Довгохвильові сквараїнові барвники, як флуоресцентні біоаналітичні реагенти

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦіОНАЛЬНА аКАДЕМіЯ НАУК УКРАЇНи

ФIЗИКО-ХIМIЧНИЙ IНСТИТУТ ІМЕНІ О. В. БОГАТСЬКОГО

УДК 543.426:[667.287:577.112.85]

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук

Довгохвильові сквараїнові барвники, як флуоресцентні біоаналітичні реагенти

02.00.02 - аналітична хімія

Поврозін Євген Анатолійович

Одеса - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в ДНУ "НТК "Інститут монокристалів" НАН України, м. Харків. сквараїновий високомолекулярний біотин

Науковий керівник: кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник Паценкер Леонід Давідович, ДНУ "НТК "Інститут монокристалів" НАН України, м. Харків, виконуючий обов'язки завідувача відділу органічних люмінофорів і барвників.

Офіційні опоненти:

доктор хімічних наук, професор Логінова Лідія Павлівна Харківський Національний університет імені В. Н. Каразіна, м. Харків, завідувач кафедри хімічної метрології;

кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник Єгорова Алла Володимирівна Фізико-хімічний інститут імені О. В. Богатського НАН України, м. Одеса, старший науковий співробітник відділу аналітичної хімії та фізико-хімії координаційних сполук.

Захист відбудеться "27" вересня 2011 року о 10⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.219.01 в Фізико-хімічному інституті імені О. В. Богатського НАН України за адресою: 65080, м. Одеса, Люстдорфська дорога, 86.

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Фізико-хімічного інституту імені О. В. Богатського НАН України (65080, м. Одеса, Люстдорфська дорога, 86).

Автореферат розісланий "22" серпня 2011 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат хімічних наук К. О. Вітюкова.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Флуоресцентні біоаналітичні методи широко застосовуються у клінічній діагностиці, медико-біологічних дослідженнях, в біології, аналітичній хімії, біохімії, при аналізі харчових продуктів, моніторингу біологічного та хімічного забруднення навколишнього середовища. Завдяки своєї високій чутливості, достовірності, продуктивності, простоті, дешевизні та екологічній чистоті ці методи мають істотні переваги у порівнянні з абсорбційними, імунохімічними, радіоізотопними, рентгеноструктурними, мас-спектрометричними, хроматографічними та електрофоретичними методами. Один з найперспективніших шляхів подальшого поліпшення чутливості та достовірності флуоресцентного визначення біоаналітів полягає у проведенні вимірювань у довгохвильовій області спектру (600-900 нм), де біологічні речовини мають мінімум власного поглинання та випромінювання, що заважають спектральним дослідженням, а також заміна інтенсивності, як вимірюваної аналітичної характеристики (параметру флуоресценції), на поляризацію та час життя флуоресценції. Вирішення цієї задачі стримується відсутністю довгохвильових флуоресцентних біоаналітичних реагентів -- барвників, придатних для цих вимірювань, а також біоаналітичних методик, заснованих на цих реагентах.

Нещодавно було розроблено нові довгохвильові сквараїнові барвники з комплексом поліпшених характеристик, що можуть допомогти вирішенню проблеми недостатньої чутливості та достовірності флуоресцентних методів визначення. Але ці барвники не застосовувалися раніше як реагенти для розробки флуоресцентних біоаналітичних методів, заснованих на вимірюваннях поляризації та часу життя флуоресценції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано в ДНУ "НТК "Інститут монокристалів" НАН України у відповідності до теми відомчого замовлення НАН України: "Синтез та дослідження довгохвильових барвників та люмінофорів" (2004-2006 р.р., №0104U008441); вона була частиною міжнародних проектів УНТЦ №U111 "Червоні та інфрачервоні флуоресцентні зонди та мітчики для медико-біологічних досліджень", №3804 "Засновані на часах гасіння флуоресценції мітчики і зонди для медико-біологічних аналізів та моніторингу бактеріального забруднення" та №P313 "Медико-біологічні зонди та мітчики".

Мета і завдання дослідження. Головна мета роботи полягає у підвищенні чутливості та достовірності біоаналітичних методів шляхом застосування нових флуоресцентних реагентів на основі довгохвильових сквараїнових барвників. Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити наступні основні завдання:

вивчити спектральні і фотофізичні властивості та фотостабільність довгохвильових сквараїнових барвників у водних середовищах, а також при ковалентному та нековалентному зв'язуванні з біотином, олігонуклеотидами та модельними протеїнами -- альбуміном (BSA) та імуноглобуліном (IgG); встановити закономірності щодо впливу молекулярної будови барвників на їх властивості у вільному та зв'язаному стані;

на підставі отриманих даних з'ясувати придатність сквараїнових барвників для флуоресцентного визначення низькомолекулярних та високомолекулярних біомолекул на прикладі біотину, олігонуклеотидів, BSA та IgG;

з'ясувати можливість використання часів життя флуоресценції сквараїнових барвників для флуоресцентного імуноаналізу низькомолекулярних антигенів, визначення вмісту біотину його реакцією з авідином, а також для гібридизаційного аналізу олігонуклеотидів;

намітити можливі шляхи використання довгохвильових сквараїнових барвників як біоаналітичних реагентів.

Об'єкти дослідження: процеси взаємодії сквараїнів та поліметинів з низькомолекулярними та високомолекулярними біоаналітами та пов'язані з цими процесами зміни флуоресцентних характеристик цих барвників.

Предмет дослідження: флуоресцентні біоаналітичні реагенти на основі сквараїнових барвників та їх кон'югатів з біотином, олігонуклеотидами та протеїнами (BSA і IgG).

Методи дослідження: електронна абсорбційна та флуоресцентна спектроскопія, фазово-модуляційна спектроскопія часів життя флуоресценції.

