Тіамінфосфатгідролазна активність плазматичних мембран нервових клітин
Властивості ензиматичного гідролізу тимидилтрифосфату у фракції плазматичних мембран. Наявність одного загального, двох окремих активних центрів тіамінзв’язувального білка. Вплив етанолу, ацетальдегіду на реакцію гідролізу в щурів з моделлю алкоголізму.
| Рубрика | Химия |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 11.08.2015 |
| Размер файла | 414,0 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
[Введите текст]
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В.ПАЛЛАДІНА
УДК 577.152.3 +577.164.1
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Тіамінфосфатгідролазна активність плазматичних мембран нервових клітин
03.00.04 - біохімія
Строкіна Анастасія Олександрівна
Київ - 2011
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (м. Київ).
Науковий керівник -
доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник
Пархоменко Юлія Михайлівна,
провідний науковий співробітник
відділу біохімії коферментів
Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор
Матишевська Ольга Павлівна,
професор кафедри біохімії
Київського національного університету
імені Тараса Шевченка;
доктор хімічних наук, професор, член-кореспондент НАН України
Вовк Андрій Іванович,
завідувач відділу механізмів біоорганічних реакцій
Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.
Захист відбудеться 21 березня 2011 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії
ім. О.В.Палладіна НАН України (м. Київ, вул. Леонтовича, 9).
Автореферат розіслано 17 лютого 2011 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук О.В. Кірсенко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Висока чутливість нервової тканини до дефіциту вітаміну В1 (тіаміну), яку виявилось неможливим пояснити лише з позиції участі тіаміндифосфату (ТДФ) як коферменту ряду ензимів вуглеводного обміну, стала причиною зародження гіпотези щодо існування специфічної “нейротропної” функції цього вітаміну. Пошуки, так званих, “некоферментних” механізмів участі тіаміну в клітинному метаболізмі були ініційовані відкриттям того факту, що при вродженому генетичному захворюванні - “хворобі Лея” (або зверхнекротизуючої енцефаломіелопатії) - спостерігалось гальмування в мозку синтезу тіамінтрифосфату (ТТФ), похідного тіаміну, роль якого в клітинах до цього часу остаточно не з'ясовано [Plaitakis A. et al., 1977; Haas R.H., 1988].
Подальші дослідження додали доказів щодо існування у вітаміну В1 функцій, окремих від його коферментної функції, але вони ще й навели на думку, що не наявність якихось унікальних тіамінзалежних біохімічних процесів в нервових клітинах, а саме особливості їх структурно-функціональної організації є причиною високої чутливості нервових клітин до дефіциту вітаміну В1 [Пархоменко Ю.М. и др., 1996]. В цьому аспекті цікавими є наступні факти. Було показано участь ТТФ та ТДФ у регуляції активності піруватдегідрогеназного комплексу та, відповідно, синтезу попередника ацетилхоліну - ацетил-СоА [Пархоменко Ю.М. и др., 1996]. Виявилось, що за одних і тих же симптомів хвороба Лея може бути викликана декількома причинами, зокрема, крім вже згаданої, дефектами в генах, що кодують протеїнові компоненти піруватдегідрогеназного комплексу або його регуляторні ензими [Haas R.H., 1988]. Оскільки ТТФ є макроергічною сполукою, було зроблено припущення, що він може бути донором фосфату в фосфорилюванні деяких протеїнів; один із таких субстратів було нарешті знайдено - це протеїн (рапсин) ацетилхолінового рецептора [Nghiem H. O. et al., 2000], але, можна припустити, він є не єдиним. На підставі спостережень декількох груп вчених було зроблено припущення про існування в нервових клітинах рухомого пулу тіаміну і його фосфатів, циркуляція якого між внутрішньоклітинним простором і пресинаптичною щілиною спряжена зі змінами мембранного потенціалу нервової клітини [Bettendorff L., 1996; Itokawa Y., 1996; Пархоменко Ю.М. и др., 1996]. В цьому аспекті привертає увагу тіамінзв'язувальний білок (ТЗБ), який було вперше ізольовано і частково охарактеризовано у відділі біохімії коферментів Інституту біохімії НАНУ [Постоенко В.А. и др., 1987]. Досліджено, що ізольований ТЗБ складається із двох різних за молекулярною масою субодиниць (Янчій О.Р. та ін., 2001) і є біфункціональним: поряд із здатністю специфічно зв'язувати тіамін, він вибірково гідролізує його фосфорні ефіри, найбільш активно - ТТФ. Здатність ТЗБ, локалізованого в плазматичній мембрані нервових клітин [Пархоменко Ю.М. и др., 2001], вибірково гідролізувати фосфорні ефіри тіаміну співпадає з ранніми спостереженнями в дослідах in situ, які свідчать, що із нервових препаратів при збудженні вивільнюється в середовище вільний тіамін, в той час як у внутрішньоклітинному пулі похідних тіаміну превалюють його фосфорні ефіри [Muralt A., 1958], тобто при проходженні через мембрану останні мають бути дефосфорильовані. На підставі вищесказаного можна зробити припущення, що ТЗБ є однією із ключових ланок в функціонуванні рухомого пулу тіаміну, яка опосередковує перенесення тіаміну через збудливу мембрану в обох напрямках.
Слід зазначити, що ТЗБ було ізольовано раніше, ніж відкрито ген транспортеру тіаміну. Останній було відкрито у зв'язку з розшифруванням етіології летального захворювання - тіамінзалежної мегалобластичної анемії. Виявилося, що це захворювання викликано дефектом в гені Slc19a2, який кодує протеїн - транспортер тіаміну [Fleming J.C. et al., 1999; Labay V. et al., 1999; Eudy J. D. et al., 2000; Gritli S. et al., 2001; Liberman M.C. et al., 2006]. Це відкриття дало можливість одержати рекомбінантний транспортер тіаміну [Oishi K. et al., 2001; Rajgopal A. et al., 2001; Said H.M. et al., 2004]. Згідно з описом властивостей рекомбінантного протеїну, він за молекулярною масою майже вдвічі менший від ТЗБ, ізольованого в Інституті біохімії НАНУ. Питання щодо того, чи є одна з субодиниць ТЗБ транспортером тіаміну або протеїном, гомологічним до нього, а також щодо функції другої субодиниці ТЗБ залишається відкритим.
На нашу думку, з'ясування структурно-функціональної організації ТЗБ в плазматичній мембрані нервових клітин та ролі і властивостей його ензиматичної (зокрема, ТТФазної) активності є важливим етапом дослідження особливостей обміну тіаміну в нервових клітинах і в цілому - ролі вітаміну В1 у функціонуванні збудливих мембран.
