Фармакогностичне вивчення кори та пагонів берези бородавчастої

12

Размещено на http://www.allbest.ru/

12

Міністерство охорони здоров'я України

Національний фармацевтичний університет

УДК:615.322:582.632.1:581.821.2:581.44

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Фармакогностичне вивчення кори та пагонів берези бородавчастої

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

Мала Ольга Сергіївна

Харків - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі ботаніки Національного Фармацевтичного університету (м. Харків), Міністерства охорони здоровья України.

Науковий керівник:доктор фармацевтичних наук, професор

Хворост Ольга Павлівна,

Національний фармацевтичний університет,

професор кафедри ботаніки

Офіційні опоненти:доктор фармацевтичних наук, професор

Ковальов Володимир Миколайович,

Національний фармацевтичний університет,

завідувач кафедри фармакогнозії

кандидат фармацевтичних наук,

старший науковий співробітник

Котов Андрій Георгійович,

Філія«Фармакопейний центр»

ДП «УФІЯ»,

провідний науковий співробітник

відділу Державної фармакопеї.

Захист відбудеться «28» травня 2010 року о ___ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою 61002, м. Харків, вул.Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університеті за адресою: 61168, м.Харків, вул. Блюхера, 4.

Автореферат розісланий «____» ____________ 2010 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук, професорЛ.М.Малоштан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

береза біологічний субстанція анатомічний

Актуальність теми. Одним з важливих завдань фармації є пошук та створення нових лікарських фітозасобів. Більшість ліків рослинного походження за хімічною природою значно ближча організму людини, вони мають більш широкий спектр фармакологічної активності, не чинять багатьох побічних дій, менш токсичні. Актуальним питанням залишається пошук нових джерел сировини, раніше невикористовуваних, в тому числі й відходів виробництва, та розробка на їх основі нових фітосубстанцій для створення ефективних лікарських засобів. Значний інтерес викликають лікарські рослини, один з видів сировини або частини яких давно використовуються в офіційній медицині, а ряд інших видів або частин сировини - популярні у народній медицині.

До таких рослин можна віднести представників роду Betula L. Ці рослини є досить розповсюдженими на території країн СНД. В нашій країні офіціальною сировиною є бруньки, що включені до ДФ СРСР ХІ видання. На вітчизняному ринку фармпрепаратів майже відсутні засоби на основі субстанцій з сировини берези (крім гомеопатичних препаратів, “Фітолізіну” та інш.). Значний інтерес викликають відходи деревозаготівельної та деревообробної галузей кора та пагони найпоширенішої рослини роду Betula L.- берези бородавчастої, або повислої (Betula verrucosa Ehrh., Betula pendula Roth). У народній медицині кору та пагони цього виду застосовують при новоутвореннях, як ранозагоюючий та протизапальний засоби. Останнім часом значний інтерес викликають фармакологічні властивості сполук фенольної природи, а саме кислоти гідроксикоричні, флавоноїди, катехіни. Джерелом цих сполук є зовнішня кора берези, що містить від 10 до 35% речовин даних груп. Відома протизапальна та мембраностабілізуюча активність фенольних сполук кори різних видів берез.

Тому актуальним питанням стає фармакогностичне вивчення вегетативних органів берез (кори та пагонів) для створення нових лікарських засобів. Особливу зацікавленість викликає використання відходів виробництва, що дозволяє отримувати сировину, не пошкоджуючи фонду флори.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету “Фармакогностичне вивчення біологічно-активних речовин, створення лікарських засобів рослинного походження” (№ держреєстрації 0103U000476).

Мета і завдання дослідження. Метою нашого дослідження є фармакогностичне вивчення кори та пагонів берези бородавчастої.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

? виявити основні групи БАР та провести визначення їх якісного складу (сполук тритерпенової та стероїдної природи, фенольних сполук: похідних кислоти гідроксибензойної, флавоноїдів, катехінів, дубильних речовин) кори та пагонів берези бородавчастої;

? провести визначення кількісного вмісту основних груп БАР в сировині та субстанції;

? вивчити хімічний склад сировини, виділити в індивідуальному стані сполуки і встановити їх структуру;

? виявити ознаки морфолого-анатомічної будови та локалізації БАР в сировині;

? встановити технологічні параметри сировини та розробити технологію отримання субстанції;

? провести дослідження ряду показників сировини та отриманих субстанцій, в тому числі вміст основних груп БАР;

? встановити види біологічної активності субстанції;

? розробити проекти аналітично-нормативної документації та технологічного регламенту.

Об'єкт дослідження. Кора та пагони берези бородавчастої, виділені з них БАР.

Предмети дослідження. Фармакогностичне вивчення кори та пагонів берези бородавчастої.

Методи дослідження. Використовували препаративну тонкошарову, паперову, колонкову адсорбційну хроматографію та рехроматографію на силікагелі та поліаміді, спектрофотометричні методи, макро- та-мікротехнічні методи та методики in vivo.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне фармакогностичне вивчення кори та пагонів берези бородавчастої. Виявлено закономірності виходу екстрактивних речовин та суми окиснюваних фенолів в залежності від віку пагонів та способу подрібнення сировини. Визначено оптимальні умови технології отримання густого екстракту з кори берези бородавчастої. Отримано ліпофільні фракції пагонів берези бородавчастої та вивчено їх склад. З кори виділено 8 сполук, з пагонів - 14 сполук та встановлено їх структуру. Вперше з пагонів берези бородавчастої виділено в індивідуальному стані та встановлено структуру 4 сполук. Визначені числові показники кори берези бородавчастої з 6 різних регіонів заготівлі. Проведено порівняльний аналіз елементного складу кори та пагонів різних регіонів заготівлі. Встановлено морфолого-анатомо-гістохімічні особливості кори берези бородавчастої.