Наукова новизна роботи

Вперше на підставі систематичного аналізу спектрально-люмінесцентних, фотофізичних та фотохімічних властивостей нових довгохвильових сквараїнових барвників, їх нековалентних комплексів та ковалентних кон'югатів з біотином, олігонуклеотидами та протеїнами продемонстровано перспективність сквараїнів як біоаналітичних реагентів для флуоресцентного визначення низькомолекулярних та високомолекулярних біоаналітів, особливо при застосуванні часів життя флуоресценції як параметру вимірювань.

Вперше на підставі аналізу зв'язку спектральних, фотофізичних та фотохімічних характеристик з молекулярною будовою сквараїнових барвників сформульовано критерії їх відбору для розробки методів флуоресцентного визначення низькомолекулярних та високомолекулярних біоаналітів.

Вперше запропоновано методологічні підходи до визначення олігонуклеотидів та низькомолекулярних антигенів з застосуванням лише одного, сквараїнового барвника, час життя флуоресценції якого є чутливим до мікрооточення.

Практичне значення одержаних результатів. Продемонстровано переваги довгохвильових сквараїнових барвників у порівнянні з відкритоланцюговими ціанінами для флуоресцентного визначення низькомолекулярних та високомолекулярних біоаналітів.

Розроблено підходи до флуоресцентного визначення вмісту біотину його реакцією з авідином, проведення гібридизаційного аналізу олігонуклеотидів та імуноаналізу низькомолекулярних антигенів, що засновані на вимірюванні часів життя флуоресценції сквараїнів. На відміну від відомих методів, заснованих на переносі енергії між двома барвниками (FRET), ці нові підходи дозволяють спростити, прискорити та підвищити достовірність визначення біоаналітів.

Сквараїнові барвники K8-1340, K8-1351 та K8-1661 запропоновано як найбільш яскраві, чутливі та стабільні біоаналітичні реагенти. Їх перспективність підтверджено в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України (Київ), Інституті проблем кріобіології та кріомедицини НАН України (Харків), а також в компаніях Agilent (США), Tecan (Австрия), ReaMetrix, Inc. (США), Dako (Данія), Luminex Corp. (США), Molecular Devices (США), ISS (США), Edinburgh Instruments (Великобританія), Becton Dickinson (США), Pierce Biotechnology (США), Avanti Polar Lipids, Inc. (США), Glen Research Corp. (США) та ін. Одержані флуоресцентні кон'югати та розроблені методи визначення біоаналітів застосовуються на практиці для кількісного визначення протеїнів; при вивченні взаємодії антигенів з антитілами в імунології; у гібридизаційному аналізі, заснованому на взаємодії комплементарних пар олігонуклеотидів; для одержання біологічних зображень методом флуоресцентної мікроскопії та при вирішенні інших біоаналітичних та медико-біологічних завдань. Кон'югати барвників K8-1610 та K8-1660 з пептидами (серія ULight) застосовано компанією PerkinElmer (США, Канада) у комерційних тест-системах LANCE Ultra для визначення активності ферментів кіназ.

Особистий внесок здобувача полягає у синтезі кон'югатів барвників з біологічними молекулами, а також у виконанні всіх спектральних досліджень, вимірюванні електронних спектрів поглинання та флуоресценції, квантових виходів, фотостабільності, поляризації та часу життя флуоресценції. За участю здобувача здійснено постановку мети та завдань дослідження, проведено обговорення отриманих результатів, формулювання висновків, написання наукових праць та заявок на винаходи.

Автор вдячний співробітникам Інституту монокристалів: к.х.н., н.с. А. Л. Татарцю, інж. О. С. Колосовій, пров. інж. О. М. Обуховій та інж. Л. І. Марковій за синтез сквараїнових барвників, пров. інж. С. У. Хабусєвій за допомогу у вимірюванні коефіцієнтів екстинкції, к.х.н., с.н.с. Т. С. Дюбко та м.н.с. В. І. Сидорову за допомогу в постановці біологічних експериментів.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідалися на Міжнародній науково-практичній конференції "Застосування лазерів в медицині та біології" (Одеса, 2004), 9-11-ій Міжнародних конференціях "Methods and Applications of Fluorescence" (Лісабон, Португалія, 2005; Зальцбург, Австрія, 2007; Будапешт, Угорщина, 2009), Міжнародній конференції "Photonics North" (Отава, Канада, 2007); Міжнародній конференції "Modern Physical Chemistry for Advanced Materials" (Харків, 2007), Всесвітньому конгресі "2009 World Molecular Imaging Congress" (Монреаль, Канада, 2009) та інших.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті у наукових журналах, 22 тези доповідей на міжнародних та українських конференціях, опубліковано заявки на патент США та по процедурі PCT (Patent Cooperation Treaty -- міжнародний договір патентного права).

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, п'яти розділів, висновків та списку цитованої літератури (205 найменувань). Загальний обсяг дисертації становить 160 сторінок, у тому числі 14 таблиць та 73 рисунки.

Основний зміст роботи

Поліпшення біоаналітичних методів за допомогою довгохвильових реагентів для вимірювання часів життя флуоресценції

Аналіз літератури показав, що час життя флуоресценції, як параметр вимірювання, є найбільш стійким у порівнянні з інтенсивністю та поляризацією до впливу багатьох перешкоджаючих факторів, таких як ефект внутрішнього фільтру, гасіння флуоресценції, автофлуоресценція, світлорозсіяння, фотознебарвлення та ін. Тому для підвищення чутливості та достовірності флуоресцентного визначення біоаналітів необхідні високостабільні біоаналітичні реагенти, що дозволяють вимірювати зміни часу життя флуоресценції у довгохвильовій області спектру (600-800 нм), де біологічні речовини мають найменше власне поглинання та автофлуоресценцію. Сучасні довгохвильові біоаналітичні реагенти не відповідають цим вимогам. Більшість з них придатна лише для вимірювання інтенсивності флуоресценції та має інші недоліки, такі як недостатня чутливість часу життя флуоресценції до мікрооточення та низька хімічна і фотохімічна стабільність. Ці недоліки характерні для лантанідних метал-лігандних комплексів та ціанінів, таких як, Cy5 і Alexa 647, що є зараз найбільш розповсюдженими довгохвильовими реагентами.

