Структурно-функціональні властивості червоного флуоресцентного білка tagrfp657 та його застосування у клітинній біології

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна

Автореферат

дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

03.00.04 - біохімія

Структурно-функціональні властивості червоного флуоресцентного білка TagRFP657 та його застосування у клітинній біології

Морозова Катерина Сергіївна

Харків 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Перський Євген Ефроїмович, Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна МОН України, завідувач кафедри біохімії.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Дробот Людмила Борисівна, Інститут біохімії імені О.В. Палладіна НАН України, м. Київ, завідувач лабораторії сигнальних механізмів клітини,

доктор біологічних наук, професор Ушакова Галина Олександрівна, Дніпропетровський національний університет імені Олеся Гончара МОН України, професор кафедри біофізики і біохімії.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради В.М. Дзюба.

Анотація

флуоресцентний білок фотохімічний

Морозова К.С. Структурно-функціональні властивості червоного флуоресцентного білка TagRFP657 та його застосування у клітинній біології. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, Харків, 2010.

Методами молекулярного клонування, на основі кДНК ФБ mKate з довжиною хвилі флуоресценції 635 нм був створений білок TagRFP657 з флуоресценцією понад 650 нм. Первинна структура TagRFP657 відрізняється від mKate замінами десяти АК залишків: Lys9Thr, Met44Gln, Lys69His, Phe84Тrp, Ser148His, Ser165Thr, Аsp166Alа, Met167Leu, Leu181Phe та Аrg203Тyr. Ароматичні АК у мікрооточенні хромофора (69His, 148His, 181Phe та 203Тyr) утворюють систему р-р стекінгових взаємодій з фенольним та імідозольним кільцями хромофора, що супроводжується зниженням енергії збудженого стану, і, як наслідок, збільшенням довжини хвилі максимумів збудження та флуоресценції.

Встановлено зв'язок структури TagRFP657 з його флуоресцентними та біохімічними властивостями. Визначено кінетичні параметри реакцій формування хромофора. Максимуми збудження та флуоресценції TagRFP657становлять 611 нм та 657 нм, відповідно. Молярний коефіцієнт екстинкції дорівнює 34000 М-1.см-1, квантовий вихід - 0,10. TagRFP657 характеризується рН-стабільністю з рКа 5,0 та фотостабільністю з півчасом фотознебарвлення 55 секунд. Півчас дозрівання білка при 37°С дорівнює 125 хв. Можливості застосування TagRFP657 у клітинній біології продемонстровано у модельних експериментах. Наведено приклад успішного застосування ФБ TagRFP657 у протоковій цитофлуориметрії.

Ключові слова: флуоресцентний білок TagRFP657, червона флуоресценція, молекулярне клонування, химерні білки, протокова цитофлуориметрія.

Аннотация

Морозова Е.С. Структурно-функциональные свойства красного флуоресцентного белка TagRFP657 и его применение в клеточной биологии. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Харьков, 2010.

Диссертация посвящена исследованию структурно-функциональных свойств нового красного флуоресцентного белка TagRFP657 с флуоресценцией, большей чем 650 нм, созданного методами молекулярного клонирования с применением направленной молекулярной эволюции на основе гена красного ФБ mKate с длиной волны флуоресценции 635 нм.

Установлено, что аминокислотная последовательность нового белка TagRFP657 отличается от исходного mKate заменами десяти АК остатков, а именно Lys9Thr, Met44Gln, Lys69His, Phe84Тrp, Ser148His, Ser165Thr, Аsp166Alа, Met167Leu, Leu181Phe и Аrg203Тyr. Введение ароматических аминокислот в микроокружение (69His, 148His, 181Phe и 203Тyr) хромофорных фенольного и имидозольного циклов приводит к р-р стэкинговому электронному взаимодействию с ними, в результате чего снижается энергия возбужденного состояния всей хромофорной системы и, как следствие, сдвигаются в дальне-красную область максимумы возбуждения и флуоресценции.

На примере TagRFP657 показана связь структуры белка с флуоресцентными и биохимическими свойствами. Определены константы скоростей реакций формирования хромофора, эффективность созревания хромофора (по соотношению пиков абсорбции) и рН-зависимость белков. Микроокружение хромофоров TagRFP657 и его мутантных форм содержит ароматические АК, что посредством стэкинговых взаимодействий с хромофором приводит к увеличению химической устойчивости. Оптимальным для созревания красного хромофора является наименьшая удаленность АК остатков 165 и 167, что достигается заменой в 166 положении Асп на небольшой Ала. Указаны структурные особенности, лежащие в основе изменений биохимических характеристик мутантов TagRFP657. Определены спектральные и фотохимические характеристики нового белка. Максимумы возбуждения и флуоресценции составляют 611 нм и 657 нм, соответственно. Молярный коэффициент экстинкции равен 34000 М-1.см-1, квантовый выход - 0,10. ФБ TagRFP657 характеризуется высокой рН-стабильностью с рКа равной 5,0 и фотостабильностью - полувремя фотообесцвечивания равно 55 секундам. Белок эффективно созревает при температуре 37°С, полувремя созревания составляет 125 минут.