Новизну досліджень підтверджено поданням заявки № а 201002470 від 05.03.2010 на винахід «Спосіб одержання засобу з мембраностабілізуючою дією» та заявки № u 201002469 від 05.03.2010 на однойменну корисну модель.

Практична цінність роботи. Оформлено на технологію одержання густого екстракту з кори берези бородавчастої проект технологічного промислового регламенту. Технологію отримання густого екстракту апробовано в умовах ВАТ «Лубнифарм». Розроблено проекти «Методи контролю якості «Берези кора»» та «Методи контролю якості «Екстракт кори берези густий»».

Дані вивчення хімічного складу, морфолого-анатомічної будови та локалізації сполук, технологічні параметри кори берези бородавчастої впроваджено у навчальний процес кафедр фармакогнозії та хімії природних сполук Національного фармацевтичного університету, кафедри фармакогнозії з курсом ботаніки та кафедри фармакогнозії, фармхімії та технології ліків ФПО Запорізького державного медичного університету, кафедри фармакогнозії з медичною ботанікою Тернопільского державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського.

Особистий внесок здобувача. Проведено комплексне фармакогностичне дослідження кори, пагонів берези бородавчастої. Встановлено наявність основних груп БАР, визначено їх якісний склад та кількісний вміст у корі та пагонах берези бородавчастої. Виділено в індивідуальному стані з кори 8 сполук, з пагонів 14 сполук. Визначено технологічні параметри для кори берези бородавчастої, розроблено технологію отримання густого екстракту з кори берези бородавчастої. Розроблено проекти «Методи контролю якості «Берези кора»» та «Методи контролю якості «Екстракт кори берези густий»».

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи доповідались на ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції «Актуальні проблеми сучасних наук: теорія та практика - 2006» (Дніпропетровськ, 2006), науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів» (Харків, 2007), Всеукраїнському конгресі «Сьогодення та майбутнє фармації» (Харків, 2008), науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів» (Харків,2008), VI Міжнародній науково-практичній конференції «Бъдеши изследования» (Софія, 2010).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 робіт, у тому числі 4 статті в фахових виданнях та 6 тез доповідей.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 168 сторінках, має 13 рисунків, 23 таблиць та 2 схеми і складається із вступу, огляду літератури, 4 глав власних досліджень, загальних висновків і списку літератури, який містить 192 джерел (з них 55 іноземних).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Вступ

У вступі подано актуальність теми, мету та завдання дослідження, наукову новизну одержаних результатів, практичну цінність роботи, особистий внесок здобувача, апробацію результатів дисертації та публікації.

Найпоширеніші представники роду Betula як перспективні джерела лікарської рослинної сировини

(розділ 1 - огляд літератури)

Приведені відомості щодо ботанічної характеристики берези бородавчастої, хімічного складу кори та пагонів, способів отримання бетуліну, аспектів застосування в медицині та інших галузях народного господарства.

Виявлення основних груп БАР в сировині берези бородавчастої (розділ 2)

Об'єктами вивчення були кора, пагони берези бородавчастої, зібрані в ботанічному саду Національного фармацевтичного університету (м. Харків), в ботанічному саду Одеського національного університету ім. Іллі Мечнікова (м. Одеса) в п. Снігурівці Миколаївської області, в с. Липці Харківської області, в м. Дунаївці Хмельницької області, в м. Свердловську Луганської області.

Проведено системне дослідження якісного хімічного складу. Встановлено, що в корі, пагонах берези бородавчастої містяться вільні та зв'язані цукри, вільні та зв'язані амінокислоти, кислоти органічні, фенольні сполуки: похідні кислоти гідроксибензойної, флавоноїди, катехіни, дубильні речовини, стероїди, тритерпеноїди. Методом тривимірної скануючої спектрофлюориметрії визначено якісний склад ліпофільних фракцій кори та пагонів берези бородавчастої. Перспективними видами сировини кора та й пагони берези бородавчастої, що містили значні кількості таких БАР як тритерпеноїди, похідні гідроксибензойної кислоти, флавоноїди, дубильні речовини.

Кількісне визначення основних груп БАР в сировині берези бородавчастої (розділ 3)

Проведено порівняльний аналіз якісного складу та кількісного вмісту жирних кислот в ліпофільних фракціях кори та пагонів берези бородавчастої (табл.1). Аналіз даних табл.1 показав, що за вмістом домінували ненасичені кислоти жирні, з яких вміст кислоти олеїнової склав біля половини від загального вмісту цієї групи сполук. У ліпофільних фракціях кори та пагонів берези бородавчастої за методом спектрофотометрії визначили кількісний вміст суми каротиноїдів (в перерахунку на в-каротин 0,240,01 % та 1,010,02 %, відповідно), в ліпофільній фракції пагонів - кількісний вміст суми хлорофілів (в перерахунку на хлорофіл А - 1,70,02%). Таким чином, дослідження ліпофільних фракцій підтверджено комплексність переробки рослинної сировини.

