Створення та дослідження полімерів-біоміметиків для сенсорної технології та твердофазової екстракції

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут молекулярної біології і генетики

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

03.00.20 - біотехнологія

Створення та дослідження полімерів-біоміметиків для сенсорної технології та твердофазової екстракції

Сергеєва Тетяна Анатоліївна

Київ 2010

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в лабораторії біомолекулярної електроніки відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (м. Київ).

Науковий консультант доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Єльська Ганна Валентинівна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, директор інституту, завідувач відділу механізмів трансляції генетичної інформації.

Офіційні опоненти доктор біологічних наук, професор, чл.-кор. НАН України Говорун Дмитро Миколайович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, заступник директора з наукової роботи, завідувач відділу молекулярної та квантової біофізики; доктор біологічних наук, c.н.с. Галатенко Наталія Андріївна, Інститут хімії високомолекулярних сполук НАН України, завідувач відділу полімерів медичного призначення; доктор біологічних наук, с.н.с. Верьовка Сергій Вікторович, ДУ “Інститут отоларингології ім. О.С. Коломійченка АМН України”, завідувач лабораторії біохімії.

Захист дисертації відбудеться 5 жовтня 2010 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03680, Київ-680, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (03680, Київ-680, вул. Заболотного, 150).

Автореферат розіслано “3” “вересня” 2010 року.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради к.б.н., с.н.с. І.В.Крупська

1. Загальна характеристика роботи

полімерний сенсорний екстракція біомакромолекула

Актуальність теми. Життєздатність живих клітин, зокрема можливість отримувати інформацію з зовнішнього середовища базується на феномені молекулярного розпізнавання. Молекулярне розпізнавання, що ґрунтується на комплементарності біомолекул, лежить в основі ферментного каталізу, взаємодії гормонів та інших медіаторів з їхніми рецепторами, взаємодії антитіл з антигенами і, таким чином, є фундаментальною основою всіх біохімічних процесів у живих організмах.

Унікальні властивості біомолекул забезпечують їхнє широке використання у практиці, наприклад, у біотехнологічних процесах, для розробки аналітичних методів та медичній діагностиці. Останнім часом біомолекули широко застосовують для розробки біосенсорних методів, які завдяки високій селективності та чутливості аналізу, поєднаних з експресністю, мобільністю та невисокою вартістю, є найуспішнішими методами сучасної аналітичної біотехнології (Lowe, et al., 2007, Cooper, 2004). Однак, незважаючи на те, що нині вже розроблено безліч лабораторних макетів біосенсорів, існує відносно небагато прикладів їхньої успішної комерціалізації. Великою мірою це зумовлено тим, що всі біомолекули є надзвичайно нестабільними у зовнішньому середовищі. Для них властиві складність виділення та очищення і, як наслідок, - висока вартість. Все це суттєво обмежує можливості їхнього практичного застосування.

З цього погляду значний інтерес становить створення штучних рецепторів або так званих полімерів-біоміметиків, які б імітували активні сайти біологічних макромолекул, та водночас поєднували їхню високу селективність з прийнятною стабільністю за жорстких умов зовнішнього середовища. Ефективним підходом до створення таких матеріалів є метод молекулярного імпринтингу (Wulff, Sarhan, 1972; Arshady, Mosbach, 1981), який передбачає синтез полімерів з високим ступенем зшивання навколо молекул-матриць (які водночас є аналітами). Екстракція матричних молекул із повністю сформованого полімеру призводить до утворення у полімерній сітці порожнин, які комплементарні їм як за розміром, так і за просторовим розташуванням функціональних груп. Полімери, синтезовані згідно цього методу, здатні повторно селективно зв'язувати матричні молекули, за присутності яких вони були синтезовані. Молекулярно імпринтовані полімери (МІП) можуть бути синтезовані до практично необмеженої кількості речовин. Вони є високоселективними при розпізнаванні відповідних аналітів, а також демонструють високу термо-, механічну та хімічну стабільність (Sellergren, 1989, Svenson, Nicholls, 2001).

Полімери-біоміметики становлять як великий теоретичний, так і практичний інтерес. Вони використовуються в аналітичній хімії як принципово нові носії для хроматографії (Ansell et al., 2005) та твердофазової екстракції (Baggiani et al., 2007), можуть бути застосовані як штучні ферменти в біотехнологічних процесах (Wulff, 1996, Motherwell, 2001), а також як альтернатива антитілам в імуноаналізі (Ansell, 2001) та біосенсорній технології (Mosbach, 2001).

Основна маса опублікованих нині робіт присвячена дослідженню та практичному застосуванню МІПів у вигляді полімерних частинок (Sambe et al., 2006, Beltran et al., 2009, Nakamura et al., 2005, Song et al., 2008). Проте, такий підхід є працемістким та малоефективним, оскільки в процесі отримання полімерних частинок втрачається більшість штучних рецепторних сайтів зв'язування. Крім того, існує низка суттєвих технологічних труднощів при їхньому застосуванні як у біосенсорній технології, імуноаналізі, так і у розділенні речовин.

Привабливою альтернативою є синтез та практичне застосування МІПів у вигляді полімерних мембран зі стабільними фізико-хімічними характеристиками. Це дозволить уникнути проблем, пов'язаних із інтеграцією МІПів з поверхнею фізичних перетворювачів та планшетів для імуноферментного аналізу, а також проведення дослідів при високому тиску у випадку розділення речовин із застосуванням МІПів як стаціонарної фази.

З іншого боку, незважаючи на те, що протягом останнього десятиріччя кількість робіт, присвячених синтезу та практичному застосуванню МІПів, зростає експоненційно, більшість із них є емпіричними. У більшості випадків компоненти для синтезу МІП вибирають, виходячи із загальних міркувань, без ґрунтовного аналізу здатності різних мономерів утворювати рецепторні сайти, які імітують активні сайти біомакромолекул, а також їхньої здатності утворювати системи, в яких більшість сформованих селективних сайтів є доступною для взаємодії з відповідними аналітами.

