Ліпідний склад плазматичної мембрани коренів проростків кукурудзи за умов засолення та обробки синтетичними регуляторами росту

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 577.115:581.144.2:581.526:661.126.6

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ЛІПІДНИЙ СКЛАД ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ КОРЕНІВ ПРОРОСТКІВ КУКУРУДЗИ ЗА УМОВ ЗАСОЛЕННЯ ТА ОБРОБКИ СИНТЕТИЧНИМИ РЕГУЛЯТОРАМИ РОСТУ

Контурська Ольга Олексіївна

Київ - 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі клітинної біології та анатомії рослин Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Палладіна Тетяна Олександрівна, Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України, провідний науковий співробітник відділу клітинної біології та анатомії рослин

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Кучмеровська Тамара Муратівна, Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, провідний науковий співробітник відділу біохімії коферментів;

доктор біологічних наук, професор Косаківська Ірина Василівна, Інститут ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України, провідний науковий співробітник відділу фітогормонології

Захист дисертації відбудеться «22» лютого 2010 р. о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий «19» січня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Т. Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним з найсильніших для рослин стресовим фактором є засолення ґрунтів, роль якого поряд з посухою посилюється у зв'язку з глобальними змінами клімату. За умов засолення рослини, на відміну від умов посухи та дії високих температур, зазнають не лише осмотичного, але й іонного стресу, які супроводжуються оксидативним [Zhu J-K., 2001, Munns R., Tester M., 2008]. Особливу загрозу створює накопичення іонів Na+, які є токсичними для рослинних організмів за рахунок дезорганізації метаболічних процесів у цитоплазмі. До того ж, на відміну від тваринних, у рослинних клітинах не існує спеціальних канальних структур для виведення іонів Na+, а його вміст у клітині регулюється сумісною роботою Na+/Н+ антипортера та Н+-АТФази [Niu X. et al., 1995, Палладина Т. А., 1999].

Першим мембранним бар'єром на шляху іонів Na+ є плазматична мембрана клітин коренів рослин. Встановлено, що основну частину ліпідного шару плазматичної мембрани клітин коренів складають фосфоліпіди, причому співвідношення окремих класів фосфоліпідів залежить від виду рослин [Gronewald J.W. et al., 1982, Brown D. J., Navari-Izzo F. et al. 1988, Dupont F., 1989, Norberg P., Liljenberg C., 1991]. На ранніх етапах вивчення ліпідних структурних компонентів плазматичної мембрани їх розглядали лише як механічний каркас, однак у подальшому встановлено, що фосфоліпіди та їх похідні відіграють значну роль у її функціонуванні. Так, виявлено, що робота Н+-АТФази, яка бере участь у видаленні іонів Na+ з клітини, залежить від співвідношення окремих класів фосфоліпідів та активується лізофосфатидилхоліном (ЛФХ) [Palmgren M. G., 1989, Педченко В. К., 1992]. Продукти деградації фосфоліпідів, зокрема фосфатидна кислота (ФК) [Munnik T., 2001], інозитолтрифосфат [Einspahr K. J., Thompson G. A., 1990], вільні жирні кислоти [Гречкин А. Н., Тарчевский И. А., 1999], беруть участь у трансдукції сигналів. Існує думка, що зміни співвідношення фосфоліпідів та інших ліпідоподібних компонентів плазматичної мембрани - стеринів, також сприяють адаптації рослин до стресових умов [Wu J., 1998].

Засолення завдає шкоди сільському господарству в багатьох регіонах світу [Flowers T. J., 2004], в тому числі на південному сході України, де воно останнім часом швидко поширюється, особливо на зрошуваних ґрунтах. Перспективи сільськогосподарського використання засолених ґрунтів пов'язують з посиленням солестійкості рослин. Спроби створення солестійких сортів сільськогосподарських культур методами класичної та клітинної селекції виявилися мало ефективними [Flowers T. J., 2004]. Радикальним способом розв'язання цієї проблеми вважається створення трансгенних форм рослин [Zhu J-K., 2001], проте цей спосіб є економічно виправданим тільки для головних агрокультур.

