Участь активних форм кисню у розвитку фітотоксичної дії гербіцидів інгібіторів ацетил-коа-карбоксилази

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ

03.00.12. - фізіологія рослин

УДК 581. 132:632.954:633.15

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

УЧАСТЬ АКТИВНИХ ФОРМ КИСНЮ У РОЗВИТКУ ФІТОТОКСИЧНОЇ ДІЇ ГЕРБІЦИДІВ ІНГІБІТОРІВ АЦЕТИЛ-КОА-КАРБОКСИЛАЗИ

Паланиця Марія

Павлівна

Київ- 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділлі фізіології дії гербіцидів Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ

Науковий керівник: доктор біологічних наук Мордерер Євген Юлійович Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, завідувач відділу фізіології дії гербіцидів

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук член-кореспондент НАН України Швартау Віктор Валентинович Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, завідувач відділу фізіології живлення рослин доктор біологічних наук Колупаєв Юрій Євгенович Харківський національний аграрний університет ім. В.В. Докучаєва, професор кафедри ботаніки і фізіології рослин

Захист дисертації відбудеться « 18 » березня 2010 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ, вул. Васильківська, 31/17

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ, вул. Васильківська, 31/17

Автореферат розіслано «11» лютого 2010 р.

В.о. вченого секретаря спеціалізованої вченої ради, д.б.н. Кірізій Д.А.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гербіциди інгібітори ацетил-КоА-карбоксилази (АКК) утворюють групу так званих грамініцидів, оскільки діють виключно на рослини з родини тонконогових (злакових). Грамініциди є найбільш ефективним сучасним засобом боротьби зі злаковими бур'янами, вони становлять понад 10% сучасного світового ринку гербіцидів і поряд з інгібіторами ацетолактатсинтази (АЛС) являють собою найбільш перспективну в комерційному плані групу препаратів [Harwood, 1999]. Однак суттєвим недоліком грамініцидів є зменшення ефективності їх дії при несприятливих погодних умовах [Collings et all., 2003] та антагоністична взаємодія з гербіцидами, ефективними проти дводольних видів бур'янів [Мордерер та ін., 1996; Baerg et all., 1996; Culpepper et all., 1999; Palmer et all., 1999, Gardner et al., 2006].

Встановлено, що антагоністичне зменшення фітотоксичності грамініцидів не пов'язане зі змінами у їх надходженні, транслокації, метаболізмі або інгібуванні активності АКК [Bjelk et all., 1992]. З цього випливає, що остаточна фітотоксичність інгібіторів АКК не детермінована однозначно інгібуючою активністю у сайті дії, а залежить від проходження індукованого грамініцидами патогенезу.

Дані щодо зменшення фітотоксичності грамініцидів антиоксидантами [Banas et all., 1993; Shimabucuro et all., 2001] свідчать, що дія грамініцидів може бути пов'язана з прискоренням реакцій ПОЛ, аналогічно тому як це відбувається за дії гербіцидів, що порушують процес фотосинтезу [Fuerst et all., 1991; Dan Hess, 2000]. Однак прямий вплив грамініцидів на реакції ПОЛ не досліджувався.

Порівняно недавно було встановлено, що утворення активних форм кисню (АФК) при дезорганізації гербіцидами процесу фотосинтезу може призводити не тільки до стимуляції реакцій ПОЛ та пошкодження мембран, але й до індукції процесу програмованої загибелі клітин (ПЗК) [Ross et all., 2006; Graham, 2005; Murgia, 2004; Chen et all., 2004; De Freitas et all., 2007]. Таким чином, для розробки методів підвищення ефективності застосування грамініцидів та запобігання втрат їх фітотоксичності актуальним є розкриття механізму індукованого грамініцидами патогенезу, зокрема дослідження ролі АФК у цьому процесі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках відомчої теми відділу фізіології дії гербіцидів «Дослідження фітотоксичної дії гербіцидів інгібіторів ацетил-КоА-карбоксилази» (№ держреєстрації 0103U002398).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягає у розкритті природи індукованого грамініцидами патогенезу та розробці методів підвищення їх фітотоксичності. Для досягнення вказаної мети поставлені наступні завдання досліджень:

· Вивчити вплив антиоксидантів та пероксиду водню на індукцію грамініцидами некрозів меристем.

· Оцінити вплив грамініцидів на реакції пероксидного окиснення ліпідів.

· Визначити вміст пероксиду водню (ПВ), супероксидного аніон-радикала (САР) та зміни активності антиоксидантних ферментів - супероксиддисмутази (СОД), каталази та пероксидази за дії грамініцидів та модифікаторів їх активності.

· Дослідити характер деградації ДНК за дії грамініцидів.

· Визначити можливість підвищення фітотоксичної дії грамініцидів за рахунок комплексування з гербіцидами, що можуть стимулювати окиснювальні процеси у рослин з родини тонконогових.

Об'єкт дослідження: процес патогенезу, індукованого гербіцидами інгібіторами АКК.

Предмет дослідження:

АФК, реакції ПОЛ, активність анти-/прооксидантних ферментів, деградація ДНК за дії гербіцидів інгібіторів АКК.

