Роль фосфоліпази D в реалізації біологічної дії цитокінінів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії

УДК 577.175.14; 577.125.53

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Роль фосфоліпази D в реалізації біологічної дії цитокінінів

02.00.10 - біоорганічна хімія

Колесников Ярослав Сергійович

Київ-2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, відділ молекулярних механізмів регуляції метаболізму клітини

Науковий керівник:Доктор біологічних наук Кравець Володимир Степанович Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу молекулярних механізмів регуляції метаболізму клітини

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, професор Кібірєв Володимир Костянтинович Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, провідний науковий співробітник відділу хімії білків та пептидів

Кандидат біологічних наук Веденічева Ніна Петрівна Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, старший науковий співробітник відділу фітогормонології

Захист відбудеться 26 травня 2010 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02660, Київ-94, вул. Мурманська, 1).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1).

Автореферат розісланий 26 квітня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Пошук та синтез нових фізіологічно активних сполук для біотехнології та новітніх технологій агропромислового виробництва потребує дослідження природи механізмів, які забезпечують сприйняття та трансдукцію сигналів у клітинах рослин, індукованих дією фітогормонів та їх синтетичних аналогів [Романов, 2009]. Формування уявлень щодо змін метаболізму клітин за дії біологічно активних сполук є ключовим також для розкриття молекулярних основ регуляції росту та розвитку рослин [Ситник, Мусатенко та ін., 2003]. Фітогормони реалізують свій вплив як на генному, так і на метаболічному рівнях [Терек, 2007; Яворська та ін., 1991]. Цитокініни є регуляторами цілої низки ключових фізіологічних процесів: клітинного циклу, розвитку хлоропластів, старіння [Werner et al., 2003], росту коренів та пагонів [Веденічева, 2009], репродукції [Веденічева, Мусатенко, 2008], сприйняття рослинами патогенних грибів [Рябченко и др., 2009], біосинтезу пігментів, транспорту метаболітів [Werner et al., 2003] тощо. Численна кількість новітніх генетичних та біохімічних досліджень присвячена молекулярним механізмам дії цитокінінів у клітинах. Наразі поширеною є схема двохкомпонентної системи внутрішньоклітинної трансдукції сигналу цитокінінів, яка передбачає активацію каскаду послідовного фосфорилювання білків, що призводить до змін експресії генів [Schmьlling, 2004]. Водночас, багато аспектів молекулярного механізму дії цитокінінів у клітинах рослин є слабо вивченими та потребують подальших досліджень [Романов, 2009].

Особлива роль серед первинних реакцій клітин рослин на дію цілої низки чинників довкілля належить швидким змінам метаболізму фосфоліпідів мембран, що здійснюються специфічними ферментами. Чільне місце серед останніх посідає фосфоліпаза D (ФЛD, ЕС 3.1.4.4), яка гідролізує структурні фосфоліпіди з утворенням фосфатидної кислоти та вільних водорозчинних сполук. Фосфатидна кислота є вторинним посередником сигнальних каскадів клітин рослин, який функціонує за механізмом безпосередньої активації або пригнічення регуляторних білків та ферментів [Li et al., 2009], що зумовлює її ключову роль в регуляції метаболізму. Існують свідчення на користь можливої участі фосфоліпази D в трансдукції сигналу цитокінінів [Romanov et al., 2000, 2002].

Аналіз моделі реалізації біологічної дії цитокінінів за участю ліпідної сигналізації, зокрема фосфоліпази D, надає можливість поглибити пізнання молекулярних механізмів дії фітогормонів у живих системах на етапі від специфічних рецепторів мембран клітин до перепрограмування експресії генів та зміни інтенсивності та направленості метаболізму клітин; закладає основи для розробки сучасних технологій управління онтогенезом сільськогосподарських культур.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відділі молекулярних механізмів регуляції метаболізму клітини Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України в рамках теми 2.1.10.32-05 «Дослідження ролі фосфоліпаз в реалізації молекулярних механізмів дії фітогормонів» та грантів: INTAS, № 602/2001, “Role of phospholipases in the mechanism of cytokinin action”, НАН України та Російського фонду фундаментальних досліджень 5/3-08, 5/1-09 “Роль фосфоліпази D в регуляції метаболізму клітин рослин і реалізації дії цитокінінів”.

Мета та завдання дослідження. Метою роботи є встановлення участі фосфоліпази D у трансдукції сигналів, індукованих цитокінінами.

На виконання поставленої мети вирішувались наступні завдання:

1. Дослідити вплив цитокінінів на біосинтез пігменту амарантину в клітинах сім'ядолей амаранту (Amaranthus caudatus L.) за дії інгібітору сигналізації фосфоліпази D - 1-бутанолу.

2. Дослідити вплив цитокінінів на активність ФЛD за вмістом фосфатидилбутанолу in vivo в клітинах сім'ядолей амаранту.

3. Вивчити динаміку вмісту продукту ФЛD за вмістом фосфатидилбутанолу в клітинах сім'ядолей амаранту за дії цитокінінів in vivo.

4. З'ясувати роль іонів кальцію в регуляції фосфоліпази D за дії цитокінінів.

5. З'ясувати роль фосфатидилінозитол-4,5-бісфосфату (ФІФ₂) в регуляції фосфоліпази D за дії цитокінінів.

Об'єкт дослідження - фосфоліпаза D клітин рослин як компонент сигнального каскаду цитокінінів.

Предмет дослідження - рівень продуктів фосфоліпази D у клітинах сім'ядолей амаранту за дії цитокінінів in vivo та його залежність від іонів кальцію та ФІФ₂ в клітинах.

Методи дослідження - методи мічених ізотопів (³³Р): введення мітки, тонкошарова хроматографія мічених фосфоліпідів, авторадіографія та сцинтиляційний обрахунок (визначення кількості фосфатидилбутанолу); біотест на цитокініни.