Вибір флуоресцентних біоаналітичних реагентів на підставі їх спектральних та фотофізичних властивостей

Нещодавно було синтезовано нові сквараїнові барвники -- оксосквараїни серії K8-16xx, тіосквараїни (K8-12xx), аміносквараїни (K8-14xx), барбітурові (K8-17xx) та диціанометиленові (K8-13xx) сквараїни, що у порівнянні з ціанінами мають поліпшені характеристики, але ці сквараїни не застосовувалися раніше як флуоресцентні біоаналітичні реагенти. Завдяки різноманіттю молекулярної будови, спектральних та гідрофільно-гідрофобних властивостей ці барвники надають широкі можливості для їх вибору в якості біоаналітичних реагентів для конкретних застосувань. Досліджені сквараїни мають як симетричну, так і несиметричну будову та містять різну кількість гідрофільних сульфогруп. Деякі сквараїни (норсквараїни) містять атоми водню замість алкільних груп у гетероциклічних атомів азоту. Всього було досліджено 27 барвників.

Для з'ясування можливості застосування цих сквараїнів як біоаналітичних реагентів досліджено їх спектральні, фотофізичні та фотохімічні властивості у вільному стані, в нековалентних комплексах та ковалентних кон'югатах з біоаналітами та вибрано ті сквараїни, що мають найбільший динамічний діапазон змін параметрів флуоресценції, насамперед, часу життя, а також найкращу фотостабільність. Для цього синтезовано кон'югати барвників з високомолекулярними речовинами, а саме, модельними протеїнами -- сироватковим альбуміном бика (BSA, молекулярна маса (MW) 66 кДа) та імуноглобуліном класу G (IgG, MW 150 кДа), низькомолекулярними сполуками -- біотином (MW 244 Да), а також 15-мірним 3'_аміномодифікованим олігонуклеотидом ACAATTTGCTGCCGG (MW 4569 Да). Крім того, проведено титрування барвників з концентрацією 0.5 мкM розчином BSA у діапазоні 0-90 мкМ.

Одержано закономірності щодо зв'язку положення (_макс.), інтенсивності (I_Fl), форми та напівширини () смуг поглинання та флуоресценції, а також квантового виходу (_F), поляризації (P), часу життя флуоресценції () та фотостабільності з будовою барвників, їх комплексів та кон'югатів з біомолекулами.

Сквараїнові барвники, як і ціаніни Cy5 та Alexa 647, мають у довгохвильовій області спектру високоінтенсивну смугу поглинання та флуоресценції (табл. 1). Це робить їх придатними для збудження червоними напівпровідниковими лазерами та світлодіодами, що дуже важливо для сучасних інструментальних біоаналітичних методів. Загальним недоліком сквараїнів та ціанінів є малі стоксови зсуви, що призводять до зниження чутливості та достовірності біоаналітичних вимірювань. На відміну від ціанінів та оксосквараїнів, сквараїни з заміщеним атомом кисню мають ще одну, короткохвильову смугу з максимумом в області 336-445 нм та коефіцієнтом екстинкції () у межах 12000-48500 М-¹см-¹. Ця смуга надає можливості збуджувати флуоресценцію барвників не тільки червоними, але ще й синіми напівпровідниковими джерелами світла і, таким чином, зменшити вплив джерела випромінювання на флуоресцентний сигнал, що покращує чутливість і достовірність вимірювань.

Таблиця 1 Спектральні характеристики сквараїнів у фосфатному буфері pH 7.4, в комплексах з BSA (90 мкМ) та в кон'югатах з BSA та IgG (D/P¹ = 1)

¹Число молекул барвника, пов'язаних з молекулою протеїну (Dye-to-Protein Ratio)

У той час як параметри флуоресценції ціанінів при утворенні комплексів (барвник + BSA) та кон'югатів (барвник-BSA) з протеїнами практично не змінюються, інтенсивність, квантові виходи та часи життя флуоресценції сквараїнів суттєво зростають (табл. 1, 2), що робить їх більш переважними біоаналітичними реагентами. Сквараїни демонструють різну чутливість до макромолекул та різний динамічний діапазон концентрацій протеїнів, які вони можуть визначати. Встановлено, що покращення водорозчинності сквараїнів шляхом збільшення кількості сульфогруп знижує чутливість їх параметрів флуоресценції до комплексоутворення з макромолекулами. Для підвищення чутливості можна не тільки зменшувати кількість сульфогруп, але й збільшувати полярність молекул, зокрема, заміщенням сквараїнового атому кисню іншим атомом або групою. При зв'язуванні з протеїнами поляризація флуоресценції збільшується (табл. 3).

Таблиця 2 Часи життя флуоресценції () сквараїнів, їх комплексів та кон'югатів

Ще однією перевагою сквараїнів як біоаналітичних реагентів є їх краща фотостабільність у порівнянні з ціанінами. Фотостабільність зростає в ряду: ціаніни < оксо- (K8-16xx) < тіо- (K8-12xx) < барбітурові (K8-17xx) < диціанометиленові (K8-13xx) сквараїни, а також при збільшенні кількості сульфогруп, що перешкоджає агрегації молекул барвників, та при ковалентному зв'язуванні з макромолекулами (протеїнами).

Таким чином, довгохвильові сквараїнові барвники мають певні переваги як біоаналітичні реагенти, бо дозволяють збільшити чутливість та достовірність вимірювання завдяки високої чутливості інтенсивності, поляризації та часу життя флуоресценції до мікрооточення, можливості використання часів життя флуоресценції як параметру детекції, можливості зменшити вплив джерела збудження на сигнал реєстрації та завдяки підвищеній фотостабільності.