Продемонстрированы возможности применения ФБ TagRFP657 в клеточной биологии путем создания белков слияния нового дальне-красного белка с клеточными белками и их экспрессии в живых клетках. Все меченые клеточные белки характеризовались специфической локализацией и высокой яркостью. Показано успешное применение ФБ TagRFP657 в проточной цитофлуориметрии при разделении смеси клеток с цитоплазматической экспрессией одного из трёх красных ФБ. TagRFP657 при сравнении с уже известными дальне-красными ФБ обладает существенными преимуществами, такими, как более высокая рН-стабильность, большая фотостабильность, отсутствие остаточной зеленой флуоресценции и высокая интенсивность дальне-красной флуоресценции при возбуждении при 633 нм. Такой ФБ является оптимальным маркером для клеточной биологии и проточной цитофлуориметрии с применением стандартных красных лазеров с излучением 633 нм и 638 нм, добавляя новый красный цвет, необходимый для многоцветового мечения.

Ключевые слова: флуоресцентный белок TagRFP657, красная флуоресценция, молекулярное клонирование, белки слияния, проточная цитофлуориметрия.

Annotation

Morozova K.S. Structural and functional properties of the far-red fluorescent protein TagRFP657 and cell biology application. - The manuscript.

Dissertation thesis on obtaining the scientific degree of PhD (Biology) in the speciality 03.00.04 - biochemistry. - V.N. Karazin Kharkiv National University, Kharkiv, 2010.

As original template for the molecular evolution a FP mKate with a fluorescence emission peak at 635 nm was used to design new far-red fluorescent variant TagRFP657 with a fluorescence emission peak above 650 nm. TagRFP657 contains ten substitutions compared to the parental mKate, namely Lys9Thr, Met44Gln, Lys69His, Phe84Trp, Ser148His, Ser165Thr, Asp166Ala, Met167Leu, Leu181Phe, and Arg203Tyr. Aromatic amino acids in chromophore microenvironment (69His, 148His, 181Phe and 203Tyr) can create a р-р stacking interaction with chromophore's aromatic rings and result in red-shifted excitation and emission spectra. The connection between structure of TagRFP657 and its fluorescent and biochemical properties was determined. Kinetic characteristics of chromophore maturation reactions were calculated.

TagRFP657 described by an excitation peak at 611 nm and a fluorescence emission peak at 657 nm. A recombinant purified TagRFP657 has a pH-stability with an apparent рКа value of 5,0. An extinction coefficient of RFP657 is 34000 М-1.см-1, and its quantum yield is 0,10 and photobleaching half-time is 55 sec. The chromophore maturation half-time of TagRFP657 is 125 min. In model experiments TagRFP657 was successfully expressed and visualized untagged and in fusions in mammalian cells. Far-red fluorescent protein TagRFP657 will expand possibilities of flow cytometry applications.

Keywords: fluorescent protein TagRFP657, far-red fluorescence, molecular cloning, protein fusions, flow cytometry.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. В останнє десятиріччя одним із пріоритетних методів досліджень у біології та медицині стала зажиттєва візуалізація різноманітних процесів у живих організмах, тканинах або клітинах за допомогою флуоресцентних маркерів. Особливе місце серед них займає зелений флуоресцентний білок (GFP), його варіанти та гомологи. Встановлено, що практично кожний білок у живій клітині можна помітити за допомогою GFP, якщо закодувати його послідовність в одній рамці зчитування з цим білком. Ця особливість робить GFP-подібні білки унікальними генетично кодованими флуоресцентними маркерами, що стали незамінними інструментами при вивчені взаємодії білків, їх локалізації та внутрішньоклітинного транспорту (Giepmans et al., 2006; Stepanenko, 2008), а також біосенсорами внутрішньоклітинних метаболітів, що дозволяють визначати концентрацію Ca²⁺, cAMP, рН, мембранний потенціал, активність деяких ензимів (наприклад, каспаз, кіназ і протеаз) у живих клітинах (Li et al., 1999; Zacharias et al., 2000; Metzger et al., 2002).

Важливість відкриття флуоресцентних білків для сучасної науки була відзначена присудженням Нобелевської премії з хімії у 2008 році американським вченим Осамі Шимомурі (Osamu Shimomura), Мартіну Чалфі (Martin Chalfie) та Роджеру Тсієну (Roger Tsien) за отримання та розробку нових форм зеленого флуоресцентного білка.

Для подальшого розвитку сучасних методів досліджень, спрямованих на вивчення складних клітинних процесів, необхідне одночасне використання декількох флуоресцентних білків (ФБ) з різними спектральними характеристиками. Ця мета досягається завдяки створенню нових різноманітних ФБ. Дослідження природи хромофора, структури та властивостей GFP і GFP-подібних білків дозволили розробити підходи до створення нових ФБ з покращеними й навіть заданими характеристиками, які знайшли застосування у сучасній клітинній біології та біотехнології. Цьому сприяє те, що на відміну від інших природних пігментів, ФБ формують хромофор шляхом автокаталітичної реакції взаємодії внутрішніх амінокислотних залишків білка, без участі допоміжних кофакторів, ензимів або субстратів, крім молекулярного кисню (Heim et al., 1994; Reid, Flynn, 1997; Tsien, 1998). На сьогодні клоновано гени понад 200 флуоресцентних білків з флуоресценцією в області спектру від 445 нм до 645 нм з представників класів Anthozoa та Hydrozoa типу Cnidaria, і їх кількість постійно зростає (Carter et al., 2004; Shagin et al., 2004). Різні спектральні характеристики ФБ пояснюють хімічними відмінностями у структурі хромофорів та взаємодією хромофору з його мікрооточенням.