Наукова новизна отриманих результатів. За допомогою радіоактивного мічення фосфоліпідів тканин сім'ядолей амаранту досліджено вплив фітогормонів цитокінінів на рівні продукту фосфоліпази D - фосфатидилбутанолу. Вперше встановлено різке підвищення рівня формування фосфатидилбутанолу на 5 хвилині дії цитокінінів, що тривало на 10, 15 та 30 хвилинах обробки рослин цими фітогормонами. Отримані результати демонструють участь фосфоліпази D в механізмах формування первинних реакцій клітин у відповідь на дію цитокінінів. Швидка зміна рівнів продукту ФЛD за вмістом фосфатидилбутанолу вказує на роль цього ферменту в трансдукції сигналу цитокінінів у клітинах рослин. Вперше показано, що рівень формування фосфатидилбутанолу, індукований цитокінінами, різко знижується за умов дії хелатору іонів кальцію в апопласті (ЕГТА), інгібітору каналів кальцію плазматичних мембран (верапамілу) та, особливо, хелатору фосфатидилінозитол-4,5-бісфосфату (неоміцину). Чутливість утворення фосфатидилбутанолу, індукованого цитокінінами, до іонів кальцію та фосфатидилінозитол-4,5-бісфосфату засвідчує участь специфічних молекулярних форм ФЛD, залежних від цих кофакторів, у реалізації біологічної дії цих фітогормонів.

Практичне значення отриманих результатів. Результати даного дисертаційного дослідження поглиблюють уявлення про механізми реалізації дії фітогормонів та участь ферментів метаболізму фосфоліпідів у сигнальних каскадах клітин рослин. З'ясування механізмів трансдукції сигналів у клітинах, які зумовлюють зміни інтенсивності та напрямку метаболічних потоків та, як наслідок, модулювання росту та розвитку рослин, може бути використане на навчальних курсах з біоорганічної хімії, біохімії, молекулярної біології та фізіології рослин в процесі формування уявлення щодо молекулярних механізмів первинних реакцій клітин рослин на дію фітогормонів та механізмів регуляції росту та розвитку рослин. Дослідження функціонування сенсорних систем клітин рослин має на меті подальше використання отриманих результатів для розробки методик застосування фізіологічно активних речовин для вирощування сільськогосподарських культур.

Основний внесок здобувача. Дослідження біосинтезу амарантину у відповідь на дію цитокінінів у сім'ядолях амаранту, систематизація літературних даних, аналіз і узагальнення отриманих результатів виконані особисто дисертантом. Експериментальні дані, використані в дисертації та представлені в статтях зі співавторами, отримані за безпосередньої участі автора. Постановку мети дослідження та обговорення результатів здійснено разом з науковим керівником д.б.н. В.С. Кравцем. Аналіз фосфоліпідів за допомогою радіоізотопного мічення виконано разом з науковим співробітником відділу С.В. Кретиніним.

Апробація результатів дисертаційної роботи. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на XІV Міжнародному конгресі FESPB XІV «Congress Federation of European Societies of Plant Biology» (м. Краків, Польща, 2004 р.), 1-му Українському конгресі клітинної біології (м. Львів, Україна, 2004 р.), 5-й “Parnas” конференції молекулярних механізмів клітинної сигналізації (м. Київ, Україна, 2005 р.), 2-му Міжнародному симпозіумі «Auxins and Сytokinins in Plant Development» (м. Прага, Чехія, 2005 р.), XV Міжнародному конгресі FESPB XV «Congress Federation of European Societies of Plant Biology» (м. Ліон, Франція, 2006 р.), XXI Науковій конференції з біоорганічної хімії та нафтохімії ІБОНХ НАН України (м. Київ, Україна, 2006 р.), міжнародній конференції «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (м. Сиктивкар, Росія, 2007 р.), 2-му Міжнародному симпозіумі «Регулятори росту рослин: внутрішньоклітинна гормональна сигналізація та застосування в сільському господарстві» (м. Київ, Україна, 2007 р.) та VI-й Міжнародній науковій конференції «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (м. Мінськ, Бєларусь, 2009 р.).

Публікації. Матеріали дисертаційної роботи викладені у 6 статтях у фахових наукових журналах та в тезах 8 доповідей.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, опису отриманих результатів та їх обговорення, висновків та списку використаних джерел (310 найменувань). Дисертаційна робота викладена на 140 сторінках друкованого тексту і містить 13 рисунків, 4 схеми і 1 таблицю.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. Розділ присвячено аналізу сучасних уявлень про молекулярний механізм дії цитокінінів у клітинах рослин. Наведені дані останніх років щодо структури та регуляції фосфоліпази D, механізмів функціонування сигнальних каскадів ФЛD в клітинах рослин та ролі цього ферменту в реалізації дії фітогормонів.

Матеріали та методи дослідження. Для досліджень були використані етіольовані рослини амаранту - Amaranthus caudatus L., які вирощували в термостатованих умовах. Вивчення дiї цитокінінів на активність ФЛD in vivo та чутливість ФЛD до іонів кальцію та ФІФ₂ за дії цитокінінів проводили на ізольованих сімядолях амаранту.

З метою вивчення можливої ролі ФЛD в реакції клітин сім'ядолей амаранту на дію цитокінінів досліджували біологічну активність цитокініну 6-бензиламінопурину (БАП) за вмістом пігменту амарантину за методикою Романова та співавторів [Romanov et al., 2000]. Сімядолі разом з верхньою частиною гіпокотилів переносили на фосфатний буфер (12 мМ К₂НРО₄-NaН₂РО₄, рН 6,4) з 1 мг/мл тирозину та речовини, досліджуваної на біологічну активність - цитокініну 6-бензиламінопурину (БАП, 5х10^-6 М). Для досліджень використовували також інгібітор сигналізації фосфаліпази D - 0,8% 1-бутанол та його неактивний аналог - 0,8% 2-бутанол. Сім'ядолі інкубували протягом 18 годин у термостаті за 24,5±0,5С. З метою виділення пігменту амарантину рослинний матеріал тричі заморожували та відтаювали у 0,1 М НСl. Оптичну густину отриманого розчину амарантину вимірювали на спектрофотометрі Unicam SP 1800 (Pye Unicam Ltd., UK) за довжини хвилі 540 нм [Romanov et al., 2000].

Дослідження активації ФЛD за дії цитокінінів in vivo проводили за допомогою радіоізотопного мічення фосфоліпідів. Мітку вводили шляхом інкубації сім'ядолей протягом 14 годин при +25°С у 25 мM 2-(N-морфоліно)етансульфонова кислота-КОН (Mes-KOH) буфері з рН 6,4. Буфер містив [³³P]-ортофосфат з активнiстю 100 мкКі на 1 мл (Amersham). Для бiльш швидкого проникнення мітки у тканини застосовували вакуумну iнфiльтрацiю [Munnik et al., 1998, 2000]. Наважкa тканини для кожної проби складала 200 мг. Тканини відмивали від надлишку невбудованого радіоактивного фосфору в буфері Mes-KOH.