Беручи до уваги вищенаведене, актуальною як з точки зору фундаментальних досліджень процесів молекулярного розпізнавання, так і для розв'язання прикладних задач сучасної біотехнології є розробка універсальних підходів до синтезу МІПів у вигляді мембран і тонких плівок на поверхні фізичних перетворювачів та оптимізації їхнього складу, а також їхнє практичне застосування у біосенсорній технології та твердофазовій екстракції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт лабораторії біомолекулярної електроніки відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології і генетики НАН України і виконана в рамках таких тем: „Розробка наукових засад створення біосенсорів на основі кондуктометричних перетворювачів” (бюджетна тема 2.2.4.22, № держ. реєстрації 0195U005362, 1995-1998 рр.); „Розробка нетрадиційних підходів до створення селективних елементів біоелектронних систем” (бюджетна тема 2.2.4.22, № держ. реєстрації 0199U000660, 1999-2002 рр.); „Розробка монобіосенсорів та сенсорних масивів для аналізу забруднення навколишнього середовища та харчових продуктів” (бюджетна тема 2.2.4.18, № держ. реєстрації 0101U008008, 2001-2006 рр.), „Розробка нових підходів для створення амперометричних біосенсорів для потреб біотехнології” (бюджетна тема 2.2.4.22, № держ. реєстрації 0103U000074, 2003-2007 рр.); “Розробка та дослідження сенсорних систем для екологічного моніторингу на основі полімерів-біоміміків. Комп'ютерне моделювання для створення штучних аналогів біологічних рецепторів.” (НДР НАНУ, № держ. реєстрації 0107U003131, 2004-2006 рр.), “Створення та дослідження гербіцид-специфічних матричних полімерних мембран на основі взаємопроникних полімерних сіток для твердофазової екстракції” (НДР НАНУ, № держ. реєстрації 0106U000822, 2004-2006 рр.), “Розробка та дослідження портативних сенсорних систем для визначення фенолів на основі полімерів-біоміміків з каталітичними властивостями. Портативні сенсорні системи для визначення фенолів з каталітичними властивостями” (НДР НАНУ, № держ. реєстрації 0107U003131, 2007-2009 рр.), “Молекулярно імпринтовані полімерні мембрани як синтетичні аналоги біологічних рецепторів для детектування низькомолекулярних органічних сполук. Комп'ютерне моделювання для оптимізації складу полімерів-біоміміків” (НДР НАНУ, № держ. реєстрації 0107U004946, 2007-2009 рр.), “Test-system for detection of the trace quantities of herbicides.”(INTAS grant UA 95-0161, 1995-1998 рр.), “Molecularly imprinted polymer membranes for herbicide-selective solid-phase extraction from water” (INTAS grant YSF-00-25, 2001-2002 рр.), “Computational design and synthesis of molecularly imprinted polymers for chemoremediation of triazine herbicides” (INTAS grant, YSF-00-25R, 2002-2003 рр.) та “Development of toxin-specific molecularly imprinted polymer membranes based on interpenetrating polymer networks” (STCU project №3307, 2006-2008 рр.).

Метою роботи є розробка наукових та технологічних засад створення високостабільних аналогів рецепторних сайтів біомакромолекул у структурі полімерних мембран та тонких плівок, а також вивчення можливостей їхнього застосування у біосенсорній технології та твердофазовій екстракції.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі наукові завдання:

ь Розробити метод синтезу високостабільних полімерів-біоміметиків у формі мембран із застосуванням методу полімеризації in situ.

ь Розробити метод синтезу полімерів-біоміметиків в формі тонких плівок з використанням методу прищепленної полімеризації.

ь Дослідити можливість застосування МІП мембран, синтезованих методом полімеризації in situ, а також полімерів-біоміметиків, синтезованих у формі тонких плівок методом прищепленної полімеризації, як селективних елементів електрохімічних та оптичних біосенсорів для визначення забруднювачів навколишнього середовища і харчових токсинів.

ь Розробити підходи до підвищення чутливості створених біосенсорних пристроїв та дослідити можливість використання МІП мембран як стаціонарної фази у твердофазовій екстракції.

ь Розробити методи синтезу високостабільних полімерів-біоміметиків у формі пористих мембран з застосуванням комбінації методу молекулярного імпринтингу та принципу синтезу взаємопроникних полімерних сіток, а також методу прищепленої полімеризації.

ь Вивчити структуру, морфологію, та мікрофазову структуру полімерних мембран, синтезованих методом полімеризації in situ.

ь Узагальнити отримані результати та виявити взаємозв'язок структури і функцій синтетичних рецепторів, що сприятиме кращому розумінню феномену молекулярного розпізнавання, провести порівняльний аналіз рецепторних сайтів полімерів-біоміметиків, синтезованих методом молекулярного імпринтингу, з їхніми природними аналогами.

Об'єкт дослідження: процеси розпізнавання молекул забруднювачів навколишнього середовища та харчових токсинів полімерами-біоміметиками, синтезованими згідно методу молекулярного імпринтингу у формі мембран та тонких плівок.

Предмет дослідження: полімери-біоміметики, синтезовані згідно методу молекулярного імпринтингу, як чутливі елементи біосенсорних пристроїв та стаціонарна фаза в твердофазовій екстракції.

Методи дослідження: кондуктометрія, імпедансна спектроскопія, еліпсометрія, флуориметрія, амперометрія, УФ-спектроскопія, високоефективна рідинна хроматографія, рідинна та газова хроматомасспектрометрія, сканувальна електронна мікроскопія (СЕМ), метод Брунауера-Емета-Теллера (БЕТ), динамічний механічний термоаналіз (ДМТА), ширококутове та малокутове розсіяння рентгенівських променів, біохімічні методи, твердофазова екстракція, методи комп'ютерного моделювання (молекулярної динаміки), статистичні методи обробки даних.

Наукова новизна одержаних результатів.

· Вперше розроблено універсальні методи формування рецепторних та каталітичних сайтів, що є подібними до таких біологічних макромолекул, у структурі густо-зшитих, гнучких і пористих МІП мембран, отриманих методом полімеризації in situ, а також технологію синтезу густо-зшитих полімерів-біоміметиків у вигляді тонких плівок МІПів на поверхні фізичних перетворювачів та пористих полімерних мембран із застосуванням методу прищепленої полімеризації.

· Вперше із застосуванням гнучких густо-зшитих МІП мембран, отриманих методом полімеризації in situ, створено кондуктометричні та оптичні біосенсори для визначення триазинових гербіцидів та харчових токсинів, що належать до групи афлатоксинів.

· Вперше методи комп'ютерного моделювання застосовано для отримання рецепторних сайтів зв'язування харчових токсинів та забруднювачів довкілля у МІП мембранах із передбачуваною селективністю щодо відповідних аналітів. Вперше методом молекулярної динаміки визначено можливу структуру рецепторних сайтів у МІП мембранах та проведено її порівняння зі структурою активних сайтів біологічних макромолекул.

· Вперше тилакоїдні мембрани хлоропластів та гербіцид-зв'язуючий білок Д1 застосовано як селективні елементи тест-систем та біосенсорних пристроїв для визначення фотосинтез-інгібуючих гербіцидів. Проведено порівняльний аналіз створених біосенсорів та тест-систем на основі природних рецепторів із сенсорними пристроями на основі полімерів-біоміметиків.