Актуальність таких досліджень обумовлена тим, що різного походження функціональні порушення тіамінзалежних процесів в нервових клітинах є одним із важливих патогенетичних або обтяжуючих факторів таких захворювань, як вже згадана зверхнекротизуюча енцефаломіелопатія (хвороба Лея), синдром Верніке-Корсакова - часте захворювання при хронічному алкоголізмі, хвороби Альцгеймера, Паркінсона та деяких інших [Cooper J.R. et al., 1972; Kril J.J., 1996; Heap L.C. et al., 2002; Butterworth R.F., 2003; Lopez L.C. et al., 2006; Ganesh R. et al., 2009; Harper C., 2009; Mathews L. et al., 2009]. З'ясування вкладу тіамінзалежних процесів у функціонуванні нервових клітин є підґрунтям до пошуку шляхів попередження та лікування вищевказаних захворювань.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, проблема “Біохімія тварин та людини ” (шифр 2.28.4) за бюджетними темами: тема №4: № держреєстрації 0102V000628, “Дослідження молекулярних механізмів взаємодії вітамінів, коферментів та їх білків-акцепторів в регуляції внутрішньоклітинного метаболізму в нормі та патології” (2002-2006 рр.), № держреєстрації 0107U003251, “Дослідження молекулярних механізмів реалізації біологічної ролі вітамінів та їх специфічних білків-акцепторів у забезпеченні функціонування та життєздатності клітин за норми та за умов деяких патологій” (2007-2011 рр.); тема № 15: № держреєстрації 0107V007187, “Дослідити роль білків в реалізації специфічних клітинних функцій вітамінів В1, РР та Е за різних метаболічних станів” (2007 -
2011 рр.); проект ДФФД МОН України, № держреєстрації 0109V005634, “Характеристика молекулярних механізмів дії вітаміну В1 та його похідних на метаболізм і проведення сигналу в нервовій тканині” (2009-2010 рр.).
Мета і завдання дослідження. Метою роботи є дослідження особливостей структурно-функціональної організації мембранозв'язаної тіамінфосфатгідролази як фрагменту ТЗБ у складі плазматичних мембран нервових клітин.
Оскільки протеїн, відповідальний за тіамінфосфатгідролазну активність в мембранах, найактивніше гідролізує ТТФ, і саме для визначення цієї активності відпрацьовано високочутливий і високоспецифічний метод, далі йдеться про гідроліз ТТФ і, відповідно, ТТФазну активність.
Відповідно до мети були поставлені наступні завдання:
1. Дослідити властивості ензиматичного гідролізу ТТФ у фракції плазматичних мембран синаптосом та провести порівняльний аналіз протеїнів, які виявляють ТТФазну активність.
2. Визначити локалізацію активного центру протеїну з ТТФазною активністю в плазматичній мембрані нервової клітини.
3. Із використанням специфічних похідних тіаміну визначити наявність одного загального чи двох окремих активних центрів тіамінзв'язувального білка у складі плазматичних мембран синаптосом (ПМС), відповідальних за зв'язування тіаміну ПМС та реакцію ензиматичного гідролізу ТТФ.
4. За допомогою поліклональних антитіл, специфічних до цитозольної ТТФази, дослідити можливу гомологію між цим протеїном та мембранозв'язаною ТТФазою, що досліджувалася у складі тіамінзв'язувального білка ПМС.
5. На щурах з моделлю хронічного алкоголізму дослідити вплив етанолу (в дослідах in vivo) та етанолу і ацетальдегіду (в дослідах in vitro) на властивості реакції ензиматичного гідролізу ТТФ у фракції плазматичних мембран синаптосом.
Об'єкт дослідження. Ензиматичний гідроліз ТТФ плазматичною мембраною нервових клітин та тіамінзв'язувальним білком.
Предмет дослідження. Структурно-функціональна організація протеїну, відповідального за гідроліз ТТФ в плазматичних мембранах синаптосом, та тіамінзв'язувального білку, локалізованого в цих мембранах.
Методи дослідження. У роботі були застосовані методи препаративної біохімії, молекулярної біології, біохімічної мембранології, ензимології, спектрофотометрії, хімічної та біохімічної кінетики, а також статистичного аналізу.
Наукова новизна одержаних результатів. Показано, що активний центр протеїну з ТТФазною активністю в ПМС локалізовано з цитоплазматичного боку мембрани. За результатами експериментів з дослідження впливу специфічних похідних тіаміну (ампроліум, окситіамін та піритіамін) на обидві активності, які виявляє тіамінзв'язувальний білок, запропоновано існування двох відмінних активних центрів на цьому протеїні у складі ПМС, відповідальних за зв'язування тіаміну та гідроліз ТТФ. Вперше продемонстровано, що ТЗБ, а саме, одна з його субодиниць (35 кДа), і є мембранозв'язаною ТТФазою плазматичних мембран нервових клітин, а також є гомологічною цитозольному ензиму.
Одержані результати розширюють сучасні уявлення щодо властивостей реакції ензиматичного гідролізу ТТФ в плазматичній мембрані нервової клітини та її можливої ролі у функціонуванні ТЗБ в мозку. Експериментальні дані мають значення для подальшого вивчення ролі ТЗБ в реалізації функції тіаміну в нервовій тканині.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані в роботі результати є принципово новою інформацією щодо структурно-функціональної організації в плазматичній мембрані нервових клітин тіамінзв'язувального білка, який є важливою ланкою в обміні тіаміну в нервових клітинах, і наближають нас до розуміння молекулярних механізмів, які лежать в основі реалізації нейротропної дії вітаміну В1. З'ясування цього питання є необхідним для пошуку засобів захисту нервових клітин від дегенеративних змін.
Особистий внесок здобувача. Головна ідея та задачі досліджень були сформульовані науковим керівником - д.б.н. Пархоменко Ю.М. Підбір, систематизація, аналіз та узагальнення відповідних літературних даних було проведено дисертанткою. Деякі експерименти були проведені разом із співробітниками Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, які є співавторами опублікованих робіт. Аналіз експериментальних результатів, їх узагальнення, інтерпретацію, формулювання основних положень і висновків роботи було проведено разом із науковим керівником. Кінетичний і статистичний аналіз експериментальних результатів було здійснено автором дисертації.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладено в дисертації, були заслухані, апробовані та обговорені на таких наукових конференціях: IX Український біохімічний з'їзд (2006 р., Харків, Україна);
VI Парнасівська конференція молекулярних механізмів клітинного сигналювання (2007 р., Краків, Польща); міжнародний консорціум “Регіональна взаємодія здоров'я, науки та технології” (2007 р., Печ, Угорщина); міжнародна наукова конференція “Лікарські засоби та біологічно активні сполуки” (2007 р., Гродно, Білорусь); IV конференція Українського товариства нейронаук (2008 р., Слов'янськ, Україна); конференція молодих вчених Ін-ту біохімії ім. О.В. Палладіна “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології” (2008 р., Київ, Україна); X Український біохімічний з'їзд (2010 р., Одеса, Україна). Результати експериментів неодноразово доповідались та обговорювались на наукових семінарах відділу біохімії коферментів, наукових семінарах та засіданнях Вченої Ради Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (2005-2010 рр.).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті в “Українському біохімічному журналі” та 8 тез доповідей у матеріалах міжнародних та всеукраїнських наукових конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, заключення, висновків та списку використаних літературних джерел із 305 найменувань. Робота викладена на 139 сторінках, містить 3 таблиці та проілюстрована 32 рисунками.
Перелік умовних скорочень. ТДФ - тіаміндифосфат, ТТФ - тіамінтрифосфат, ПМС - плазматична мембрана синаптосом, ТЗБ - тіамінзв'язувальний білок.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В огляді літератури наведено сучасні дані щодо фізико-хімічних властивостей вітаміну В1 та його біологічно активних похідних, ролі їх в клітинному обміні, ензимів, що беруть участь в синтезі та деградації тіаміну і його похідних в живих клітинах, механізмів транспорту тіаміну в клітинах та протеїнів, що беруть участь в цьому процесі. Окремо розглянуто сучасні гіпотези відповідно ролі тіаміну в функціонуванні нервової системи.