З метою встановлення динаміки активності ФЛD у відповідь на дію цитокінінів тканини рослин інкубували з 0,8% 1-бутанолом у Мes-KOH буфері впродовж 30 хвилин в темряві. 1-бутанол використовували для формування фосфатидилбутанолу в клітинах, каталізованого ФЛD. Радіоактивність останнього використовували як показник активності ФЛD in vivo. Тканини інкубували в розчині з БАП (5 мкМ) впродовж 5, 10, 15 та 30 хвилин. В контрольні варіанти додавали 1-бутанол без БАП, БАП без 1-бутанолу або БАП з 2-бутанолом (аналогом 1-бутанолу, який не перешкоджає формуванню фосфатидної кислоти, каталізованому ФЛD). Чутливість ФЛD до іонів кальцію та ФІФ₂ досліджували шляхом інкубування тканин протягом 30 хвилин з 0,8% 1-бутанолом у Мes-KOH буфері та інгібіторами сигнальних каскадів, у яких бере участь ФЛD (0,8% 1-бутанолом, 5 мM ЕГТА, 0,3 мМ верапамілом, 4 мМ неоміцином). Тканини інкубували в розчині з БАП (5 мкМ) впродовж 30 хвилин. Фіксацію тканин проводили рідким азотом.

Фосфоліпіди екстрагували шляхом додавання до кожної проби 3,75 мл суміші хлороформ/метанол/12М соляна кислота (50:100:1, об./об.). Двофазну систему створювали шляхом додавання 3,75 мл хлороформу та 0,9% розчину NaCl. Проби перемішували 15 секунд та центрифугували 2 хвилини. Нижню органічну фазу промивали 1 раз 3,75 мл суміші хлороформ/метанол/1М соляна кислота (3:48:47, об./об.). Розчинники випаровували в струмі азоту, а отримані ліпіди зберігали за -20?С для подальшого використання [Munnik et al., 2000; Zonia, Munnik, 2004]. Тонкошарову хроматографію ліпідів здійснювали на силiкагелевих пластинках фірми "Merck" (Німеччина) в системі розчинників етилацетат/ізооктан/мурашина кислота/вода (12:2:3:10, об./об.) для відділення фосфатидилбутанолу (тест на активність фосфоліпази D) [Munnik et al., 1995; Munnik et al., 1998; Zonia, Munnik, 2004]. З метою ідентифікації ліпідів за значеннями Rf використовували відповідні речовини-стандарти (фірми “FLUKA” та “SIGMA”). Хроматографічні пластинки з мiченими по ³³Р фосфолiпiдами візуалізували методом авторадiографiї на рентгенiвський плiвцi “Retina XBM” (Україна-Німеччина). Зони фосфатидилбутанолу знімали з хроматограм, переносили у сцинтиляційні флакони та змішували зі сцинтиляційною рідиною. Радіоактивність фосфатидилбутанолу визначали на рiдинному сцинтиляцiйному лічильнику Rack Beta 1219 (“Wallac”, Фінляндія). Статистична обробка даних здійснювалася за допомогою обрахування середнього значення виборки з довірчими інтервалами 95% вірогідності.

Реакція клітин амаранту на цитокініни за умов дії інгібітору сигналізації ФЛD. Успіх в дослідженнях механізмів дії гормонів обумовлений використанням модельного об'єкту, здатного швидко та специфічно реагувати на дію досліджуваної речовини. Тканини сім'ядолей етіольованих проростків амаранту надзвичайно чутливі до екзогенних цитокінінів (рис. 1) та реагують на них швидким акумулюванням червоного пігменту амарантину. Такий ефект покладений в основу чутливого, швидкого, специфічного та кількісного біотесту на цитокініни. Можлива участь ФЛD в процесі трансдукції сигналу, індукованої цитокінінами, була запропонована Романовим і співавторами [Romanov et al., 2000].

Фосфоліпаза D каталізує реакцію гідролізу структурних фосфоліпідів з формуванням фосфатидних кислот. Первинні спирти, особливо 1-бутанол, перешкоджають каталізованому ФЛD утворенню фосфатидних кислот (ФК). В результаті синтезуються неактивні фосфатидилспирти. Вторинні спирти (зокрема, 2-бутанол), в свою чергу, не впливають на формування ФК. Таким чином, первинні спирти використовують з метою пригнічення сигналізації ФЛD, тоді як вторинні - в якості негативного контролю [Munnik et al., 1995]. За результатами аналізу кінетики накопичення амарантину, 1-бутанол діє перед початком транскрипції генів ферментів біосинтезу вказаного пігменту. З іншого боку, 2-бутанол не впливає на біосинтез амарантину. Виражений рівень його накопичення зафіксований в діапазоні концентрацій цитокініну 6-бензиламінопурину (рис. 1) від 10^-5 до 10^-7 М. Концентрація БАП, що зумовлювала максимальний рівень акумулювання амарантину, складала 5х10^-6 М [Romanov et al., 2000, 2003]. Ця концентрація цитокінінів використовувалася в даній роботі.

В нашому дослідженні із застосуванням біотесту на визначення біологічної активності цитокінінів за вмістом амарантину у сімядолях амаранту використовувалися БАП, 1-бутанол та його неактивний аналог - 2-бутанол. Пригнічення біосинтезу амарантину первинними спиртами буде свідчить на користь можливої ролі ФЛD в регуляції цього процесу. В результаті обробки рослин БАП була зареєстрована активація біосинтезу амарантину, оптична густина розчину якого складала 0,2-0,25. За умов введення до інкубаційного середовища рослин 1-бутанолу (0,8%) зафіксоване різке зниження рівня біосинтезу амарантину, індукованого БАП (рис. 2). Неактивний аналог 1-бутанолу - 2-бутанол - не пригнічував цю реакцію клітин на дію цитокінінів. Відомо, що 1-бутанол блокує утворення фосфатидної кислоти фосфоліпазою D [Munnik et al., 1995]. З огляду на вищезазначене, отримані дані свідчать на користь можливої ролі фосфоліпази D в механізмі дії цитокінінів, який зумовлює формування амарантину. цитокінін біосинтез амарант фосфоліпаза

Наведені дані узгоджуються з результатами попередніх досліджень динаміки біосинтезу амарантину у відповідь на дію цитокінінів [Romanov et al., 2000, 2003], в яких використовували 1-бутанол з метою вивчення механізму дії БАП. Таким чином, отримані дані підтверджують можливість участі фосфоліпази D в реалізації дії цитокінінів у клітинах сім'ядолей амаранту.