Таблиця 1

Кількісний вміст кислот жирних у ліпофільних фракціях кори та пагонів берези бородавчастої

Назва кислоти жирної	Індекс кислоти жирної	Вміст кислоти жирної в ліпофільній фракції, в мг/г
		кори	пагонів
Монодеканова	С10:0	0,50	-
Лауринова	С12:0	1,30	Сліди
Міристинова	С14:0	0,80	3,51
Пальмітинова	С16:0	2,00	12,63
Гептадеценова	С17:0	1,80	2,63
Стеаринова	С18:0	3,40	8,77
Олеїнова	С18:1	34,50	70,17
Лінолева	С18:2	10,00	49,12
Вміст суми ненасичених жирних кислот		44,50	119,29
Вміст суми насичених жирних кислот		9,80	27,54
Загальний вміст жирних кислот		54,30	146,83

Визначено амінокислотний склад кори, пагонів берези бородавчастої (табл.2). Якісний амінокислотний склад всіх досліджуваних видів сировини однаковий і представлений 17 сполуками (7 незамінними та 10 замінними амінокислотами). Домінуючими компонентами у корі є фенілаланін (1730 мг%), тирозин (1580 мг%) та метіонін (1400 мг%), в пагонах - фенілаланін (1250 мг%).

Таблиця 2

Амінокислотний склад кори, пагонів берези бородавчастої (в мг%, в перерахунку на абсолютно суху сировину)

Назва амінокислоти	Кількісний вміст амінокислоти в
	корі	пагонах
незамінні амінокислоти
Валін	180	185
Ізолейцин	700	810
Лейцин	795	485
Лізин	345	200
Метіонін	1400	950
Треонін	210	215
Фенілаланін	1730	1250
замінні амінокислоти
Аланін	140	200
Аргінін	685	730
Гістидин	770	420
Гліцин	175	255
Кислота аспарагінова	365	470
Кислота глутамінова	615	637
Пролін	390	267
Серин	235	245
Тирозин	1580	545
Цистеїн	сліди	сліди
Вміст суми незамінних амінокислот	5360	4095
Вміст суми замінних амінокислот	4995	3769
Загальний вміст амінокислот	10355	7864

Таблиця 3

Макро- та мікроелементний склад кори берези бородавчастої з різних місць заготівлі (мг/100г, в розрахунку на абсолютно суху сировину)

Елементи	Номер зразка та місце заготівлі
	1	2	3	4	5	6
Na	2900,00	3200,00	3010,00	3150,00	2300,00	3100,00
Mg	198,00	175,00	191,00	170,00	190,00	150,00
Al	24,00	26,00	30,00	26,10	22,00	21,50
Mn	8,50	7,00	8,20	6,80	7,10	7,70
Fe	10,00	15б00	20б00	14б90	11б00	17б00
Ni	0,03	0,04	0б05	0б04	0б02	0б03
Cu	0,45	0,70	0б90	0б70	0б60	0б55
Zn	0,13	0,15	0б20	0,14	0,10	0,19
Mo	0,02	0,03	0,09	0,03	0,01	0,05
Pb	0,09	0,12	0,19	0,11	0,06	0,13
Si	500,00	320,00	380,00	318,00	120,00	260,00
K	2110,00	1360,00	1600,00	1355,50	2060,00	1460,00
Ca	650,00	260,00	340,00	262,30	210,00	160,00
Р	80,00	20,00	37,00	19,70	90,00	45,00

Примітки: місця заготівлі сировини: 1 - ботанічний сад Одеського національного університету ім. Іллі Мечнікова (м. Одеса), 2 - ботанічний сад Національного фармацевтичного університету (м. Харків), 3 - п. Снігурівка, Миколаївська обл., 4 - с. Липці, Харківська обл., 5 - м. Дунаївці, Хмельницька обл., 6 - м. Свердловськ, Луганська обл.

Проведено порівняльний аналіз елементного складу кори берези бородавчастої з різних регіонів заготівлі (табл. 3). Аналіз даних табл. 3 показав, що вміст кожного елементу в корі в залежності від місця заготівлі коливається в межах від 1,3-2 рази (магній, манган, алюміній, натрій, купрум, калій, нікель та цинк) до 4-9 разів (кальцій,. сіліцій, фосфор, молібден). Так, для більшості зразків кори, що вивчали, спостерігалася наступна закономірність: Na > K > Ca, Si > Mg > P. Найвищий вміст натрію винайдено в зразкові, що заготовлений в ботанічному саду НФаУ м. Харкова (3200,00 мг/100 г), в 1,3 рази - в корі, що заготовлена в м. Дунаївці (Хмельницька обл.), Вміст калію в декілька разів нижчий: від 2110,00 мг/100 г (ботанічний сад Одеського національно університету ім. Іллі Мечнікова, м.Одеса) до 1360 мг/100 г (ботанічний сад НФаУ, м. Харків). Також встановлено елементний склад пагонів берези бородавчастої з різних регіонів заготівлі.

Визначено числові показники для кори берези бородавчастої з різних регіонів заготівлі: втрату в масі при висушуванні, загальну золу, екстрактивні речовини, вміст суми окиснюваних фенолів, також проведено визначення кількісного вмісту дубильних речовин (метод комплексонометрії в розрахунку на галотанін) та суми катехінів (метод спектрофотометрії в розрахунку на (+)-катехін) (табл. 4). Аналіз результатів досліджень показав, що вміст загальної золи коливався в 1,2 рази, вміст екстрактивних речовин - в 1,13 разів в залежності від місця заготівлі. Майже в 1,3 рази варіював вміст суми окиснюваних фенолів, вміст дубильних речовин коливався в1,6 рази, вміст суми катехінів - в 1,3 рази.