На сьогодні, найбільший інтерес, з точки зору практичного застосування, привертають червоні ФБ з довжиною хвилі флуоресценції понад 630 нм, завдяки їх здатності підвищувати рівень детекції флуоресценції. Це пов'язано з тим, що автофлуоресценція клітин (флуоресценція флавінів, вітамінів, NAD(P)H) зменшується при збільшенні довжини хвилі. Червоні флуоресцентні білки дозволять візуалізувати структури тканин, розташовані на міліметровій глибині. Гемоглобін та меланін поглинають світло з довжиною хвилі нижче 650 нм, у той час як вода - більше 900 нм. Саме між цими значеннями знаходиться червона частина спектру, оптимальна для отримання зображень тканин. Беручи до уваги гостру необхідність подальшого розвитку методів візуалізації біологічних об'єктів для з'ясування фундаментальних основ життєдіяльності клітин за умов норми та патологій різного генезу, створення нових варіантів флуоресцентних білків з довжиною хвилі флуоресценції в діапазоні 650-670 нм є актуальним завданням, що має велике теоретичне та практичнее значення. Впровадження цих білків у практику експериментальної роботи є неможливим без з'ясування механизмів виникнення довгохвильових властивостей ФБ, зокрема вивчення зв'язку між їх структурою та оптичними і біохімічними характеристиками.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна в рамках держбюджетних тем «Фізіолого-біохімічні та структурно-функціональні закономірності клітинної адаптації до дії екзо- та ендогенних чинників» (№ державної реєстрації 0106U001584) та «Фізико-хімічні особливості червоного флуоресцентного білка RFP і його застосування у візуалізації клітинних структур» (№ державної реєстрації 0109U004544).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було створення на основі гена ФБ mKate нового червоного ФБ з довжиною хвилі флуоресценції від 650 нм до 670 нм та з'ясування зв'язку особливостей первинної структури нового білка з його довгохвильовими спектральними властивостями і фотохімічними характеристиками, а також оцінка можливості практичного застосування нового червоного ФБ у живих клітинах та як флуоресцентного маркера у протоковій цитофлуориметрії.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

1. Методами молекулярного клонування створити новий червоний ФБ з довжиною хвилі флуоресценції від 650 нм до 670 нм на основі гена мономерного червоного флуоресцентного білка mKate (довжина хвилі флуоресценції 635 нм).

2. Виявити амінокислотні заміни, що відповідають за збільшення довжини хвилі збудження та флуоресценції, а також впливають на біохімічні характеристики нового білка TagRFP657.

3. Визначити величини фотостабільності, квантового виходу, коефіцієнта екстинкції, відносної яскравості, швидкості дозрівання хромофора та рН-стабільності TagRFP657. Порівняти отримані характеристики з відповідними показниками вже відомих червоних білків (з довжиною хвилі флуоресценції більш, ніж 625 нм).

4. Проаналізувати можливості практичного застосування TagRFP657 у живих клітинах шляхом створення й аналізу експресії його химерних генетичних конструкцій з клітинними білками у клітинах лінії HeLa та за допомогою протокової цитофлуориметрії показати можливості багатокольорового мічення клітин новим та вже відомими червоними білками.

Об'єкт дослідження - метод створення флуоресцентних білків з довжиною хвилі флуоресценції від 650 нм до 670 нм і зв'язок між первинною структурою та флуоресцентними і біохімічними властивостями нового ФБ; можливість його застосування у клітинній біології.

Предмет дослідження - ген ФБ mKate, мутантні варіанти mKate, флуоресцентний білок TagRFP657, його первинна структура, спектральні та фотохімічні характеристики, химерні конструкції TagRFP657 з клітинними білками.

Методи дослідження - полімеразна ланцюгова реакція, електрофорез у поліакриламідному гелі, методи трансфекції клітин у культурі, випадковий та сайт-спрямований мутагенези, аналіз первинної структури ДНК та білків, спектрофотометрія, спектрофлуориметрія, протокова цитофлуориметрія, флуоресцентна мікроскопія.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше створено червоний флуоресцентний білок TagRFP657 з максимумом збудження 611 нм та флуоресценції 657 нм, виявлено амінокислотні залишки та структурні особливості мікрооточення хромофора, відповідальні за зрушення спектрів збудження та флуоресценції у довгохвильову область. Встановлено спектральні та біохімічні властивості TagRFP657. Визначений зв'язок між його структурними та флуоресцентними особливостями і біохімічними властивостями. Виміряно константи швидкостей реакцій формування хромофора, ефективність дозрівання хромофора та рН-залежність інтенсивності флуоресценції для TagRFP657. Виявлено структурно-функціональні зміни білка mKate, що визначають флуоресцентні та біохімічні властивості TagRFP657 в процесі штучного відбору. Вперше показано, що у порівнянні з аналогічними характеристиками вже відомих мономерних червоних білків, TagRFP657 має суттєві переваги для застосування у клітинній біології. Вперше, на прикладі створених химерних конструкцій TagRFP657 з клітинними білками, продемонстровано перевагу візуалізації у червоному діапазоні спектру від 650 нм до 670 нм. Показано, що новий флуоресцентний білок розширює можливості багатокольорового мічення клітин, додаючи новий червоний колір, та спектрально відрізняється від існуючих червоних ФБ при застосуванні у протоковій цитофлуориметрії.