У той же час існує можливість значно посилити стійкість рослин до негативних умов, зокрема засолення, шляхом застосування синтетичних сполук. Тому увагу було зосереджено на синтезованих в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України препаратах метіур (натрієва сіль 6-метил-2-меркапто-4-гідроксипіримідину) та івін (N-оксид-2,6-диметилпіридин). Ці сполуки було кваліфіковано на підставі скринінгу як регулятори росту рослин стимулюючої дії. У попередніх дослідженнях показано антистресові властивості цих синтетичних препаратів, застосовування яких послаблювало інтенсивність процесів пероксидного окиснення в проростках кукурудзи та зменшувало гальмування їх росту, викликане експонуванням у присутності NaCl [Палладіна Т. О., 2001, Куриленко І. М., 2005]. Існують відомості щодо опосередкованої дії цих препаратів на генетичному рівні [Пономаренко С. П., 1999; Цыганкова В. А., 2003]. Виходячи з цього, було зроблено припущення, що обробка насіння метіуром та івіном впливаючи на функціонування ферментів деградації ліпідів та ліпідний склад плазматичної мембрани може сприяти адаптації рослин до умов засолення. Дослідження нового аспекту дії вищезазначених препаратів розширять можливості їх використання з метою підвищення солестійкості рослин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася у відповідності з планами фундаментальних досліджень відділу клітинної біології та анатомії рослин Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України: «Дослідження механізмів дії засолення ґрунтів на рослинні організми та підвищення їх солестійкості» (2004 р., № д/р 0106U000687), «Дослідження механізмів дії засолення ґрунтів на рослинні організми та підвищення їх солестійкості» (2005 р., № д/р 0106U000688), «Посилення солестійкості сільськогосподарських рослин за допомогою синтетичних антидепресантів» (2006 р., № д/р 0107U002627), «Механізми солепротекторної дії антидепресантів у рослинних організмах» (2007 р., № д/р 0107U002628); «Механізми адаптогенної дії синтетичних препаратів на рослинні організми за умов сольового стресу» (2008 р., № д/р 0108U007727).

Мета та завдання дослідження. Мета роботи: визначити ліпідний склад плазматичної мембрани клітин коренів проростків кукурудзи (Zea mays L.) за умов різного ступеня засолення та обробки насіння синтетичними препаратами.

Для досягнення мети поставлено такі завдання:

визначити загальний вміст ліпідів та співвідношення фосфоліпідів і стеринів у плазматичній мембрані коренів проростків кукурудзи за умов різного ступеня засолення та обробки синтетичними препаратами;

встановити фосфоліпідний склад плазматичної мембрани коренів проростків кукурудзи за умов різного ступеня засолення та обробки синтетичними препаратами;

дослідити вплив умов засолення та синтетичних препаратів на жирнокислотний склад плазматичної мембрани коренів проростків кукурудзи;

оцінити активність фосфоліпази D у тканинах коренів проростків кукурудзи під впливом NaCl та при обробці досліджуваними препаратами;

визначити ліпоксигеназну активність у тканинах коренів проростків кукурудзи за умов різного ступеня засолення та обробки метіуром та івіном;

дослідити антиоксидантні властивості синтетичних препаратів метіур та івін in vitro. фосфоліпідний кукурудза плазматичний мембрана

Об'єкт дослідження: напрямок та характер змін фосфоліпідного та жирнокислотного складу плазматичної мембрани, активності фосфоліпази D та ліпоксигеназної активності у коренях проростків кукурудзи за умов сольового стресу та під впливом препаратів метіур та івін.

Предмет дослідження: ліпідний склад плазматичної мембрани коренів проростків кукурудзи за умов сольового стресу та під впливом препаратів метіур та івін.

Методи дослідження: диференційне центрифугування (ізолювання фракції плазматичної мембрани), хроматографічний (розділення ліпідів на окремі класи), спектрофотометричний (визначення вмісту продуктів пероксидного окислення, вмісту загального білка та активності ферментів, кількості неорганічного фосфору).

Наукова новизна одержаних результатів. Проведено комплексне порівняльне дослідження змін співвідношення фосфоліпіди/стерини, фосфоліпідного та жирнокислотного складу плазматичної мембрани коренів проростків кукурудзи та активності ферментів деградації ліпідів, зокрема фосфоліпази D та ліпоксигенази, за умов різного ступеня засолення протягом коротко- та довготривалої експозиції. Вперше досліджено ефект обробки насіння синтетичними препаратами метіур та івін на ліпідний склад плазматичної мембрани коренів проростків кукурудзи за умов засолення. Показано, що обробка насіння метіуром та івіном приводить до активації фосфоліпази D та ліпоксигенази, у коренях проростків кукурудзи, які були експоновані у присутності 0,1 М NaCl.