На підставі визначення втрати в масі при висушуванні, загальної золи, вмісту екстрактивних речовин та суми окиснюваних фенолів в пагонах 1-3го років, 5-6 років життя та в корі з 40-річного стовбура встановлено закономірності кількісного вмісту екстрактивних речовин та суми окиснюваних фенолів в залежності від віку пагонів. Це дозволило зробити висновки що до крітерію стандартизації кори берези за макроскопічними ознаками.

Виділення БАР в індивідуальному стані з кори та пагонів берези бородавчастої та встановлення їх структури (розділ 4)

За допомогою вибіркової екстрагуючої здатності органічних розчинників, препаративної ТШХ, колонкової адсорбційної хроматографії на силікагелі і поліамідному сорбенті в індивідуальному стані вилучено з кори берези бородавчастої 8 сполук, а з пагонів - 14 сполук (табл.5). На підставі проведених досліджень за допомогою фізичних, фізико-хімічних, хімічних методів (УФ-, ІЧ-, ПМР-спектроскопії, визначення оптичної активності, кислотного гідролізу тощо) встановлено структуру 18 сполук. Це тритерпеноїди -амірін (речовина 4.1), бетулін (речовина 4.2), кислота бетулінова (речовина 4.3); стероїд - -сітостерин (речовина 4.4); каротиноїд -каротин (речовина 4.5); похідні кислоти бензойної - кислота галова (речовина 4.6), дилактон гексагідроксідифенової кислоти (кислота елагова) (речовина 4.7), метилгалат (речовина 4.7), етилгалат (речовина 4.9); похідні кислоти коричної - кислота кофейна (речовина 4.10), кислота хлорогенова (речовина 4.11); похідні 2- фенілбензо--пірону кемпферол (речовина 4.12), кверцетин (речовина 4.13), міріцетин (речовина 4.14); похідні 2-фенілбензопірану (+)-катехін (речовина 4.15), (-)-катехін (речовина 4.16), (+)-епікатехін)(речовина 4.17), (-)- епікатехін (речовина 4.18).

Вперше вилучено з пагонів берези бородавчастої 4 сполуки: (+)-катехін, (-)-катехін, (+)-епікатехін та (-) епікатехін.

Таблиця 4. Числові параметри кори берези бородавчастої з різних місць заготівлі (m=5, P=0,95, в %, в розрахунку на абсолютно суху сировину)

Показник	Об'єкт, що вивчали
	1	2	3	4	5	6
Втрата в масі при висушуванні (за методикою ДФУ І видання) не більше 10%	8,01±0,13	8,15±0,17	8,31±0,21	9,02±0,16	9,46±0,22	7,86±0,08
Загальна золи (за методикою ДФУ І видання) не більше 10%	8,25±0,10	9,44±0,17	7,84±0,12	8,41±0,16	8,21±0,09	8,93±0,51
Екстрактивні речовини (за методикою ДФ СРСР, ХІ видання) не менше 22%	22,21±0,13	22,34±0,22	25,15±0,40	23,10±0,30	23,18±0,37	24,23±0,37
Сума окиснюваних фенолів (за методикою ДФ СРСР, ХІ видання) не менше 12%	15,34±0,52	16,77±0,19	15,42±0,36	13,25±0,22	15,10±0,28	14,24±0,23
Дубильні речовини (метод комплексонометрії, в розрахунку на галотанін) не менше 2%	2,56±0,05	3,18±0,06	2,08±0,02	3,24±0,07	2,91±0,09	3,34±0,17
Сума катехінів (метод спектрофотометрії, в розрахунку на (+)-катехін) не менше 3%	3,69±0,15	4,11±0,20	3,18±0,10	3,13±0,08	3,24±0,18	3,82±0,28

Примітки: місця заготівлі сировини: 1 - ботанічний сад Одеського національного університету ім. Іллі Мечнікова (м. Одеса), 2 - ботанічний сад Національного фармацевтичного університету (м. Харків), 3 - п. Снігурівка, Миколаївська обл., 4 - с. Липці, Харківська обл., 5 - м. Дунаївці, Хмельницька обл., 6 - м. Свердловськ, Луганська обл.

Розробка технології отримання субстанції з перспективних видів сировини берези бородавчастої та стандартизація сировини та субстанцій (розділ 5)

Визначено технологічні параметри кори берези, що подрібнена за різними способами (за допомогою вальців) та комбінованим способом (дезмембраторний подрібнювач та вальці) різних видів кори (табл.6).

Визначено питому масу, об'ємну масу та насипну масу, пористість сировини, порізність сировини, вільний об'єм шару, кут природного ухилу та коефіціенти поглинання води та 40 % спирту етилового. Комлева кора, подрібнена за допомогою вальців має високі значення питомої маси та вільного об'єму шару.

Як видно з даних табл.6, комбінований спосіб подрібнення (давлено-різаний) кори призводив до високих значень об'ємної маси та порозності сировини, коефіцієнтів поглинання екстрагентів.