· Вперше синтезовано молекулярно імпринтовані полімери та мембрани з каталітичними властивостями, що містять в своїй структурі сайти, подібні до активного центру тирозинази грибів (КФ 1.14.18.1). На їхній основі вперше створено електрохімічні біосенсорні пристрої, здатні до високоселективного визначення о-гідроксифенолів.

· Вперше в структурі густо-зшитих пористих полімерних мембран створено рецепторні сайти, здатні до селективного розпізнавання триазинових гербіцидів та афлатоксинів, та застосовано їх як стаціонарну фазу в твердофазовій екстракції. Створені системи застосовано для попереднього високоселективного та групо-селективного концентрування розбавлених зразків токсичних молекул, що забезпечило зменшення межі визначення як розроблених біосенсорів та тест-систем, так і традиційних аналітичних методів визначення токсинів.

· Вперше досліджено структуру та фізико-хімічні характеристики полімерів-біоміметиків на основі МІП мембран, синтезованих методом полімеризації in situ.

Наукове значення роботи полягає у тому, що вперше розроблено загальну концепцію отримання аналогів рецепторних сайтів біологічних макромолекул у структурі тонких, гнучких та пористих полімерних мембран та створення на їхній основі новітніх біотехнологічних методів. Ця концепція враховує всі фактори, починаючи з вибору мономерів, що є відповідальними за ефективне розпізнавання молекул-аналітів, збереження просторової структури сайтів зв'язування протягом тривалого часу, доступність рецепторних сайтів для взаємодії з аналітами, створення на їхній основі високостабільних та високоселективних біосенсорних пристроїв, а також їхнє застосування у твердофазовій екстракції з метою зниження меж визначення відповідних аналітів за допомогою як біосенсорних, так і традиційних аналітичних методів. Ці результати дозволяють підвищити ефективність при створенні полімерів-біоміметиків, здатних розпізнавати цільові аналіти, за рахунок зменшення часу і вартості виконання таких робіт.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено наукові і технологічні засади застосування аналогів рецепторних сайтів біологічних макромолекул, створених у структурі полімерних мембран та тонких плівок, у біосенсорній технології та твердофазовій екстракції. Створено лабораторні прототипи біосенсорних пристроїв із застосуванням полімерів-біоміметиків, синтезованих методом молекулярного імпринтингу, як селективних елементів для визначення забруднювачів довкілля (триазинових гербіцидів) та харчових токсинів (афлатоксинів). Вперше сформульовано практичні рекомендації для вибору кращих мономерів при синтезі аналогів рецепторних сайтів біологічних макромолекул з оптимальними властивостями щодо розпізнавання цільових аналітів у залежності від споживчих потреб (висока селективність чи групова селективність). Із застосуванням гербіцид-зв'язуючого білку Д1 тилакоїдних мембран хлоропластів розроблено прості у використанні та високочутливі тест-системи для визначення фотосинтез-інгібуючих гербіцидів у водних розчинах, придатні до масового скринінгу зразків токсинів. Вперше із застосуванням полімерних частинок та мембран, що мають у своєму складі каталітично-активні сайти, які імітують активний центр природного ферменту тирозинази грибів (КФ 1.14.18.1), створено високостабільні біосенсорні пристрої для визначення о-гідроксифенолів у природних та стічних водах. Отримані результати дозволяють застосовувати розроблені біосенсорні пристрої у повсякденній практиці в біотехнології, при моніторингу довкілля та у харчовій промисловості. Розроблено технологію застосування пористих полімерних мембран зі сформованими у їхній структурі штучними рецепторними сайтами в твердофазовій екстракції, що забезпечило підвищення чутливості створених біосенсорних пристроїв, а також традиційних аналітичних методів до 100 разів.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок дисертанта є визначальним на всіх етапах роботи і полягає у розробці концепції дослідження, постановці задач дослідження, проведенні основної частини експериментальної роботи. Основні напрямки роботи, положення і висновки обговорено з науковим консультантом академіком НАН України, професором Г.В. Єльською. Результати експериментальних досліджень із розробки універсальних методів синтезу полімерів-біоміметиків у вигляді мембран та тонких плівок, розробки біосенсорних пристроїв на їхній основі, а також їхнього практичного застосування у твердофазовій екстракції отримані особисто автором. Частину експериментальних робіт із розробки біосенсорів та тест-систем на основі природних рецепторів, а також комп'ютерного моделювання виконано спільно з проф. С.А.Пілецьким та к.б.н. О.В.Пілецькою (Кренфілдський університет, Велика Британія). Біосенсорні пристрої та композитні МІП мембрани на основі тонких плівок МІПів розроблялись разом з к.б.н. Т.Л.Панасюк (Регенсбургський Університет, Німеччина), проф. М.Ульбріхтом (Есенський університет, Німеччина) та др. Х.Матушевскі (ПоліАн ГМБХ, Німеччина). Дослідження фізико-хімічних та морфологічних властивостей полімерів-біоміметиків виконано у тісній співпраці з д.х.н. О.О.Бровко, д.х.н. Л.В.Карабановою, к.х.н. О.А.Слінченко, к.х.н. Л.А.Горбач та м.н.с. Л.А.Гончаровою (Інститут хімії високомолекулярних сполук НАНУ). Результати досліджень опубліковано у спільних працях.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідалися і обговорювалися на таких конференціях: 3 Міжнародна конференція “Biosensors for direct monitoring of environmental pollutants in the field” (Коїмбра, Португалія, 1998), NATO Workshop “New trends in biosensor development” (Київ, Україна, 1998), Міжнародна конференція “Advanced environmental and chemical sensing technology” (Бостон, США, 2000), 1 Міжнародна конференція з молекулярного імпринтингу “MIP 2000” (Кардіф, Великобританія, 2000), 7 Міжнародна конференція “Applied physics of condensed matter” (Демановска долина, Словаччина, 2001), Міжнародна конференція “Polymers in the third millenium” (Монпельє, Франція, 2001), 2 Міжнародна конференція з молекулярного імпринтингу “MIP 2002” (Ля Гранд Мотт, Франція, 2002), Міжнародна конференція молодих вчених, студентів та аспірантів з молекулярної біології і генетики (Київ, Україна, 2003), 1 Світовий конгрес з синтетичних рецепторів “Synthetic receptors 2003” (Лісабон, Португалія, 2003), 3 Міжнародна конференція з молекулярного імпринтингу “MIP 2004” (Кардіф, Великобританія, 2004), Міжнародна конференція “Analytical chemistry and chemical analysis 2005” (Київ, Україна, 2005), 2 Світовий конгрес з синтетичних рецепторів “Synthetic receptors 2005” (Зальцбург, Австрія, 2005), 2 Міжнародна конференція “Сенсорна електроніка та мікросистемні технології СЕМСТ-2” (Одеса, Україна, 2006), 1 Міжнародний симпозіум “Baltic Polymer Symposium 2007” (Друскенінкай, Литва, 2007), Всеукраїнський науковий семінар “Біомедична електроніка та фізичні методи в екології” (Львів-Ворохта, Україна, 2007), 1 Міжнародна наукова конференція “Мембранні та сорбційні процеси і технології” (Київ, Україна, 2007), Міжнародна конференція “Functional materials” (Партеніт, Україна, 2007), 3 Міжнародна конференція “Сенсорна електроніка та мікросистемні технології СЕМСТ-3” (Одеса, Україна, 2008), 2 Міжнародний симпозіум “Baltic Polymer Symposium 2008” (Отепаа, Естонія, 2008), ХІХ Український семінар “Мембранні та сорбційні процеси і технології” (Київ, Україна, 2008), ХХ Український семінар “Мембранні та сорбційні процеси і технології” (Київ, Україна, 2009), ІІ Міжнародна конференція “Фізичні методи в екології, біології та медицині” (Львів-Ворохта, Україна, 2009), ІІ Міжнародна конференція “Functional materials” (Партеніт, Україна, 2009).