У роботі продемонстровано в системі in vitro антиоксидантні властивості препарату метіур за антирадикальним механізмом.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати досліджень розширюють уявлення про механізм впливу синтетичних препаратів адаптогенної дії метіур та івін на рослинні організми. Дані можуть бути використані для розробки методів підвищення солестійкості рослин за допомогою використання синтетичних сполук з метою збільшення продуктивності сільськогосподарських культур на засолених ґрунтах, а також за умов посухи та техногенних забруднень.

Особистий внесок здобувача. Дисертанткою самостійно проведено пошук і аналіз вітчизняної та зарубіжної літератури з даної проблеми, виконано всі експериментальні дослідження, зроблено обробку отриманих результатів. Спільно з науковим керівником розроблено напрямок досліджень, висунуто робочу гіпотезу, сформульовано завдання роботи, обґрунтовано методологію постановки експериментів, зроблено узагальнення отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи доповідалися на ІІ Міжнародній конференції студентів та аспірантів „Молодь і поступ біології” (Львів, 2006); Міжнародній конференції молодих учених-ботаніків „Актуальні проблеми ботаніки, екології та біотехнології” (Київ, Україна, 2006); III International young scientists conference „Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution” (Одеса, 2007); 7th International conference „Eco-physiological aspects of plant responses to stress factors” (Kracow, Poland, 2007); 2nd International symposium „Plant growth substances: intracellular hormonal signaling and applying in agriculture” (Kyiv, 2007); International conference „Biostimulators in modern agriculture” (Warsaw, Poland 2008); The FESPB Congress (Tampere, Finland, 2008), Міжнародній конференції молодих учених-ботаніків “Актуальні проблеми ботаніки та екології” (м. Кам'янець-Подільський, 2008).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 11 наукових робіт, у тому числі 3 статі у провідних фахових виданнях, затверджених переліком ВАК України, та 8 тез у збірках матеріалів вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, узагальнення, висновків та списку використаних джерел, який містить 209 найменувань. Робота викладена на 128 сторінках, містить 14 таблиць та 11 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень

У дослідах використовували проростки кукурудзи сортолінійного гібриду Колективний 225 МВ, які вирощували на поживному середовищі Хогланда при 24°С за умов 16-годинного світлового дня (освітлення здійснювали люмінесцентними лампами 50 Вт/м2). Обробку насіння проводили шляхом намочування його протягом доби у водних розчинах метіуру та івну у кінцевій концентрації 10-7 [Вакуленко В. В., 1992]. Для створення сольового стресу 7-добові проростки культивували протягом доби та 10-ти діб за наявності у поживному середовищі 0,05 або 0,1 М NaCl. Гомогенати тканин та препарати плазматичної мембрани одержували з коренів 8- та 17-добових проростків.

Фракцію плазматичної мембрани ізолювали методом диференційного центрифугування у градієнті густини сахарози за [Leonard R. T., Van der Woude W. J., 1976]. Екстракцію ліпідів проводили за методом [Bligh E. G., Dyer W. J., 1959]. Для розділення сумарних ліпідів на класи (фосфоліпіди та стерини) використовували тонкошарову хроматографію на стандартних силікагелівих пластинках. Хроматографічні зони ліпідів визначали в парі йоду, ідентифікацію проводили за допомогою стандартів ліпідів та якісних реакцій. Кількість фосфоліпідів визначали за неорганічним фосфором, що утворювався після їх спалення. Жирні кислоти аналізували за допомогою методу газорідинної хроматографії.

Активність фосфоліпази D визначали за методом [Котельникова И. М., 2004], що базується на здатності ферменту в присутності спиртів переносити фосфатидильну групу на спирт. Активність фосфоліпази D оцінювали за утворенням фосфатидилметанолу (ФМ).

Ліпоксигеназну активність оцінювали за методом [Ильинская Л. И., 2000], що базується на здатності ферменту окислювати ненасичені жирні кислоти до гідроперекисів, використовуючи лінолеву кислоту як субстрат.

Антиоксидантну активність препаратів визначали у системі in vitro з використанням міцел лінолевої кислоти за вмістом тіобарбітурової кислоти (ТБК)-активних продуктів за методом [Dhindsa R.S., 1981]. Для оцінки антирадикальної активності синтетичних препаратів використовували їх реакцію з вільним стабільним радикалом дифенілпікрилгідразилом (ДФПГ) [Починок Т. В., 1985].