Практичне значення одержаних результатів. Практичне значення результатів дисертаційної роботи полягає насамперед у тому, що новий флуоресцентний білок TagRFP657, позбавлений таких серйозних недоліків, як схильність до агрегації у клітинах ссавців, низька рН-стабільність та залишкова зелена флуоресценція і, таким чином, має великий потенціал застосування у біотехнології. Створений ФБ розкриває нові можливості для багатокольорового мічення, дозволяючи спостерігати за більшою кількістю об'єктів одночасно. У парі з вже існуючими червоними ФБ, TagRFP657 може використовуватися для розробки молекулярних біосенсорів на основі безвипромінювального переносу енергії. Спектральні характеристики TagRFP657 оптимальні для візуалізації живих клітин та тканин навіть на міліметровій глибині. ФБ TagRFP657 збуджується стандартними червоними лазерами 633 нм та 638 нм протокових цитофлуориметрів, завдяки чому може стати незамінним інструментом візуалізації у біомедичних дослідженнях.

Особистий внесок здобувача. Аналіз власних експериментальних результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень та висновків роботи проведено спільно з науковим керівником. Автор брав активну участь у написанні та підготовці до друку усіх статей та тез доповідей за темою дисертаційної роботи. Підбір, систематизація, аналіз та узагальнення відповідних даних літератури було проведено дисертантом. Ним особисто виконані абсолютно всі експериментальні дослідження (у деяких з них брав участь к.х.н. Субач Ф.В.). Процес створення ФБ TagRFP657 було проведено сумісно зі співробітниками лабораторії флуоресцентних білків у Медичному коледжі імені Альберта Ейнштейна (Нью-Йорк, США), керівник професор Верхуша В.В., що відображено в спільних публікаціях. В дисертації не використані ідеї чи розробки, які належали б співавторам опублікованих наукових праць.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені та обговорені на: ІІІ Міжнародній конференції молодих науковців «Біологія: від молекули до біосфери» (Харків, 2008); 48th Аnnual meeting of The American Society for Cell Biology (San Francisco, USA, 2008); науковій конференції молодих вчених «Актуальні питання геронтології та геріатрії» пам'яти академіка В.В. Фролькіса (Київ, 2009); V Міжнародній конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2009); науково-практичній конференції «Биологически активные вещества: фундаментальные вопросы получения и применения» (Новый Свет, АР Крым, 2009); IV Міжнародній конференції молодих вчених «Біорізноманіття. Екологія. Адаптація. Еволюція» (Одеса, 2009); VII Міжнародній Парнасівській Конференції (Ялта, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 робіт, які повністю відбивають основний зміст дисертації, у тому числі 5 статей у фахових наукових журналах та 7 - в матеріалах і тезах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 135 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів та їх обговорення, висновків. Список використаних джерел літератури включає 204 найменування. Роботу проілюстровано 37 рисунками і 17 таблицями.

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Для створення нових червоних ФБ з довжиною хвилі флуоресценції понад 650 нм використовували ген білка mKate (максимуми збудження та флуоресценції 588 нм та 635 нм, відповідно). Цей ген був ампліфікований за допомогою ПЛР як BamHI-HindIII фрагмент та введений по відповідних сайтах у вектор pBAD/His-B (Invitrogen). Шляхом чергування послідовних циклів випадкового мутагенезу, проведеного з використанням GeneMorph II Random Mutagenesis Kit (Stratagene), за умов, що ведуть до 16 мутацій на 1000 пар основ, та сайт-спрямованого мутагенезу з використанням QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) було отримано 3 бібліотеки мутантів (Ho S., 1989). Для створення кожної наступної бібліотеки використовували гени кращих мутантів з попередньої. Після мутагенезу, клітини Escherichia coli штаму LMG194 (Invitrogen) трансформували сумішшю ДНК мутантів за допомогою електропорації (Neylon C., 2004).

Типова бібліотека мутантів нараховувала приблизно 10⁷ клонів. Для двох перших бібліотек клітини спочатку культивували при 37⁰C протягом 18 год у мінімальному середовищі RM з 0,002% арабінози для експресії мутантних білків. Потім клітини сортували на цитофлуориметрі MoFlo XDP (Beckman Coulter), обладнаному 592 нм лазером та набором фільтрів для довжини хвилі емісії 630/30. Останню бібліотеку мутантів зі зрушенням спектрів у довгохвильову область сортували на FACSAria (Becton Dickinson) з лазером 638 нм та фільтрами 670/30.

В усіх випадках збирали бактеріальні клітини з найбільшим співвідношенням далеко-червоної флуоресценції до червоної та найяскравішою флуоресценцією у далеко-червоному каналі. Зібрані клітини висівали на чашки Петрі з агаризованим середовищем LB та 0,02% арабінози. Через 16 годин результати сортування аналізували під флуоресцентним стереомікроскопом Leica MZ16F, обладнаним червоним (збудження 570/30 нм, флуоресценція 615/40 нм) та далеко-червоним (збудження 605/40 нм, флуоресценція 640 нм LP) наборами фільтрів (Chroma). Клони з найбільшою інтенсивністю далеко-червоної флуоресценцїї відбирали для визначення спектральних характеристик та амінокислотних послідовностей. Амінокислотні послідовності досліджуваних білків реконструювали за допомогою програми Genetyx на основі відповідних нуклеотидних послідовностей, визначених на автоматичному секвенаторі CEQ-2000 DNA Analysis (Beckman) (Tavare, 1986). Створений у результаті застосування спрямованої молекулярної еволюції білок TagRFP657 та білок порівняння mKate2 з полігістидиновими молекулярними мітками на N-кінці було очищено на Ni-NTA агарозі (Qiagen) для подальшої характеристики. Спектри збудження та флуоресценції вимірювали на спектрофлуориметрі FluoroMax-3 (Jobin Yvon), а спектри абсорбції - на спектрофотометрі Hitachi U-3010.