Публікації. Основний зміст роботи викладено у 30 наукових статтях, з яких 26 у фахових виданнях, 6 патентах (3 міжнародні патенти та 3 патенти України), 1 розширеній праці міжнародної конференції та тезах 8 доповідей на міжнародних конференціях. Наведені публікації у повному обсязі висвітлюють зміст роботи.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, експериментальної частини, що складається із 4 розділів, аналізу і узагальнення результатів, висновків та додатку. Обсяг дисертації становить 388 сторінок, основний текст розміщено на 284 сторінках друкованого тексту, враховуючи 117 рисунків та 24 таблиці, 4 таблиці містяться в додатку. Перелік цитованої літератури містить 677 найменувань.

2. Основний зміст

Матеріали і методи досліджень. В роботі використовували акриламід, 2-акриламідо-2-метил-1-пропансульфонову кислоту, афлатоксини В1, В2 та G2, ацетонітрил, бензофенон, бичий сироватковий альбумін, глутаровий альдегід, ди(метакрилетиленкарбонат)діетиленгліколь, диметилформамід, 2,6-дихлорфеноліндофенол, етилацетат, етил-2-оксоциклопентанкарбоксилат, етиленглікольдиметакрилат, етилендіамін-тетраоцтову кислоту, ітаконову кислоту, меламін, метакрилову кислоту, метанол, N,N'-метиленбісакриламід, метилетилкетон, поліетиленгліколь (ПЕГ) ММ 1000, 3000, 10000, 20000, 100000, 200000, полістирол ММ 10000, триетиленглікольдиметакрилат, уроканову кислоту, хлороформ, (Sigma-Aldrich, США), гексадекантіол (Fluka, США), азобісізобутиронітрил (Wako Pure Chemicals, Япония), атразин, симазин, прометрин, тербуметон, десметрин, метрибузин, МСРА (Riedel-deHaen, Німеччина), резорцинол (Aсros Organics, Бельгія), полівінилалкоголь, що містить стирилпіридин (PVA-SbQ) з ММ 3500 та ступенем омилювання 0,88 (Tokyo Gosei Kogyo, Японія), поліметилметакрилат ММ 15000 (Acros Organics, Бельгія), лінійний термопластичний поліуретан марки “Вітур” на основі 4,4'-дифенилметандіізоціанату та олігобутиленглікольадипінату (ТУ6-05-221-806-85) (Владимирский Научно-Исследовательский Институт Синтетических Смол, Россия), монометакриловий ефір етиленгліколю (МЕГ) (Bisomer, Німеччина), триізоціанурат на основі гексаметилендіізоціанату (Bayer AG, Німеччина). Олігоуретанакрилат (ОУА) ММ 2600 було синтезовано згідно методики, яку описано в роботі (Спирин и др., 1968), та люб'язно надано к.х.н.В.Ф.Матюшовим (Інститут хімії високомолекулярних сполук НАНУ). Етиловий ефір уроканової кислоти отримано з уроканової кислоти шляхом реакції етерифікації (Сергеєва та ін., 2009). Екстракти арахісу та кукурудзи у середовищі ацетонітрил/H2O=40/60 люб'язно надані компанією Toximet Ltd, Кент, Велика Британія. Солі та кислоти було отримано від Sigma-Aldrich (США) та використано без додаткового очищення. Всі виміри проводили при температурі 22-25С.

Результати досліджень та обговорення.

Створення біосенсорних пристроїв та тест-систем на основі полімерів-біоміметиків і природних рецепторів. Синтез МІП мембран здійснювали in situ шляхом фотоініційованої (=365 нм) або термоініційованої (80С) радикальної полімеризації. Відомо, що висока селективність МІПів забезпечується надвисокими ступенями зшивання таких матеріалів, аби утворені рецепторні сайти зберігали свою форму навіть після екстракції матричних молекул. Проте, отримання тонких пористих мембран з таких матеріалів є проблематичним, що зумовлено їхньою крихкістю та механічною нестабільністю. Як зшиваючі агенти, що склали основу густо-зшитих МІП мембран, застосовували триетиленглікольдиметакрилат (ТЕГДМ) та ди(метакрилоксиетиленкарбонат)діетиленгліколь (ОКМ-2). Зниження їхньої крихкості було досягнуто уведенням до складу густо-зшитої полімерної сітки гнучких лінійних олігомерних фрагментів. Як модифікатор, що знижує крихкість МІП мембран на основі ТЕГДМ або ОКМ-2, та сприяє підвищенню їхньої гнучкості, вперше застосовано лінійний олігомер - олігоуретанакрилат (ОУА), ММ 2610, n=35 (рис. 1).

Рис. 1 Структурна формула олігоуретанакрилату (ОУА)

Як пороутворюючі агенти, відповідальні за утворення системи пор у МІП мембранах, що забезпечує доступність рецепторних сайтів для взаємодії з матричними молекулами, використовували органічні розчинники різної полярності (метилетилкетон, етилацетат, хлороформ, толуол та диметилформамід (ДМФА)). Застосування олігоуретанакрилату дало змогу розробити універсальний метод отримання густо-зшитих МІПів у формі тонких та механічно-стабільних мембран, використаних надалі як чутливі елементи електрохімічних та оптичних сенсорів для визначення забруднювачів навколишнього середовища та харчових токсинів.