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програм “Excel 2002” та “Origin 6.0”. Відмінності результатів, що обговорюються в роботі вірогідні при рівні значимості Р?0,05 за критерієм Ст'юдента.

Результати дослідження та їх обговорення

Нашими дослідженнями з'ясовано особливості ліпідного складу плазматичної мембрани та функціонування ферментів деградації ліпідів у коренях проростів кукурудзи за умов засолення та обробки насіння препаратами івін та метіур (рис. 1).

Фосфоліпідний склад плазматичної мембрани коренів проростків кукурудзи за умов засолення. Аналіз ліпідного складу препаратів плазматичної мембрани клітин коренів показав, що сольова експозиція проростків мало позначилася на загальному вмісті ліпідів, проте змінювала співвідношення фосфоліпіди/стерини (рис. 2). Присутність 0,1 М NaCl у поживному середовищі викликала збільшення вмісту стеринів з одночасним зменшенням кількості фосфоліпідів, що привело до зменшення значення співвідношення фосфоліпіди/стерини (рис. 2). Обробка насіння синтетичними препаратами практично не вплинула на загальний вміст ліпідів, а також на співвідношення фосфоліпіди/стерини. Однак у разі сольової експозиції проростків з обробленого насіння у присутності 0,1 М NaCl у поживному середовищі відмічено збільшення значення співвідношення фосфоліпіди/стерини у порівнянні з сольовим варіантом, за рахунок збільшення кількості фосфоліпідів, причому ці значення наближалися до значень безсольового контролю (рис. 2).

Фосфоліпіди плазматичної мембрани клітин коренів проростків кукурудзи представлені переважно фосфатидилхоліном (ФХ) та фосфатидилетаноламіном (ФЕА), а також фосфатидилінозитом (ФІ), фосфатидилгліцерином (ФГ) та невеликою кількістю фосфатидилсеріну (ФС). Присутність NaCl у поживному середовищі змінювала співвідношення основних класів фосфоліпідів (табл. 1). Виявлено, що сольова експозиція проростків кукурудзи викликала зменшення вмісту ФХ та ФЕА у плазматичній мембрані цих проростків, причому такі зміни посилювались зі збільшенням концентрації солі та терміну сольової експозиції (табл. 1). Співвідношення ФХ/ФЕА при дії різних концентрацій солі суттєво не змінилось. На фоні таких змін відмічено збільшення вмісту ФІ, ФК та ЛФХ.

Дослідження впливу обробки насіння синтетичними препаратами у разі сольової експозиції та без неї засвідчило відміни їх дії на фосфоліпідний склад плазматичної мембрани. Обробка насіння метіуром викликала збільшення ФХ на фоні зменшення ФЕА, причому у разі сольової експозиції така тенденція змін вмісту цих фосфоліпідів зберігалась (табл. 1). Імовірно, що такий перерозподіл головних ліпідів має адаптивний характер. Головне значення такого перерозподілу полягає в заміні ФЕА, що легко руйнується, на ФХ, який є більш стійким щодо дії ферментів деградації ліпідів та має виразну антиокиснювальну активність [Котлова И. М., 2003].

У свою чергу обробка насіння івіном мала протилежний результат - збільшення вмісту ФЕА з одночасним зменшенням вмісту ФХ (табл. 1). Сольова експозиція проростків з такого насіння збільшувала вміст ФЕА при цьому ж підвищувала вміст ФХ у порівнянні з сольовим контролем (табл. 1).

Активність фосфоліпази D у тканинах коренів проростків кукурудзи за умов засолення та обробки синтетичними препаратами. Показані зміни співвідношення компонентів фосфоліпідної фракції та збільшення в ній частки ФК за умов засолення можуть вказувати на залучення у ці процеси фосфоліпази D. Показано, що експозиція проростків у присутності 0,05 М NaCl посилювала активність фосфоліпази D у 2 рази в порівнянні з контрольним варіантом, при цьому відмічено і збільшення вмісту ФК (табл. 1). Експозиція проростків у присутності 0,1 М NaCl навпаки знижувала в 2 рази активність ферменту (рис. 3), проте зниження вмісту ФК у плазматичній мембрані за таких умов не спостерігалось, а навпаки було відмічено збільшення вмісту цього фосфоліпіда. Встановлений ефект, вірогідно, зумовлюється іншими шляхами утворення цього фосфоліпіда, а саме через реакцію фосфорилювання діацилгліцеролу, яку відмічено при гіперосмотичному стресі у різних видів рослин [Munnik T., 2000, Arizs S. A, 2003].