Вплив цитокінінів на активність ФЛD в клітинах сім'ядолей амаранту. Дослідження активності ФЛD здійснюють за допомогою аналізу динаміки продуктів реакцій, які каталізуються цим ферментом (схема 1). Окрім ФЛD, в клітинах рослин існують інші ферменти, які генерують фосфатидну кислоту. Цей факт ускладнює дослідження механізмів регуляції та функціонування ФЛD. З метою достовірного аналізу активності цього ферменту in vivo застосовують первинні спирти (переважно, 1-бутанол). За наявності низьких концентрацій первинних спиртів ФЛD перемикається з формування фосфатидних кислот на утворення фосфатидилспиртів. Зазначене відбувається завдяки властивості ФЛD каталізувати трансферазну реакцію. В результаті цієї реакції синтезуються стабільніші за ФК фосфатидилспирти (зокрема, фосфатидилбутанол).

Зони структурних фосфоліпідів, фосфатидної кислоти та фосфатидилбутанолу, отримані за допомогою тонкошарової хроматографії, візуалізують за допомогою методу авторадіографії. Кількісну активність зон фосфоліпідів, в які вбудовується радіоактивний ізотоп фосфору (³²P або ³³Р), вимірюють за допомогою сцинтиляційного обрахунку [Lanteri et al., 2008; Krinke et al., 2009]. Рівень радіоактивності фосфатидилспиртів, які утворюються за рахунок фосфоліпази D, може відігравати роль індикатору активності цього ферменту in vivo [Munnik et al., 1995]. Підвищення рівня акумулювання міченого радіоактивним фосфором фосфатидилбутанолу, що характеризує активацію ФЛD, було зафіксоване за короткочасної обробки рослин фітогормонами - абсцизовою кислотою [Hallouin et al., 2002], ауксином [Lanteri et al., 2008] та саліциловою кислотою [Krinke et al., 2009].

З метою встановлення факту активації ФЛD за дії цитокінінів визначали вбудовування радіоактивного фосфору до продукту ФЛD фосфатидилбутанолу за допомогою тонкошарової хроматографії та авторадіографії та оцінювали інтенсивність його формування за дії та за відсутності цих фітогормонів.

Тонкошарова хроматографія з подальшою авторадіографією засвідчили включення ³³Р в структурні фосфоліпіди, фосфатидні кислоти та фосфатидилбутанол (рис. 4). Зони фосфатидилбутанолу чітко візуалізувалися тільки в тих треках ліпідів з рослин, які були оброблені цитокінінами. За результатами авторадіографії та сцинтиляційного обрахунку було виявлене різке підвищення рівня фосфатидилбутанолу вже на 10 хвилині дії БАП (рис. 4, 5), що свідчить на користь швидкої активації ФЛD за дії цитокінінів у клітинах рослин. Посилення інтенсивності формування фосфатидилбутанолу у відповідь на дію БАП свідчить про утворення фосфатидних кислот в клітинах рослин, обумовлене цитокінінами. 1-Бутанол, субстрат ФЛD в реакції трансетерифікації, введений до тканин рослин за відсутності цитокінінів, достовірно не змінював базовий рівень біосинтезу фосфатидилбутанолу в клітинах амаранту. З іншого боку, одночасна інкубація рослин з БАП та 1-бутанолом зумовлювала підвищення інтенсивності формування продукту ФЛD - фосфатидилбутанолу (рис. 4, 5). Це пояснюється наявністю в середовищі інкубації рослин як субстрату ФЛD (1-бутанолу), необхідного для формування індикатора активності цього ферменту (фосфатидилбутанолу), так і фітогормонів цитокінінів.

2-Бутанол, сполука, яка не перешкоджає каталізованому ФЛD формуванню фосфатидних кислот, не використовується цим ферментом з метою синтезу фосфатидилбутанолу. Це пояснює відсутність підвищення його рівнів у відповідь на дію цитокінінів (рис. 4, 5). Зумовлений БАП біосинтез фосфатидилбутанолу за наявності 1-бутанолу, субстрату ФЛD, на відміну від 2-бутанолу, що не є субстратом цього ферменту, є важливим аргументом на користь активації ФЛD за дії цитокінінів.

Рис. 5. Активація фосфоліпази D (за радіоактивністю фосфатидилбутанолу) за дії цитокінінів у клітинах амаранту

Отримані дані підтверджуються результатами досліджень впливу БАП на співвідношення фосфоліпідів у колеоптилях кукурудзи, обраховане за кількістю в них фосфору. Обробка відрізків колеоптилів проростків вказаними цитокінінами впродовж 30 хвилин зумовлює підвищення втричі рівнів фосфатидних кислот, продуктів реакції гідролізу, каталізованої ФЛD, та зниження кількості субстрату цього ферменту - фосфатидилетаноламіну [Тарасова, Медведев, 2008]. Таким чином, дія цитокінінів на клітини рослин веде до різкого підвищення рівнів обох продуктів фосфоліпази D - фосфатидилбутанолу та фосфатидних кислот.

Трансдукція внутрішньоклітинних сигналів передбачає швидкі зміни біохімічних параметрів клітин у відповідь на дію стимулів довкілля. Короткий проміжок часу від дії стимулу до змін активності ферментів свідчить на користь участі останніх на етапі передачі сигналів. Зазначене є передумовою аналізу активності сигнальних ферментів.

З метою дослідження динаміки активності ФЛD у відповідь на дію БАП реєстрували інтенсивність формування фосфатидилбутанолу через різні проміжки часу дії цитокінінів. Підвищення рівня біосинтезу фосфатидилбутанолу було встановлене вже на 5 хвилині обробки рослин БАП. На 10 та 15 хвилинах дії цитокінінів зафіксоване подальше накопичення вищезазначеного продукту ФЛD. На 30 хвилині БАП індукував найбільш інтенсивне акумулювання фосфатидилбутанолу, що відображено на радіоавтографі. 1-Бутанол або БАП, введені окремо до середовища інкубації рослин, не обумовлювали змін біосинтезу фосфатидилбутанолу (рис. 6). Достовірне підвищення рівня радіоактивності фосфатидилбутанолу на 5 хвилині дії БАП свідчить про високу якість проведення тонкошарової хроматографії та авторадіографії - методів, що дозволили встановити мінімальні зміни рівнів продукту ФЛD, які відображають накопичення фосфатидної кислоти - ліпідного посередника сигнальних каскадів у клітинах рослин - за дії цитокінінів.