Як основні молекули-аналіти у роботі використовували дві групи токсичних речовин: фотосинтез-інгібуючі гербіциди групи триазинових та мікотоксини групи афлатоксинів. Ефект молекулярного імпринтингу ґрунтується на формуванні молекулярних комплексів між матричними молекулами та функціональними мономерами, які разом із зшиваючим агентом входять до складу полімерної сітки. Сила таких комплексів визначає здатність МІПів до селективного розпізнавання матричних молекул. Всі потенційні функціональні мономери, здатні формувати комплекси із застосованими в даній роботі матричними молекулами, тестували щодо сили взаємодії з останніми методом комп'ютерного моделювання з використанням робочої станції Silicon Graphics Octane, операційної системи IRIX 6.5 та програми SYBYL 6.8 (Tripos Inc., США). Було створено віртуальну бібліотеку функціональних мономерів, яка містила мономери, здатні, з одного боку, утворювати ковалентні зв'язки з полімерною сіткою, а з іншого - формувати міцні комплекси з матричними молекулами за рахунок водневих, електростатичних, Ван-дер-Вальсових та дипольно-дипольних взаємодій (рис. 2).

Бібліотеку функціональних мономерів аналізували щодо взаємодії з матричними молекулами та визначали мономери з найбільшими енергіями взаємодії. Відібрані функціональні мономери застосовували для синтезу МІП мембран in situ. Контрольні мембрани синтезували з тієї ж суміші мономерів, що не містила матричних молекул.

Рис. 2 Віртуальна бібліотека функціональних мономерів, здатних до взаємодії з триазиновими гербіцидами та афлатоксинами: 3.1 -2-акриламідо-2-метил-1-пропансуль-фонова кислота; 3.2 - 4-вінілпіридин; 3.3 - акрилова кислота; 3.4 - вініл-імідазол; 3.5 - алліламін; 3.6 - п-дивінілбензол; 3.7 - етиленгліколь-диметакрилат; 3.8 - етиловий ефір уроканової кислоти; 3.9 - ітаконова кислота; 3.10 - м-дивінілбензол; 3.11 -N,N'-метиленбісакриламід; 3.12 - метакрилова кислота; 3.13 - стирол; 3.14 - уроканова кислота; 3.15 - 2-вінілпіридин; 3.16 - диетиламіноетил-метакрилат; 3.17 - 2-(трифторметил)-акрилова кислота, 3.18 - гідрокси-етилметакрилат, 3.19 - акролеїн; 3.20 - акриламід; 3.21 - акрилонітрил

Для оцінки чутливості біосенсорних пристроїв на основі виготовлених МІП мембран до матричних молекул оцінювали їхню електропровідність (рис. 3).

МІП мембрани демонстрували значні зміни своєї електропровідності у відповідь на додавання матричних молекул (триазинового гербіциду атразину) в аналізований розчин, тоді як контрольні мембрани виявляли значно менші зміни цього параметру (рис. 3). Границя визначення матричних молекул за допомогою такого сенсора становила 15 нМ, а його лінійний динамічний діапазон - 15-50 нМ.

Рис. 3 Типова залежність сенсорного відгуку від концентрації матричних молекул (атразину) для МІП та контрольної мембран: 1 - МІП мембрана; 2 - контрольна мембрана. Виміри здійснювали в 25 мM Na-фосфатному буфері, pH 7,5, що містить 35 мM NaCl. Хлороформ (30 об%) використаний як пороутворювач, а метакрилова кислота як функціональний мономер при синтезі МІП мембран

Зміни електропровідності як МІП, так і контрольних мембран, у відповідь на додавання матричних молекул в аналізований розчин істотно залежать від типу функціонального мономеру, застосованого при синтезі мембран. Так, для триазинового гербіциду атразину на етапі комп'ютерного моделювання показано, що оптимальними функціональними мономерами є метакрилова та ітаконова кислоти, а також акриламід, які забезпечують енергії взаємодії -28,35 кКал/Моль, -16,07 кКал/Моль та -34,97 кКал/Моль, відповідно.

Показано, що у випадку метакрилової кислоти спостерігаються незначні зміни електропровідності контрольних мембран у відповідь на додавання атразину. Як наслідок, для атразин-імпринтованих мембран, синтезованих з застосуванням метакрилової кислоти, спостерігали яскраво виражений ефект імпринтингу (різниця між сенсорними відгуками МІП та контрольних мембран). Цей ефект набагато менш виражений у випадку застосування ітаконової кислоти та акриламіду, що зумовлено високими рівнями неспецифічного зв'язування атразину з контрольними мембранами.

Результати цих досліджень добре узгоджуються з результатами комп'ютерного моделювання. Очевидно, що для створення високоселективних аналогів рецепторних сайтів біологічних макромолекул важливим є не тільки відбір функціональних мономерів, які забезпечують значні енергії взаємодії з матричною молекулою, але й кількість молекул функціонального мономера, що беруть участь у формуванні комплексу з матричною молекулою у процесі її розпізнавання.

Як видно з рис. 4, формування комплекса “атразин-метакрилова кислота” відбувається за участі двох молекул функціонального мономера (рис. 4, а), тоді як комплекси “атразин-ітаконова кислота” та “атразин-акриламід” формуються за участі лише одної молекули функціонального мономера (рис. 4, б, в).

Імовірно, що у випадку, коли взаємодія матриця-функціональний мономер відбувається за участі лише одної молекули функціонального мономеру, має місце випадковий розподіл активних груп функціонального мономеру, які взаємодіють з матричною молекулою, на поверхні МІПу, селективний сайт як такий не формується, внаслідок чого спостерігається високий рівень неспецифічного зв'язування.

Рис. 4 Комплекси між атразином та двома молекулами метакрилової кислоти (а), ітаконовою кислотою (б) та акриламідом (в)

Позаяк склад і, як наслідок, структура МІП мембран визначає їхню спроможність селективно зв'язувати матричні молекули, аналізували вплив ступеню зшивання МІП мембран, а також концентрації та типу пороутворювача, застосованого при синтезі на величину сенсорного відгуку. Показано, що оптимальне співвідношення між зшиваючим агентом (ТЕГДМ) та еластичним компонентом (ОУА) у суміші мономерів становить 85:15, тоді як вміст пороутворюючого розчинника - 30%. Істотний вплив на величину сенсорних відгуків мала полярність органічного розчинника-пороутворювача. Досить високі відгуки отримано для мембран, синтезованих за участі неполярних розчинників (хлороформ, етилацетат), вплив яких на утворення комплексу матриця-функціональний мономер є мінімальним. Проте, набагато вищі відгуки виявляли сенсори на основі МІП мембран, синтезованих за присутності досить полярного розчинника - ДМФА. Очевидно, що для таких мембран характерне менше набрякання у водному середовищі порівняняно з мембранами, синтезованими за присутності неполярних розчинників. Завдяки цьому відбуваються мінімальні зміни у просторовому розташуванні активних груп функціонального мономера, що беруть участь у процесі розпізнавання матричних молекул, а застосування таких мембран в біосенсорній технології є значно ефективнішим. Таким чином, розчинник, використаний при полімеризації як пороутворюючий агент, має бути близьким до розчинника, в якому проводяться виміри, як у випадку ДМФА і води.

