем, що пояснюється активацією процесів вільнорадикального окиснення ФЛ клітинних мембран гепатоцитів та порушенням їх цілісності внаслідок накопичення продуктів ліпопероксидації, яке має місце за умов розвитку запального процесу при пошкодженні клітин печінки.

У печінці щурів ІІ групи відбувається тенденція до відновлення вмісту ТБК-активних продуктів, активності СОД і Кат, що може свідчити про активацію захисних антиоксидантних факторів організму, спрямованих на стабілізацію рівноваги між про- і антиоксидантними процесами у паренхімі печінки. Поряд із цим, у печінці цих тварин спостерігається зниження вмісту GSН та активності ГТ відповідно на 44,7 і 24,4 %, що, очевидно, вказує на виснаження потенціалу захисних факторів глутатіонової системи.

Таблиця 9. Показники прооксидантно-антиоксидантної рівноваги у печінці щурів в умовах експерименту (M m, n = 10)

У щурів ІІІ групи встановлено відновлення у печінці вмісту ТБК-активних продуктів, вірогідне підвищення активності Кат - на 23,2 %, тенденцію до підвищення активності ГП, хоча вміст GSН і активність ГТ дещо зменшені (відповідно на 18,6 і 27,7 %), що, в цілому, характеризує стабілізувальну дію компонентів БАД FLP-MD у відношенні інтенсивності перебігу окисних процесів і, можливо, пов'язано з більш швидкою репарацією клітинних мембран у підтвердження антиоксидантних властивостей ФЛ.

Висновки

еритроцитарний ліпідний медикаментозний гепатит

У дисертаційній роботі наведене теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової задачі, щодо визначення змін у показниках обміну ліпідів і жовчних кислот за розвитку експериментального медикаментозного гепатиту, а також встановлення різного корегувального ефекту при застосуванні лікувальних засобів на основі фосфоліпідів: рослинного (препарат “Есенціале-форте”) й тваринного (ліпосомальна форма БАД FLP-MD) походження.

1. При клінічному, патолого-анатомічному і гістоморфологічному дослідженнях у печінці щурів, хворих на експериментальний медикаментозний гепатит, встановлено розвиток неспецифічного реактивного гепатиту з ознаками дистрофічних змін у гепатоцитах. У випадку застосування фосфоліпідовмісних препаратів відсутні макроскопічні та гістоморфологічні ознаки гепатиту, за винятком наявних ознак жирової дистрофії в окремих гепатоцитах при введенні препарату “Есенціале-форте”, що, в цілому, свідчить про більш швидке відновлення структурної організації гепатоцитів під їх впливом.

2. Зміни біохімічних показників сироватки крові у щурів за експериментального медикаментозного гепатиту свідчать про наявність клітинної деструкції, внутрішньопечінкового холестазу та зниження інтенсивності білоксинтетичних процесів у гепатоцитах. При застосуванні щурам препарату “Есенціале-форте” відмічається часткове відновлення в сироватці крові параметрів гепатоспецифічних біохімічних показників. У випадку введення щурам БАД FLP-MD встановлено відновлення значень усіх досліджуваних біохімічних показників, що вказує на краще виражений репаративний ефект.

3. У хворих щурів спостерігаються дисліпідемія і суттєві розлади ліпотропної функції печінки: зменшення вмісту вільних жирних кислот на 66,7 % в еритроцитарній масі; етерифікованого холестеролу, вільних жирних кислот і триацилгліцеролів відповідно на 46,1, 28,1 і 34,8 % у печінці; фосфоліпідів та етерифікованого холестеролу на 17,8 і 41,3 % у вмісті кишечника, в тому числі загальних фосфоліпідів на 13,9 % в еритроцитарній масі, на 21,7 % у сироватці крові, на 18,6 % у мікросомальній мембрані гепатоцитів та на 17,8 % у вмісті порожньої кишки. Краще виражене відновлення синтетичної, ферментативної та етерифікуючої функцій печінки відмічається при введенні в організм щурів БАД FLP-MD порівняно з ефектом від застосування препарату “Есенціале-форте”.

4. За експериментального медикаментозного гепатиту в щурів відбуваються істотні зміни ліпопротеїнового спектра сироватки крові: зниження рівня ліпопротеїнів дуже низької щільності на - 39,6 % та суттєве зростання - ліпопротеїнів низької щільності у 2,1 раза. При лікуванні препаратом “Есенціале-форте” залишається підвищеним у 2,3 раза вміст ліпопротеїнів низької щільності. У випадку застосування БАД FLP-MD кількісні характеристики ліпопротеїнів сироватки крові найбільш наближені до контрольних значень, що підтверджує її протиатерогенний ефект.