Застосування метіуру при сольовій експозиції призвело до підвищення в 2 рази активності фосфоліпази D у коренях проростків (рис. 3), проте за таких умов відмічено зниження вмісту ФК щодо сольового контролю (табл. 1). У разі обробки івіном активність фосфоліпази D (рис. 3) також підвищилась у 2 рази, однак вміст ФК наближався до значень сольового варіанту(табл. 1)

Ліпоксигеназна активність у тканинах коренів проростків кукурудзи за умов засолення та обробки синтетичними препаратами. Збільшення вмісту ЛФХ (таб.1) за умов засолення свідчить про активацію фосфоліпази А2, через що у клітинах збільшується вміст вільних ненасичених жирних кислот, але значного їх накопичення не відбувається завдяки роботі ліпоксигеназ. Окислюючи вільні ненасичені жирні кислоти ліпоксигенази дають початок ліпоксигеназній сигнальній системі [Гречкин А. Н., 1999].

У наших дослідах присутність у поживному середовищі 0,05 М NaCl протягом доби приводила до підвищення ліпоксигеназної активності в 1,4 раза у порівнянні з контрольним варіантом, що може вказувати на розвиток адаптаційних процесів, тоді як подовження експозиції спричинило інгібування активності цих ферментів (рис. 4). При концентрації солі 0,1 М спостерігали зменшення ліпоксигеназної активності (рис. 4). Обробка синтетичними препаратами насіння спричинила підвищення ліпоксигеназної активності у тканинах коренів проростків, які експонували у присутності 0,1 М NaCl протягом десяти діб щодо сольового контролю (рис. 4).

Посилення ліпоксигеназної активності та активності фосфоліпази D при застосуванні метіуру та івіну може зумовлюватися здатністю цих сполук впливати на процеси білкового синтезу [Пономаренко С. П., 1999; Цыганкова В. А., 2003].

Вплив синтетичних препаратів на вміст жирних кислот у плазматичній мембрані коренів проростків кукурудзи за умов сольового стресу. Властивості бішару плазматичної мембрани значною мірою визначаються природою ацильних ланцюгів ліпідів, що його утворюють. Аналіз жирнокислотного складу плазматичної мембрани клітин коренів проростків кукурудзи показав, що переважають пальмітинова та лінолева кислоти, а також ідентифіковані стеаринова, міристинова, олеїнова, ліноленова, ерукова, бегенова жирні кислоти (табл. 2).

Присутність обох досліджуваних концентрацій NaCl у поживному середовищі приводила до збільшення загального вмісту насичених жирних кислот та зменшення ненасичених жирних кислот, що знижує їх співвідношення та індекс ненасиченості, причому такі зміни посилювались зі збільшенням терміну сольової експозиції (табл. 2). Обробка насіння метіуром та івіном та сольова експозиція проростків з такого насіння мали протилежний ефект - збільшення індексу ненасиченості жирних кислот. При цьому значення індексу ненасиченості у плазматичній мембрані коренів проростків з обробленого препаратами насіння наближувалось до значення контрольного варіанту (табл. 2).

Збільшення ненасиченості можна пояснити послабленням процесів перекисного окиснення ліпідів. Раніше відмічено, що обробка насіння метіуром та івіном приводила до зменшення рівня ініційованої хемілюмінесценції у тканинах проростків, що зазнавали впливу 0,1 М NaCl [Куриленко І. М., 2005], що свідчить про здатність цих препаратів зменшувати ступінь окисного пошкодження. Більш того, метіур та івін здатні посилювати активність ферментів антиоксидантного захисту, що ймовірно опосередковується впливом цих препаратів на білковий синтез [Куриленко І. М., 2005].

Антиоксидантні властивості синтетичних препаратів у системі in vitro. Продемонстрований нами вплив обробки насіння метіуром та івіном на зміни ненасиченості жирних кислот можливо зумовлено антиоксидантною природою цих препаратів, яку вони виявили в дослідах in vivo, посилюючи активність ферментів антиоксидантного захисту [Куриленко І. М., 2005]. Визначення вмісту ТБК-активних продуктів у реакційних сумішах у присутності синтетичних препаратів дозволило оцінити їх загальну антиоксидантну спроможність у системі in vitro.