Показано, що величина відгуку створених кондуктометричних сенсорів залежить від умов середовища, а саме - буферної ємності, рН та іонної сили робочого розчину. Максимальну різницю між селективним і неселективним зв'язуванням атразину з МІП мембранами спостерігали у 25 мМ фосфатному буфері, рН 7,5, що містить 35 мМ NaCl.

Для оцінки селективності розроблених сенсорів на основі МІП мембран застосовували близькі структурні аналоги матричної молекули - атразину (триазин, симазин, прометрин). Показано, що ці речовини викликали незначні зміни електропровідності МІП мембран порівняно до матричних молекул (рис. 5).

Час відгуку створених кондуктометричних сенсорів становить 6-10 хв. Синтезовані мембрани демонстрували високу стабільність впродовж тривалого зберігання. Не спостерігалося змін чутливості сенсорів на основі МІП мембран, що зберігалися за кімнатної температури у сухому стані протягом 18 місяців.

Рис. 5 Селективність кондукто-метричного сенсора на основі атразин-селективних МІП мембран. Оцінювали сенсорні відгуки на 60 нМ атразину, симазину, триазину і прометрину. Виміри здійснювали в 25 мМ Na-фосфатному буфері (рН 7,5), що містив 35 мМ NaCl. Контроль - відгук сенсора з контрольною мембраною на 60 нМ атразину

Для підтвердження ефективності та універсальності запропонованого нами методу синтезу МІП мембран in situ, як матричні молекули застосовували органічні молекули, що істотно різняться за своєю структурою. Так, поряд з гербіцидами групи триазинових, використовували мікотоксини групи афлатоксинів. Позаяк афлатоксин В1 є найтоксичнішим з представників групи, увагу було зосереджено на синтезі афлатоксин В1-селективних МІП мембран in situ та створення на їхній основі простих у використанні біосенсорних пристроїв для визначення цього токсину. Вибір функціональних мономерів до афлатоксину В1 здійснювали із застосуванням бібліотеки функціональних мономерів (рис. 2). Показано, що аліламін, диетиламіноетилметакрилат, N,N'-метиленбісакриламід, акриламід та 2-акриламідо-2-метил-1-пропан-сульфонова кислота взаємодіють з афлатоксином В1 з високими (-60,30 - -19,60 - кКал/Моль) енергіями зв'язування (табл. 1).

Таблиця 1 Енергія зв'язування афлатоксинів В1, В2, G2 з потенційними функціональними мономерами

Оскільки метою даного етапу роботи був синтез МІП мембран, здатних до селективного розпізнавання афлатоксину В1 із суміші його близьких структурних аналогів (афлатоксинів В2 та G2), оптимальні функціональні мономери мають взаємодіяти з афлатоксином В1 з високою енергією зв'язування і меншими енергіями зв'язування з афлатоксинами В2 та G2. Крім того, для отримання рецепторних сайтів з високою селективністю до афлатоксину В1 бажано, щоби функціональний мономер взаємодіяв з різними частинами молекул зазначених афлатоксинів. Це має забезпечити низькі рівні неспецифічного зв'язування афлатоксинів В2 та G2 з афлатоксин В1-імпринтованими мембранами.

Згідно даних комп'ютерного моделювання алліламін, диетиламіноетилметакрилат та N,N'-метиленбісакриламід взаємодіють з дифурановою частиною молекули афлатоксинів В1, В2 та G2, яка є подібною для всіх мікотоксинів групи афлатоксинів, з дуже високими (-63,61- -32,26 кКал/Моль) енергіями зв'язування. Зважаючи на це, такі функціональні мономери були виключені з подальшого дослідження, оскільки їхнє застосування має призвести до формування рецепторних сайтів, здатних до розпізнавання всіх мікотоксинів, що належать до групи афлатоксинів.

З погляду синтезу полімерів з високою селективністю до афлатоксину В1 найперспективнішими з зазначених функціональних мономерів є акриламід. З одного боку, він забезпечує досить високу енергію зв'язування з афлатоксином В1(-27,11 кКал/моль). З іншого - за допомогою методу молекулярної динаміки показано, що акриламід зв'язується з кето-лактонною частиною молекул афлатоксинів В1 та В2 (рис. 6, а, б), але з дифурановою частиною молекули афлатоксину G2 (рис. 6, в).

Рис. 6 Комплекси акриламіду з афлатоксинами В1 (а), В2 (б) та G2 (в)

Таким чином, застосування акриламіду як функціонального мономера має призвести до формування МІП мембран, здатних зв'язувати афлатоксин В1, але не здатних розпізнавати афлатоксин G2, позаяк у взаємодії акриламід-афлатоксин G2 задіяний дифурановий фрагмент молекули і зв'язування з рецепторними сайтами у складі МІП мембран буде ускладнено через просторове незбігання селективних сайтів, сформованих за участю кето-лактонної частини молекули афлатоксину В1 та дифуранової частини молекули афлатоксину G2. В той же час, енергія взаємодії акриламіду з афлатоксином В1 складає -27,11 кКал/моль, тоді як для комплекса акриламід-афлатоксин В2 ця величина становить -26,62 кКал/моль. Оскільки акриламід утворює комплекс з афлатоксином В2 з меншою енергією взаємодії порівняно з афлатоксином В1, то можна припустити, що афлатоксин-В1-імпринтовані полімери будуть здатні розпізнавати афлатоксин В1, але при цьому можлива певна перехресна реактивність при зв'язуванні афлатоксину В2.

З метою здешевлення полімерів-біоміметиків, селективних до афлатоксину В1, як матричні молекули для синтезу МІП мембран застосували його структурний аналог - етил-2-оксоциклопентанкарбоксилат (рис. 7), який моделює кето-лактонну частину молекули афлатоксину В1, здатну до взаємодії з акриламідом.