Таблиця 5. Виділені сполуки з кори та пагонів берези бородавчастої

Шифр речовини	Назва речовини	Тпл., С	Сировина, з якої виділено
4.1	-амірін (олеан-12-ен-3 в-ол)	197-200С	Кора
4.2	Бетулін (3в,28-дигідроксілуп-20,29-єн)	258-260оС	Кора
4.3	Кислота бетулінова (кислота 3в-гідроксі-20(29)-лупаєн-28-ова)	318-320С	Кора
4.4	-сітостерін (3в-гідрокси-олеан-12-єн)	138-140оС	Кора
4.5	-каротин (,-каротин)	179-180оС	Пагони
4.6	Кислота галова (кислота 3,4,5-тригідроксибензойна)	254-256оС	Пагони
4.7	Кислота елагова (дилактон кислоти гексагідроксидифенової)	360єС розкл.	Пагони
4.8	Метилгалат (метиловий етер кислоти галової)	155-156єС	Пагони
4.9	Етилгалат (етиловий етер кислоти галової)	151-152єС	Пагони
4.10	Кислота кофейна (кислота 3,4- дигідроксикорична)	194-195єС	Пагони
4.11	Кислота хлорогенова (кислота 5-0-кофеіл-D-хінна)	203-205єС	Пагони
4.12	Кемпферол (3,5,7,4'-тетрагідроксифлавон)	275-276єС	Пагони
4.13	Кверцетин (3,5,7,3',4'-пентагідроксифлавон)	311-313єС	Пагони
4.14	Мірицетин (3,5,7,3,4,5-гексагідроксифлавон)	344-350єС	Пагони
4.15	(+)-катехін (3,5,7,3',4'-пентагідроксифлаван)	175-176єС	Кора, пагони
4.16	(-)-катехін 3,5,7,3',4'- пентагідроксифлаван	175-176єС	Кора, пагони
4.17	(+)-епікатехін (3,5,7,3',4'-пентагідроксіфлаван)	243-245єС	Кора, пагони
4.18	(-)епікатехін (3,5,7,3',4'- пентагідроксифлаван)	243-245єС	Кора, пагони

Визначено динаміку вилучення екстрактивних речовин та суми окиснюваних фенолів з сировини в залежності від виду екстрагенту (рис. 1).

Таблиця 6. Деякі технологічні параметри кори берези бородавчастої в залежності від способу подрібнення

Технологічні параметри сировини	Од. вим.	Варіант подрібнення сировини
		I	II	III
Питома маса(dп)	г/см3	1,41±0,06	1,63±0,07	1,53±0,07
Об'ємна маса(do)	г/см3	1,01±0,04	1,26±0,05	1,28±0,06
Насипна маса(dн)	г/см3	0,50±0,02	0,44±0,01	0,50±0,01
Пористість сировини(Пс)	-	0,30±0,01	0,21±0,01	0,16±0,007
Порозність шару (Пш)	-	0,51±0,02	0,65±0,02	0,76±0,03
Вільний об'єм шару (V)	-	0,65±0,03	0,72±0,02	0,68±0,02
Кут природного ухилу	град.	?	?	?
Коефіцієнт водопоглинання		2,82±0,14	2,94±0,15	3,25±0,15
Коефіцієнт поглинання 40 % спирту етилового		2,18±0,09	2,69±0,13	2,80±0,13

Примітки: «I» - кора середньої частини стовбура, подрібнена за допомогою вальців; «II» - комлева кора, подрібнена за допомогою вальців; «III» - комлева кора, яка спочатку була подрібнена на дезмембраторному подрібнювачеві, а потім за допомогою вальців.

На підставі цього обрано оптимальний екстрагент - 40 %-вий спирт етиловий, вихід екстрактивних речовин дорівнював майже 30 % в розрахунку на абсолютно суху сировину.

Визначено динаміку вилучення екстрактивних речовин та суми окиснюваних фенолів з кори берези бородавчастої при використанні методу вакуумно-фільтраційної екстракції (з варіантами різного подрібнення сировини - табл. 7) та методу дрібної мацерації (рис. 2) та показано доцільність використання дрібної марцерації.

Таблиця 7

Динаміка екстрагування екстрактивних речовин та суми окиснюваних фенолів з кори берези бородавчастої за методом вакуум-фільтраційної екстракціі (в %, m=5, в перерахунку на абсолютно суху сировину, екстрагент 40 % спирт етиловий)

Номер зливу	Кількісний вміст у витязі
	І	ІІ	ІІІ
	екстрактивних речовин	суми окиснюваних фенолів	екстрактивних речовин	Суми окиснюваних фенолів	екстрактивних речовин	суми окиснюваних фенолів
1	8,79±0,03	4,88±0,16	12,88±0,29	7,04±0,19	12,50±0,26	7,31±0,14
2	7,23±0,17	3,60±0,09	8,32±0,18	3,78±0,14	10,32±0,21	4,70±0,09
3	5,74±0,11	2,02±0,07	4,89±0,10	2,54±0,06	5,58±0,12	2,28±0,07
4	5,38±0,10	1,47±0,05	3,09±0,10	0,83±0,03	5,62±0,12	1,15±0,04
5	3,93±0,15	1,37±0,05	3,75±0,10	0,42±0,01	1,12±0,03	0,42±0,01
Разом	30,93±0,64	13,85±0,39	33,35±0,68	14,85±0,17	36,02±0,74	16,04±0,30

Примітки: «І» - кора з середньої частини стовбура подрібнена за допомогою вальців; «ІІ» - комлева кора подрібнена за допомогою вальців; «ІІІ» - комлева кора подрібнена на дезмембраторному подрібнювачеві , а потім за допомогою вальців (комбінований спосіб)

Також встановлено оптимальні параметри технологічного процесу (кратність зливів - 3, співвідношення сировина екстрагент 1:15). Розроблену технологію отримання екстракту берези кори густого оформлено проектом технологічного промислового регламенту, який апробовано в умовах ВАТ «Лубнифарм».