Встановлено, що вміст ТБК-активних продуктів у присутності в реакційній суміші метіуру нижче на 43% щодо контрольного варіанту (табл. 3) На відміну від метіуру, івін суттєво не впливав на вміст ТБК активних продуктів. Згідно з будовою молекули метіуру (рис. 1) його можна віднести до групи речовин з антирадикальними властивостями, що здатні in vitro відновлювати вільні радикали, зокрема стабільний радикал ДФПГ [Зайцев В. Г., 2003]. Нами виявлено, що вміст ДФПГ (радикальна форма) в реакційній суміші у присутності метіуру зменшувалася на 37%, тоді як присутність івіну не змінювала кількості цього стабільного радикалу (табл. 3).

Результати проведених досліджень продемонстрували участь ліпідної частини плазматичної мембрани у стресовій відповіді клітин коренів проростків кукурудзи на засолення середовища, яка відбувається через зміни у складі та співвідношенні ліпідних компонентів. Адаптивний ефект препаратів метіур та івін на фоні засолення здійснюється шляхом нормалізації ліпідного складу плазматичної мембрани, що може сприяти функціонуванню білків транспортних і сигнальних систем. Виявлена у метіуру антиоксидантна активність антирадикального типу, на відміну від івіну, вказує на певні відміни у механізмах дії цих сполук у рослинних організмах.

ВИСНОВКИ

Досліджено ліпідний склад плазматичної мембрани та активність ферментів деградації ліпідів у клітинах коренів проростків кукурудзи (Zea mays L.) впродовж 1 та 10 діб експозиції у присутності 0,05 М та 0,1 М NaCl. Вперше показано вплив синтетичних препаратів метіур та івін, застосованих шляхом обробки насіння, на ліпідний склад плазматичної мембрани та активність ферментів деградації ліпідів у коренях проростків кукурудзи за умов засолення.

Показано, що присутність NaCl не змінювала загальний вміст ліпідів у плазматичній мембрані коренів проростків кукурудзи, проте зменшувала значення співвідношення фосфоліпіди/стерини. При цьому обробка насіння препаратами метіур та івін приводила до його збільшення через підвищення загального вмісту фосфоліпідів.

Знайдено, що умови сольового стресу спричиняли зменшення вмісту у плазматичній мембрані основних фосфоліпідів фосфатидилхоліну та фосфатидилетаноламіну на фоні збільшення вмісту фосфатидилінозиту, фосфатидної кислоти та лізофосфатидилхоліну. За таких умов обробка насіння метіуром привела до збільшення вмісту фосфатидилхоліну та зменшення вмісту фосфатидної кислоти та лізофосфатидилхоліну, тоді як обробка івіном спричинила збільшення вмісту фосфатидилетаноламіну та фосфатидної кислоти, що вказує на відмінності механізмів дії цих препаратів у рослинних організмах, зокрема за умов стресового стану.

Показано, що активність фосфоліпази D у тканинах коренів проростків кукурудзи інгібувалась під впливом 0,1 М NaCl, причому цей процес посилювався з подовженням терміну сольової експозиції. Застосування препаратів метіур та івін привело до підвищення активності цього ферменту, що сприяло адаптаційному процесу.

Встановлено, що сольова експозиція викликала зменшення індексу ненасиченості жирних кислот у плазматичній мембрані коренів проростків кукурудзи. Обробка насіння синтетичними препаратами збільшувала цей показник.

Виявлено, що ліпоксигеназна активність у тканинах коренів проростків кукурудзи при помірному засоленні посилювалась, тоді як критичний рівень засолення спричинив інгібування активності цього ферменту. Проте обробка насіння метіуром та івіном посилювала ліпоксигеназну активність у тканинах коренів проростків, експонованих у присутності 0,1 М NaCl, протягом десяти діб, що сприяло адаптаційному процесу.

Продемонстровано, що препарат метіур виявляв антиоксидантні властивості за антирадикальним механізмом у системі in vitro, тоді як препарат івін не мав такої здатності.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Контурська О. О. Ліпоксигеназна активність в коренях проростків кукурудзи за умов засолення та обробки синтетичними регуляторами росту/ О. О. Контурська, Т. О. Палладіна // Доповіді НАН України. - 2006.- №11.- С.184-187.

2. Контурська О. О. Фосфоліпідний склад плазмалеми коренів проростків кукурудзи за умов засолення та обробки синтетичними препаратами / О. О. Контурська, Т. О. Палладіна // Вісник Харьківського національного аграрного університету. - 2007.- 2(11). - С. 64-68.