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Експериментальні дослідження виконано на самцях білих щурів (маса - 120-200 г). Тварин утримували на стандартному харчовому раціоні віварію, де вони знаходилися в цілому у однакових умовах.
Одержання фракції плазматичних мембран нервових клітин. Фракцію ПМС виділяли з мозку щурів методом диференційного центрифугування у градієнті густини сахарози, як описано раніше [Пархоменко Ю.М. и др., 2001]. Контроль чистоти фракції здійснювали за допомогою електронної мікроскопії та активності маркерних ензимів [Henn S.W. et al., 1982].
Виділення тіамінзв'язувального білка плазматичних мембран синаптосом. ТЗБ з мозку виділяли методом афінної хроматографії [Постоенко В.А. и др., 1987] із модифікаціями. Як афінний сорбент використовували тіамін-N-4-азобензоїл--амінокапроїл-гідразидосефарозу 4В, синтезований за модифікованим методом Кляшицького Б.А. [Кляшицкий Б.А. и др., 1980]. Вміст протеїну визначали за методом Lowry O. та спектрофотометрично при 280 нм.
Визначення ТТФазної активності проводили за накопиченням ТДФ як продукту реакції гідролізу ТТФ. Ензиматичне визначення ТДФ базується на рекомбінації його як коферменту з апопіруватдекарбоксилазою і проведенням реакції з надлишком пірувату в присутності алкогольдегідрогенази [Островський Ю.М., 1979]. ТТФазну активність визначали при 37 єС в стандартному середовищі інкубації (об'єм 0,25 мл) такого складу: 50 мМ трис-HCl буфер pН 7,4, 5 мМ МgCl2, 20-100 мкМ ТТФ. Ензиматичну реакцію ініціювали введенням в середовище інкубації 50 мкл суспензії ПМС (50 мкг протеїну) та зупиняли через 20 хв додаванням 1 мл 0,05 М Na-фосфатного буфера (рН 6,8). Для кількісного визначення утвореного ТДФ 0,1 мл аліквоти інкубували протягом 30 хв при 25 єС в спеціальному середовищі з апопіруватдекарбоксилазою [Островський Ю.М., 1979]. Активність визначали в реакції, спряженій з алкогольдегідрогеназою, за зниженням концентрації NАDН на спектрофотометрі СФ-46, довжина хвилі 340 нм.
Виділення піруватдекарбоксилази та апопіруватдекарбоксилази з пивних дріжджів (Saccharomyces carlsbergensis) проводили за методом, що описаний в роботі [Sieber M. et al., 1983] із модифікаціями.
Визначення Na+,K+-ATP-азної активності. Загальну Na+,K+,Mg2+-залежну ATP-азну активність визначали в середовищі інкубації (об'єм 0,4 мл) наступного складу: 20 мМ HEPES-Трис-буфер (рН 7,4), 3 мМ MgCl2, 130 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 1 мМ ATP, 0,2 мМ ЕДТА, 1,25 мМ дитіотрейтол, 50 мкг протеїну фракції ПМС. Тривалість інкубації - 4 хв при 37°С. Вміст неорганічного фосфату визначали за методом W. Rathbun, V. Betlach [Болдырев А.А., 1977]. Активність Na+,K+-ATP-ази розраховували як різницю між загальною Na+,K+,Mg2+-залежною ATP-азною активністю та Na+,K+,Mg2+-залежною ATP-азною активністю в присутності 1 мМ уабаїну (Mg2+-залежною ATP-азною активністю).
Визначення ацетилхолінестеразної активності проводили з реактивом Еллмана [Ruano M.J. et al., 2000] в середовищі інкубації (об'єм 2,5 мл) такого складу: 0,1 М К-фосфатний буфер (рН 8,0), 0,33 мМ 5,5-дитіо-біс-2-нітробензойна кислота, 0,5 мМ ацетилтіохолін йодид, 50 мкг протеїну суспензії фракції ПМС. Час інкубації - 10 хв при 37°С.
Зв'язування [14С]тіаміну плазматичною мембраною синаптосом. Взаємодію тіаміну з ПМС досліджували за допомогою радіолігандного методу [Cuatrecasas P., 1972]. Визначення тіамінзв'язувальної активності проводили з використанням [тіазол-214C]тіаміну в 0,05 М Рінгер-бікарбонатному буфері, рН 7,4 (125 мМ NaCl, 4,5 мМ КСl, 2,5 мМ СаCl2, 1,3 мМ КН2PО4, 1,3 мМ MgSO4·7H2О, 17,6 мМ NaHCО3, 11 мМ глюкоза). Об'єм iнкубацiйного сеpедовища дорівнював 0,5 мл, концентpацiя [14С]тiамiну в пробі 2-10 мкМ, кількість ПМС по протеїну дорівнювала 0,2 мг. Інкубацію проводили при 37°С протягом 5 хв.
Електрофорез в поліакриламідному гелі проводили за денатуруючих умов з додаванням SDS за методом Laemmli [Laemmli U.K., 1970].
Вестерн-блот аналіз проводили відповідно до стандартного методу “Western blotting” [Burnette W.N., 1981], використовували поліклональні антитіла курча до високо специфічної розчинної цитозольної ТТФази, які одержували за стандартними методиками.
Методи статистичної обробки матеріалу. Одержані дані обробляли статистично з використанням програми Excel 2000. При цьому вірогідність різниці середніх величин (p<0.05) визначали за критерієм t Ст'юдента. Значення p < 0,05 вважали вірогідним.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Дослідження параметрів реакції ензиматичного гідролізу ТТФ препаратами плазматичних мембран синаптосом. На першому етапі роботи охарактеризовано основні параметри реакції ензиматичного гідролізу ТТФ у фракції плазматичних мембран синаптосом. Було одержано куполоподібну залежність між ТТФазною активністю ПМС та значенням рН в діапазоні величин водневого показника 5,0-9,0, найвища ензиматична активність спостерігалась при рН 7,4. Залежність ТТФазної активності у фракції ПМС від концентрації іонів Mg (концентрація ТТФ - 80 мкМ) та ТТФ (концентрація MgCl2 - 5 мМ) відповідає класичному рівнянню Міхаеліса-Ментен. Значення уявної константи активації іонами Mg (KMg) дорівнює 1,9±0,4 мМ, максимальної швидкості за Mg2+ (V0Mg) - 0,50 ± 0,02 нмоль ТДФ/мг протеїну за хв. Відповідно для ТТФ значення константи Міхаеліса (Km) складає 52±7 мкМ, максимальної швидкості за ТТФ (V0max) - 0,51 ± 0,02 нмоль ТДФ/мг протеїну за хв. Проведено порівняльний аналіз відповідних характеристик ензимів, які виявляють здатність до ензиматичного гідролізу ТТФ. Відповідно даних літератури, визначене значення оптимуму рН для ТТФазної активності, асоційованої з препаратами ПМС, співпадає з визначеним раніше для ізольованого ТЗБ мозку щура [Янчий О.Р., 2001] та ближче до рН-оптимуму, визначеному іншими дослідниками для мембранозв'язаного ензиму (6,5-7,2) [Barchi R.L. et al., 1972], і, навпаки, досить істотно відрізняється від рН-оптимуму цитозольного ензиму (8,7-9,5) [Makarchikov A.F. et al., 1992]. Спорідненість до іону Mg ензимів, які виявляють ТТФазну активність, суттєво не відрізняється. Не спостерігається також суттєвої різниці за величинами уявних Km для ТТФазной активності ізольованого ТЗБ, препаратів ПМС та цитозольного ензиму мозку щура. Дані літератури стосовно цього параметру для мембранозв'язаної ТТФази [Barchi R.L. et al., 1972], де використовували малочутливий метод для оцінки активності тіамінтрифосфатазної активності, скоріше за все, не є коректними, оскільки використані авторами концентрації ТТФ не є фізіологічними. Проаналізовано також здатність ТТФаз гідролізувати інші фосфорні ефіри тіаміну. Описувана нами мембранозв'язана ТТФаза, так саме як і ТЗБ, гідролізує всі тіамінфосфати, включаючи ТДФ та ТМФ, причому для ізольованого ТЗБ ця активність є строго вибірковою, він не здатен гідролізувати жодного з відомих нуклеотидтрифосфатів [Пархоменко Ю.М. и др., 1988; Янчий О.Р. и др., 2001], тоді як ізольований цитозольний ензим є строго специфічним тільки до ТТФ [Черникевич И.П. и др., 1998; Makarchikov A.F. et al., 2003]. Для мембранозв'язаної ТТФази, описаної в літературі [Barchi R.L. et al., 1972], яка не була ізольована, абсолютна специфічність до ТТФ, звичайно, не була показана.