Вивчено ознаки морфолого-анатомічної будови кори берези бородавчастої, в тому числі заготовленої зі стовбура на різній висоті та встановлено загальнородові та індивідуальні риси зовнішньої та внутрішньої будови. Діагностичними рисами є майже відсутня забарвленість оболонок клітин перидерми, наявність склереїд та луб'яних волокон. Також встановлено локалізацію БАР в тканинах кори. Це дозволило зробити висновки що до крітерію стандартизації кори берези за мікроскопічними ознаками.

Визначено числові показники 5 серій кори берези бородавчастої 2007-2009 рр. заготівлі: макро- та мікроскопічні ознаки, ідентифікація, втрата в масі при висушуванні (не більше 8%), загальна зола (не більше 10,0 %), домішки (потемнілої сировини не більше 5%, органічних домішок не більше ніж 1%, мінеральних домішок не більше 1%), вміст екстрактивних речовин (не менше 22,0 %), вміст суми окиснюваних фенолів (не менше 12,0 %).

Рис. 2. Динаміка вилучення екстрактивних речовин (А) та суми окиснюваних фенолів (Б) з комлевої кори берези бородавчастої (комбінований спосоіб подрібення) за методом дрібної мацерації (у %, в перерахунку на абсолютно суху сировину, екстрагент - 40 % спирт етиловий, коефіціент поглинання екстрагенту К_n =2,80)

Розроблено проект «Методи контролю якості «Берези кора Betulae cortex»». Визначено показники 5 серій субстанції, напрацьованої в лабораторних умовах (опис, розчинність, ідентифікація, сухий залишок, важкі метали, вміст суми окиснюваних фенолів - не менше 25,0 %) та розроблено проект «Методи контролю якості «Екстракт кори берези густий Extractum cortici Betulae spissum»».

Під керівництвом д.м.н. проф. С.М. Дроговоз на кафедрі фармакології НФаУ проведено вивчення протизапальної та мембраностабілізуючої дії екстракту кори берези густого (in vivo). Новизну досліджень підтверджено поданням заявки № а 201002470 від 05.03.2010 на винахід «Спосіб одержання засобу з мембраностабілізуючою дією» та заявки № u 201002469 від 05.03.2010 на однойменну корисну модель.

ВИСНОВКИ

Вперше проведено комплексне фармакогностичне дослідження кори та пагонів берези бородавчастої, показано перспективність розробки на їх основі нових оригінальних вітчизняних лікарських засобів протизапальної та мембраностабілізуючої дії.

1. Встановлено, що в корі, пагонах берези бородавчастої містяться вільні та зв'язані цукри, вільні та зв'язані амінокислоти, органічні кислоти, фенольні сполуки: флавоноїди, катехіни, дубильні речовини, стероїди, тритерпеноїди. Методом тривимірної скануючої спектрофлюориметрії визначено якісний склад ліпофільних фракцій кори та пагонів берези бородавчастої.

2. Проведено порівняльний аналіз якісного складу та кількісного вмісту кислот жирних в ліпофільних фракціях кори та пагонів (домінували ненасичені, з них - олеїнова), визначено кількісний вміст суми каротиноїдів, в ліпофільній фракції пагонів кількісний вміст суми хлорофілів за методом спектрофотометрії.

3. Визначений амінокислотний склад кори, пагонів берези бородавчастої. Домінуючими компонентами в корі є фенілаланін (1730 мг%), тирозин (1580 мг%) та метіонін (1400 мг%), в пагонах - фенілаланін (1250 мг%).

4. Проведено порівняльний аналіз елементного складу кори та пагонів берези бородавчастої з різних регіонів заготівлі, а також порівняльний аналіз елементного складу кори, субстанції, та грунту з-під рослин. Визначено числові показники кори берези бородавчастої з різних регіонів заготівлі: втрата маси при висушуванні, загальна зола, екстрактивні речовини, вміст суми окиснюваних фенолів, вміст дубильних речовин та суми катехінів. Встановлено закономірності кількісного вмісту екстрактивних речовин та суми окиснюваних фенолів в залежності від віку пагонів та місця заготівлі.

5. З кори виділено в індивідуальному стані 8, з пагонів - 14 сполук. За допомогою фізичних, фізико-хімічних, хімічних методів встановлено їх структуру. Це 3 похідні тритерпеноїдної, 1 похідне стероїдної природи, 1 каротиноїд, 4 похідних бензойної кислоти, 2 похідних коричної кислоти, 3 похідних 2-фенілбензо--пірону, 4 похідних 2-фенілбензопірану. Вперше з пагонів берези бородавчастої виділено в індивідуальному стані та встановлено структуру 4 сполук.

6. Визначено технологічні параметри кори берези різних способів подрібнення. Обрано оптимальний екстрагент, оптимальний спосіб екстрагування та параметри технологічного процессу. При цьому вихід екстрактивних речовин дорівнював не менше 27 % в розрахунку на абсолютно суху сировину. Розроблено оптимальну технологію отримання екстракту берези кори густого.

7. Визначено показники 5 серій кори берези бородавчастої 2007-2009 рр. заготівлі ( в тому числі морфолого-анатомо-гістохімічні ознаки) та 5 серій субстанції. Доведено протизапальну та мембраностабілізуючу дії екстракту кори берези густого.

8. Розроблено проекти «Методи контролю якості «Берези кора Betulae cortex»», «Методи контролю якості «Екстракт кори берези густий Extractum cortici Betulae spissum»». На технологію оформлений проект промислового технологічного регламенту, який апробовано в умовах ВАТ «Лубнифарм».