Рис. 7 Структура етил-2-оксоциклопентанкарбоксилату - аналогу афлатоксину В1, застосованого як матрична молекула для синтезу афлатоксин В1-селективних полімерних мембран

Із застосуванням методу полімеризації in situ синтезовано МІП мембрани, які за оптимізованого складу виявляли високу адсорбційну здатність щодо афлатоксину В1 (рис. 8).

Рис. 8 Залежність адсорбційної здатності МІП (заштриховані стовпчики) та контрольних (білі стовпчики) полімерних мембран від концентрації афлатоксину В1 в розчині. Як пороутворювач використовували суміш 50 об. % ДМФА і 15 ваг% ПЕГ 20000. (10 мл розчину афлатоксину В1 фільтрували через мембрани при 0,5 мл/хв). Рідка фаза - H2O, що містить 10% ацетонітрилу

Спостерігали лише незначне зв'язування афлатоксину В1 з поверхнею контрольних мембран, в яких не були сформовані селективні сайти. Таким чином, ефект імпринтингу (переважне зв'язування афлатоксину В1 МІП мембранами порівняно до контрольних) має місце завдяки формуванню у структурі МІП мембран рецепторних сайтів зв'язування, функціонально комплементарних кето-лактонній частині афлатоксину В1. Величина адсорбційної ємності МІП мембран виявилась дуже високою і складала 164 мг афлатоксину В1 / 1г полімерної мембрани.

Для визначення загальної селективності синтезованих мембран застосовували близькі структурні аналоги афлатоксину В1 - афлатоксини В2 та G2. Характерною для таких мембран була висока адсорбція афлатоксину В1, незначне зв'язування афлатоксину В2, тоді як для афлатоксину G2 практично не спостерігали зв'язування на поверхні етил-2-оксоциклопентанкарбоксилат-імпринтованих мембран (рис. 9).

Рис. 9 Адсорбція афлатоксинів В1, В2 та G2 на поверхні етил-2-оксоциклопентанкарбоксилат-імпринтованих (заштриховані стовпчики) та контрольних (білі стовпчики) мембран (10 мл розчинів афлатоксинів В1, В2 та G2 з концентрацією 100 нг/мл фільтрували через мембрани при 0, 5 мл/хв). Рідка фаза - H2O, що містить 10% ацетонітрилу

МІП мембрани з оптимізованою композицією застосовували як селективний елемент біосенсору для визначення афлатоксину В1 із суміші з його близькими структурними аналогами.

Принцип його роботи полягає в тому, що після фільтрації аналізованих зразків через МІП мембрани, афлатоксин В1, який міститься в аналізованих розчинах, селективно адсорбується штучними рецепторними сайтами.

УФ-опромінення таких мембран при л=367нм ініціює власну флуоресценцію афлатоксину В1, інтенсивність якої пропорційна його концентрації в аналізованому зразку. Показана можливість визначення афлатоксину В1 в концентраціях 1-500 нг/мл (рис. 10).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 10 Оптичний біосенсор для виявлення афлатоксину В1 на основі МІП мембран, синтезованих in situ. Флуоресценція етил-2-оксоциклопентан-карбоксилат-імпринтованих мембран після фільтрації розчинів афлатоксину В1 в концентраціях 1-500 нг/мл

Межа визначення афлатоксину В1 за допомогою створеного біосенсору становила 1 нг/мл, що значно (на 2 порядки) перевищує чутливість традиційних інструментальних методів аналізу і є подібною до такої методів імуноферментного аналізу, а також розроблених дотепер імуносенсорних пристроїв. Час сенсорного відгуку складає 5 с. При цьому стабільність чутливих елементів біосенсору при зберіганні за кімнатної температури становила не менше 18 місяців, що істотно перевищує таку аналогічних імуносенсорних пристроїв. Створений біосенсор є експресним, недорогим та простим у використанні.

Альтернативним підходом до створення біосенсорних пристроїв є модифікація поверхні фізичних перетворювачів тонким шаром густо-зшитого МІПу шляхом прищепленої полімеризації. Для модифікації електрохімічних перетворювачів застосовано метод прищепленої полімеризації з водних розчинів, адаптований для модифікації золотих поверхонь. Ініціатор фотополімеризації (бензофенон) іммобілізується безпосередньо на поверхні електроду, яку модифіковано шаром гексадекантіолу. УФ-опромінення призводить до переходу ініціатора прищепленої полімеризації (бензофенону) у збуджений триплетний стан, здатний до відтягування атомів водню від поверхні субстрату. Це призводить до утворення радикалу на поверхні субстрату та вільного кетил-радикалу. Завдяки цьому відбувається синтез густо-зшитих полімерних ланцюгів, прищеплених до поверхні електроду. Формування селективних рецепторних сайтів на поверхні золотого електроду відбувається після екстракції матричних молекул. Модифіковані у такий спосіб електроди застосовано як селективний елемент ємнісного сенсору. Показано, що присутність матричних молекул (триазинового гербіциду десметрину) в розчині призводила до значних змін ємності сконструйованого сенсора, пропорційних концентрації матричних молекул в аналізованому зразку

Рис. 11 Типова залежність відгуку ємнісного сенсору на основі тонких плівок МІПів від концентрації матричних молекул (десметрину) та їхніх структурних аналогів в аналізованому зразку: 1 - десметрин; 2 - тербуметон; 3 - атразин; 4 - креатинін; 5 - контроль. Виміри проводили у 25 мМ К-фосфатному буфері, pH 7,5, що містить 100 мM NaCl

Показано, що тип функціонального мономера, використаного при синтезі МІПу, має визначний вплив на робочі характеристики створеного псевдоімуносенсорного пристрою. Для синтезу десметрин-селективних МІПів як функціональні мономери застосовували ітаконову, метакрилову та 2-акриламідо-2-метил-1-пропансульфонову кислоти, які забезпечували енергії взаємодії -90,64; -76,66 та -52,61 кКал/Моль відповідно. Виражений ефект імпринтингу спостерігали лише для полімерів, синтезованих за участі 2-акриламідо-2-метил-1-пропансульфонової кислоти як функціонального мономеру. У випадку застосування метакрилової та ітаконової кислот контрольні електроди у відповідь на додавання десметрину в аналізований розчин виявляли сенсорні відгуки, подібні до таких на робочих електродах. Очевидно, це пов'язано з тим, що у формуванні комплексу “десметрин-функціональний мономер” беруть участь дві молекули 2-акриламідо-2-метил-1-пропансульфонової кислоти, тоді як у формуванні комплексів “десметрин-метакрилова кислота” та “десметрин-ітаконова кислота” задіяна лише одна молекула функціонального мономера (рис. 12).