Отже, аналіз даних, одержаних у проведених нами дослідженнях на цьому етапі, дозволяє зробити припущення, що ТЗБ є найбільш вірогідним і єдиним носієм тіамінтрифосфатазної активності в плазматичній мембрані нервової клітини.
Визначення внутрішньомембранної локалізації активного центру протеїну, відповідального за ТТФазну активність в ПМС. У визначенні функціональної ролі ензиму важливим є питання стосовно його орієнтації в плазматичній мембрані, а саме локалізація активного центру. У випадку мембранозв'язаної ТТФази в літературі немає таких даних. Було використано метод, описаний раніше [Данилович Г.В., 2005], який базується на визначенні активностей ензимів в ПМС до та після обробки фракції детергентом. Визначаючи збільшення активності маркерних ензимів плазматичної мембрани ацетилхолінестерази (активний центр локалізований на зовнішній поверхні) та уабаїнчутливої Na+,К+-АТР-ази (активний центр локалізований на внутрішній поверхні плазматичної мембрани) після оброблення мембранної фракції розчином дигітоніну (0,005 - 0,2 %), ми кількісно (за вмістом протеїну) охарактеризували топологію мембранних фрагментів. Виявилося, що фракція ПМС на 59±5 % складається з везикул, замкнених цитоплазматичним боком в середину, 9±3 % - везикул, замкнених цитоплазматичною поверхнею назовні, 32±5 % представлені невезикульованими фрагментами. Практично такі ж самі кількісні результати було одержано при тестуванні топології мембранних фрагментів за збагаченням активностей ацетилхолінестерази, уабаїнчутливої Na+,K+-АТР-ази та мембранозв'язаної ТТФази, виходячи з уявлень, що остання має саме цитоплазматичну орієнтацію активного центру. Отже, встановлено, що активний центр ензиму, який відповідає за гідроліз ТТФ в ПМС, має внутрішньоклітинну локалізацію. Локалізація активного центру цього протеїну з цитозольного боку мембрани забезпечує своєрідний кордон для виходу в пресинаптичну щілину фосфорильованих похідних тіаміну, які, потрапляючи в це середовище, можуть спричиняти деполяризацію збудливої мембрани.
Визначення активних центрів на тіамінзв'язувальному білку, відповідальних за зв'язування тіаміну та гідроліз тіамінтрифосфату в плазматичній мембрані синаптосом. З метою знайти відповідь на питання, чи властиві обидві біологічні активності ТЗБ (здатність зв'язувати тіамін та здатність гідролізувати тіамінфосфати) одному і тому ж активному центру (або субодиниці) цього протеїну, чи вони є функцією різних активних центрів або субодиниць, нами було застосовано декілька підходів. На першому етапі було проведено дослідження впливу ТТФ на зв'язування тіаміну ПМС та впливу тіаміну на реакцію ензиматичного гідролізу ТТФ ТЗБ у фракції ПМС. Показано, що ТТФ дозозалежно пригнічує зв'язування тіаміну ПМС за конкурентним типом інгібування. ТТФ з достатньо високою спорідненістю та в концентрації 8 мкМ інгібує зв'язування тіаміну ПМС відносно контролю на 86% та 80% за концентрацій [14C]тіаміну 0,8 мкМ та 1,2 мкМ, відповідно (рис.1). Значення уявної константи інгібування Кi для дії ТТФ на зв'язування тіаміну ПМС складає 2,1±0,1 мкМ.
Рис. 1. Вплив тіамінтрифосфату на зв'язування [14С]тіаміну ПМС за умов зміни концентрації [14C]тіаміну: 1 - 0,8 мкМ; 2 - 1,2 мкМ (а). Лінеаризація одержаних концентраційних кривих (б) у модифікованих координатах Хілла {lg (Ao-A)/(A-Amin); lg ([ТТФ])}, де A - зв'язування тіаміну ПМС у разі наявності в середовищі інкубації ТТФ у відповідній концентрації, A0 та Amin - зв'язування тіаміну за відсутності (“нульова точка”) та у присутності в середовищі інкубації ТТФ у “насичувальній” концентрації відповідно. Дані типового експерименту.
Інгібувальний ефект ТТФ на зв'язування тіаміну з ПМС ще не є доказом того, що тіамінзв'язувальні ділянки на мембрані (і, відповідно, на ТЗБ) є відповідальними і за гідроліз тіамінфосфатів. Ці дані можуть вказувати, зокрема, на спорідненість центрів зв'язування тіаміну не тільки до самого тіаміну, а і до його фосфатів. Тому було досліджено вплив зв'язування тіаміну в діапазоні його концентрацій 0,5-20 мкМ на реакцію ензиматичного гідролізу ТТФ у фракції ПМС.
Показано, що на ізольованих мембранах тіамін не виявляє інгібувальної дії на ТТФазну активність. Навпаки, за концентрацій 0,5-2,5 мкМ тіамін стимулює гідроліз ТТФ в середньому на 49 % відносно контролю, а збільшення концентрації вище 5 мкМ призводить до зниження стимулюючого ефекту ензиматичного гідролізу ТТФ(рис. 2).
Рис. 2. Вплив тіаміну на тіамінтрифосфатазну активність ПМС. За 100 % прийнято ТТФазну активність за відсутності в інкубаційному середовищі тіаміну (M±m, n=6).
Одержані дані дозволяють припустити, що на даному ензимі мають місце два різних активних центри - центр зв'язування з тіаміном та центр, що відповідає за ензиматичний гідроліз ТТФ, взаємодія яких достатньо складно регулюється. Не виключена можливість, що зв'язування тіаміну ТЗБ сприяє конформаційним змінам в активному центрі, відповідальному за ТТФазну активність, що в цілому веде до підвищення цієї активності. На наступному етапі у вирішенні питання, чи дві активності ТЗБ в складі ПМС є результатом функціонування одного і того ж протеїнового центру, чи вони відмінні, ми дослідили вплив специфічних інгібіторів тіаміну (антагоністів): ампроліуму, окситіаміну та піритіаміну на обидві активності, властиві ТЗБ. Крім того, оскільки використані нами похідні тіаміну останнім часом широко використовуються для одержання моделей нейродегенерації [Pfefferbaum A. et al., 2007; Wang X. et al., 2007; Dror V. et al., 2010], важливо було дослідити їх дію на окремі ланки обміну рухомого пулу тіаміну в нервових клітинах, зокрема на функціонування ТЗБ.