Електрофорез білків проводили у 15% поліакриламідному гелі з 0,4% додецилсульфату натрію за методом Леммлі, без попереднього нагрівання білків. Як стандарти молекулярної маси використовували мономерний, димерний та тетрамерний ФБ (Laemmly, 1970). Коефіцієнт екстинкції визначали, вимірюючи абсорбцію нативного і денатурованого лугом білка та порівнюючи його з коефіцієнтом екстинкції модельної суміші хромофорів, отриманим за тих же умов. Квантовий вихід TagRFP657 розраховували, порівнюючи його флуоресценцію з mKate2 (квантовий вихід 0,04) за умов однакової абсорбції. Визначення рН-стабільності проводили, вимірюючи флуоресценцію TagRFP657 у буферних розчинах з рН від 2 до 10.

Кінетику дозрівання білка TagRFP657 вивчали, вимірюючи інтенсивність флуоресценції при температурі 37°С через рівні проміжки часу, починаючи з моменту доступу кисню. Розрахунки констант швидкостей реакцій дозрівання проводили за допомогою аналізу кінетичних кривих у програмі OriginPro 7,5; наведені криві були типовими для серії повторних вимірювань (не менш 8-9 вимірювань у кожній серії). Фотостабільність білків аналізували на інвертованому мікроскопі Olympus IX81 з фільтром 605/40 (Chroma), при потужності світла від 5 до 50 мВт/см². Для порівняння фотохімічних параметрів TagRFP657 з відповідними параметрами вже існуючих ФБ, використовували ФБ: mKate, mKate2, mRaspberry, mPlum, mNeptune. Химерні конструкції з ФБ TagRFP657 створювали методами молекулярного клонування, замінюючи гени відповідних ФБ у комерційно доступних векторах: pEGFP-C1, pEGFP-N1, pEGFP-в-actin (Clontech); pTagRFP-N1 pTurboRFP-mito (Evrogen) та конструкціях mTagBFP з гістоном Н2В, паксиліном, міозином, білком ЕВ3, б-актиніном, люб'язно наданих M. Davidson (Florida State University), по сайтах впізнавання ендонуклеазами рестрикції NheI/BglII та AgeI/NotI. Зазначеними плазмідами трансфікували клітини лінії HeLa за допомогою Effectene reagent (Qiagen). Клітини вирощували на 25 мм покривних скельцях у середовищі DMEM з доданням антибіотиків (стрептоміцин та пеніцилін) і 10% фетальної сироватки бика. Мікроскопію проводили через 48-72 год після трансфекції на інвертованому мікроскопі Olympus IX81 з програмою SlideBook v.4.1 (Intelligent Imaging Innovations).

Результати досліджень та їх обговорення.

Створення нового далеко-червоного флуоресцентного білка TagRFP657. Розмір першої другої та третьої бібліотек становив 4,1Ч10⁷, 8Ч10⁶ та 6Ч10⁷ клонів, відповідно (табл. 1). Після сортування на протокових цитофлуориметрах та подальшого відбору колоній та штрихів під флуоресцентним стереомікроскопом, спираючись на найбільше співвідношення далеко-червоної (фільтр 640 LP) до червоної флуоресценції (фільтр 615/30) клонів, були знайдені мутанти з більшою довжиною хвилі флуоресценції.

Було встановлено, що кращі мутанти першої бібліотеки несуть заміну Мet у позиції 44, розташованій у внутрішній частині в-бочонку, на Аlа, Gln, Тhr або Ser. Заміна Lys 9 Тhr знаходиться в крайній N- кінцевій частині послідовності і не може відігравати значної структурної ролі. Для створення другої бібліотеки мутантів сайт-спрямованим мутагенезом з використанням праймерів, що перекривались, було відібрано кДНК мутанта № 134 (Lys9Тhr; Мet44Gln), з максимумами збудження та флуоресценції 590 нм та 648 нм, відповідно. З метою досягнення більшого довгохвильового зміщення спектрів мутантів було здійснено спрямоване заміщення амінокислотних залишків (АК) в положеннях 69, 84, 148, 165, 167 і 203, що входять до мікрооточення хромофора. Відомо, що заміни існуючих АК на ароматичні у вказаних позиціях можуть призводити до р-р стекінгової взаємодії з фенольним та імідозольним кільцями хромофора, тим самим знижаючи енергію збудженого стану та спричиняючи збільшення довжини хвилі максимумів збудження та флуоресценції (Ormц et al., 1996). У кращих мутантах другої бібліотеки (№ 157, № 159, № 177) додалася заміна в положенні 126, яке знаходиться у зовнішній частині в-бочонка і може зумовити димеризацію, що підтверджується високою яскравістю зазначених мутантів. Виявилось, що мутант № 206 з найвидатнішими максимумами збудження та флуоресценції 601 нм та 652 нм, відповідно, несе заміни на ароматичні АК залишки у бажаних внутрішніх позиціях: 69 та 148 - His, 84 - Тrp, 203 - Тyr, що відповідає меті створення другої бібліотеки.