Результати статистичної обробки отриманих даних по кількості імпульсів на хвилину вбудованого у фосфатидилбутанол радіоактивного фосфору наведені на рис. 7. Протягом 5-15 хвилин додавання БАП в середовище інкубації рослин зареєстроване відповідне підвищення накопичення фосфатидилбутанолу. Виражене акумулювання цієї сполуки зафіксоване на 30 хвилині дії БАП. Рівні фосфатидилбутанолу на 5 хвилині дії цитокінінів підвищуються порівняно з контролем у 2,5 рази, на десятій хвилині - в 3,2-4,3 рази, на 15 хвилині - у 4,7-6,2 рази, тоді як на тридцятій хвилині дії цих фітогормонів - у 9-12 разів (рис. 7). Таким чином, клітини сім'ядолей амаранту реагують на обробку цитокінінами in vivo швидким підвищенням активності ФЛD. Зазначене є важливим аргументом на користь участі фосфоліпази D в передачі сигналу цитокінінів.

Вищезазначені результати є прямим свідченням на користь можливої участі ФЛD в трансдукції сигналу цитокінінів, однак дані про вплив цих фітогормонів на активність вказаного ферменту були до цього моменту відсутніми. Вперше отримані результати демонструють активацію ФЛD виключно на початкових етапах дії цитокінінів. Швидке стимулювання цього ферменту - на 5-10 хвилинах обробки рослин БАП (рис. 7) - свідчить про його незалежність від новоутворення білків у клітинах, оскільки мінімальний проміжок часу, необхідний для формування білкових продуктів генів первинної відповіді на цитокініни у Arabidopsis thaliana, складає 1 годину [Romanov et al., 2002]. З огляду на вищезазначене, активація ФЛD за дії цитокінінів не залежить від транскрипції та трансляції генів. Підвищення накопичення продуту ФЛD за триваліших експозицій сім'ядолей з цитокінінами відображає більш повне проникнення цих фітогормонів у тканини амаранту. Варто відзначити, що наведені дані були отримані не завдяки гомогенізації тканин та подальшої реєстрації активності ФЛD in vitro, а на інтактних сім'ядолях in vivo, що є вагомим аргументом на користь активації ФЛD, обумовленої цитокінінами, в живих клітинах.

Характерною рисою фосфатидилбутанолу є здатність до накопичення в мембранах клітин з моменту активації ФЛD, оскільки ця сполука в клітинах не розщеплюється. Рівень акумулювання фосфатидилбутанолу, зафіксований на 5 хвилині дії БАП, є наслідком активації ФЛD на більш ранніх етапах дії цитокінінів у клітинах. За літературними даними, швидке накопичення фосфатидилбутанолу в інтактних клітинах зумовлюють також інші фітогормони. Зокрема, абсцизова кислота стимулює підвищення рівня накопичення фосфатидилбутанолу на 30%, однак це відбувається лише на 30 хвилині її дії на суспензії клітин Arabidopsis [Hallouin et al., 2002]. В проростках Cucumis sativus ауксин через десять хвилин зумовлює підвищення вдвічі рівня фосфатидилбутанолу [Lanteri et al., 2008]. В суспензіях клітин Arabidopsis cаліцилова кислота індукує виражене накопичення фосфотидилбутанолу лише на 45 хвилині дії, тоді як слабке підвищення рівнів останнього зафіксоване в проміжку часу обробки цим фітогормоном між 15 та 30 хвилинами [Krinke et al., 2009]. Чітка та швидка активація ФЛD у відповідь на дію цитокінінів свідчить про доцільність вибору об'єкту досліджень - сім'ядолей Amaranthus caudathus L., які специфічно реагують на ці фітогормони. З огляду на вищезазначене, ФЛD активується на ранніх етапах трансдукції сигналу цитокінінів.

Роль іонів кальцію та ФІФ₂ в регуляції фосфоліпази D за дії цитокінінів. Клітини рослин містять різні молекулярні форми ФЛD, що відрізняються за структурою, біохімічними властивостями та чутливістю до кофакторів - іонів кальцію та фосфатидилінозитол-4,5-бісфосфату [Wang, 2005; Li et al., 2009]. Кальцій посідає чільне місце серед вторинних посередників сигнальних каскадів клітин рослин [Medvedev, 2005]. Серед хімічних речовин, які пригнічують дію іонів кальцію, часто застосовують ЕГТА, що зв'язує кальцій в апопласті, та верапаміл (похідне фенілалкіламіну), який пригнічує активність каналів кальцію L-типу плазматичних мембран [Shishova, Lindberg, 2004] (рис. 8). Ці модифікатори балансу іонів кальцію використовуються для досліджень регуляції активності ФЛD. Зокрема, формування ФК, каталізоване ФЛD за дії холодового шоку, пригнічується ЕГТА в суспензіях клітин Arabidopsis. Іони лантану, інгібітору каналів кальцію, слабше пригнічують акумуляцію ФК за дії холодового шоку, каталізовану ФЛD [Ruelland et al., 2002]. ЕГТА пригнічує активність ФЛD в проростках рису - 50% активності цього ферменту зафіксовані за 60 мкМ вказаного хелатору кальцію [Lee, 1989].

З метою з'ясування чутливості фосфоліпаз D, які активуються за дії цитокінінів, до іонів кальцію, в тканини рослин вводили ЕГТА та верапаміл. По завершенню інкубації рослин з цими модифікаторами балансу іонів кальцію вводили БАП та фіксували тканини через 30 хвилин. В результаті, як свідчать радіоавтографи (рис. 9), кількість новосинтезованого фосфатидилбутанолу у відповідь на дію цитокінінів різко знижувалася за умов додавання сполук, які зв'язують позаклітинні іони кальцію та пригнічують активність його каналів.

Результати кількісного аналізу дії вищезазначених модифікаторами балансу іонів кальцію (ЕГТА та верапамілу) на інтенсивність формування фосфатидилбутанолу у відповідь на дію цитокінінів наведені на діаграмі кількості імпульсів на хвилину нововбудованого у фосфатидилбутанол радіоактивного ізотопу фосфору (рис. 10). ЕГТА знижує біосинтез фосфатидилбутанолу на 30%, тоді як верапаміл - на 59%. Таким чином, цитокініни активують молекулярні форми ФЛD, чутливі до іонів кальцію.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 10. Залежність активації ФЛD клітин амаранту за дії БАП (30 хвилин) від рівня іонів кальцію та ФІФ₂ в клітинах (за радіоактивністю фосфатидилбутанолу)

ФІФ₂ є кофактором окремих класів ФЛD [Li et al., 2009]. Хімічною речовиною, яка взаємодіє з ФІФ₂ шляхом хелатування, є аміноглікозид неоміцин [Schacht, 1978; Huang et al., 1999]. Він широко використовується в дослідженнях щодо ролі фосфоліпаз у рослин. Зокрема, вказана сполука виражено пригнічує формування ФК в проростках Vicia faba, зумовлене факторами утворення бульбочок та агоністом гетеротримерних G-білків - мастопараном [Den Hаrtog et al., 2001]. Неоміцин також блокує зумовлене холодовим шоком накопичення ФК, каталізоване ФЛD, в культурах клітин Arabidopsis [Ruelland et al., 2002] та акумулювання ФК, індуковане дією позаклітинного АТФ на культури клітин помідорів [Sueldo et al., 2010]. Більш того, вказана сполука також використовувалась в якості інгібітору ФЛС з метою дослідження регуляції динаміки мікротрубочок в клітинах тютюну фосфоліпазою D [Dhonukshe et al., 2003].