Наукова новизна отриманих результатів. Розкрито природу індукованого грамініцидами патогенезу. Вперше показано, що некроз, індукований у меристемах злакових рослин грамініцидами, не пов'язаний безпосередньо із інтенсифікацією реакцій ПОЛ. Фітотоксична дія грамініцидів в меристемах реалізується шляхом індукції оксидного стресу: дія гербіцидів призводить до утворення АФК, які викликають деградацію ДНК, наслідком чого є некротизація меристем та загибель рослин. За дії грамініцидів встановлено короткочасне підвищення вмісту ендогенного пероксиду водню та тривале збільшення вмісту супероксидного аніон-радикала. Показано зміни в динаміці анти-/прооксидантних ферментів за дії грамініцидів та модифікаторів їх активності.

Практичне значення одержаних результатів. На підставі одержаних експериментальних даних запропоновано метод підвищення фітотоксичності грамініцидів шляхом індукції оксидативних реакцій за допомогою речовин-прооксидантів.

Показано, що вибірна фітотоксичність грамініциду феноксапроп-Р-етилу може бути збільшена за рахунок застосування у потрійній суміші з синергістом метрибузином та антагоністами - гербіцидами інгібіторами АЛС. Отримано патент «Високоефективна гербіцидна композиція для захисту посівів зернових колосових від злакових та дводольних бур'янів». Розроблено технологію комплексного застосування грамініциду галоксифоп-R-метилу у сумішах з гербіцидом оксифлуорфеном в посівах цибулі.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто здійснені інформаційний пошук та аналіз літературних даних. Спільно з науковим керівником роботи визначено мету і завдання досліджень, розроблена робоча гіпотеза та методологія постановки експериментів, проведені інтерпретація та узагальнення результатів досліджень, підготовлено друковані праці. Експериментальні дослідження проводилися автором особисто та за участю співробітників відділу фізіології дії гербіцидів. Дослідження процесу деградації ДНК проводилися за сприяння завідувача відділу генетичної інженерії д.б.н. Тищенко О.М.. Частка особистої участі дисертанта складає 70%.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційного дослідження були представлені на 2-му міжнародному симпозіумі “Plant growth substances: intracellular signaling and applying in agriculture” (Київ, 2007), 3-5 міжнародних наукових конференціях студентів та аспірантів “Молодь та поступ біології”(Львів, 2007, 2008 та 2009 рр..), 10-й конференції молодих вчених “Сучасний стан і пріоритети розвитку фізіології рослин, генетики і біотехнології”(Київ, 2007), конференції молодих науковців “Актуальні проблеми ботаніки та екології ”(Кам'янець-Подільський, 2008), 3-й міжнародній науковій конференції молодих науковців “Біологія: від молекули до біосфери ”(Харків, 2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових праць, у тому числі 5 статей, 3 з яких - у провідних фахових виданнях, що відповідають вимогам ВАК України та 9 тез доповідей у матеріалах конференцій, отримано патент України.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із переліку умовних скорочень, вступу, 5 розділів (огляд літератури, об'єкти та методи досліджень, 3 експериментальні розділи), узагальнення результатів досліджень, висновків. Список літератури містить 225 джерел. Дисертація викладена на 135 сторінках, ілюстрована 20 рисунками, містить 31 таблицю.

В огляді літературних джерел обговорюється питання застосування грамініцидів, зокрема проблема зменшення їх ефективності за несприятливих умов та у сумішах з гербіцидами, ефективними проти дводольних бур'янів. Обговорюється можлива роль реакцій ПОЛ, участь АФК та ПЗК в індукованому грамініцидами патогенезі. На базі проаналізованого літературного матеріалу сформульовано робочу гіпотезу, мету та завдання досліджень.

2. ОБ'ЄКТИ, УМОВИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Оскільки фітотоксична дія грамініцидів реалізується в першу чергу через появу некрозів меристем пагона і кореня [Asare-Boamah, Fletcher, 1983; Lichtenthaler, Meiеr, 1984; Chandrasena, Sagar, 1987], то як об'єкт для вивчення індукованого грамініцидами патогенезу було обрано меристеми коренів проростків кукурудзи (Zea mays L.) гібрида Нептун.

Насіння замочували протягом 24 год у воді у термостаті за температури 240С. Після 24 год замочування насіння промивали водопровідною водою і пророщували на фільтрувальному папері у кюветах (по 100 насінин). Обробка грамініцидом галоксифоп-R-метилом (ГФ) та модифікаторами його фітотоксичності антиоксидантами токоферолом і іонолом, синтетичним ауксином 2,4-Д, пероксидом водню проводилася шляхом замочування насіння, або шляхом інкубації 3-добових проростків у відповідних розчинах.

Концентрації ГФ та модифікаторів були попередньо відібрані в результаті спостережень за їх впливом на індукцію некрозів меристем коренів. Біохімічні аналізи проводили через 3, 24, 48 та 72 години після обробки до появи некрозів.

Ліпіди екстрагували за методом Фолча [Владимиров, Арчаков, 1972]. Жирнокислотний склад (ЖКС) ліпідів визначали методом газорідинної хроматографії [Синяк и др., 1976], визначення вмісту у ліпідах гідропероксидів (ГП) проводили йодометричним титруванням [Арутунян, Арищева, 1979]. Вміст ТБК-активних продуктів визначали фотометрично за реакцією з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) [Bieri, 1960].

Генерацію супероксидного аніон-радикала меристемами визначали за методикою Шорнінга [Шорнинг и др., 2000]. Вміст пероксиду водню визначали феротіоціанатним методом Сагісакі [Sagisaka, 1976] та за реакцією з сульфатом титанію [Chen, 1999].