3. Контурська О. О. Активність фосфоліпази D у коренях проростків за умов сольового стресу та передпосівного оброблення кукурудзи препаратами адаптогенної дії/ О. О. Контурська, Т. О. Палладіна // Укр. біохім. журн. - 2008. - Т.80, №2. - С. 141-146.

4. Контурська О. О. Вплив NaCl на ліпоксигеназну активність в коренях проростків кукурудзи/ О. О Контурська // Молодь та поступ біології: міжнар. конф., 21-24 бер. 2006 р.: тези доп. - Львів, 2006. - С. 56.

5. Контурська О. О. Вплив регуляторів росту на ліпоксигеназну активність в коренях проростків кукурудзи за умов засолення/ О. О. Контурська // Актуальні проблеми ботаніки, екології та біотехнології: міжнар. конф., 27-30 вер. 2006 р.: тези доп. - К., 2006. - С. 147-148.

6. Konturska O. Effect of synthetic compounds on phospholipids composition of plasmalemma from root of corn seedlings under salt stress/ O. Konturska // Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution: international young scientist conference, 15-18 May 2007: abstract. - Odesa, 2007 - P. 35.

7. Konturska O. Lipid comроsition of plasmalemma from root of corn seedlings under the salt stress and synthetic compounds treatment/ O. Konturska, T. Palladina // Eco-physilogical aspects of plant responses to stress factors: international conference, 19-22 September 2007: abstract. - Kracow, 2007 - P. 75.

8. Konturska O. Effect of synthetic preparations on peroxidation processes in corn roots under salinity/ I. Kurylenko, T. Palladina // Plant growth substances: intracellular hormonal signaling and applying in agriculture: international symposium, 8-12 October 2007: abstract. - Kyiv, 2007 - P. 140.

9. Konturska O. Effect of synthetic growth stimulators on activity of phospholipase D in roots of corn seedlings under salinity stress/ O. Konturska, T. Palladina // Biostimulators in modern agriculture: conference, 7-8 February 2008: abstract. - Warsaw,2008. - P. 52.

10. Konturska O. Effect of synthetic growth stimulators on lipids composition o f plasma membranes from root of maize seedlings under salinity stress/ O. Konturska, T. Palladina // Congress of FESPB, 17-22 August 2008: abstract. - Tampere, 2008. - P. 91.

11. Контурська О. Вплив синтетичних препаратів адаптогенної дії на жирнокислотний склад плазматичних мембран з коренів проростків кукурудзи за умов засолення/ О. Контурська //Актуальні проблеми ботаніки та екології: міжнар. конф., 13-16 вересня 2008 р.: тези доп. - Кам'янець-Подільський, 2008. - С. 224-225.

АНОТАЦІЯ

Контурська О. О. Ліпідний склад плазматичної мембрани коренів проростків кукурудзи за умов засолення та обробки синтетичними регуляторами росту. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2009.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню ліпідного складу плазматичної мембрани та активності фосфоліпази D, ліпоксигенази у коренях проростків кукурудзи за умов сольового стресу, а також вивченню ефекту метіуру та івіну на вищезазначені показники, застосованих з метою корекції сольового впливу.

Виявлено, що стрес, індукований NaCl, викликав зміни співвідношення ліпідних компонентів плазматичної мембрани, причому їх напрям залежав від сили та тривалості дії стресового фактору. Помірне засолення спричиняло підвищення активності фосфоліпази D та ліпоксигенази, тоді як критичний рівень засолення зменшував їх активність.

Показано, що обробка насіння метіуром та івіном приводила до нормалізації ліпідного складу плазматичної мембрани та підвищення активності досліджуваних ферментів у коренях проростків кукурудзи за умов засолення.

Продемонстровано, що препарат метіур у системі in vitro виявив антиоксидантну активність за антирадикальним механизмом.

Використання метіуру та івіну може бути запропоновано для розробки методів підвищення солестійкості рослин.

Ключові слова: плазматична мембрана, ліпіди, фосфоліпаза D, ліпоксигеназа, сольовий стрес, метіур, івін.

АННОТАЦИЯ

Контурская О. А. Липидный состав плазматической мембраны корней проростков кукурузы в условиях засоления и обработки синтетическими регуляторами роста. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2009.

Диссертационная работа посвящена исследованию липидного состава плазматической мембраны и активности фосфолипазы D, липоксигеназы в корнях проростков кукурузы в условиях солевого стресса, а также изучению эффекта метиура и ивина на вышеуказанные показатели, использованные с целью коррекции солевого влияния.