З метою з'ясування ролі кофактору ФІФ₂ в регуляції ФЛD за дії цитокінінів використовували неоміцин, який вводили до інкубаційного середовища до початку обробки БАП. За даними авторадіографії (рис. 9), неоміцин зумовлює різке зниження кількості фосфатидилбутанолу, сформованого за дії цитокінінів. Це свідчить про пригнічення активації ФЛD, індукованої вказаними фітогормонами.Результати кількісного аналізу акумулювання фосфатидилбутанолу, обумовленого цитокінінами, за дії неоміцину на наведені на діаграмі (рис. 10). Рівень формування фосфатидилбутанолу за дії цитокінінів в умовах інкубації рослин з неоміцином знижується на 75%. Слід зазначити, що неоміцин, порівняно з ЕГТА та верапамілом, найбільш виражено знижував біосинтез продукту ФЛD, що свідчить про істотну роль ФІФ₂ як кофактору фосфліпази D, активованої цитокінінами.

Фосфоліпази D клітинах рослин є гетерогенною родиною ферментів з різними біохімічними властивостями. Зокрема, вони відрізняються за залежністю активності від концентрації іонів кальцію в цитозолі та ФІФ₂ в мембранах [Wang et al., 2006; Li et al., 2009]. В клітинах Arabidopsis thaliana L. існують різні молекулярні форми ФЛD - ФЛDб, ФЛDв, ФЛDг, ФЛDд, ФЛDе та ФЛDж. Серед них, активність ФЛDб залежнить від іонів кальцію, ФЛDв, ФЛDг, ФЛDе та ФЛDж залежать від ФІФ₂, тоді як активність ФЛDд та ФЛDе є чутливою до олеїнової кислоти. Водночас, ФЛDж є нечутливою до іонів кальцію [Wang et al., 2006; Li et al., 2009]. Встановлення чутливості ФЛD до вищезазначених кофакторів може свідчити про участь певних молекулярних форм ФЛD в реалізації дії цитокінінів. Верапаміл, інгібітор каналів кальцію плазматичної мембрани, та ЕГТА, хелатор іонів кальцію в апопласті, знижували рівень накопичення продукту активності ФЛD. Зазначене свідчить на користь участі молекулярних форм ФЛD, залежних від кальцію, в реалізації дії цитокінінів. Водночас, NAE 12, інгібітор ФЛDб, не пригнічує біосинтез амарантину, індукований цитокнінами у амаранту, що свідчить проти участі ФЛD класу б в реалізації дії цитокінінів у клітинах рослин [Kravets et al., 2010]. З іншого боку, здатність неоміцину, сполуки, яка хелатує ФІФ₂, знижувати в порівнянні з модифікаторами балансу іонів кальцію накопичення фосфатидилбутанолу у відповідь на дію БАП, може свідчити про істотну роль залежних від ФІФ₂ ФЛD (ФЛDв, ФЛDг) в реалізації дії цього фітогормону. Іншою властивістю ФЛD, стимульованої цитокінінами, є гідроліз фосфатидилетаноламіну в якості субстрату [Тарасова, Медведев, 2008]. Залежність від ФІФ₂ та специфічний гідроліз фосфатидилетаноламіну характерні для молекулярної форми ФЛDг1 у Arabodopsis thaliana L. [Li et al., 2009]. Це свідчить на користь того, що специфічні ФЛD можуть брати участь в реалізації дії цитокінінів у Amaranthus caudatus.

Роль ФЛD в якості компоненту сигнального каскаду цитокінінів підтверджують результати інших досліджень. Зокрема, цитокініни впродовж двох годин дії на рослини не впливають на експресію генів ФЛD [Xu et al., 1997; Brenner et al., 2005]. Більш того, первинні спирти за концентрацій, які блокують дію цитокінінів у клітинах [Romanov et al., 2000, 2003], не перешкоджають зв'язуванню цих фітогормонів з їх рецепторами [Romanov et al., 2006]. Водночас, первинні спирти пригнічують накопичення транскриптів типового гену первинної відповіді на цитокініни у Arabidopsis [Romanov et al., 2002, 2003] та барвінку [Amini et al., 2008], зумовлене вказаними фітогормонами. Таким чином, фосфоліпаза D функціонує в механізмі дії цитокінінів саме перед початком транскрипції генів, тобто на рівні трансдукції сигналу вказаних фітогормонів. Швидка активація ФЛD за дії цитокінінів свідчить про її незалежність від транскрипції генів та новоутворення білків у клітинах. ФЛD може зазнавати посттрансляційних модифікацій з боку систем сприйняття зазначених фітогормонів.

Активація ФЛD у відповідь на дію цитокінінів свідчить на користь ролі ФК в якості вторинного посредника передачі внутрішньоклітинного сигналу цих фітогормонів.

Можливі різні варіанти участі ФК в механізмі передачі сигналу цитокінінів. Відомо, що в клітинах сім'ядолей амаранту інгібітор протеїнфосфатаз пригнічує біосинтез пігменту амарантину, індукований цитокінінами. Згідно з аналізом кінетики інгібування біосинтезу амарантину, ця речовина діє після 1-бутанолу, однак перед транскрипцією [Romanov et al., 2000]. Більш того, блокатори протеїнфосфатаз нівелюють індукцію активності промотору типового гену первинної відповіді, обумовлену цитокінінами [Romanov et al., 2002]. Наявні дані свідчать на користь того, що цитокініни можуть зумовлювати активацію протеїнфосфатаз за рахунок фосфатидної кислоти, що відображається в змінах транскрипції генів. В трансдукції сигналу цитокінінів можуть також брати участь протеїнкінази. Інгібітор цих ферментів послаблює активацію промотору гену ARR5, індуковану вказаними фітогормонами [Romanov et al., 2002]. З огляду на вищезазначене, активність протеїнкіназ та протеїнфосфатаз може змінюватись внаслідок дії фосфатидних кислот, що відіграє важливу роль в трансдукції сигналу цитокінінів.