Активність СОД (КФ. 1.15.1.11) визначали за методом, в основі якого здатність ферменту конкурувати з нітросинім тетразолієм за супероксидні аніони, вихід яких індукується ксантиноксидазною системою [Beauchamp, 1971]. Визначення активності розчинної форми пероксидази (КФ. 1.11.1.7) проводили за реакцією з гваяколом [Ridge, Osborne, 1970] чи бензидином [Бояркин, 1961]. Активність іоннозв'язаної пероксидази визначали в осаді фракції клітинних стінок, екстрагуючи її за допомогою буферу Серенсена з додаванням 0,5М NaCl та 2% детергенту тритону X-100 [Ridge, Osborne, 1970]. Активність каталази (КФ. 1.11.1.6) визначали за швидкістю реакції прямого розкладу пероксиду водню [Polidoros, 1999].

Для дослідження стану геному виділяли ДНК з клітин меристем коренів за модифікованим методом Деляпорта [Dellaporta, 1983, Тищенко, Топчий, 2001]. Електрофорез ДНК проводили в 2 % агарозному гелі.

Дослідження ефекту взаємодії гербіцидів у сумішах проводили в умовах вегетаційних дослідів. Як об'єкти використовували рослини вівса (Avena sativa L.) сорту Чернігівський 28 (чутливий до феноксапроп-р-етилу) та озиму пшеницю (Triticum aestivum L.) сорту Смуглянка (чутлива до галоксифоп-R-метилу, стійка до феноксапроп-Р-етилу).

Рослини вирощували у пластикових посудинах місткістю 1 кг у грунті (суміш грунту з піском у співвідношенні 3:1) на вегетаційному майданчику та у мініфітотроні під люмінесцентними лампами (фотоперіод: освітлення - 16 годин, темрява - 8 годин). Обробку рослин гербіцидами у вегетаційних дослідах проводили шляхом занурення листків рослин на 5 хвилин у робочий розчин відповідних гербіцидів.

Зміни фітотоксичності гербіцидів досліджували за показниками зменшення вмісту пігментів, інтенсифікації утворення продуктів ПОЛ (ТБК-активних речовин) та за неспецифічним інтегральним критерієм - зменшенням маси сирої речовини рослин.

Вміст фотосинтетичних пігментів визначали методом екстракції наважки рослинного матеріалу в ДМСО [Welburn, 1994 ]. За показниками зменшення наростання маси сирої речовини визначали ефект взаємодії гербіцидів у сумішах [Colby, 1967].

Ефективність та селективність застосування досліджуваних сумішей гербіцидів перевіряли у польових дослідженнях. Досліди проводилися в посівах озимої пшениці сорту Смуглянка та Подолянка на полях дослідно-виробничого відділу ІФРГ НАНУ та цибулі сорту Сатросо на полях ТОВ «Бучанське» (с.Рубежівка, Гостомельського району Київської області). Умови проведення польових дослідів стандартні [Трибель, 2001].

У дослідженнях використовували такі гербіцидні препарати: зеллек супер (галоксифоп-R-метил, 104 г/л); пума супер (феноксапроп-Р-етил, 69 г/л + антидот (фенхлоразон-етил)); зенкор (метрибузин, 700 г/кг); гоал (оксифлуорфен, 240 г/л); гроділ максі (амідосульфурон, 100 г/л + йодосульфуронметил натрію, 25г/л + антидот мефенпірадиетил, 250г/л ).

Статистична обробка результатів здійснювалася за допомогою стандартного комп'ютерного пакета Microsoft Excel та за загальноприйнятими методиками [Доспехов, 1985]. При проведенні біохімічних аналізів біологічна повторність в межах кожного експерименту була 3-разовою, крім того кожен дослід відтворювали незалежно 4-5 разів.

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Механізм патогенезу, індукованого гербіцидами інгібіторами ацетил-КоА-карбоксилази

Фітотоксична дія ГФ та модифікація даного процесу за допомогою екзогенних пероксиду водню, 2,4-Д та антиоксидантів (токоферол, іонол). Відомо, що екзогенні антиоксиданти і 2,4-Д виявили здатність зменшувати фітотоксичність грамініцидів при обробці ними листків злакових рослин [Banas, 1993; Shimabukuro et. all., 2001]. Однак, оскільки фітотоксична дія грамініцидів реалізується в першу чергу через появу некрозів меристем пагона і кореня, було поставлено заавдання перевірити, як впливатимуть дані модифікатори на індукцію некрозів меристем коренів. Незалежно від методу обробки антиоксиданти та 2,4-Д гальмували, а пероксид водню прискорював появу некрозів меристем коренів. Гальмування появи некрозів іонолом було найбільш значним у випадку, коли обробка антиоксидантом тривала протягом однієї години за 2 години до обробки гербіцидом (рис. 1.). Окрім цього рослини, які попередньо оброблялися іонолом, були здатні до часткового подальшого розвитку, в той час як дія екзогенного ПВ призводила до повної загибелі рослин.

Деградація ДНК за дії гербіцидів інгібіторів ацетил-КоА-карбоксилази. Оскільки нагромадження АФК не супроводжувалося інтенсифікацією реакцій ПОЛ було висловлено припущення, що пошкодження меристем коренів проростків під дією ГФ відбувається шляхом безпосередньої дії АФК на ДНК. В цьому випадку одним з первинних процесів, які відбуваються після утворення АФК має бути деградація ДНК. Було встановлено, що за дії ГФ у меристемах кореня проростків кукурудзи деградація ДНК відбувається вже на 2 добу.