Таблиця 3 Поляризація флуоресценції барвників та кон'югатів

Імунофлуоресцентне визначення вмісту низькомолекулярних антигенів на прикладі біотину

Імуноаналітичні методи дозволяють визначати будь-які сполуки, що викликають генерацію антитіл імунною системою людини чи тварин. Існуючі методи гомогенного імунофлуоресцентного аналізу засновано, як правило, на реєстрації зміни ефективності безвипромінювального переносу енергії (FRET) між двома барвниками (донором та акцептором енергії), один з яких зв'язаний з антитілом (Ab), а інший -- з антигеном (Ag). Використання двох барвників-реагентів ускладнює та уповільнює проведення аналізу, бо вимагає проведення процедур зв'язування обох барвників. Досліджені сквараїни при зв'язуванні з IgG демонструють істотні зміни квантових виходів та часів життя флуоресценції, що робить їх потенційними кандидатами для розробки методів флуоресцентного імуноаналізу з використанням лише одного барвника.

У дисертації запропоновано проводити імунофлуоресцентний аналіз з використанням флуоресцентного реагенту -- кон'югату сквараїну К8-1661 з антигеном-біотином. Цей барвник демонструє найбільший діапазон змін квантового виходу і часу життя флуоресценції при зв'язуванні з модельним антитілом -- IgG. Для розробки імуноаналізу проведено титрування реагенту з постійною концентрацією 0.65 мкМ специфічним антитілом -- антибіотином, а для контролю -- неспецифічним антитілом -- IgG бика. У кон'югаті з біотином (MW 244 Да) барвник K8-1661 має час життя () 0.66 нс та поляризацію (P) 0.275±0.002. При титруванні специфічним антитілом (анти-біотином, MW 160 кДа) досягає свого максимального значення 1.82 нс, тобто спостерігається зростання в 2.8 рази, а поляризація збільшується до 0.420±0.002, тобто у 1.5 рази. На підставі цих даних визначено діапазон змін параметрів флуоресценції при зв'язуванні антитіла (антибіотину) з реагентом. Максимальне значення інтенсивності, поляризації та часу життя флуоресценції відповідає одному й тому ж співвідношенню концентрацій антитіла і реагенту, а саме 1.2. Зниження цієї величини зменшує точність вимірювання, а збільшення -- погіршує нижню концентраційну межу визначення біоаналіту.

З використанням знайденого співвідношення отримано градуювальні залежності, встановлено межу виявлення (0.1 мкМ) та стандартні відхилення для визначення невідомого вмісту біотину. При цьому були використані два різних підходи до проведення імунореакції. Перший підхід засновано на конкурентній взаємодії антитіла з реагентом та антигеном-аналітом (біотином): до серії розчинів з постійним вмістом реагенту (0.65 мкМ) та змінним вмістом вільного антигену-біотину (0-10 мкМ) додавали розчин антитіла-антибіотину (0.65 мкМ) та вимірювали інтенсивність, поляризацію та час життя флуоресценції. В іншому підході, суміш антитіла-антибіотину (0.65 мкМ) з реагентом (0.65 мкМ) титрували вільним антигеном-аналітом (біотином). Отримані двома методами градуювальні залежності виявилися однаковими у межах похибки вимірювань. Тому для побудови градуювальних залежностей при розробці конкретних методик імунофлуоресцентного визначення низькомолекулярних антигенів рекомендується використовувати цей другий підхід, який потребує меншої витрати кошторисних та важкодоступних специфічних антитіл.

Продемонстрований підхід до проведення імуноаналізу з використанням лише одного барвника (K8-1661) може бути без обмежень застосовано до визначення будь-яких інших низькомолекулярних (<5 кДа) аналітів за умови доступності відповідних специфічних антитіл. Запропонована методологія є придатною для вимірювання інтенсивності та поляризації, але має найбільші переваги при застосуванні часів життя флуоресценції, як параметру реєстрації.

Флуоресцентне визначення вмісту біотину реакцією з авідином

Завдяки надзвичайно високій спорідненості біотину до авідину, їх комплекс часто використовується у різноманітних біоаналітичних методах. Існуючі авідин-біотинові методи засновано на переносі енергії (FRET) від флуоресцентного реагенту на інший барвник. Недоліком цих методів є багатостадійність, пов'язана з використанням двох барвників-реагентів. Для спрощення авідин-біотинових методів продемонстровано можливість визначення біотину реакцією з авідином на основі реєстрації змін часу життя флуоресценції лише одного реагенту -- кон'югату сквараїна K8-1661 з біотином. В основу визначення покладено конкуренцію цього флуоресцентного реагенту та біотину-аналіту за місця зв'язування на молекулі авідину.

При розробці цього методу було встановлено, що порядок додавання реагентів впливає на результат аналізу, а саме: при одноразовому додаванні надлишку авідину до реагенту час життя флуоресценції () зростає в 2.7 рази та сягає 1.78 нс, а інтенсивність флуоресценції зростає в 1.4 рази; при титруванні реагенту авідином час життя зростає до 1.10 нс, а інтенсивність зменшується в 2.9 рази; при титруванні авідину реагентом час життя зменшується з 1.78 нс до 1.10 нс, а інтенсивність флуоресценції зростає. В умовах надлишку реагенту флуоресцентні характеристики комплексів, отриманих цими двома шляхами, співпадають між собою у межах похибки вимірювання.

Такий ефект пояснюється різним характером розподілу молекул флуоресцентного реагенту по чотирьом можливим місцям зв'язування на молекулі авідину і, відповідно, різним ступенем концентраційного гасіння флуоресценції. Найменше гасіння досягається за схемою, коли середньостатистична відстань (R) між молекулами барвника є максимальною. Таким чином, для зменшення небажаного ефекту гасіння та збільшення динамічного діапазону змін параметру флуоресценції при отриманні градуювальних залежностей необхідно забезпечити утворення комплексу складу 1:1, а при проведенні авідин-біотинового аналізу додавати авідин до суміші аналіту з реагентом.