Отже показано, що всі досліджувані антагоністи тіаміну інгібують зв'язування тіаміну ПМС. Виявлено, що інгібування залежить від структури антагоніста. Найефективнішим виявився піритіамін, що замість тіазолового фрагменту, який є в молекулі тіаміну, має піридиновий цикл. Максимальний ефект дії цього антагоніста (зниження зв'язування тіаміну ПМС в середньому на 80 %) спостерігається за концентрації 5 мкМ (рис. 3, в). Значення уявної константи інгібування Кі складає 2,0±0,4 мкМ. Ампроліум, який за своєю структурою найменше нагадує тіамін, інгібує зв'язування тіаміну ПМС в середньому на 62 % відносно контролю в концентрації 100 мкМ. (рис. 3, а). Значення Кі дорівнює 36±6 мкМ. Найменш ефективним виявився окситіамін, структура якого відрізняється лише заміною в піримідиновому кільці NH2- на ОН-групу. Максимально ця сполука інгібує зв'язування на 49 % в концентрації 1000 мкМ (рис. 3, б), значення Кі становить 110±20 мкМ.
Рис. 3. Концентраційна залежність впливу ампроліуму (а), окситіаміну (б) та піритіаміну (в) на зв'язування тіаміну ПМС (M±m, n=5) за умови присутності в середовищі інкубації 1,4 мкМ тіаміну.
Результати з впливу антагоністів тіаміну на реакцію ензиматичного гідролізу ТТФ ПМС виявили, що ампроліум взагалі не впливає на ТТФазну активність ТЗБ. Піритіамін, який вважається одним з найсильніших антагоністів тіаміну [Rindi G. et al., 2003; Sudarsan N. et al., 2005; Liu J.Y. et al., 2006; Agyei-Owusu K. et al., 2009] серед досліджених нами речовин, а в наших дослідженнях найбільше інгібує його зв'язування ПМС, реакцію ензиматичного гідролізу ТТФ інгібує з набагато меншою спорідненістю і лише в середньому на 52 % в концентрації 100 мкМ (рис. 4, б). Значення Кі для цього процесу становить 35±8 мкМ, що у 18 разів перевищує цей параметр для зв'язування тіаміну ПМС. Окситіамін інгібує ТТФазну активність максимально на 73 % (рис.4, а), але з дуже низькою спорідненістю, значення Кі складає 620±80 мкМ.
Рис. 4. Концентраційна залежність впливу окситіаміну (а) та піритіаміну (б) на ТТФазну активність у фракції плазматичних мембран синаптосом (M±m, n=5) за умови присутності в середовищі інкубації 80 мкМ ТТФ.
Отже, нами показано, що всі вищевказані антагоністи тіаміну, а також сам ТТФ, з різною спорідненістю (залежно від структури їх молекул) блокують зв'язування тіаміну ПМС, але ефективність інгібування зв'язування тіаміну в жодному випадку не досягає 100%. У зв'язку з тим, що окситіамін та піритіамін (але не ампроліум), на відміну від тіаміну, не тільки не стимулюють, а навпаки, гальмують гідроліз ТТФ, але з дуже низькою спорідненістю (в порівнянні щодо їх впливу на зв'язування тіаміну плазматичною мембраною нервової клітини), можна зробити висновок щодо прямого блокування ними центру ензиму, який відповідає за гідроліз ТТФ. Значення Кі для антагоністів тіаміну, розраховані для обох процесів, які відбуваються за участю ТЗБ ПМС, а саме зв'язування тіаміну та гідроліз ТТФ, вказують, що вони більш афінні саме до центрів зв'язування тіаміну на ПМС, ніж до гідролітичного центру ензиму.
Отже, аналіз одержаних даних дає підстави припустити, що на ТЗБ присутні два окремих центри, один з яких відповідає за специфічне зв'язування тіаміну, інший - за гідролітичну активність тіамінфосфатів (зокрема, ТТФ), які найімовірніше локалізовані на різних його субодиницях (із виявлених двох [Янчий О.Р. и др., 2001]). Можна припустити, що тіамінзв'язувальна активність ТЗБ забезпечує здатність плазматичної мембрани нервової клітини зв'язувати тіамін та транспортувати його всередину клітини, де він фосфорилюється тіамінкіназою, а тіамінфосфатгідролазна активність - здатність плазматичних мембран гідролізувати тіамінфосфати з утворенням вільного тіаміну з подальшим його виходом з клітини при деполяризації.
Порівняльне дослідження (ідентифікація) протеїнів, які виявляють тіамінтрифосфатазну активність в ПМС та цитозолі. Одержані нами дані свідчать, що ТЗБ є найбільш вірогідним і єдиним носієм тіамінтрифосфатазної активності в плазматичних мембранах нервових клітин. Цікавим є питання стосовно того, чи досліджувана мембранозв'язана ТТФаза, яка за нашим припущенням є частиною ТЗБ, подібна до протеїну з такою ж активністю, наявного в цитозолі, чи це є два різні за своєю структурою протеїни. Таким чином, мета наших подальших досліджень полягала у з'ясуванні наявності гомології між досліджуваним нами мембранним протеїном та високо специфічною розчинною цитозольною ТТФазою. Було досліджено вплив поліклональних антитіл, специфічних до цитозольного ензиму на ТТФазну активність у складі ПМС. Виявилось, що обробка ПМС антитілами, специфічними до цитозольної ТТФази з молекулярною масою близько 25 кДа, призводить до зниження ТТФазної активності плазматичних мембран в середньому на 48 % порівняно з контролем (рис. 5).
Рис. 5. Вплив поліклональних антитіл до цитозольної 25 кДа ТТФази на ТТФазну активність ПМС. 100 % - ТТФазна активність за відсутності антитіл (M±m, n=6). * - p<0,05 порівняно з контролем.
Інгібувальна дія поліклональних антитіл специфічних до цитозольної ТТФази на ТТФазну активність ПМС вказує на взаємодію цих антитіл з мембранозв'язаною ТТФазою. Можливо, цей факт можна пояснити тим, що протеїн ПМС має на своїй поверхні епітопи, аналогічні цитозольній ТТФазі. Отже, одержані дані вказують, що протеїн з ПМС володіє високим ступенем гомології з цитозольною ТТФазою у первинній послідовності, оскільки відбувається досить істотне зниження активності мембранного ензиму (на 48 % порівняно з контролем). Таким чином, ми можемо говорити про наявність в ПМС нової мембранозв'язаної ізоформи ТТФази, яка, за нашими припущеннями, входить до складу ТЗБ. Слід зазначити, що згідно даним літератури, тіамінзв'язувальний білок складається з двох субодиниць з молекулярною масою 63 і 35 кДа [Янчій О.Р., 2004], але немає даних стосовно того, якій субодиниці належить тіамінзв'язувальна активність, а якій - здатність гідролізувати тіамінфосфати, і яка з двох субодиниць (або обидві субодиниці) бере участь у транспорті тіаміну через плазматичну мембрану.