З цього випливає, що процес деградації ДНК відбувся ще до того, як були зруйновані інші макромолекулярні системи, оскільки ми спостерігали зростання активності СОД, каталази та пероксидази і після появи некрозів. Характер електрофореграми не дозволяє зробити висновок, яким чином відбувався патологічний процес - шляхом некрозу чи програмованої загибелі клітин (ПЗК), оскільки не було виявлено типової для ПЗК “драбини” ДНК. Відомо, що деградація ДНК до моно- та олігонуклеосом є типовою, але не обов'язковою ознакою ПЗК [Самуилов и др., 2000].

Підвищення вибірної фітотоксичності грамініциду феноксапроп-р-етилу

Найбільше значення питання щодо втрат фітотоксичності у сумішах з іншими гербіцидами має для тих препаратів з групи грамініцидів, які можуть застосовуватися в посівах злакових культур, зокрема для феноксапроп-Р-етилу (ФП), оскільки для ефективного захисту цих культур потрібно забезпечити ефективне знищення як злакових, так і дводольних видів бур'янів. Відомо, що серед гербіцидів, ефективних проти дводольних бур'янів, синергічно взаємодіяти з грамініцидами можуть тільки метрибузин (МТЗ) та прометрин [Мордерер та ін., 1996, 1998, 1999, 2002, Швартау та ін., 2005]. Особливість взаємодії грамініцидів з метрибузином та прометрином може пояснюватися тим, що ці гербіциди, на відміну від інших інгібіторів транспорту електронів у фотосистемі 2 хлоропластів, діють не тільки на дводольні, але й на злакові види бур'янів і відповідно здатні стимулювати в них окиснювальні процеси.

У зв'язку з цим, перспективним є використання сумішей МТЗ з ФП для забезпечення контролювання дводольних видів бур'янів та підвищення фітотоксичної дії ФП на злакові бур'яни. Однак синергічна взаємодія МТЗ з грамініцидами, зокрема з флуазифоп-бутилом, була встановлена при застосуванні їх суміші в посівах стійких до МТЗ пасльонових культур, де останній застосовувався у виробничих нормах [Мордерер та ін., 1998, 1999]. Оскільки внесення МТЗ у цих нормах в посівах зернових колосових, зокрема озимої пшениці, може призвести до пригнічення культури, доцільність застосування сумішей ФП з МТЗ залежить від того, чи буде спостерігатися синергічна взаємодія при зменшених нормах МТЗ, які є безпечними для озимої пшениці. В зв'язку з цим, ми поставили задачу вивчити ефект взаємодії у сумішах ФП з МТЗ.

При вивченні ефекту взаємодії суміші ФП з МТЗ з використанням в якості критерію фітотоксичності зменшення маси сирої речовини було встановлено, що взаємодія має синергічний характер у широкому діапазоні концентрацій МТЗ. Характер взаємодії змінювався з синергічного на адитивний тільки при низьких концентраціях МТЗ, коли його фітотоксична дія на рослини ставала дуже малою (рис.4.).

Залежність ефекту взаємодії від концентрації ФП виявилася більш сильною, ніж для МТЗ. При зменшенні концентрації ФП з 5•10-4М до 10-4М характер взаємодії змінився з синергічного на адитивний (рис.5).

Вміст ТБК-активних речовин у варіанті з синергічним посиленням фітотоксичності у суміші достовірно підвищувався (р=0,001), що є підтвердженням ролі активації окиснювальних процесів у детермінації взаємодії грамініцидів з іншими гербіцидами (табл. 3).

Отримані дані підтверджують принципову можливість використання МТЗ для підвищення фітотоксичної дії ФП при застосуванні сумішей цих гербіцидів в посівах зернових колосових, але тільки за умови достатньої активності самого грамініциду.

Ефективність та селективність застосування бакової суміші гербіцидів пума супер (ФП) та зенкор (МТЗ) було перевірено у польових дослідженнях в посівах озимої пшениці сорту Смуглянка. Результатами 2007 року встановлено, що дана суміш протягом двох перших обліків бур'янів показала підвищення фітотоксичності щодо злакового бур'яну метлюга звичайного (Apera spica-venti (L.) Pal. Beauv.), однак в подальшому такої стимуляції не спостерігалося. Такий результат можливо був пов'язаний з тим, що обробка сумішшю пуми супер та зенкора проводилася по фону внесення гербіциду гроділу максі, який було застосовано з метою контролювання дводольних видів бур'янів. Можливо антагоністичний вплив гроділу максі, діючими речовинами якого є інгібітори АЛС, призвів до зменшення фітотоксичності пуми супер, для здолання якої синергічного впливу зенкору виявилося недостатньо. В той же час було встановлено здатність зенкору синергічно посилювати дію гроділу максі на дводольні види бур'янів. Не було виявлено фітотоксичної дії гербіцидів на озиму пшеницю в жодному з варіантів досліду. У 2008 році було продовжено дослідження ефективності застосування суміші пуми супер та зенкору, але без потенційного антагоніста. Було встановлено, що зенкор дійсно здатний синергічно підсилювати фітотоксичну дію грамініциду пума супер, однак при цьому спостерігалося пригнічення культури. У зв'язку з цим, в умовах вегетаційних дослідів було досліджено ефект взаємодії у потрійній суміші пума супер + зенкор + гроділ максі залежно від концентрації амідосульфурону (АСФ), який є діючою речовиною гербіциду гроділ максі. В певному діапазоні концентрацій проділ максі підвищував вибірну фітотоксичність грамініциду, що підтверджувалося і визначенням вмісту ТБК-активних речовин: гроділ максі знижував індуковане дією суміші пуми супер з зенкором зростання вмісту ТБК-активних речовин у рослин пшениці (культура), а у рослин вівса (модель злакових бур'янів) додавання гроділу максі призвело до достовірного підвищення даного показника (табл.4).