Невелика інтенсивність флуоресценції цього мутанту свідчить про неоптимальне структурне положення АК залишків. Щоб виправити цей недолік, на основі кДНК мутанта № 206 було отримано третю бібліотеку методом випадкового мутагенезу. Оскільки при цьому у мутанта № 206 відбулось значне зміщення максимуму збудження флуоресценції (13 нм, відносно mKate), тому сортування бібліотеки проводили на протоковому цитофлуориметрі FACSAria II (Becton Dickinson) з лазером 638 нм.

Таблица 1. Характеристики бібліотек мутантів

У мутантів третьої бібліотеки відмічено подальше збільшення довжини хвилі збудження та флуоресценції, відносно mKate на 23 нм та на 22 нм, відповідно. Аналіз амінокислотних послідовностей виявив, що кращі мутанти несуть однакові заміни: внутрішні - Ser165Thr, Met167Leu, Leu181Phe та одну зовнішню Asp166Alа (табл. 2). Мутанта з зазначеними характеристиками було визнано остаточним.

Таблиця 2. Амінокислотні заміни mKate та мутантних форм TagRFP657

Вірогідно, ключовими АК залишками, відповідальними за довгохвильові властивості TagRFP657, є чотири залишки ароматичних амінокислот у положеннях 69His, 148His, 181Phe, 203Тyr (рис. 1). Вони можуть створити систему р-р стекінгових взаємодій з фенольним та імідозольним ароматичними кільцями хромофора. У такій просторово розподіленій електронній системі знижується енергія збудженого стану, що призводить до зміщення максимумів збудження та флуоресценції у далеко-червону область. Інші шість АК замін впливають на згортання та стабільність білка.

Характеристики мутантних форм TagRFP657. Для TagRFP657 та трьох його мутантних форм було визначено параметри реакції формування хромофора, що є основою дозрівання білка та появи флуоресценції. Цей процес складається з двох послідовних реакцій: спочатку нефлуоресцентна форма хромофору С окиснюється до блакитної форми В, яка у результаті наступного окиснення перетворюється на червоний хромофор - форму R. Розраховані константи швидкостей та вільні енергії активації Гіббса для обох послідовних реакцій наведено у табл. 3.

Таблиця 3. Параметри реакції дозрівання для ФБ TagRFP657 та його мутантних форм

При виборі найбільш ефективно дозріваючого ФБ серед мутантів з максимумом флуоресценції 657 нм (№ 2, № 3, № 4) активаційні параметри цього процесу не грають ролі, оскільки процес окиснення є автокаталітичним. Крім того, величини ?G не відрізняються вірогідно у одержаних мутантів. Таким чином, умовами відбору стають мономерний стан молекули ФБ, час дозрівання хромофору та інтенсивність флуоресценції. Мономерами є мутанти № 2 і № 4.

При цьому найменший час дозрівання і найбільша інтенсивність флуоресценції виявляються у мутанта № 4. Спираючись на отримані результати, TagRFP657 було визнано оптимальним варіантом для подальшої роботи.

Цей вибір підтверджується визначенням ефективності дозрівання, для мутантних форм по 166 положенню, що описується співвідношенням піків абсорбції при 610 нм (поглинання червоного хромофора) та 408 нм (поглинання блакитної форми) (табл. 4).

Таблиця 4

Оптимальною структурною детермінантою для дозрівання червоного хромофору є найменша відстань між АК залишками 165 та 167, що має місце при заміні у 166 положенні Asp на невеликий за розмірами Аlа. У результаті аналізу залежності інтенсивності флуоресценції мутантних форм TagRFP657 від рН (табл. 5) з'ясувалося, що у мутантів з більшою рН-стабільністю у 165 положенні знаходиться полярний Thr, який може утворювати водневий зв'язок з гідроксильною групою Tyr66 і тим самим стабілізувати trans-конфігурацію хромофору.

Таблиця 5. Залежність рК_а від АК замін для mKate2 та мутантних форм TagRFP657

Взагалі, мікрооточення хромофору TagRFP657 з замінами на ароматичні АК є більш хімічно стійким, ніж у mKate2. Результати досліджень дозволили зробити висновки відносно структурних особливостей TagRFP657 та визначити цей варіант як оптимальний для наступного випробування у клітинній біології. Фотохімічні характеристики нового далеко-червоного білка TagRFP657. Результати вимірювань фотохімічних характеристик очищеного білка TagRFP657 у порівнянні з покращеним варіантом білка mKate - mKate2 (Shcherbo et al., 2009). Спектри нового ФБ TagRFP657 характеризуються максимумами збудження 611 нм та флуоресценції 657 нм. TagRFP657 відрізняється високою рН-стабільністю з рК_а, що дорівнює 5,0; високою фотостабільністю, з півчасом фотознебарвлення 55 секунд, що більш ніж у два рази перевищує відповідний параметр для mKate2; половинний час дозрівання TagRFP657 дорівнює 125 хв; залишкова зелена флуоресценція практично відсутня.

У табл. 6 наведено характеристики відомих далеко-червоних ФБ (за даними: ¹ Shcherbo et al., 2007; ² Shcherbo et al., 2009; ³ Strack et al., 2009; ⁴ Lin et al., 2009.) та нового білку TagRFP657. Згідно з цими даними можна зробити висновок, що на сьогоднішній день білок TagRFP657 має найбільш довгохвильову флуоресценцію та за іншими характеристиками не поступається іншим ФБ. Перевагами TagRFP657 є висока рН-стабільність та яскравість при довжині хвилі збудження 633 нм.