Оскільки ми виявили наявність гомології між мембранозв'язаною ізоформою та цитозольною ТТФазою, на наступному етапі нашого дослідження ми сконцентрували увагу на аналізі ізоформи ТТФази, мембранозв'язаної та в складі ТЗБ із використанням поліклональних антитіл, специфічних до цитозольного протеїну, методом Вестерн-блот аналізу (рис.6).
Размещено на http://www.allbest.ru/
[Введите текст]
Рис. 6. Аналіз протеїнових фракцій, які виявляють ТТФазну активність, методом електрофорезу в 10 % ПААГ за денатуруючих умов (а) та методом Вестерн-блот аналізу із використанням поліклональних антитіл, специфічних до цитозольної ТТФази мозку (б). М - протеїни-маркери, кДа; 1 - протеїни цитозольної фракції мозку; 2 - ТЗБ мозку; 3 - протеїни ПМС.
Проведені експерименти демонструють, що мемранозв'язана ТТФаза з ПМС (рис. 6, б, доріжка 3) є складовою частиною ТЗБ ПМС, який в свою чергу складається з двох субодиниць з молекулярною масою 35 кДа и 63 кДа (рис. 6, а, доріжка 2), і виявляє здатність зв'язувати тіамін та здійснювати ензиматичний гідроліз ТТФ. Причому субодиниця з молекулярною масою 35 кДа виявляє високий ступінь гомології з цитозольною ТТФазою (рис. 6, б, доріжка 2) та, скоріше за все, відповідає протеїну з ТТФазною активністю в ПМС. Отже, аналіз одержаних даних дозволив підтвердити наше припущення про те, що ТЗБ ПМС є єдиним носієм ТТФазної активності в ПМС.
Зміни властивостей мембранозв'язаної тіамінтрифосфатази за умов хронічного алкоголізму. Згідно нашим уявленням, ТЗБ є однією із ключових ланок в обміні рухомого пулу тіаміну в нервових клітинах, і критичні порушення в його функціонуванні можуть бути однією із причин ініціації нейродегенеративних процесів. Загально відомим фактом є те, що при довготривалому вживанні алкоголю спостерігається дефіцит вітаміну В1, який вважається основною причиною розвитку нейродегенеративного захворювання у людей, що страждають на хронічний алкоголізм - синдрому Верніке-Корсакова [Heap L.C. et al., 2002; Thomson A.D. et al., 2008; Harper С., 2009]. Однак дані відносно впливу етанолу на біохімічні процеси, які беруть участь в обміні та функціонуванні тіаміну в нервових клітинах, доволі обмежені. Дослідження впливу алкоголю на окремі ланки функціонування тіаміну в нервовій тканині є актуальним для з'ясування цього питання. У зв'язку з вищенаведеним вивчено зміни активності ТЗБ, а саме його ТТФазної активності, за умов хронічного вживання алкоголю (модель алкоголізму). Було виявлено, що споживання щурами 15% етанолу протягом 4 місяців викликає достовірні зміни ТТФазної активності у препаратах ПМС клітин. А саме, показано, що за умов хронічного алкоголізму спостерігається підвищення ТТФазної активності ПМС. Значення уявної константи Міхаеліса та максимальної швидкості реакції гідролізу ТТФ дорівнюють 31 ± 7 мкМ та 1,06 ± 0,06 нмоль ТДФ/ мг протеїну за хв відповідно. Слід зазначити, що величина Km для ТТФази в нормі складає 52 ± 8 мкМ, що в 1,7 рази вище, ніж при алкоголізмі, тобто, для мембранозв'язаного ензиму при хронічній алкоголізації відбувається зростання спорідненості до субстрату. Максимальна швидкість (V0max) в порівнянні із контролем підвищується у 2 рази (в нормі складає 0,51 ± 0,02 нмоль ТДФ/мг протеїну за хв).
Отже, одержані дані дають змогу припустити, що підвищення ТТФазної активності ПМС разом із підвищенням здатності нервових клітин в цих умовах зв'язувати тіамін [Пархоменко Ю.М. и др., 2008] може відображати компенсаторні зміни в цих процесах у відповідь на порушення обміну рухомого пулу тіаміну в нервових клітинах при хронічному алкоголізмі.
Оскільки досліджувана нами ТТФаза є мембранним протеїном, то, згідно з даними літератури, зміна активності цього ензиму за хронічного алкоголізму може бути опосередкована мембранотропною дією як етанолу, тобто його взаємодією з гідрофобними ділянками мембрани і порушенням її просторової структури в місці локалізації протеїну, так і ацетальдегіду [Hunt W.A., 1996; Forn-Frias C. et al., 2003; Quertemont E. et al., 2006]. Але за рахунок чого відбувається підвищення ТТФазної активності ПМС при алкоголізмі?
В результаті експериментів з дослідження впливу етанолу та ацетальдегіду на ТТФазну активність у фракції плазматичних мембран синаптосом показано, що етанол в діапазоні концентрацій 0,01-0,04 % не впливає на досліджувану ензиматичну активність, тоді як під впливом ацетальдегіду в концентраційному діапазоні 2-50 мкМ спостерігається статистично вірогідна (р<0,05) стимуляція ТТФазної активності плазматичних мембран нервових клітин в середньому на 36 % за концентрації ацетальдегіду 5 мкМ (рис.7).
Рис. 7. Концентраційна залежність впливу ацетальдегіду на ТТФазну активність у фракції плазматичних мембран синаптосом за умови присутності в середовищі інкубації 80 мкМ ТТФ (M±m, n=5).
Отже, аналіз одержаних даних вказує на те, що активуючий вплив ацетальдегіду на реакцію гідролізу ТТФ (і взагалі, тіамінфосфатів), разом із підвищенням здатності нервових клітин в цих умовах зв'язувати тіамін [Пархоменко Ю.М. и др., 2008] може забезпечувати при хронічному алкоголізмі підтримання пулу похідних тіаміну в нервових клітинах на фізіологічному рівні, в той час як в інших органах (печінка) спостерігається його виснаження .
Таким чином, було показано підвищення активності мембранозв'язаної ТТФази мозку за умов хронічного алкоголізму. Також на препаратах ПМС, виділених з мозку контрольних щурів, продемонстровано, що активуюча дія належить не самому етанолу, а його метаболіту - ацетальдегіду.
ВИСНОВКИ
1. Тіамінзв'язувальний білок відіграє важливу роль у функціонуванні нервових клітин, оскільки є однією із центральних ланок рухомого пулу похідних тіаміну в цих клітинах. Дослідження тіамінтрифосфатазної активності, яку виявляє цей протеїн, є важливим для розуміння його структурно-функціональної організації в плазматичній мембрані нервової клітини. У дослідах, виконаних на фракції плазматичних мембран синаптосом мозку щурів, проведено дослідження властивостей реакції ензиматичного гідролізу ТТФ, а також локалізації відповідного активного центру протеїну в мембрані. Проведено порівняльне дослідження протеїнів, які виявляють тіамінтрифосфатазну активність в ПМС та цитозолі.
2. Визначено основні кінетичні характеристики реакції ензиматичного гідролізу ТТФ плазматичною мембраною синаптосом. Показано, що рН-оптимум реакції становить 7,4. Константа активації іонами Mg KMg та константа Міхаеліса Km за ТТФ дорівнюють 1,9±0,3 мМ та 52 ± 7 мкМ відповідно, а величини максимальної швидкості гідролізу за Mg2+ V0Mg та за ТТФ V0max складають 0,50 ± 0,02 та 0,51 ± 0,02 нмоль ТДФ/мг протеїну за хв відповідно. Показано, що тіамінзв'язувальний білок плазматичних мембран синаптосом з великою імовірністю є носієм ТТФазної активності збудливих мембран.