Таблиця 4 Вміст ТБК-активних речовин (мкг/г сухої речовини) у листках вівса (модель злакових бур'янів) та озимої пшениці (культура)

Враховуючи результати вегетаційних дослідів, польовий дослід 2009 р. було закладено з метою перевірки можливості захисту культури від ушкоджуючої дії суміші пума супер+зенкор за рахунок внесення різних норм гроділу максі. Однак на відміну від попередніх дослідів у 2009 р. дія гербіциду пума супер на метлюг звичайний виявилася дуже високою, що не дозволило визначити зміни фітотоксичності у суміші. Крім того, при всіх нормах внесення не спостерігалося негативного впливу гербіцидів на культуру. Можливо ці відмінності пов'язані з особливостями вегетаційного періоду 2009 р. та впливом залишків гербіцидів, які застосовувалися на даному полі в попередні роки.

Таким чином, нашими польовими і вегетаційними дослідженнями показано принципову можливість підвищення вибірної фітотоксичності грамініциду феноксапроп-Р-етилу за рахунок застосування у потрійній суміші з синергістом метрибузином та антагоністом амідосульфуроном. Пріоритет на застосування даної гербіцидної композиції було захищено патентом України. Однак, для остаточного висновку щодо ефективності та доцільності застосування такої суміші ці дослідження мають бути продовжені. водень антиоксидант окиснення гербіцид

Комплексне застосування грамініциду зеллек супер з гоалом в посівах цибулі

Дія інгібіторів протопорфириногеноксидази (ПРОТОКС) пов'язана з підсиленням вільнорадикальних окиснювальних реакцій пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) [Kenion W., 1985]. Спектр дії інгібітора ПРОТОКС оксифлуорфену поширюється, окрім дводольних, і на злакові види бур'янів, що є передумовою для припущення щодо використання сумішей даного гербіциду з грамініцидами з метою підвищення контролю за багаторічними злаковими видами бур'янів. Проте дані щодо взаємодії гербіцидів інгібіторів ПРОТОКС з грамініцидами є досить суперечливими: в окремих випадках спостерігалося синергічне збільшення фітотоксичності грамініцидів, в інших - антагоністичне її зменшення [Godley et al., 1986; Hopkins et al., 1984]. Це протиріччя може пояснюватися тим, що дія інгібіторів ПРОТОКС розвивається значно швидше, ніж дія грамініцидів, в той час як для реалізації синергізму необхідно, щоб індукція окиснювальних процесів обома гербіцидами збігалася у часі. Якщо ж підсилення окиснювальних процесів інгібітором ПРОТОКС у стійких до нього злакових бур'янів буде незначним та короткочасним, то існує велика вірогідність компенсаційного підвищення активності антиокиснювальних ферментів, що зумовить підвищення стійкості рослин та відповідне зменшення фітотоксичної дії грамініциду. Зниження фітотоксичності даної суміші є можливим і при незначному освітленні, оскільки дія інгібіторів ПРОТОКС сильно залежить від світла. Водночас при сильному освітленні дія інгібіторів ПРОТОКС розвивається значно швидше, ніж дія грамініцидів. Врахування всіх цих моментів і зумовлює складність отримання синергічного ефекту взаємодії у суміші грамініцидів з інгібіторами ПРОТОКС.

Гербіцид гоал (оксифлуорфен), який належить до інгібіторів ПРОТОКС, використовується для контролювання дводольних бур'янів у посівах цибулі. Однак при високих нормах внесення можливий негативний вплив даного гербіциду на культуру. Для підвищення селективності, а також для пролонгування захисної дії доцільним є кратне внесення цього гербіциду. У зв'язку з цим виникає питання щодо можливості комплексування гоалу з грамініцидами.

Вивчення ефекту взаємодії грамініциду ГФ з оксифлуорфеном не виявило антагонізму у даній суміші у широкому діапазоні його концентрацій. При мінімальній і максимальній концентраціях оксифлуорфену, відповідно, 10-4М і 5·10-4М спостерігалося незначне синергічне підсилення фітотоксичності, в той час як при середній з обраних нами концентрацій - 2·10-4М у суміші спостерігалася адитивна взаємодія.

Визначення вмісту ТБК-активних речовин підтвердило здатність оксифлуорфену індукувати реакції ПОЛ (табл.5).

Таблиця 5 Вміст ТБК-активних речовин (мкг/г сухої речовини) в листках пшениці (модель злакових бур'янів) на третю добу при дії ГФ (5·10-4М) та його сумішей з оксифлуорфеном

Так, вміст ТБК-активних речовин при підвищенні концентрацій оксифлуорфену зростав у 3,3, 3,7 і 4,9 раза порівняно з контролем, в той час як за дії ГФ це підвищення було неістотним. У сумішах з грамініцидом спостерігалося незначне підвищення даного показника порівняно з дією одного оксифлуорфену, однак при максимальній концентрацій оксифлуорфену за дії суміші вміст ТБК-активних речовин дещо знижувався.