5. У щурів, хворих на медикаментозний гепатит, у сироватці крові та печінці відмічається вірогідне зростання рівня більшості насичених жирних кислот та зниження - моно- і поліненасичених з переважанням умісту ю-6 прозапальних жирних кислот, що може свідчити про порушення обміну жирних кислот і прогресування запального процесу на рівні печінки. У випадку застосування фосфоліпідовмісних засобів встановлено протилежну тенденцію, що більш виражено при введенні в організм БАД FLP-MD, доводячи її протизапальний ефект дії.

6. В еритроцитарній масі щурів, хворих на експериментальний медикаментозний гепатит, спостерігається зростання рівня частини жовчних кислот. Поряд із цим, у вмісті порожньої кишки та калі виявляється вірогідне зниження рівня більшості фракцій жовчних кислот, що може вказувати на порушення синтетичної та кон'югуючої функцій печінки і наявність холестазу. В мишей при дослідженні аналогічних показників у міхуровій жовчі та вмісті порожньої кишки виявлено подібну закономірність. При введенні БАД FLP-MD спостерігається жовчогінний ефект і більш швидка стабілізація кон'югуючої та етерифікуючої функцій печінки, ніж при застосуванні препарату “Есенціале-форте”.

7. За умов моделювання медикаментозного гепатиту в щурів встановлено пригнічення функціонування системи антиоксидантного захисту організму. При лікуванні хворих тварин препаратом “Есенціале-форте” залишається підвищена у сироватці крові концентрація ТБК-активних продуктів на тлі мобілізації факторів антиоксидантного захисту. Проте у сироватці крові та печінці цих тварин встановлено дефіцитний рівень показників глутатіонової системи. За умов застосування БАД FLP-MD, активність ферментів системи антиоксидантного захисту наближується до контрольних значень чи зростає на тлі одночасного зменшення вмісту відновленого глутатіону, що свідчить про мобілізацію захисних факторів в організмі цих тварин та підтверджує антиоксидантні властивості фосфоліпідів.

8. За медикаментозного гепатиту в тварин застосування препаратів на основі фосфоліпідів різного походження має подібний терапевтичний ефект. Краще виражене відновлення якісних та кількісних характеристик показників обміну ліпідів і жовчних кислот відмічено при пероральному введенні їм 1 %-го розчину ліпосомальної форми БАД FLP-MD один раз на добу, впродовж 50 діб у дозі 13,5 мг/кг маси тіла, що супроводжується проявом репаративного, протизапального, протиатерогенного, антиоксидантного, жовчоутворного і жовчогінного ефектів.

Література

1. Грищенко В.А. Біохімічні показники сироватки крові при медикаментозному гепатиті щурів та їх зміни за різних способів корекції / В.А. Грищенко, О.М. Литвиненко // Науковий вісник ЛНУВМБТ імені С.З. Гжицького - 2007. - Т. 9, № 3 (34), Ч. 2. - С. 54-57.

2. Грищенко В.А. Особливості жовчно-кислотного спектра міхурової жовчі та дуоденального вмісту в мишей при медикаментозному гепатиті і застосуванні корегуючої терапії / В.А. Грищенко, О.М. Литвиненко // Український біохімічний журнал - 2007. - Т. 79, № 4. - С. 97-101.

3. Литвиненко О. Дослідження дії фосфоліпідвмісної добавки на мембрани гепатоцитів / О. Литвиненко, Л. Степанова, В. Грищенко, Л. Бабич // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. - 2008. - Вип. 52-53. - С. 10-12.

4. Грищенко В.А. Вплив фосфоліпідовмісних препаратів на ліпідний спектр печінки щурів при медикаментозному гепатиті / В.А. Грищенко, О.М. Литвиненко // Науковий вісник ЛНУВМБТ імені С.З. Гжицького. - 2008. - Т. 10, № 2 (37), Ч. 2. - С. 64-67.

5. Мельничук Д.О. Ліпідний та ліпопротеїновий склад сироватки крові при медикаментозному гепатиті щурів за різних способів корекції / Д. О. Мельничук, В.А. Грищенко, О.М. Литвиненко // Доповіді Національної академії наук України. - 2008. - № 2. - С. 171-173.

6. Сердюков Я.К. Патолого-анатомічні та гістологічні зміни в печінці щурів за медикаментозного гепатиту / Я.К. Сердюков, О.М. Литвиненко, В.А. Грищенко // Современные проблемы токсикологии. - 2008. - № 2 - С. 63-65.

Размещено на Allbest.ru