Таблиця 6. Характеристики мономерних ФБ з довжиною хвилі флуоресценції понад 625 нм

Мономерний стан TagRFP657 підтверджено за допомогою електрофорезу у 15% поліакриламідному гелі (рис. 3), разом з червоними ФБ як стандартами: мономерним mKate2, димерним tdTomato та тетрамерним DsRed2. Червону флуоресценцію TagRFP657 детектувати не вдалось (рис. 3, В), але у далеко-червоному каналі він чітко розташований на рівні мономера mKate2. Застосування нового далеко-червоного флуоресцентного білка TagRFP657 у клітинній біології. Клітини лінії HeLa були трансфіковані конструкціями, що кодували флуоресцентний білок TagRFP657 та один з клітинних белків: в-актин, паксилін, кератин, гістон-2B, віментин, б-актинін, б-тубулін, ЕВ3, міозин або мітохондріальний та лізосомальний спрямовуючі пептиди. За результатами флуоресцентної мікроскопії, усі химерні конструкції ефективно експресувались та коректно вбудовувались у відповідні клітинні структури, що свідчило про їх специфічну локалізацію з достатньої для візуалізації дрібних елементів яскравістю. Агрегація та утворення неспецифічних флуоресцентних частинок були мінімальними. Правильна локалізація усіх химерних білків у живих клітинах підтверджує мономерний стан ФБ TagRFP657, який раніше було встановлено на очищеному рекомбінантному білку.

Застосування нового далеко-червоного флуоресцентного білка TagRFP657 у протоковій цитофлуориметрії. Суміш клітин з надекспресією одного з трьох червоних ФБ: mKate, TagRFP або TagRFP657 (рис. 4), сортували на цитофлуориметрі BD FACS Aria, використовуючи лазери 561 нм і 638 нм та фільтри 585/20 нм і 660/20 нм для детекції флуоресценції. У каналі 638 нм лазера детектувалась флуоресценція клітин, мічених TagRFP657, тоді як клітини з mKate та TagRFP не відрізнялись від нефлуоресцентних клітин. Таким чином, TagRFP657, додаючи новий далеко-червоний колір, розширює можливості багатокольорового мічення у сучасних біомедичних дослідженнях з використанням протокової цитофлуориметрії.

Висновки

У дисертаційній роботі приведено результати дослідження структурно-функціональних властивостей нового червоного флуоресцентного білка TagRFP657: амінокислотної послідовності та замін, відповідальних за довгохвильові властивості, швидкість та ефективність дозрівання хромофора, залежність інтенсивності флуоресценції від рН. Проведено вимірювання спектральних та фотохімічних характеристик TagRFP657 та порівняння їх з відповідними параметрами вже відомих мономерних червоних ФБ. Продемонстровано можливості практичного застосування TagRFP657 у клітинній біології та для протокової цитофлуориметрії.

1. Методами молекулярного клонування на основі кДНК мономерного червоного ФБ mKate (довжина хвилі флуоресценції 635 нм) створено новий, найбільш довгохвильовий на даний час, флуоресцентний білок TagRFP657 з максимумами збудження та флуоресценції 611 нм і 657 нм, відповідно.

2. Встановлено, що амінокислотна послідовність нового білка TagRFP657 відрізняється від mKate замінами десяти АК залишків: Lys9Thr, Met44Gln, Lys69His, Phe84Trp, Ser148His, Ser165Tre, Asp166Alа, Met167Leu, Leu181Phe та Arg203Tyr. Введення ароматичних амінокислот до мікрооточення хромофора (69His, 148His, 181Phe та 203Tyr) призводить до утворення системи р-р стекінгових взаємодій з фенольним та імідозольним ароматичними кільцями хромофора, супроводжується зниженням енергії збудженого стану, і, як наслідок, збільшенням довжини хвилі максимумів збудження та флуоресценції. Інші шість АК замін впливають на згортання та стабільність білка.

3. Продемонстровано зв'язок структури білка з його флуоресцентними та біохімічними властивостями на прикладі TagRFP657 та його мутантних форм. Визначено константи швидкостей реакцій формування хромофора, ефективність дозрівання хромофора (по співвідношенню піків абсорбції) та рН-стабільність білків. Показано, що мікрооточення хромофору TagRFP657 з ароматичними АК залишками є хімічно стійкішим, порівняно з mKate, але формування хромофора проходить повільніше. Оптимальна ефективність дозрівання червоного хромофора досягається при заміні у 166 позиції Аsp>Аlа. Охарактеризовано структурні особливості, що визначають зміну біохімічних характеристик мутантів TagRFP657.

4. У роботі наведено результати вимірювання та розрахунків фотохімічних характеристик TagRFP657: квантовий вихід - 0,10; молярний коефіцієнт екстинкції - 34000 М^-1.см^-1; рН-стабільність - рК_а дорівнює 5,0; півчас фотознебарвлення- 55 секунд та півчас дозрівання при 37°С - 125 хвилин.

5. Показано, що порівняно з іншими мономерними ФБ з флуоресценцією від 625 нм (mRaspberry, mKate, mKate2, mPlum і mNeptune) TagRFP657 характеризується такими перевагами, як вища рН-стабільність та фотостабільность, відсутність залишкової зеленої флуоресценції та найбільша інтенсивність червоної флуоресценції при довжині хвилі збудження 633 нм.