Проведені протягом 2007-2009 рр. польові дослідження у посівах цибулі показали, що дробове внесення гербіциду гоал є ефективним засобом боротьби з дводольними бур'янами, а застосування сумішей гоалу з грамініцидами забезпечувало ефективне знищення одно- та багаторічних злакових бур'янів. На основі проведених досліджень розроблено технологію комплексного застосування грамініциду зеллек супер у сумішах з гербіцидом гоалом в посівах цибулі. Так для запобігання можливих втрат ефективності дії грамініцидів при дробовому внесенні гоалу норма застосування гоалу має не перевищувати 0,3 л/га.

ВИСНОВКИ

Розвиток фітотоксичної дії грамініцидів реалізується шляхом індукції окиснювального стресу. Дія гербіцидів призводить до генерації активних форм кисню, які викликають деградацію ДНК, що є причиною некротизації меристем та загибелі рослин. Участь активних форм кисню у індукованому грамініцидами патогенезі пояснює залежність їх фітотоксичності від інтенсивності анти-/прооксидантних процесів і є основою для розробки методів підвищення ефективності дії за допомогою речовин-прооксидантів.

1. Екзогенні антиоксиданти гальмують, а пероксид водню прискорює появу некрозів меристем за дії грамініциду галоксифоп-R-метилу.

2. За дії грамініциду у меристемах не спостерігається зростання вмісту продуктів ПОЛ, водночас відбувається збільшення процентного вмісту у ліпідах ненасичених жирних кислот, які є субстратом цих реакцій. З цього випливає, що некротизація меристем за дії грамініциду не супроводжується інтенсифікацією реакцій ПОЛ.

3. За дії грамініциду спостерігається підвищення вмісту активних форм кисню: вже через годину після обробки проростків кукурудзи гербіцидом в меристемах коренів спостерігається короткочасне підвищення вмісту пероксиду водню та зростання вмісту супероксидного аніон-радикала, яке триває до появи некрозів.

4. Антиоксидант іонол знижує індуковане грамініцидом підвищення вмісту в меристемах активних форм кисню, а екзогенний пероксид водню - підвищує.

5. Дія гербіциду призводить до змін в активності ферментів, які беруть участь у трансформації активних форм кисню. Антиоксидант іонол затримує, а пероксид водню прискорює індуковані грамініцидом зміни активності супероксиддимсмутази, каталази та пероксидази.

6. Деградація ДНК у меристемах, викликана дією грамініцидів, відбувалася без фрагментації до моно- і олігонуклеосом, що може бути свідченням загибелі клітин шляхом некрозу.

7. Синергічна взаємодія у суміші грамініциду феноксапроп-Р-етилу з інгібітором транспорту електронів у ФС 2 супроводжувалася підвищенням вмісту кінцевих продуктів ПОЛ - ТБК-активних речовин.

8. Вибірна фітотоксичність грамініциду феноксапроп-Р-етилу може бути збільшена за рахунок застосування у потрійній суміші з синергістом метрибузином та антагоністом інгібітором АЛС.

РЕКОМЕНДАЦІЇ

Для ефективного контролювання однорічних і багаторічних злакових та однорічних дводольних видів бур'янів протягом вегетації цибулі доцільним є застосування грамініциду зеллек супер (галоксифоп-R-метил) у нормах 0,4-1,0 л/га та центуріон (клетодим) у нормі 0,8 л/га у сумішах з гербіцидом гоал (оксифлуорфен), за умови кратного внесення гоалу в нормі 0,3 л/га.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Мордерер Є.Ю. Дослідження участі вільнорадикальних окиснювальних реакцій у розвитку фітотоксичної дії грамініцидів / Є.Ю. Мордерер, М.П. Паланиця, О.П. Родзевич Физиология и биохимия культурн. растений. - 2008. - 40, №1. - С.56-62.

Паланиця М.П. Можлива участь активних форм кисню у розвитку фітотоксичної дії грамініцидів / М.П. Паланиця, В.В. Трач, О.П. Родзевич, Є.Ю. Мордерер Физиология и биохимия культурн. растений. - 2008. - 40, № 4. - С.355-361.

Паланиця М.П. Генерування активних форм кисню за дії грамініцидів і модифікаторів їх активності/ М.П. Паланиця, В. В. Трач, Є.Ю. Мордерер Физиология и биохимия культурн. растений. - 2009. - 41, №4. - С. 328-334.

Мордерер Є.Ю. Синергічне підвищення фітотоксичної дії грамініциду феноксапроп-Р-етилу у сумішах з метрибузином / Є.Ю. Мордерер, В.В. Трач, М.П. Паланиця Фізіологія рослин: проблеми та перспективи розвитку. Матеріали з'їзду Товариства фізіологів рослин - Київ, 2009. - Т. 2 - С. 46-50.

Мордерер Є.Ю. Дослідження механізму індукованого грамініцидами патогенезу / Є.Ю. Мордерер, В.В. Трач, М.П. Паланиця, О.П. Родзевич Рослини-бур'яни та ефективні системи захисту від них посівів сільськогосподарських культур. Матеріали VI науково-теоретичної конференції Українського наукового товариства гербологів (14-15 березня 2008 року). - Київ, 2008. - С. 106-116.

Пат. 43543, України МПК (2009) А01N 37/00, А01N 47/28. Високоефективна гербіцидна композиція для захисту посівів зернових колосових від злакових та дводольних бур'янів; Є.Ю. Мордерер, В.В. Трач, М.П. Паланиця - №43543; заявник і патентовласник - Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Пат. №43543, Заявл. 26.02. 09; Опубл. 25.08.09, Бюл. №16 - 4 с.