За результатами представлених досліджень побудована модель трансдукції сигналу цитокінінів за участю фосфоліпази D (схема 2). Згідно з цією моделлю, цитокініни в позаклітинному середовищі зв'язуються зі специфічними рецепторами (1), які передають сигнал на фосфоліпазу D (2). Активація цього ферменту забезпечує утворення фосфатидних кислот - вторинних посередників сигнальних каскадів (3). Дані сполуки можуть активувати специфічні сигнальні ферменти - зокрема, протеїнкінази та протеїнфосфатази (4), що відображається на характері експресії генів (5). Зазначене є передумовою змін інтенсивності та напряму цілої низки метаболічних потоків у клітинах рослин (6).

Висновки

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що полягає у встановленні in vivo активації фосфоліпази D за дії цитокінінів та чутливості цього ферменту до іонів кальцію та ФІФ₂ в клітинах.

1. Встановлено, що фосфоліпаза D приймає участь в реалізації біологічної дії цитокінінів у клітинах рослин.

2. Підтверджено, що інгібітор формування фосфатидних кислот за рахунок фосфоліпази D - 1-бутанол - пригнічує біосинтез амарантину, який є фізіологічною реакцією клітин на дію цитокінінів у Amaranthus caudatus L.

3. Встановлене in vivo підвищення рівня утворення фосфатидилбутанолу, продукту активності фосфоліпази D в присутності первинних спиртів, на перших хвилинах дії бензиламінопурину свідчить про швидку активацію фосфоліпази D за дії цитокінінів.

4. Показано пригнічення індукованої цитокінінами активності фосфоліпази D за дії модуляторів вмісту іонів кальцію в клітинах - ЕГТА та верапамілу.

5. Встановлено, що зв'язування фосфатидилінозитол-4,5-бісфосфату неоміцином призводить до зниження інтенсивності утворення фосфатидилбутанолу фосфоліпазою D за дії цитокінінів.

6. Чутливість формування фосфатидилбутанолу до наявності іонів кальцію та фосфатидилінозитол-4,5-бісфосфату в клітинах свідчить про залучення чутливих до цих кофакторів молекулярних форм фосфоліпази D до реакції клітин рослин на дію цитокінінів.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Role of phospholipase D in the mechanism of cytokinin action / [Kravets V.S., Kretynin S.V., Kolesnikov Ya.S., Machaиkova I., Romanov G.A., Martineж J.] // Physiol. Plant. - 2004. - Vol. 26. - P. 32.

2. The effect of cytokinin on plant ceels phospholipase D / [Kravets V.S., Kretynin S.V., Kolesnikov Ya.S., Romanov G.A., Martineж J., Machбиkovб I.] // 1^st Ukr. Congr. Cell Biol. - Lviv, 2004. - P. 183.

3. Kravets V.S. Cooperation of the plant cells phospholipase D and phospholipase C in signal transduction / Kravets V.S., Kretynin S.V., Kolesnikov Y.S. // The Ukrainian Biochemical journal. - 2005. - V. 7, № 2 (special issue “5^th Parnas Conference Molecular Mechanisms of Cellular Signaling”). - P. 123.

4. The role of phospholipase C and D in the mechanism of cytokinin action / [Kravets V.S., Kretynin S.V., Kolesnikov Ya.S., Romanov G.A., Martineж J., Machбиkovб I.] // Biologia Plantarum. - 2005. - Vol. 49 (suppl.). - P. 19.

5. Role of PIP2-dependent phospholipase D in the mechanism of cytokinin action / [Kolesnikov Ya., Kravets V., Kretynin S., Romanov G., Martineж J., Machбиkovб I.] // Abstr. 15^th Congr. Fed. Eur. Soc. Plant Biol., Lyon, France, 17-21 July 2006, HOR01-027.

6. Роль ФИФ2-зависимой фосфолипазы Д в реализации действия цитокинина / [Koлесников Я.С., Кравец В.С., Кретинин С.В., Романов Г.А., Мартинец Я., Махачкова И.] // Современная физиология растений: от молекул до экосистем: материалы докладов Международной конференции. Часть 1. - Сыктывкар, 2007. - С. 298-299.

7. Participation of PIP₂-phospholipase D in cytokinin signaling / [Kolesnikov Ya.S., Kravets V.S., Kretynin S.V., Romanov G.A., Martineж J. and Machбckovб I.] // Abstr. of 2^nd International Symposium “Plant Growth Substances: Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture”, Kyiv, Ukraine. - 2007. - P. 49.

8. О возможном участии фосфолипазы D в трансдукции сигнала цитокинина / [Кравец В.С., Колесников Я.С., Кретинин С.В., Гетман И.А., Карпова Г.М., Романов Г.А.] // Регуляция роста, развития и продуктивности растений: материалы VI-й Международной научной конференции. - Минск: ИВЦ Минфина, 2009. - c. 81.

9. Кравец В.С. II Международный симпозиум «Регуляторы роста растений: внутриклеточная гормональная сигнализация и применение в аграрном производстве» / Кравец В.С., Колесников Я.С., Кухарь В.П. // Цитология и генетика. - 2008. - Т. 42, № 3. - С. 94-103.

10. The Second International Symposium Plant Growth Substances: Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture (Kiev, Ukraine, October 8-12, 2007) / [Kravets V. S., Kolesnikov Ya. S., Kuznetsov V. V., Romanov G. A.] // Russian Journal of Plant Physiology. - 2008. - Vol. 55, № 4. - Р. 568-577.

11. Цитокинины вызывают быструю активацию фосфолипазы D в чувствительных тканях растений / [Кравец В.С., Кретинин С.В., Колесников Я.С., Гетман А.И., Романов Г.А.] // Доклады Академии Наук. - 2009. - Т. 428, № 5. - С. 1-4.

12. Rapid activation of specific phospholipase(s) D by cytokinin in Amaranthus assay system / [Kravets V.S., Kolesnikov Ya.S., Kretynin S.V., Getman I.A., Romanov G.A.] // Physiologiae Plantarum. - 2010. - Vol. 138. - P. 249-255.