Рис. 12 Комплекси десметрину з ітаконовою (а), метакриловою (б) та 2-акриламідо-2-метил-1-пропансульфоновою (в) кислотами

Таким чином, підтверджено, що поряд з енергією взаємодії матриця-функціональний мономер, істотним фактором, що має вирішальний вплив на селективність рецепторних сайтів зв'язування у МІПах, є кількість молекул функціонального мономера, що бере участь у формуванні комплекса з матричною молекулою, а також в процесі її розпізнавання. У випадку формування рецепторного сайту за участі лише однієї молекули функціонального мономера утворюються неселективні сайти, внаслідок чого спостерігається високий рівень неспецифічного зв'язування.

Створені біосенсорні пристрої виявляють високу селективність: спостерігали лише незначні зміни сенсорного відгуку у відповідь на додавання структурних аналогів матричної молекули (рис. 11). Межа визначення десметрину становила 100 нМ, а лінійний динамічний діапазон роботи сенсору - 100-300 нМ. Час сенсорного відгуку складає 10 хв. Стабільність такого сенсора при зберіганні за кімнатної температури становила 12 місяців.

З розроблених дотепер методів визначення триазинових гербіцидів на основі природних рецепторів найефективнішими залишаються методи твердофазного імуноферментного аналізу (ІФА) (Salmain M. et al., 2008), що забезпечують визначення триазинових гербіцидів у межах 10-8-10-6 М. Для подолання основного недоліку методу ІФА - його тривалого часу при збереженні основної переваги методу - його придатності до масового скринінгу зразків, нами розроблено тест-системи, які базуються на здатності гербіцидів групи триазинових інгібувати фотосистему ІІ хлоропластів вищих рослин завдяки зв'язуванню її основним компонентом - білком Д1.

Принцип дії такої тест-системи ґрунтується на здатності тилакоїдних мембран хлоропластів вищих рослин до каталітичного відновлення 2,6-дихлорфеноліндофенолу (ДХФІФ) на світлі згідно з рівнянням Хілла:

Світло

2H2O + 2 ДХФІФ 2 ДХФІФ H2 + O2,

де ДХФІФ - штучний акцептор електронів, а ДХФІФ H2 - його незабарвлена відновлена форма.

Присутність фотосинтез-інгібуючих гербіцидиів пригнічує цей процес, тоді як ступінь знебарвлення ДХФІФ є пропорційним концентрації гербіцидів в аналізованому зразку.

Запропоновані нами тест-системи ґрунтуються на мікромодифікації реакції Хілла, яку здійснювали у комірках полістиролових планшетів для ІФА. Застосування реакції Хілла дає змогу одночасного визначення всіх фотосинтез-інгібуючих гербіцидів, присутніх у аналізованому зразку. Створені тест-систем на основі нативних тилакоїдних мембран хлоропластів вищих рослин давали змогу визначати фотосинтез-інгібуючі гербіциди в межах 10-7 - 10-5 М (рис. 13). Чутливість створених тест-систем є подібною до такої методу ІФА, тоді як час аналізу складає 15 хвилин (порівняно до 3,5 годин для ІФА). Важливою особливістю таких тест-систем є їхня придатність до масового скринінгу зразків (96 проб аналізується протягом 15 хв.).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 13 Типові калібрувальні криві для визначення фотосинтез-інгібуючих гербіцидів за допомогою тест-системи на основі нативних тилакоїдних мембран хлоропластів шпінату (Spinacea oleracea L.): 1 - діурон; 2 - метрибузин; 3 - атразин; 4 - ціаназин; 5 - симазин. Ступінь інгібування тилакоїдних мембран гербіцидами визначали як оптичну густину зразка після 10 хв. опромінення видимим світлом. Стандартне відхилення - 0,003-0,01 оптичних одиниці (n=3)

Варто зазначити, що нативні тилакоїдні мембрани є дуже нестабільними і потребують спеціальних умов зберігання (-196 С, темрява). При зберіганні за -20С активність тилакоїдних мембран хлоропластів вищих рослин залишалась достатньою для використання як селективних елементів тест-систем протягом 7 днів, тоді як при +4С - протягом 7 годин.

Іммобілізація тилакоїдних мембран призводила до істотного підвищення їхньої стабільності. Оптимальним для їхньої іммобілізації виявився полімерний матрикс на основі PVA-SbQ, який утворює гомогенну прозору плівку на поверхні комірок планшетів для ІФА, при цьому активність тилакоїдних мембран зберігалася на рівні 70% від початкової після зберігання протягом 4 місяців при +4С. Таким чином, стабільність тест-систем на основі природних рецепторів виявилась прийнятною для практичного застосування.

Застосування природного рецептору фотосинтез-інгібуючих гербіцидів (білка Д1) як селективного елементу біосенсорних пристроїв для визначення цих речовин виявилось неефективним. Створені на його основі еліпсометричні біосенсорні пристрої виявляли невисоку чутливість (1Ч10-5-1Ч10-3 М) та дуже повільну кінетику сенсорних відгуків, що є неприйнятним для потреб сучасної аналітичної біотехнології.

Таким чином, застосування полімерів-біоміметиків, здатних розпізнавати триазинові гербіциди та мікотоксини, має низку очевидних переваг при створенні нових методів їхнього визначення порівняно з природними рецепторами. З одного боку, біосенсорні пристрої на основі МІП мембран та тонких плівок густо-зшитих МІПів, отриманих методами in situ та прищепленої полімеризації, забезпечують високоселективне та високочутливе визначення відповідних аналітів (межі визначення для різних біосенсорів складають від 1 до 100 нМ). З іншого боку - стабільність аналогів рецепторних сайтів біомолекул, сформованих у структурі МІП мембран та тонких плівок, становить 12-18 місяців, що істотно (на 2 порядки) перевищує стабільність природних макромолекул.

Полімери-біоміметики з каталітичними властивостями та їхнє застосування у біосенсорній технології. Однією з причин, що стримують розвиток біосенсорної технології з застосуванням МІПів, є проблема ефективної реєстрації події зв'язування МІП-аналіт. Створення МІПів, здатних до високоселективного розщеплення аналітів з утворенням електрохімічно-активних продуктів, забезпечило би можливість ефективного електрохімічного визначення. Основну увагу в даному розділі зосереджено на створенні згідно методу молекулярного імпринтингу штучних аналогів природного ферменту тирозинази (КФ 1.14.18.1) та їх застосування як селективних елементів електрохімічних біосенсорних пристроїв для експрес-визначення фенолів. Активний центр тирозинази забезпечує окислення двох молекул о-гідроксифенолу до о-хінону, що супроводжується відновленням молекулярного кисню до води (рис. 14).