Варіюванням концентрацій флуоресцентного реагенту та біотину при постійній концентрації авідину встановлено, що оптимальне співвідношення реагенту та авідину, яке забезпечує найбільшу чутливість визначення, дорівнює одиниці. З використанням цього співвідношення, конкурентною взаємодією біотину-аналіту та реагенту з авідином одержано градуювальні залежності для інтенсивності та часу життя флуоресценції для визначення невідомого вмісту біотину. Згідно з отриманими градуювальними залежностями зміни інтенсивності не можуть бути застосовані для визначення біотину, бо одному й тому ж значенню інтенсивності відповідає декілька значень концентрацій біотину. У той же час біотин можна визначати вимірюванням часу життя флуоресценції з межею виявлення 0.1 мкМ. Запропонована методологія може використовуватися як більш чутлива альтернатива імуноферментному аналізу та може бути застосована в різноманітних флуоресцентних, у тому числі імунофлуоресцентних, визначеннях низькомолекулярних та високомолекулярних аналітів замість більш складних методів, заснованих на переносі енергії (FRET) між двома реагентами.

Гібридизаційний аналіз олігонуклеотидів, заснований на вимірюванні часів життя флуоресценції

Гібридизаційний аналіз, що засновано на реакції гібридизації, тобто на селективному зв'язуванні комплементарних пар олігонуклеотидів (Оліго-1 і Оліго-2), широко застосовується для визначення невідомих олігонуклеотидів та їх концентрацій. Існуючі гібридизаційні аналізи, як правило, використовують перенос енергії (FRET) з донору, ковалентно зв'язаного з Оліго-1, на акцептор, зв'язаний з комплементарним Оліго-2. Для спрощення та прискорення визначення олігонуклеотидів в дисертації запропоновано метод, який засновано на вимірюванні часу життя флуоресценції з застосуванням лише одного флуоресцентного реагенту -- кон'югату сквараїну К8-1340 з олігонуклеотидом. У протилежність до розглянутого вище імунофлуоресцентного та авідин-біотинового аналізу, цей метод вимагає надзвичайної чутливості барвника до мікрооточення, що пов'язано з низькою молекулярною масою олігонуклеотидів. Але проведені дослідження показали, що навіть найбільш чутливі сквараїни, такі як К8-1340, не забезпечили необхідних змін параметрів флуоресценції при гібридизації. Для збільшення чутливості реагенту було змінено його мікрооточення, що досягалося застосуванням міцел, утворених Тритоном Х-100, або протеїну (BSA). При цьому час життя флуоресценції (ф) збільшився з 2.20 нс до 3.25 нс. При наступному додаванні аналіту (Оліго-2) та за умов комплементарної взаємодії реагент (кон'югат К8-1340 з Оліго-1) виходить з міцели, що скорочує ф до 2.50 нс. Такої зміни часу життя виявилося цілком достатньо для розробки гібридизаційних методів визначення олігонуклеотидів.

Для запропонованого гібридизаційного методу побудовано градуювальні залежності для визначення невідомого вмісту Оліго-2 при різних концентраціях флуоресцентного реагенту. З цих залежностей видно, що запропонований підхід при обраних в якості прикладу концентраціях реагентів забезпечує достовірне визначення олігонуклеотиду з межею виявлення 0.02 мкM.

Таким чином, на прикладах імуноаналізу, біотин-авідинової взаємодії та гібридизаційного аналізу запропоновано методологічний підхід до визначення низькомолекулярних та високомолекулярних біоаналітів, заснований на вимірюванні часів життя флуоресценції довгохвильових сквараїнів. На відміну від інших флуоресцентних методів цей підхід застосовує тільки один флуоресцентний реагент, що дозволяє спростити та прискорити проведення аналізу.

Рекомендації щодо застосування сквараїнових барвників

Встановлено, що найбільш універсальними флуоресцентними реагентами є високостабільні сквараїнові барвники, що мають високі квантові виходи, коефіцієнти екстинкції та час життя флуоресценції у водних розчинах. До таких барвників належать оксосквараїни K8-1600, K8-1660, K8-1661 і K8-1680, барбітурові сквараїни K8-1751, K8-1760 і K8-1780 та диціанометиленові сквараїни K8-1300 і K8-1340. Їх можна використовувати у багатьох біоаналітичних та медико-біологичних застосуваннях як більш яскраві та більш стабільні аналоги інших комерційно доступних барвників, таких як Cy5, Cy5.5 та Alexa 647. Завдяки підвищеній яскравості та стабільності вони забезпечують кращу чутливість та достовірність визначення, особливо при малих концентраціях біоаналітів.

Для розробки методик флуоресцентного визначення, заснованих на реєстрації інтенсивності флуоресценції, найбільш перспективними є оксо-, тіо- та барбітурові сквараїни K8-1260, K8-1600, K8-1661, K8-1680, K8-1751 та K8-1760, які демонструють найбільші діапазони змін цього параметру при взаємодії як з гідрофобними, так і з гідрофільними макромолекулами. Ці барвники можна рекомендувати, зокрема, як флуоресцентні реагенти для визначення різноманітних протеїнів та антитіл. Диціанометиленові сквараїни, такі як K8-1300, K8-1350 і K8-1351, демонструють значні зміни часів життя флуоресценції при зміні мікрооточення, що дозволяє використовувати їх як біоаналітичні реагенти у флуоресцентних аналізах, заснованих на вимірюванні часу життя флуоресценції. Для методик, заснованих на поляризаційних вимірюваннях, найбільш придатними є норсквараїни K8-1665, K8-1675, K8-1405, K8-1365, K8-1375, K8-1765 и K8-1775. У вільному стані вони мають невеликі значення поляризації, які суттєво зростають при зв'язуванні з високомолекулярними сполуками (табл. 3). Для застосування у якості нековалентних зондів для визначення вмісту протеїнів можна рекомендувати диціанометиленові сквараїни K8-1350, K8-1300 та K8-1351, що відрізняються високою чутливістю параметрів флуоресценції до присутності макромолекул.