3. Із використанням методу визначення активності маркерних ензимів плазматичної мембрани (ацетилхолінестерази - активний центр локалізований на зовнішній поверхні мембрани та уабаїнчутливої Na+,K+-ATP-ази - активний центр локалізований на внутрішній поверхні мембрани) до та після оброблення мембранної фракції розчином дигітоніну (0,005-0,2 %), було встановлено, що ензим, який відповідає за гідроліз ТТФ в ПМС, локалізований на внутрішній поверхні мембрани. Припускається, що така локалізація активного центру мембранозв'язаної ТТФази може мати функціональне значення у забезпеченні своєрідного кордону для виходу в пресинаптичну щілину фосфорильованих похідних тіаміну.
4. Показано, що ТТФ конкурентно пригнічує зв'язування тіаміну тіамінзв'язувальним білком у складі ПМС (значення уявної константи інгібування Кi становить 2,1±0,1 мкМ), а зв'язування тіаміну сприяє підвищенню реакції ензиматичного гідролізу ТТФ відносно контролю. Зроблено припущення, що зв'язування тіаміну тіамінзв'язувальним білком сприяє конформаційним змінам в активному центрі, відповідальному за ТТФазну активність, що веде до підвищення цієї активності.
5. При вивченні впливу специфічних похідних тіаміну (ампроліуму, окситіаміну та піритіаміну) на зв'язування тіаміну ПМС та реакцію ензиматичного гідролізу ТТФ препаратами ПМС показано, що антагоністи тіаміну більш афінні до центрів зв'язування тіаміну на ПМС, ніж до активного центру, який відповідає за гідроліз тіамінфосфатів. Одержані дані вказують на наявність двох окремих активних центрів на тіамінзв'язувальному білку у складі ПМС, відповідальних за зв'язування тіаміну та гідроліз ТТФ.
6. Методом Вестерн-блот аналізу із використанням поліклональних антитіл, специфічних до цитозольної ТТФази, визначено, що досліджувана мембранозв'язана ТТФаза має високий ступень гомології з цитозольним ензимом у первинній послідовності, а також є складовою частиною тіамінзв'язувального білка, ізольованого з ПМС, а саме, його субодиницею з молекулярною масою 35 кДа.
7. Доведено, що за умов хронічного алкоголізму зростає максимальна швидкість гідролізу ТТФ та спорідненість мембранозв'язаної ТТФази до ТТФ в порівнянні із контролем. Відповідно V0max дорівнює 1,06 ± 0,06 нмоль ТДФ/ мг протеїну за хв, Km складає 31 ± 7 мкМ. В експериментах in vitro на препаратах ПМС показано, що за активацію мембранозв'язаної ТТФази відповідає не сам етанол, а його метаболіт - ацетальдегід, який підвищує ТТФазну активність в препаратах ПМС на 36 % відносно контролю.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Нарушения метаболизма тиамина в мозге крыс при экспериментальном алкоголизме и возможность их коррекции витамином Е / Ю.М. Пархоменко, С.Ю. Пилипчук, А.А. Сидорова (Строкина), С.П. Степаненко, Л.И. Чеховская, Г.В. Донченко // Укр. біохім. журн. - 2008. - Т. 80, № 4. - C. 90-98
2. Сидорова (Строкина) А.А. Характеристика тиаминтрифосфатазы, ассоциированной с плазматическими мембранами нервных клеток / А.А. Сидорова (Строкина), С.П. Степаненко, Ю.М. Пархоменко // Укр. біохім. журн. - 2009. - Т.81, № 3. - С. 57-65.
3. Наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом / Ю.М. Пархоменко, А.А. Строкина, С.Ю. Пилипчук, С.П. Степаненко, Л.И. Чеховская, Г.В. Донченко // Укр. біохім. журн. - 2010. - Т.82 , №1. - С. 34 - 41.
4. Sydorova (Strokina) A.О. Thiaminetriphosphatase activity of rat brain thiamine binding protein / A.О. Sydorova, О.R. Yanchiy, Z.S. Protasova // IX Український біохімічний з'їзд: 24-27 жовтня 2006, Харків: тези доп. - 2006. - С. 174.
5. Sydorova (Strokina) A. Properties of thiamine receptor of neural cells / A. Sydorova, О. Yanchiy, Iu. Parkhomenko // Acta Biochimica Polonica: аbstracts of 6th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cellular Signalling”, 30 May-02 June 2007, Krakow. - 2007. - Vol. 54, N 2. - P. 27.
6. Sydorova (Strokina) A. Thiaminetriphosphatase activity of thiamine-binding protein of neural cells / A. Sydorova // Bridges in Life Sciences Annual Scientific Review Meeting of the Regional Cooperation for Health, Science and Technology (RECOOP HST) Consortium, 7 October 2007, Pecs: abstracts conf. - 2007. - P. 72.
7. Использование комбинации витамина Е с другими биологически активными соединениями для нормализации обмена тиамина при экспериментальном алкоголизме / Ю.М. Пархоменко, С.Ю. Пилипчук, А.А. Сидорова (Строкина), Л.И. Чеховская, C.П. Степаненко, Г.В. Донченко // Лекарственные средства и биологически активные соединения: материалы междунар. науч. конф. 11-12 октября 2007, Гродно. - 2007. - С.124-126.
8. Sydorova (Strokina) A. Localization of membrane thiamine triphosphatase in neural cells / A. Sydorova, I.M. Parkhomenko // Нейронауки: теоретичні та клінічні аспекти: IV конференція українського товариства нейронаук, 10-12 червня 2008, Слов'янськ: тези доп. - 2008. - Т. 4, № 1. - С. 76.
9. Сидорова (Строкіна) А.О. Дослідження тіамінтрифосфатазної активності, асоційованої з тіамінзв'язуючим білком мозку щурів / А.О. Сидорова // Укр. біохім. журн.: конференція молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології”, 12-13 червня 2008, Київ: тези доп. - 2008. - Т. 80, № 4. - С. 170.
10. Строкіна А.О. Мембранозв'язана тіамінтрифосфатаза у складі тіамінзв'язуючого протеїну плазматичної мембрани синаптосом / А.О. Строкіна, Ю.М. Пархоменко // Укр. біохім. журн.: тези доп. X Українського біохімічного з'їзду, 13-17 вересня 2010, Одеса. - 2010. - Т.82 , №4 (додаток 1). - С. 106-107.
11. Key stages of thiamine metabolism that are most significant for the viability of nerve cells / Yu.M. Parkhomenko, A.A. Strokina, S.A. Chornii, S.P. Stepanenko, L.I. Chekhovskaya // Укр. біохім. журн.: тези доп. X Українського біохімічного з'їзду, 13-17 вересня 2010, Одеса. - 2010. - Т.82 , №4 (додаток 1). - С. 139-140.
АНОТАЦІЯ
Строкіна А.О. Тіамінфосфатгідролазна активність плазматичних мембран нервових клітин. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2011.
Дисертацію присвячено дослідженню структурно-функціональної організації тіамінзв'язувального білка в плазматичній мембрані синаптосом (ПМС), ролі і властивостей його ензиматичної тіамінтрифосфатазної (ТТФазної) активності.