Morderer Ye.Yu. The mechanism of pathogenesis induced by herbicides inhibitors of acethyl-CoA-carboxilase / Ye.Yu. Morderer, M.P. Palanytsya Plant growth substances: intracellular hormonal sygnaling and applying in agriculture. Abstracts of 2nd International symposium (8-12 October, 2007). - Kyiv,Ukraine.- P.145.

Паланиця М.П. Дослідження фітотоксичної дії гербіцидів похідних арилоксифеноксипропіонової кислоти / М.П. Паланиця, Є.Ю. Мордерер, О.П. Родзевич Молодь та поступ біології. Збірник тез III Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів (23-27 квітня 2007 року). - Львів, 2007. - С. 433-434.

Паланиця М.П. Вплив токоферолу та 2,4-Д на фітотоксичну дію галоксифоп-R-метилу Сучасний стан і пріоритети розвитку фізіології рослин, генетики та біотехнології. Матеріали десятої конференції молодих вчених (25-26 жовтня 2007 року). - Київ, 2007. - С. 102-103.

Паланиця М.П. Участь активних форм кисню у розвитку фітотоксичної дії грамініцидів / М.П. Паланиця, Є.Ю. Мордерер, В.В. Трач, О.П. Родзевич Молодь та поступ біології. Збірник тез IV Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів (7-10 квітня 2008 року). - Львів, 2008. - С. 397-398.

Паланиця М.П. Можлива сигнальна роль активних форм кисню у розвитку фітотоксичної дії грамініцидів / М.П. Паланиця, Є.Ю. Мордерер, В.В. Трач Актуальні проблеми ботаніки та екології. Матеріали міжнародної конференції молодих учених (13-16 серпня 2008 року). - Кам'янець-Подільський, 2008. - С. 242-243.

Паланиця М.П. Участь активних форм кисню у розвитку фітотоксичної дії грамініцидів / М.П. Паланиця, В.В. Трач, Є.Ю. Мордерер Біологія: від молекули до біосфери. Матеріали III Міжнародної конференції молодих науковців (18-21 листопада 2008 року). - Харків, 2008. - С. 288-289.

Паланиця М.П. Можливість підвищення фітотоксичної дії грамініцидів за рахунок індукції оксидативних реакцій / М.П. Паланиця, В.В. Трач, Є.Ю. Мордерер Молодь та поступ біології. Збірник тез V Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів (12-15 травня 2009 року). - Львів, 2009. - С. 214-215.

Нестерова Н.Г. Генерування активних форм кисню за дії галоксифоп-R-метилу та модифікаторів його фітотоксичності у меристемах коренів проростків кукурудзи / Н.Г. Нестерова, М.П. Паланиця, Є.Ю. Мордерер Молодь та поступ біології. Збірник тез V Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів (12-15 травня 2009 року). - Львів, 2009. - С. 213-214.

Сичук А.М. Активність супероксиддисмутази та оксидоредуктаз за дії галоксифоп-R-метилу та модифікаторів його фітотоксичності у меристемах коренів кукурудзи / А.М. Сичук, М.П. Паланиця, Є.Ю. Мордерер Молодь та поступ біології. Збірник тез V Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів (12-15 травня 2009 року). - Львів, 2009. - С. 220-221.

АНОТАЦІЯ

Паланиця М.П. Участь активних форм кисню у розвитку фітотоксичної дії гербіцидів інгібіторів ацетил-КоА-карбоксилази. - Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 - фізіологія рослин. Інститут фізіології рослин і генетики НАН України. - Київ, 2010.

Дисертація присвячена вивченню процесу патогенезу, індукованого гербіцидами інгібіторами ацетил-КоА-карбоксилази (АКК) та пошуку шляхів підвищення їх фітотоксичної дії.

Показано здатність антиоксидантів гальмувати, а пероксиду водню прискорювати індукцію некрозів меристем коренів кукурудзи (Zea mays L.), викликану гербіцидом галоксифоп-R-метилом (ГФ). Встановлено, що індукований гербіцидом патогенез не пов'язаний з індукцією реакцій пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ), однак за дії ГФ спостерігається короткочасна генерація пероксиду водню і довготривале підвищення вмісту у меристемі супероксидного аніон-радикала. Встановлено, що появі некрозів меристем коренів передує деградація ДНК. Показано, що синергічне посилення фітотоксичної дії гербіцидів інгібіторів АКК у суміші з гербіцидом метрибузином супроводжується підвищенням вмісту у листках кінцевих продуктів ПОЛ - ТБК-активних речовин. Зроблено висновок, що розвиток фітотоксичної дії грамініцидів у меристемах рослин реалізується шляхом індукції окиснювального стресу.

Встановлена принципова можливість підвищення вибірної фітотоксичності гербіциду пума супер (феноксапроп-Р-етил) за рахунок його застосування у потрійній суміші з синергістом гербіцидом зенкор (метрибузин) та антагоністом гербіцидом гроділ максі (амідосульфурон + йодсульфурон). Розроблено рекомендації щодо застосування гербіциду зеллек супер (ГФ) у сумішах з гербіцидом гоал (оксифлуорфен) в посівах цибулі.

Ключові слова: гербіциди, ацетил-КоА-карбоксилаза, активні форми кисню, супероксидний аніон-радикал, пероксид водню.