Висновки

Вирішено наукову проблему щодо з'ясування можливості використання нових довгохвильових сквараїнових барвників як флуоресцентних біоаналітичних реагентів для збільшення чутливості та достовірності флуоресцентного визначення біоаналітів. Розроблені флуоресцентні реагенти та методологічні підходи, засновані на вимірюванні їх часів життя флуоресценції, запропоновано для створення нових високочутливих та високодостовірних методів та методик флуоресцентного визначення низькомолекулярних та високомолекулярних біоаналітів. Ці реагенти та методології можна застосовувати у клінічній діагностиці, медико-біологічних дослідженнях, в біології, аналітичній хімії, біохімії, при аналізі харчових продуктів, моніторингу біологічного та хімічного забруднення навколишнього середовища.

Довгохвильові сквараїнові барвники завдяки своєму спектральному діапазону, високій яскравості, фотостабільності та чутливості інтенсивності, поляризації та часу життя флуоресценції до мікрооточення є перспективними біоаналітичними реагентами для флуоресцентного визначення біоаналітів. Ці барвники дозволяють збільшити чутливість та достовірність біоаналітичних методик, особливо при використанні часів життя флуоресценції як параметру вимірювань.

Підвищення достовірності результатів визначення біоаналітів у присутності інших, заважаючих біомолекул, може бути досягнуто зниженням чутливості сквараїнових барвників до нековалентних взаємодій (комплексоутворення), зокрема, покращенням їх водорозчинності.

Для підвищення чутливості параметрів флуоресценції сквараїнових барвників до полярності мікрооточення та присутності макромолекул рекомендується збільшувати полярність їх молекул, зокрема, шляхом заміщення сквараїнового атому кисню іншим атомом або групою.

Запропоновано методологічний підхід до визначення низькомолекулярних та високомолекулярних біоаналітів, заснований на вимірюванні часів життя флуоресценції довгохвильових сквараїнових барвників, який на відміну від методів, що використовують флуоресцентний резонансний перенос енергії між двома барвниками (FRET), застосовує тільки один флуоресцентний реагент. Новий підхід дозволяє спростити та прискорити проведення аналізу.

Розроблено метод визначення вмісту біотину реакцією з авідином та імунофлуоресцентний аналіз, що засновані на вимірюванні часів життя флуоресценції довгохвильового сквараїнового барвника К8-1661.

Розроблено гібридизаційний метод визначення олігонуклеотидів, заснований на вимірюванні часу життя флуоресценції довгохвильового сквараїнового барвника К8-1340 у міцелярному або протеїновому середовищі.

Список публикацій автора за темою дисертації

Synthesis of water-soluble, ring-substituted squaraine dyes and their evaluation as fluorescent probes and labels / A. L. Tatarets, I. A. Fedyunyayeva, T. S. Dyubko, Ye. A. Povrozin, A. O. Doroshenko, E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker // Anal. Chim. Acta. - 2006. - V. 570, No. 2. - P. 214-223. (Здобувачем виконано синтез кон'югатів барвників, спектральні та фотофізичні дослідження, обговорення результатів).

Fluorescent probes and labels for biomedical applications / L. Patsenker, A. Tatarets, O. Kolosova, O. Obukhova, Ye. Povrozin, I. Fedyunyayeva, I. Yermolenko, E. Terpetschnig // Ann. New York Acad. Sci. - 2008. - V. 1130. - P. 179-187. (Здобувачем виконано синтез кон'югатів барвників, спектральні дослідження, аналіз отриманих даних).

Near-infrared, dual-ratiometric fluorescent label for measurement of pH / Ye. A. Povrozin, L. I. Markova, A. L. Tatarets, V. I. Sidorov, E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker // Anal. Biochem. - 2009. - V. 390. - P. 136-140. (Здобувачем виконано синтез кон'югатів барвників, спектральні дослідження, обговорення результатів).

Seta-633 - A NIR Fluorescence Lifetime Label for Low-Molecular-Weight Analytes / Ye. A. Povrozin, O. S. Kolosova, O. M. Obukhova, A. L. Tatarets, V. I. Sidorov, E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker // Bioconjugate Chem. - 2009. - V. 20 - P. 1807-1812. (Здобувачем запропоновано підхід до проведення імуноаналізу низькомолекулярних антигенів, виконано синтез кон'югатів барвників, спектральні дослідження, обговорення результатів,).

Пат. PCT/US2008/001274, МПК (2006.01) C12Q. Luminescent compounds / E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker, A. Tatarets, A. Klochko, Yu. Kudryavtseva, E. Povrozin - WO 2008/094637; заявл. 30.01.2008; опубл. 07.08.2008. (Здобувачем виконано синтез кон'югатів барвників, спектральні дослідження, аналіз та обговорення результатів).

Пат. 12/512972 США, A61K 49/00, C07D 471/22, C07D 495/14. Luminescent Compounds / E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker, O. Klochko, Yu. Kudriavtseva, A. L. Tatarets, I. G. Yermolenko, Ye. A. Povrozin - US 2010/0266507 A1; заявл. 30.07.2009; опубл. 21.10.2010. (Здобувачем виконано синтез кон'югатів барвників, спектральні дослідження, аналіз та обговорення результатів).

Новые флуоресцентные красители для исследования биомембран с помощью длинноволновых полупроводниковых лазеров / Е. А. Поврозин, А. Л. Татарец, Э. А. Терпечниг, Т. С. Дюбко, Л. Д. Паценкер // XXI Международная научно-практическая конференция "Применение лазеров в медицине и биологии", междунар. конф., 26-29 мая 2004 г.: тезисы докл. - Одесса, 2004. - C. 131.