13. Молекулярные и генетические подходы в исследованиях роли фосфолипазы D клеток растений / [В.С. Кравец, Я.С. Колесников, С.В. Кретинин, Е.М. Кабачевская, Г.В. Ляхнович, О.М. Бондаренко, И.Д. Волотовский, В.П. Кухарь] // Біополімери і клітина. - 2010. - Т. 26, № 3. - С. 1-12.

14. Роль кальция в регуляции фосфолипазы D при действии цитокининов / [В.С. Kравец, Я.С. Kолесников, С.В. Kретинин, О.М. Бондаренко, Г.А. Романов] // Український ботанічний журнал. - 2010. - Т. 67, № 3. - С.

Анотація

Колесников Я.С. Роль фосфоліпази D в реалізації біологічної дії цитокінінів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. - Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2010.

Дисертацію присвячено дослідженню участі фосфоліпази D, одного з ключових ферментів сигналізації ліпідів, в механізмі трансдукції сигналу фітогормонів цитокінінів.

Досліджували in vivo динаміку фосфатидилбутанолу, продукту фосфоліпази D, у відповідь на дію цитокінінів у клітинах сім'ядолей проростків амаранту. Встановлено різке підвищення рівня фосфатидилбутанолу на п'ятій хвилині дії вказаних фітогормонів, що тривало на тридцятій хвилині. Зроблено висновок про активацію фосфоліпази D на початкових етапах трансдукції сигналів цитокінінів. Досліджено механізм регуляції фосфоліпази D в клітинах, зокрема роль кофакторів - кальцію та фосфатидилінозитол-4,5-бісфосфату. Застосування інгібітору каналів кальцію плазматичних мембран (верапамілу) та хелатору іонів кальцію в апопласті (ЕГТА) зумовлює пригнічення формування фосфатидилбутанолу, індукованого цитокінінами. Неоміцин, хелатор фосфатидилінозитол-4,5-бісфосфату, також різко знижує акумуляцію вищезазначеного продукту фосфоліпази D. Чутливість формування фосфатидилбутанолу до наявності іонів кальцію та фосфатидилінозитол-4,5-бісфосфату в клітинах рослин свідчить про участь чутливих до цих кофакторів молекулярних форм фосфоліпази D в реалізації дії цитокінінів.

Ключові слова: фосфоліпаза D, цитокінін, фосфатидилбутанол, верапаміл, ЕГТА, неоміцин, трансдукція сигналу, фосфоліпіди.

Аннотация

Колесников Я.С. Роль фосфолипазы D в реализации биологического действия цитокининов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. - Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2010.

Цитокинины являются классическими фитогормонами, играющими ключевую роль в регуляции роста и развития растений. Эти соединения стимулируют деление клеток, регенерацию побегов в культуре тканей и биосинтез пигментов, но препятствуют старению и апикальному доминированию. Изучение молекулярных механизмов передачи гормональных сигналов является актуальной задачей современной биологии. Клетки растений способны реагировать на изменение параметров внешней среды быстрой активацией фосфолипазы D. Это приводит к образованию вторичного посередника сигнальних систем - фосфатидной кислоты и, как следствие, специфическому изменению метаболизма клеток. Существуют свидетельства о возможном участии фосфолипазы D в реализации действия цитокининов.

Диссертация посвящена исследованию участия фосфолипазы D как одного из ключевых ферментов сигнализации фосфолипидов в трансдукции сигнала цитокининов в клетках растений. Ингибитор сигнализации ФЛD, 1-бутанол, угнетал реакцию клеток на действие цитокининов - биосинтез пигмента амарантина в семядолях проростков амаранта (Amaranthus caudatus L.). Это подтверждало возможность участия указанного фермента в реализации действия этих фитогормонов. Активность фосфолипазы D была исследована in vivo с помощью мечения фосфолипидов [P³³]-ортофосфатом и последующего анализа динамики радиоактивности фосфатидилбутанола, продукта ФЛD в присутствии первичных спиртов, под влиянием цитокининов. Впервые было обнаружено резкое повышение уровня фосфатидилбутанола уже на пятой минуте действия цитокининов in vivo. Эта реакция проявлялась также на 10, 15 и 30 минутах инкубации растений с этими фитогормонами. Вышесказанное свидетельствует об участии фосфолипазы D на начальных этапах действия цитокининов в клетках растений. С целью изучения механизмов регуляции фосфолипазы D, активированной указанными фитогормонами, исследовали роль широко известных кофакторов этого фермента в клетках растений - ионов кальция и фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата - в модуляции ФЛD in vivo. Впервые было зарегистрировано резкое снижение уровня аккумуляции фосфатидилбутанола, стимулированной цитокининами, в условиях обработки растений верапамилом (ингибитором каналов кальция плазматических мембран), ЭГТА (хелатором ионов кальция в апопласте), а также неомицином (хелатором фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата). Это позволяет сделать вывод об участии специфических молекулярних форм фосфолипазы D, зависимых от этих кофакторов, в механизме трансдукции сигнала вышеуказанных фитогормонов в клетках растений.

Ключевые слова: фосфолипаза D, цитокинин, фосфатидилбутанол, верапамил, ЭГТА, неомицин, трансдукция сигнала, фосфолипиды.

Annotation

Kolesnikov Ya.S. Role of phospholipase D in biological action of cytokinins. - Manuscript.

Dissertation for the candidate of biological science degree in speciality 02.00.10 - Bioorganic chemistry. Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2010.

The object of the investigation is phospholipase D as one of the key enzymes of plant phospholipid metabolism in cytokinin signal transduction.

The effect of cytokinins on phospholipase D activity in vivo - as measured according to radioactivity of its product (phosphatidylbutanol) - was investigated in cotyledons of amaranthus (Amaranthus caudatus L.) seedlings. For the first time, rapid increase of phosphatidylbutanol accumulation was found during the early 5 minutes of cytokinin administration that was maintained at 30 minutes. These results indicate the participation of phospholipase D in early stages of cytokinin action. Regulation of phospholipase D activated by cytokinin was studied, specifically the role of its cofactors - calcium and phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Pretreatment of plants with calcium channel blocker (verapamil) and extracellular calcium chelator (EGTA) reduced cytokinin-dependent phosphatidylbutanol accumulation. Application of neomycin, chelator of phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate, also repressed this effect. Sensitivity of phosphatidylbutanol accumulation to calcium and phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate availability in cells suggests a role of specific phospholipase D isoenzymes, dependent on these cofactors, in cytokinin signaling.

Key words: phospholipase D, cytokinin, phosphatidylbutanol, verapamil, EGTA, neomycin, signal transduction, phospholipids.

Размещено на Allbest.ru