Установлено, что стресс, индуцированный NaCl, приводил к изменениям соотношения липидных компонентов плазматической мембраны, причем их направление зависело от силы и продолжительности действия стрессового фактора. Умеренное засоление вызывало повышение активности фосфолипазы D и липоксигеназы, тогда как критический уровень засоления уменьшал их активность.

Показано, что обработка семян метиуром и ивином приводила к нормализации липидного состава плазматической мембраны и повышению активности исследуемых ферментов в условиях засоления.

Продемонстрировано, что препарат метиур в системе in vitro проявлял антиоксидантную активность по антирадикальному механизму.

Использование метиура и ивина может быть предложено для разработки методов повышения солеустойчивости растений.

Ключевые слова: плазматическая мембрана, липиды, фосфолипаза D, липоксигеназа, солевой стресс, метиур, ивин.

SUMMARY

Konturska O. O. Lipid composition of maize seedling roots plasma membrane under salinity and synthetic growth regulators treatment. - Manuscript.

Thesis for the candidate of biological sciences degree in speciality 03.00.04 - Biochemistry. - Kyiv Taras Schevchenko National University, Kyiv, 2009.

The thesis deals with the investigation of alterations in lipid composition of maize seedlings roots plasma membrane and lipid degradation enzymes under the salt stress condition and possibility correcting these processes by synthetic compounds methyure and ivine.

It was shown that the salt exposition had not influence on general lipids content in plasma membrane, however it changed the phospholipids/sterols ratio. The synthetic compounds treatment induced the phospholipids/sterols ratio restoration raising the phospholipids content.

Analysis of phospholipids composition showed that it is represented by phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine and phosphatidic acid. Maize seedlings exposition to 0,05 M and 0,1 M NaCl during 1 and 10 days changed the phospholipids ratio. It was shown that the salt exposition decreased phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine contents in plasma membrane and it intensified with the salt concentration increase. At that time, phosphatidylinositol, phosphatidic acid and lysophosphatidylcholine content increased under salt exposition. The methyure treatment increased phosphatidylcholine content and decreased phosphatidylethanolamine content in plasma membrane. The ivine treatment had opposite effect.

Lessening of main phospholipid content under salinity probably is induced by alteration of phospholipase D activity. It was observed that the maize seedlings exposition to 0,05 M NaCl increased phospholipase D activity whereas exposition to 0,1 M NaCl reduced the enzyme activity. The synthetic compounds treatment enhanced phospholipase D activity in root tissues of seedlings exposed to 0,1 M NaCl. The raised lysophosphatidylcholine content in plasma membrane indicates the increase of phospholipase A2 activity. It induces an accumulation of free fatty acids in cells, which leads to cell damage. However it doesn't occur because lipoxygenase turns free fatty acids into oxylipins using molecular oxygen. The maize seedlings exposition to 0,05 M NaCl during day increased lipoxygenase activity whereas 10-day exposition decreased the enzyme activity. The high salt concentration also decreased lipoxygenase activity. The synthetic compounds treatment increased lipoxygenase activity in root under 10 day exposition to 0,1 M NaCl, which indicated a contribution to adaptive processes.

Analysis of fatty acids composition indicated that it was represented mainly by palmitic acid and linoleic acid. Oleic acid, linolenic acid, stearic acid were also identified. The salt exposition caused rise of saturated fatty acid content resulted in decrease of unsaturation index. It was observed that the methyure and ivine treatment increased the usaturated fatty acids content and decreased the saturated fatty acids content in plasma membrane of seedlings exposed to 0,1 M NaCl. It resulted in the rise of unsaturation index. The effect of synthetic compounds on the unsaturated fatty acids content probably was caused by antioxidant ability of synthetic compounds. It was shown in vivo that synthetic compounds enhanced the antioxidant enzymes activity. Definition of TBA-active products content in the reaction mixture in methyure and ivine presence was used for assessment antioxidant feature in vitro. It was revealed that methyure decreased the TBA-active products content in the reaction mixture. On the basis of methyure molecule structure, it can be referred as synthetic compound with antiradical feature, which has ability to reduce free radical including stable free radical diphenylpicril hydrozyl (DPPH) in vitro. It was shown that methyure reduced the DPPH molecule and while ivine didn't. Obtained data indicate the possibility of using methyure and ivine for plant salt-tolerance increase.

Key words: plasma membrane, lipids, phospholipase D, lipoxygenase, salt stress, methyure, ivine.

Размещено на Allbest.ru