Новые длинноволновые флуоресцентные зонды для исследования белков / А. Л. Татарец, Е. А. Поврозин, Т. С. Дюбко, Э. А. Терпечниг, Л. Д. Паценкер // XXI Международная научно-практическая конференция "Применение лазеров в медицине и биологии", междунар. конф., 26-29 мая 2004 г.: тезисы докл. - Одесса, 2004. - C. 134.

New squarylium labels for biomedical assays / L. D. Patsenker, O. S. Kolosova, A. L. Tatarets, Ye. A. Povrozin, Ye. N. Obukhova, I. G. Yermolenko, E. A. Terpetschnig // Methods and Applications of Fluorescence MAF9: 9 Intern. Conf., 4-7 September 2005: book of abstr. - Lisbon, Portugal, 2005. - P. 203.

Advanced fluorescent materials for biomedical applications / L. Patsenker, E. Terpetschnig, B. Krasovitskii, O. Kolosova, I. Fedyunyayeva, A. Tatarets, Ye. Povrozin, I. Yermolenko // Modern physical chemistry for advanced materials: intern. conf., 26-30 June 2007: book of abstr. - Kharkiv, 2007. - P. 105-106.

Photo-induced hydrolysis of thiosquarylium dyes / A. Tatarets, O. Kolosova, Ye. Povrozin, Ye. Obukhova, I. Fedyunyayeva, E. Terpetschnig, L. Patsenker // Modern physical chemistry for advanced materials: intern. conf., 26-30 June 2007: book of abstr. - Kharkiv, 2007. - P. 350-351.

New fluorescent probes and labels for biomedical applications / O. Kolosova, L. Patsenker, E. Terpetschnig, I. Fedyunyayeva, A. Tatarets, Ye. Povrozin, I. Yermolenko, Yu. Kudryavtseva // Photonics North: intern. conf., 4-6 June 2007: book of abstr. - Ottawa, Canada, 2007. - P. 68.

Thiosquarylium Dyes as High-Photostable Biomedical Markers / A. Tatarets, O. Kolosova, Ye. Povrozin, E. Obukhova, I. Fedyunyayeva, E. Terpetschnig, L. Patsenker // Photonics North: intern. conf., 4-6 June 2007: book of abstr. - Ottawa, Canada, 2007. - P. 83.

Thiosquarylium Dyes as Highly-Photostable Biomedical Markers / Ye. Obukhova, A. Tatarets, O. Kolosova, Ye. Povrozin, I. Fedyunyayeva, E. Terpetschnig, L. Patsenker. // Methods and Applications of Fluorescence MAF10: 10 Intern. Conf., 9-12 September 2007: book of abstr. - Salzburg, Austria, 2007. - P. 121.

Water-soluble, pH-sensitive Fluorescent Labels Based on Squaraine Dyes / O. Kolosova, A. Tatarets, Ye. Obukhova, Ye. Povrozin, V. Sidorov, L. Markova, E. Terpetschnig, L. Patsenker // Methods and Applications of Fluorescence MAF10: 10 Intern. Conf., 9-12 September 2007: book of abstr. - Salzburg, Austria, 2007. - P. 123.

Fluorescent Probes and Labels for Biomedical Applications / L. Patsenker, O. Kolosova, A. Tatarets, I. Fedyunyayeva, Ye. Povrozin, I. Yermolenko, Yu. Kudryavtseva, E. Terpetschnig // Methods and Applications of Fluorescence MAF10: 10 Intern. Conf., 9-12 September 2007: book of abstr. - Salzburg, Austria, 2007. - P. 154.

Dicyanomethylene squarylium dyes as fluorescent probes for serum albumins / A. Tatarets, Ye. Povrozin, O. Obukhova, I. Fedyunyayeva, L. Patsenker, E. Terpetschnig // Supramolecular and NanoChemistry: Toward Applications: International Symposium, 25-29 August 2008: book of abstr. - Kharkov, 2008. - P. 2-9.

Маркова Л. И. Скварилиевые красители на основе 2,3-диметил-3-(4-сульфобутил)-3H-5-индолсульфоновой кислоты / Л. И. Маркова, Е. А. Поврозин, О. С. Колосова // 6 Всеукраїнська конференція молодих вчених та студентів з актуальних питань хімії: всеукр. конф., 3-6 червня 2008 р.: тези доп. - Харків, 2008. - С. 67.

Длинноволновые метчики с повышенной водорастворимостью на основе полиметиновых красителей / Л. И. Маркова, Е. А. Поврозин, И. А. Федюняева, О. А. Соколик, Л. Д. Паценкер // Сучасне матеріалознавство. Матеріали та технології: Всеукраїнська конференція молодих вчених, 12-14 листопада 2008 р.: тези доп. - Київ, 2008. - С. 127.

Long-Wavelength Dye Seta-633 for Fluorescence Lifetime (FLT) Immunoassay / Ye. A. Povrozin, O. S. Kolosova, A. L. Tatarets, O. M. Obukhova, V. I. Sidorov, E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker // Supramolecular Systems in Chemistry and Biology: V International Symposium, 12-16 May 2009: book of abstr. - Kyiv, 2009. - P. 167.

Squarylium Dyes With Substituted Cyclobutenone Oxygen Atom: Synthesis, Properties, Application / A. L. Tatarets, I. A. Fedyunyayeva, O. M. Obukhova, Ye. A. Povrozin, S. U. Khabuseva, L. D. Patsenker // Kiеv - Toulouse: V Scientific Joint Conference in Chemistry, 31 May - 4 June 2009: book of abstr. - Kyiv, 2009. - P. 22.