Визначено основні кінетичні характеристики реакції ензиматичного гідролізу ТТФ. Показано, що рН-оптимум реакції гідролізу ТТФ плазматичними мембранами становить 7,4. Значення константи активації іонами Mg - KMg та константи Міхаеліса Km дорівнюють 1,9±0,3 мМ та 52±7 мкМ відповідно, а величина максимальної швидкості гідролізу V0max складає 0,51±0,02 нмоль ТДФ/мг протеїну за хв.
Показано, що ТТФ конкурентно пригнічує зв'язування тіаміну тіамінзв'язувальним білком ПМС (Кi = 2,1±0,1 мкМ), а зв'язування тіаміну з мембраною підвищує ТТФазну активність у фракції ПМС на 49 % відносно контролю. Із використанням специфічних похідних тіаміну (ампроліуму, окситіаміну та піритіаміну) показано, що антагоністи тіаміну більш афінні до центру зв'язування тіаміну на ПМС, ніж до гідролітичного центру тіамінзв'язувального білка. Одержані дані вказують на наявність двох окремих активних центрів на тіамінзв'язувальному білку ПМС, відповідальних за зв'язування тіаміну та ензиматичну активність. За допомогою поліклональних антитіл, специфічних до цитозольної ТТФази, показано наявність гомології між мембранозв'язаним та цитозольним протеїнами, а також доведено, що мембранозв'язана ТТФаза є складовою частиною тіамінзв'язувального білка, ізольованого з ПМС, а саме, його субодиницею з молекулярною масою 35 кДа.
...Подобные документы
Методика іммобілізації полімерних міцел з альфа-амілазою на поверхню полісульфонових мембран. Вплив тривалості процесу ультрафіолетового випромінювання на каталітичну активність ферменту. Ознайомлення із способами модифікації мембран; їх властивості.
курсовая работа [924,7 K], добавлен 14.07.2014Понятие и виды ионообменных мембран. Рассмотрение основ применения мембранных процессов в области защиты окружающей среды. Проверка гипотезы стерического механизма отравления ионообменных мембран на примере антоциан, входящих в состав виноматериалов.
дипломная работа [6,6 M], добавлен 17.04.2015Понятие и принципы разработки мембранных технологий, сферы и особенности их практического применения, оценка главных преимуществ и недостатков. Физико-химические свойства мембран. Условия применения полимерных мембран в современном сельском хозяйстве.
курсовая работа [113,6 K], добавлен 15.11.2014Измерение удельной электропроводности анионообменных мембран МА-41-2П, модифицированных в сополимерах диметилдиаллиламмоний хлорида акриловой или малеиновой кислот с помощью пинцетной ячейки разностным методом, и сравнение их с исходными мембранами.
курсовая работа [1,3 M], добавлен 18.07.2014Классификация мембран пo материалу, происхождению, морфологии, структуре и форме. Методы их получения: формование, травление треков, спекание. Массоперенос через мембрану в локальном объеме аппарата. Фильтрование воды через электролизную установку.
курсовая работа [1,9 M], добавлен 18.10.2014Мембранные системы водоподготовки. Исследование диффузионной проницаемости анионообменных мембран. Разработка алгоритма расчета электропроводности, концентраций анионов и молекулярной формы ортофосфорной кислоты в тракте с принимающей стороны мембраны.
курсовая работа [708,1 K], добавлен 18.03.2016Свойства полианилина и его формы. Механизм полимеризации анилина в матрице МФ-4СК. Исследование электротранспортных свойств композитов на основе перфторированных сульфокатионитовых мембран и полианилина, полученных в условиях внешнего электрического поля.
дипломная работа [3,1 M], добавлен 24.09.2012Исследование эволюции физико-химических характеристик ионообменных смол и изготовленных из них мембран в процессах переработки амфолит-содержащих модельных растворов и виноматериалов. Электропроводность ионитов, её связь с другими свойствами ионитов.
дипломная работа [4,6 M], добавлен 18.07.2014Фотометричне визначення вуглеводів з антроновим реагентом та пікриновою кислотою. Дослідження етанолу на визначення цукрів. Вплив етанолу на визначення цукрів з антроновим реагентом. Оцінка збіжності, відтворюваності та правильності результатів аналізу.
дипломная работа [2,3 M], добавлен 05.09.2010Cинтез нових поліциклічних систем з тіопірано-тіазольним каркасом. Сучасні вимоги до нових біологічно-активних сполук. Створення "лікоподібних молекул" з невисокою молекулярною масою. Біологічна активність нових поліциклічних конденсованих систем.
автореферат [89,1 K], добавлен 09.04.2009Хімічний склад і поглинаюча здатність ґрунтів. Методика визначення активності іонів і термодинамічних потенціалів в ґрунтах. Вплив калійних добрив на активність іонів амонію в чорноземі типовому. Поглиблене вивчення хімії як форма диференціації навчання.
дипломная работа [823,0 K], добавлен 28.03.2012Исследование методов электромембранной технологии: электродиализа и электролиза. Анализ освобождения коллоидных растворов от растворённых в них низкомолекулярных соединений при помощи полупроницаемой мембраны. Обзор морфологии и классификации мембран.
реферат [418,7 K], добавлен 14.12.2011Основные классы фосфолипаз, расщепление лизофосфолипидов под действием фосфолипаз. Ферменты, их отличия по молекулярным массам и субъединичному составу. Активация мембранной гуанилатциклазы через ионизированный кальций и оксидантные системы мембран.
курсовая работа [713,8 K], добавлен 27.05.2010Взаимное влияние атомов и способы его передачи в органических молекулах. Роль ионизации в проявлении биологической активности. Фосфолипиды как структурные компоненты клеточных мембран. Стереохимия органических соединений. Реакции аминокислот, белки.
курс лекций [1,8 M], добавлен 05.03.2013Значение ионофоров в исследовании функционирования биологических мембран, их химическая природа и классификация. Стадии механизма переноса ионов. Препараты, функционально разобщающие окислительное фосфорилирование, их назначение и механизм действия.
доклад [496,3 K], добавлен 16.12.2009Липиды - сборная группа органических соединений. Простые и сложные липиды. Свойства мембран как надсистем регуляции клеточного метаболизма. Животные и растительные жиры, оптические и геометрические изомеры. Эфиры многоатомных спиртов с высшими кислотами.
реферат [1,2 M], добавлен 31.10.2011Характеристика теоретических основ процесса гиперфильтрации - самой совершенной на сегодняшний день технологии, которая используется для очистки воды на молекулярном уровне без химических реагентов. Принцип работы мембран и аппаратов для обратного осмоса.
реферат [1,8 M], добавлен 13.05.2012Выбор электрохимических систем и состава активных материалов твердоконтактных ПАВ-селективных сенсоров (природа электронных проводников, электродно-активных соединений, соотношение компонентов мембран). Электрохимические характеристики ПАВ-сенсоров.
автореферат [28,5 K], добавлен 17.10.2009Понятие и классификация липидов как сборной группы органических соединений, не имеющих единой химической характеристики, их типы и сравнительное описание: простые и сложные. Фосфолипиды как главные компоненты биологических мембран. Назначение гормонов.
презентация [2,8 M], добавлен 04.02.2017Особливості мембрани тваринного походження. Визначення молярної маси сахарози за допомогою експериментального метода зі свинячим міхуром. Методи дослідження осмотичного тиску. Комірка зі скляного фільтра. Комірка з мембраною із колодія та целофану.
курсовая работа [712,1 K], добавлен 26.05.2015