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Мала О. С. Вивчення амінокислотного складу деяких видів сировини Betula verrucosa Ehrh. / О. С. Мала, О. П.Хворост // Фармаком. - 2007. - № 4. - С. 28-30. (особистий внесок - участь у підготуванні проб, обробці отриманих результатів та оформленні статті).

2. Мала О. С. Визначення деяких технологічних параметрів кори берези бородавчастої Betula verrucosa Ehrh. / О. С. Мала, О. П. Хворост // Укр. журн. клін. та лаб. мед. - 2009. - Т. 4, № 3. - С. 58-59. (особистий внесок - участь в кількісному визначенні, в обговоренні експериментальних даних та підготовці статті).

3. Мала О. С. Визначення показників cтандартизації кори берези бородавчастої з різних регіонів заготівлі / О. С. Мала, О. П. Хворост // Фітотерапія. Часопис. - 2009. - № 4. - С. 72-73. (особистий внесок - участь в дослідженнях та написанні статті).

4. Мала О. С. Ліпофільні фракції кори та пагонів берези бородавчасто - перспективні джерела БАР / О. С. Мала, О. П. Хворост // Запорожский мед. журн. - 2010. - № 1. -- С. 75-76. (особистий внесок - отримання ліпофільних фракцій, участь у проведенні досліджень, обробці отриманих результатів та написанні статті).

5. Мала О. С. Фармакогностичне дослідження кори поширених видів берези - б. бородавчастої та б. пухнастої / О. С. Мала, О. П. Хворост // Актуальні проблеми сучасних наук: теорія та практика - 2006 : матеріали III міжнар. наук.-практ. конф., 16-30 черв. 2006р. - Дніпропетровськ, 2006. - Т. 2. - С. 5-6. (особистий внесок - приймала участь в проведенні досліджень, узагальненні результатів та оформлення тез доповідей).

6. Мала О. С. Представники родини березові як перспективні джерела отримання БАР / О. С. Мала, О. П. Хворост // Актуальнi питання створення нових лiкарських засобiв : матерiали всеукр. наук.-практ. конф. студ. та молодих вчен., м. Харкiв, 17-18 трав. 2007 р. - Х., 2007. - С. 60. (особистий внесок - узагальнила результати та оформила тези доповідей).

7. Перспективи створення препаратів на основі вітчизняної рослинної сировини / О. С. Мала, К. Д. Мішнєва, Т. В. Опрошанська, О. П. Хворост // Клінічна фармація в Україні : матеріали VIІ Всеукраїнської наук.-практ. конф. з міжнар. участю, м. Харків, 15-16 листоп. 2007 р. - Х., 2007. - С. 70. (особистий внесок - участь в дослідженнях та написанні тез доповідей).

8. Мала О. С. Діагностичні мікроскопічні ознаки кори берези бородавчастої / О. С. Мала, В. П. Руденко // Актуальнi питання створення нових лiкарських засобiв : матерiали всеукр. наук.-практ. конф. студ. та молодих вчених, м. Харкiв, 16-17 квiт. 2008 р. - Х., 2008. - С. 69. (особистий внесок - участь в проведенні досліджень, узагальненні результатів та написанні тез доповідей).

9. Руденко В. П. Макро- та мікроскопічні ознаки сировини рослин роду береза / В. П. Руденко, О. С. Мала // Сьогодення та майбутнє фармації : тез. доп. всеукр. конгр., м. Харків, 16-19 квіт. 2008 р. - Х., 2008. - С. 173. (особистий внесок - приймала участь у підготуванні проб, узагальненні результатів та написанні тез доповідей).

10. Хворост О. П. Использование коры березы бородавчатой в качестве источника биологически активних веществ / О. П. Хворост, О. С. Малая // Бъдещи изследвания : матеріали VI міжнар. наук.-практ. конф., 17-25 февруари 2010 г. - София : Бял ГРАД-БГ ООД, 2010. - Т. 12. Лекарство. Биология. - С. 47-48. (особистий внесок - участь в дослідженнях та написанні тез доповідей)

АНОТАЦІЯ

Мала О.С. Фармакогностичне вивчення кори та пагонів берези бородавчастої. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. Національний фармацевтичний університет, Харків, 2010.

Проведено комплексне фармакогностичне дослідження кори і пагонів берези бородавчастої, вивчено якісний склад та кількісний вміст основних груп природних речовин (кислот жирних, амінокислот, елементів, фенольних сполук) у корі та пагонах берези бородавчастої. З кори в індивідуальному стані виділено 8, з пагонів 14 сполук та за допомогою фізичних, фізико-хімічних, хімічних методів встановлено їх структуру: 3 похідні тритерпеноїдної, 1 похідне стероїдної природи, 1 каротиноїд, 4 похідних кислоти бензойної, 2 похідних кислоти коричної, 3 похідних 2-фенілбензо--пірону, 4 похідних 2-фенілбензопірану. Вперше виділено з пагонів 4 сполуки. Визначено технологічні параметри сировини та встановлено оптимальні умови одержання густого екстракту кори берези бородавчастої. Вивчено морфолого-анатомічну будову та локалізацію біологічно активних речовин в сировині. Розроблено проекти технологічного промислового регламенту одержання густого екстракту кори берези бородавчастої, «Методи контролю якості «Берези кора»» та «Методи контролю якості «Екстракт берези кори густий»». Густий екстракт кори берези проявив протизапальну та мембраностабілізуючу дію.

Ключові слова: береза бородавчаста, кора, пагони, фармакогностичне вивчення, БАР, густий екстракт, протизапальна, мембраностабілізуюча дія.