Advanced Fluorescent Probes and Labels for Biomedical Applications / L. Patsenker, A. Tatarets, O. Kolosova, L. Markova, O. Klochko, Ye. Povrozin, I. Fedyunyayeva, I. Yermolenko // Kiеv - Toulouse: V Scientific Joint Conference in Chemistry, 31 May - 4 June 2009: book of abstr. - Kyiv, 2009. - P. 128.

Fluorescence Lifetime Based Hybridization Assay Using the New Long-Wavelength Fluorescent Label Seta-670 / L. D. Patsenker, Ye. A. Povrozin, V. I. Sidorov, A. L. Tatarets, E. A. Terpetschnig // ICP 2009: 24 International Conference on Photochemistry, 19-24 July 2009: book of abstr. - Toledo, Spain, 2009. - P. 430.

Fluorescence Lifetime Immunoassay Using the Long-Wavelength Label Seta-633 / Ye. A. Povrozin, O. S. Kolosova, O. M. Obukhova, A. L. Tatarets, V. I. Sidorov, E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker // Methods and Applications of Fluorescence MAF11: 11 Intern. Conf., 6-9 September 2009: book of abstr. - Budapest, Hungary, 2009. - P. 117.

New Long-wavelength Fluorescent Protein Labels with Advanced Characteristics / O. M. Obukhova, Ye. A. Povrozin, E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker // Methods and Applications of Fluorescence MAF11: 11 Intern. Conf., 6-9 September 2009: book of abstr. - Budapest, Hungary, 2009. - P. 155.

Novel Long-Wavelength Fluorescent dye Seta-633 for Fluorescence Lifetime Imaging of Antigen-Antibody Reactions / Ye. A. Povrozin, O. S. Kolosova, O. M. Obukhova, A. L. Tatarets, V. I. Sidorov, E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker // 2009 WMIC: World Molecular Imaging Congress, 23-26 September 2009: book of abstr. - Montreal, Canada, 2009. - P. 0787.

Synthesis and Spectral Properties of Dicyanomethylene Squaraine Dyes / A. L. Tatarets, O. M. Obukhova, Ye. A. Povrozin, L. D. Patsenker, E. A. Terpetschnig // Chemistry of Nitrogen Containing Heterocycles CNCH-2009: Intern. Conf., 05-09 October 2009: book of abstr. - Kharkiv, 2009. - P. 137.

Количественное определение компонентов комплекса авидин-биотин при помощи длинноволнового сквараинового красителя / Е. А. Поврозин, В. И. Сидоров, А. Л. Татарец, Е. Н. Обухова, Л. Д. Паценкер // ХХІІ Українська конференція з органічної хімії, 20-25 вересня 2010 р.: тези доп. - Ужгород, 2010. - С. 367.

Анотація

Поврозін Є.А. Довгохвильові сквараїнові барвники як флуоресцентні біоаналітичні реагенти. -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.02 -- аналітична хімія. Фізико-хімічний інститут імені О. В. Богатського НАН України, Одеса, 2011.

Проведено систематичне дослідження спектральних, фотофізичних властивостей та фотостабільності довгохвильових сквараїнових барвників у водних середовищах, а також при ковалентному і нековалентному зв'язуванні з біотином та модельними протеїнами -- альбуміном (BSA) та імуноглобуліном (IgG). Встановлено закономірності впливу молекулярної будови сквараїнів на їх характеристики у вільному та зв'язаному з біомолекулами стані. На прикладі біотину, олігонуклеотидів, BSA та IgG показано переваги сквараїнів як біоаналітичних реагентів для визначення низькомолекулярних та високомолекулярних біоаналітів. Розроблено метод визначення вмісту біотину реакцією з авідином та метод імуноаналізу, засновані на змінах часу життя флуоресценції сквараїну К8-1661. Розроблено гібридизаційний метод визначення олігонуклеотидів, заснований на вимірюванні часу життя флуоресценції сквараїну К8-1340 у міцелярному або протеїновому середовищі.

Ключові слова: сквараїни, флуоресцентні реагенти, кон'югати, спектрально-люмінесцентні властивості, медико-біологічні застосування, час життя флуоресценції, біоаналітичні методи.

Аннотация

Поврозин Е.А. Длинноволновые сквараиновые красители как флуоресцентные биоаналитические реагенты. -- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.02 -- аналитическая химия. Физико-химический институт имени А. В. Богатского НАН Украины, Одесса, 2011.

Известным путем повышения чувствительности и достоверности флуоресцентных биоаналитических методов является измерение времени жизни флуоресценции в длинноволновой области спектра, а также улучшение стабильности используемых для измерения красителей-реагентов. Решение этой проблемы сдерживалось отсутствием биоаналитических реагентов с необходимыми характеристиками.

В диссертационной работе в качестве длинноволновых высокостабильных биоаналитических реагентов, пригодных для измерения времен жизни, предложены и исследованы скараиновые красители и их конъюгаты с биомолекулами. Для этого проведен систематический анализ спектрально-люминесцентных, фотофизических и фотохимических свойств сквараинов, их комплексов и ковалентных конъюгатов с протеином (BSA), антителом (IgG), биотином и олигонуклеотидом. Полученные результаты сопоставлены с данными для наилучших коммерчески доступных длинноволновых красителей биоаналитического назначения -- цианинами Cy5 и Alexa 647. Показано, что длинноволновые сквараиновые красители благодаря своему спектральному диапазону, высокой яркости, фотостабильности и чувствительности интенсивности, поляризации и времени жизни флуоресценции к микроокружению являются перспективными аналитическими реагентами для флуоресцентного определения биоаналитов. Эти красители позволяют увеличить чувствительность и достоверность биоаналитических методик, особенно при использовании времени жизни флуоресценции в качестве измеряемого параметра.

Предложен методологический подход к определению низкомолекулярных и высокомолекулярных биоаналитов, основанный на измерении времен жизни флуоресценции длинноволновых сквараинов и использующий, в отличие от других спектральных методов, только один краситель, что п...