Паланица М.П. Участие активных форм кислорода в развитии фитотоксического действия гербицидов ингибиторов ацетил-КоА-карбоксилазы. - Рукопись

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.12 - физиология растений. Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 2010.

Диссертация посвящена изучению процесса патогенеза, индуцированного гербицидами ингибиторами ацетил-КоА-карбоксилазы (АКК), и поиску путей повышения их фитотоксического действия.

Установлено, что некроз меристем корней кукурузы (Zea mays L.) при действии гербицидов ингибиторов АКК не сопровождается интенсификацией реакций пероксидного окисления интегральных липидов, хотя антиоксиданты замедляли, а пероксид водорода ускорял появление некрозов в меристемах. Сделано заключение, что развитие фитотоксического действия в меристемах может происходить путем стимуляции генерации активных форм кислорода (АФК), которые или непосредственно индуцируют некрозы или инициируют процесс программированной гибели клеток. Показано, что уже спустя час после обработки проростков кукурузы гербицидом галоксифоп-R-метилом (ГФ) в клетках меристем наблюдается кратковременное повышение содержания эндогенного пероксида водорода (ПВ) и длительное повышение генерации супероксидного анион-радикала (САР), которое увеличивается под действием экзогенного пероксида водорода и уменьшается при обработке антиоксидантом. При действии экзогенного пероксида водовода, индуцированные ГФ изменения активности супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ) и пероксидазы (ПК) ускорялись, а при действии антиоксидантов - замедлялись. Показано, что при действии ГФ в клетках меристем корня происходит деградация ДНК, которая предшествует появлению некрозов. Таким образом, совокупность полученных данных позволила сделать вывод о том, что фитотоксическое действие гербицидов ингибиторов АКК реализуется путем индукции окислительного стресса. Действие гербицидов ведет к генерации АФК, которые вызывают деградацию ДНК, что является причиной некротизации меристем и гибели клеток.

Установленные особенности индуцированного патогенеза позволили разработать пути для повышения фитотоксического действия гербицидов ингибиторов АКК. В условиях вегетационных опытов исследован эффект взаимодействия в смесях гербицида ингибитора АКК феноксапроп-Р-этила (ФП) с гербицидом метрибузином - ингибитором транспорта электронов в фотосистеме 2. Установлено, что метрибузин в широком диапазоне концентраций может синергически повышать фитотоксическое действие ФП на растения овса (модель злаковых сорняков). Синергическое увеличение фитотоксичности сопровождалось увеличением содержания ТБК-активных соединений в листьях растений, что подтверждает роль активации окислительных процессов в детерминировании характера взаимодействия гербицидов ингибиторов АКК с другими гербицидами. Исследование изменения фитотоксического действия гербицида пума супер (ФП) в тройной смеси с синергистом зенкором (метрибузин) и антагонистом гродилом макси (амидосульфурон + йодсульфурон), проведенные в условиях вегетационных опытов, и изучение эффективности применения данной смеси в посевах озимой пшеницы показали принципиальную возможность увеличения избирательной фитотоксичности пумы супер, в результате чего возрастала эффективность уничтожения злаковых сорняков и уменьшалась вероятность повреждения культуры. На данную гербицидную композицию получен патент Украины.

Исследование эффекта взаимодействия в смеси гербицида зеллек супер (ГФ) с гербицидом ингибитором пропорфириногеноксидазы гоалом (оксифлуорфен) показало зависимость характера взаимодействия от нормы внесения гоала. С учетом полученных данных разработана технология комплексного применения гербицидов в посевах лука, которая обеспечивает эффективную защиту от одно- и многолетних злаковых и однолетних двудольных видов сорняков. Данная технология включает кратную обработку посевов гоалом, в том числе в смесях с гербицидом зеллек супер и центурион.

Thesis for a Phd degree in Biology, speciality 03.00.12 - Plant Physiology - Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

This thesis is devoted to investigation of pathogenesis induced by herbicides inhibitors of acethyl-CoA-carboxylase (ACC) and to search of the means for the increasing of their phytotoxic action.

It was established, that antioxidants decreased and the hydrogen peroxide (HP) increased the apperiance of necrosis induced by herbicide haloxyfop-methyl (HF) in meristematic regions of seedlings of maize roots (Zea mays L.). It had been showed, that the appearance of necrosis under the effect of HF was not accompanied with intensification of peroxidation reaction of integral lipids. It was observed short-term increasing of hydrogen peroxide (HP) and prolonged increasing of superoxide radical (SOR) over one hour after the effect of HF. The degradation of DNA under the effect of HF in meristematic cells was shown, and was established, that this process is before the appearance of necrosis. Synergistic interaction of graminicides with herbicide metribuzin corelates with increase of TBA-reactive substances content in green house conditions. From the totality of obtained data it has been done the conclusion that the phytotoxic action of ACC-inhibiting herbicides realized by the induction of oxidative stress.

Was established, that adding of amidosulfurone (grodil maxi) to mixture fenoxaprop-ethyl+metribuzin (puma super+zenkor) results in a antagonistic decrease of puma super phytotoxic action, but protects the wheat from the mixture inhibition. A Ukrainian patent was obtained, based on this data. Reccomendations were made about the divisible application of oxifluorfen (goal) in mixtures with graminicide zellek super (haloxyfop-methyl) in crops of onion.

Key words: herbicides, acethyl-CoA-carboxilase, reactive oxygen species, superoxide radical, hydrogen peroxide.

Размещено на Allbest.ru