АННОТАЦИЯ

Малая О. С. Фармакогностическое изучение коры и побегов березы бородавчатой. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия. Национальный фармацевтический університет, Харьков, 2010.

Впервые проведено комплексное фармакогностическое изучение коры и побегов березы бородавчатой. Изучен качественный состав и определено количественное содержание основных групп природных веществ (веществ терпеновой и стероидной природы, фенольных соединений: флавоноидов, производных гидроксибензойной кислоты, катехинов, дубильных веществ, жирных кислот и аминокислот, макро- и микроэлементов) в коре и побегах березы бородавчатой.

При помощи методов препаративной хроматографии в тонком слое сорбента, колоночной хроматографии на силикагеле и полиамидном сорбенте из коры березы бородавчатой выделено 8 веществ, из побегов - 14. На основании физических, физико-химических, химических свойств, данных УФ-, ИК- и ПМР- спектроскопии установлено их строение: 3 производных тритерпеноидной, 1 производное стероидной природы, 1 каротиноид, 4 производных кислоты бензойной, 2 кислоты производных коричной, 3 производных 2-фенилбензо-г-пирона, 4 производных2-фенилбензопирана. Впервые из побегов выделено в индивидуальном виде 4 вещества: (-)-катехин, (+)-катехин, (-)-епикатехин, (+)-епикатехин.

Получены липофильные фракции коры и побегов и методом трехмерной спектрофлуориметрии определен их качественный состав. Методом спектрофотометрии определено количественное содержание суммы каротиноидов, в липофильной фракции побегов - количественное содержание суммы хлорофилов. Методом газожидкостной хроматографии в липофильных фракциях коры и побегов определен качественный состав и количественное содержание жирных кислот. Обнаружено 8 жирных кислот, среди которых 6 насыщенных и 2 ненасыщенных. В коре преобладали такие жирные кислоты как: олеиновая (34,50 мг/г) и линолевая (10,00 мг/г), в побегах - олеиновая (70,17 мг/г), линолевая (49,12 мг/г) и пальмитиновая (12,63 мг/г).

Изучен качественный состав и количественное содержание аминокислот в коре и побегах. Доминирующими аминокислотами в коре были фенилаланин (1730мг%), тирозин (1580мг%) и метионин (1400мг%), в побегах - фенилаланин (1250мг%).

Методом атомно-эмиссионной спектрометрии изучен элементный состав коры и побегов с разных мест заготовки, а так же установлена зависимость между накоплением макро-и микроэлементов в коре, побегах, густом экстракте коры и грунте.

Проведено морфолого-анатомическое изучение коры, заготовленной на разной высоте ствола. Установлены диагностические признаки морфологического и анатомического строения, что позволило определить критерии стандартизации сырья по данным показателям . Проведено гистохимическое исследование коры и побегов, в результате чего определены закономерности накопления основных групп БАВ.

Определены технологические параметры коры разных способов измельчения. Разработаны оптимальные параметры технологического процесса: экстрагент 40% спирт этиловый, оптимальное соотношение сырье-экстрагент 1:15. Выход субстанции составлял 27,0 % от массы воздушно-сухого сырья. Разработана технология получения густого экстракта из коры березы бородавчатой, которая оформлена проектом технологического промышленого регламента.

Проведенные исследования биологической активности in vivo позволили установить противовоспалительную и мембраностабилизирующую активность густого экстракта.

Проведена стандартизация сырья и субстанции и разработаны проекты «Методы контроля качества «Березы кора Betulae cortex»» «Методы контроля качества «Экстракт коры березы густой Extractum cortici Betulae spissum»». Технология получения густого экстракта коры березы апробирована в условиях ОАО «Лубныфарм».

Ключевые слова: береза бородавчатая, кора, побеги, фармакогностическое изучение, БАВ, густой экстракт, противовоспалительное, мембраностабилизующее действие

ANNOTATION

Mala O.S. Pharmacognostical study of bark and shoots of Betula verrucosa. - A Manuscript.

Thesis for scientific degree of the Candidate of Pharmacy in spesiality 15.00.02 - Pharmaceutical chemistry and Pharmacognosy. National University of Pharmacy, Kharkiv, 2010.

Complete pharmacognostical study of Betula verrucosa Ehrh. bark and shoot was conducted. Qualitative composition and quantitative contain of main native substances groups (fatty acids, aminoacids, elements, phenolic compounds) in bark and shoots of Betula verrucosa. An 8 individual compounds were obtain from bark and 14 compounds - from shoot. The structure of obtained compounds was identificated by the physical, physico-chemical, chemical methods: 3 triterpen compounds, 1 steroid, 1 carotene, 4 benzoic acid derivates, 2 cinnamic acid derivates, 3 2-phenylbenzo--pyrone derivates, 4 phenylbenzopyrane derivates. 4 substances were obtained at first. Technological parameters and optimal influences of thick extract obtaining from bark of Betula verrucosa were determinate. Morphology and anatomy structure and localization of biological active compounds in raw material were studied. Project technological industrial order of obtaining thick extract from Betula verrucosa bark, projects «Methods of quality control «Betula bark»», « Methods of quality control «Thick extract of Betula bark»» were worked out. Thick extract from Betula bark anti-inflammatory and membrane-stabilization action have shown.

Key words: Betula verrucosa, bark, shoots, thick extract, pharmacognostical study, biological active substances, thick extract, anti-inflammatory, membrane-stabilization action.

Размещено на Allbest.ru

...