6. У модельних експериментах продемонстровано можливості TagRFP657 як флуоресцентного маркера. Створено химерні конструкції TagRFP657 з різними клітинними білками. Відзначено специфічну локалізацію усіх мічених клітинних білків, показано відсутність агрегатів та високу чутливість детекції червоної флуоресценції, що свідчить про оптимальність TagRFP657 як клітинного маркера.

7. Продемонстровано успішне застосування TagRFP657 у протоковій цитофлуориметрії разом з вже відомими червоними ФБ. Довжина хвилі збудження стандартних червоних лазерів протокових цитофлуориметрів 633 нм і 638 нм краще підходить для збудження TagRFP657 (пік збудження 611 нм), ніж для інших далеко-червоних ФБ. TagRFP657 додає новий далеко-червоний колір та значно розширює можливості багатокольорового мічення білків, що застосовуються у сучасних біомедичних дослідженнях.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Спектральные характеристики красных флуоресцентных белков, изменяющих спектр флуоресценции во времени / Ф.В. Субач, Е.С. Морозова, В.В. Верхуша, Е.Э. Перский // Біофізичний вісник. - 2009. - Вип. 22 (1). - С. 116-122. (Дисертант проводив вимірювання спектральних характеристик білків).

2. Морозова Е.С. Флуоресцентные белки красной спектральной области / Е.С. Морозова, В.В. Верхуша, Е.Э. Перский // Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. Серія: біологія. - 2009. - Вип. 9. - № 856. -- С. 29-39. (Дисертант вивчив літературу з теми дослідження, створив новий червоний флуоресцентний білок та продемонстрував його застосування у клітинній біології, підготував статтю до друку).

3. Особенности первичной структуры красных флуоресцентных белков, изменяющих спектры флуоресценции во времени / Ф.В. Субач, Е.С. Морозова, О.М. Субач, В.В. Верхуша, Н.И. Буланкина, М.В. Гоэнага // Біофізичний вісник. - 2009. - Вип. 23 (2). - С. 52-58. (Дисертант здійснив молекулярне субклонування ФБ, дослідив структурні особливості ФБ та підготував статтю до друку).

4. Monomeric fluorescent timers that change color from blue to red report on cellular trafficking / F. Subach, O. Subach, I. Gundorov, K. Morozova, K. Piatkevich, A. M. Cuervo, V. Verkhusha // Nat. Chem. Biol. - 2009. - V. 5. - P. 118-126. (Дисертант провів експерименти по характеристиці білків in vitro).

5. Rotational order-disorder structure of fluorescent protein FP480 / S. Pletnev, K. Morozova, V. Verkhusha, Z. Dauter // Acta Cryst. - 2009. - D65. - P. 906 - 912. (Дисертант створив білок FP480 - мутантну форму TagRFP657).

6. Морозова Е.С. Разработка нового дальне-красного флуоресцентного белка / Е.С. Морозова, Ф.В. Субач, В.В. Верхуша // Матеріали ІІІ Міжнародної конференції молодих науковців «Біологія: від молекули до біосфери». (Харків, 18-21 лист. 2008 р.) - Харків, 2008. - С. 90. (Дисертант методами молекулярного клонування створив новий білок, провів вимірювання його спектральних та фотохімічних характеристик).

7. Development of new fluorescent proteins: a bright blue mTagBFP and the changing color from blue to red fluorescent timers / O. Subach, F. Subach, K. Morozova, K. Piatkevich, A. Cuervo, V. Verkhusha // 48th annual meeting of The American Society for Cell Biology (San Francisco, 13-17 Dec. 2008) - San Francisco, 2008. - Р-124. (Дисертант провів експерименти по характеристиці білків in vitro).

8. Морозова Е.С. Использование флуоресцентных белков для исследования апоптоза / Е.С. Морозова, О.М. Субач // Матеріали наукової конференції молодих вчених «Актуальні питання геронтології та геріатрії» пам'яти академіка В.В. Фролькіса (Київ, 27 січ. 2009 р.) - Київ, 2009. - С. 70-71. (Дисертант провів експерименти по характеристиці біосенсора in vivo).

9. Морозова К. Застосування нового далеко-червоного флуоресцентного білка TagRFP660 у клітинній біології / Морозова К. // Матеріали V Міжнародної конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 12-15 травня 2009 р.) - Львів, 2009. - С. 235-236.

10. Морозова Е.С. Дальне-красный флуоресцентный белок для скрининга биологически активных веществ в животных клетках / Е.С. Морозова, В.В. Верхуша Е.Э. Перский // Материали науково-практичної конференції «Биологически активные вещества: фундаментальные вопросы получения и применения» (Новый Свет, АР Крым, 25-30 мая 2009 г.) - Новый Свет, 2009. - С. 356. (Дисертант провів дослідження можливостей застосування далеко-червоного флуоресцентного білка у мікроскопії та протоковій цитофлуориметрії).

11. Morozova K.S. Optimization of biochemical and photochemical stability of far-red fluorescent protein RFP660 / K.S. Morozova // Матеріали IV Міжнародної конференції молодих вчених «Біорізноманіття. Екологія. Адаптація. Еволюція» (Одеса, 16-19 вересня 2009 р.) - Одеса, 2009.

Размещено на Allbest.ru