Взаємодія аміноцукрів із поверхнею модифікованих альбуміном високодисперсних оксидів

Предмет дослідження - вплив природи поверхні високодисперсних оксидів на адсорбцію білка, аміноцукрів та на біоактивність одержаних нанокомпозитів у системах з клітинами.

Методи дослідження: адсорбція з рідкої фази, спектроскопія в ультрафіолетовій (УФ), видимій та інфрачервоній (ІЧ) областях, визначення питомої поверхні одержаних нанокомпозитів, температурно-програмована десорбційна мас-спектрометрія (ТПД МС), термостимульована деполяризація (ТСД), низькотемпературна ¹Н ЯМР-спектроскопія, лазерно-кореляційна спектроскопія, спеціалізоване програмне забезпечення для аналізу експериментальних даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Досліджено вплив природи поверхні високодисперсних оксидів, зокрема високодисперсного кремнезему, титано- та алюмокремнеземів на адсорбцію аміноцукрів. Встановлено відмінності в термолізі альбуміну в залежності від рН його розчину та природи поверхні дисперсних оксидів. Показано можливість використання виділення сірководню при термолізі білка як тестового піку на змішаних оксидах із білковим покриттям.

У вступі обґрунтовано актуальність теми, сформульовано мету та задачі дослідження, показано наукову новизну та практичне значення одержаних результатів, наведено особистий внесок здобувача та перелік основних результатів дисертаційної роботи.

У першому розділі проведено огляд літератури за темою дисертації, в якому розглянуто формування поверхневого шару, що складається з біомолекул, будову та властивості поверхні високодисперсних оксидів; фактори, що впливають на адсорбцію білків та вуглеводів на поверхні твердих тіл. Проаналізовано методи, що дозволяють визначати конформаційні зміни при адсорбції білків, шляхи термічного розкладу адсорбованих біомолекул, структуру та термодинамічні характеристики зв'язаної води, вплив речовини на рухливі клітини. На основі аналізу літературних даних зроблено висновки про актуальність та перспективність вибраного напрямку.

Другий розділ містить матеріали, що використані при одержанні нанокомпозитів (НК): високодисперсний кремнезем (ВДК), титанокремнезем (вміст TiO₂ 20%, ТК20), алюмокремнезем (вміст Al₂O₃ 1%, АК1), білок - бичачий сироватковий альбумін (БСА), аміноцукри N-ацетил-D-глюкозамін (GlcNAc) та D-галактозамін (D-GalN). Описано одержання нанокомпозитів, визначення їх питомої поверхні, вмісту біомолекул у водному розчині, методи дослідження нанокомпозитів, а також спеціалізоване програмне забезпечення, що використано для аналізу експериментальних даних. Для встановлення біоактивності використовували сперму биків, заморожену в лактозо-гліцериновому середовищі в умовах „Національного банку генофонду тварин” (Інститут розведення та генетики тварин НААН, с. Чубинське).

Третій розділ присвячено порівняльному вивченню процесу адсорбції БСА в залежності від рН та аміноцукрів (GlcNAc, D-GalN) на поверхні високодисперсних оксидів, та впливу модифікування кремнезему альбуміном на його адсорбційні властивості по відношенню до аміноцукрів.

Таблиця 1. Значення адсорбції БСА на досліджених адсорбентах

Адсорбцію БСА досліджували при рН = 2,5; 4,8 та 7,0. Встановлено, що максимальна адсорбція БСА на поверхні ВДК, ТК20 та АК1 спостерігається при рН = 4,8 (табл. 1) та описується ізотермами ленгмюрівського типу. При всіх значеннях рН гранична адсорбція (Г_?) БСА (в мг/м²) найвища для ТК20 і найменша для АК1.

При рН 2,5 та 7,0 (табл. 1) значення граничної адсорбції зменшується. При рН 2,5 процесу адсорбції перешкоджає йон-дипольна взаємодія з поверхневими силанольними групами (оскільки білок і поверхня позитивно заряджені) та максимальна флокуляція, що зумовлена формуванням кількох зв'язків молекули БСА з частками від сусідніх агрегатів. При рН = 7,0 глобула білка та поверхня заряджені негативно, що призводить до зменшення адсорбції. Це може бути викликане латеральним відштовхуванням однойменно заряджених молекул білка в адсорбційному шарі та зменшенням йонної сили.

Встановлено, що за адсорбційними та ІЧ-спектроскопічними даними молекули БСА адсорбуються пласко на всіх досліджених кремнеземах, за винятком «ТК20/БСА» при рН 4,8, для якого характерна нахилена орієнтація макромолекул білка.

Величина десорбції альбуміну з поверхні зразків ВДК та АК1 не перевищує 25%, а ТК20 - 17%.

Досліджено адсорбцію аміноцукрів на поверхні вихідних та модифікованих білком дисперсних оксидів. Встановлено, що максимальна адсорбція GlcNAc спостерігається для вихідного ТК20 (0,18 мг/м²), а у випадку D-GalN - для АК1 (0,25 мг/м²) (табл. 2). Збільшення адсорбції для змішаних оксидів на відміну від ВДК, зумовлено наявністю на їх поверхні бренстедівських та льюїсівських активних центрів.

Більше значення адсорбції D-GalN, порівняно з GlcNAc, пояснюється відсутністю в його складі СО- та СН₃-груп, що приводить до більш сильного утримання молекули аміноцукру на поверхні носія. При попередньому модифікуванні поверхні білком максимальна адсорбція GlcNAc спостерігається на «ТК20/БСА» при всіх значеннях рН, а D-GalN - на «ТК20/БСА» при рН 2,5 та 7,0, та АК1 (рН 4,8).

Таблиця 2. Адсорбція (Г_?) аміноцукрів на поверхні адсорбентів

Встановлено, що наявність білка на поверхні адсорбенту зменшує величину адсорбції GlcNAc на «ВДК/БСА» при рН 4,8 та 7,0. У випадку D-GalN вона зменшується для всіх зразків ВДК з білком та «АК1/БСА» при рН 7,0. Це пов'язане з тим, що шар білка на поверхні кремнезему, вірогідно, перешкоджає молекулам вуглеводу взаємодіяти з поверхнею. Величина адсорбції аміноцукру на поверхні НК «нанооксид/білок» знижується в результаті заміни силанольних груп на карбонільні, що призводить до взаємного відштовхування молекул вуглеводу. Зменшення адсорбції аміноцукру може бути також зумовлене утворенням при цьому процесі агрегатів. Оскільки молекули GlcNAc містять електронодонорні атоми азоту та кисню, то можна припустити, що його взаємодія з білковим шаром, адсорбованим на поверхні кремнезему, відбувається переважно на кислотних центрах. Крім того, аміноцукри можуть також адсорбуватися в порожнинах глобул білка, витіснюючи при цьому частину води, якою вони заповнені. Десорбція GlcNAc з поверхні всіх зразків ВДК не перевищує 28%, ТК20 та АК1 - 19 та 20%, відповідно. Десорбція D-GalN з поверхні всіх зразків ВДК не вища 24%, ТК20 та АК1- 12 та 20%, відповідно.

У четвертому розділі розглянуто зміни у просторовому розташуванні БСА при його адсорбційній взаємодії з ВДК, ТК20 та АК1 при різних значеннях рН, а також дослідження поверхні кремнеземів (вихідних та модифікованих альбуміном) після адсорбції на них аміноцукрів. Для характеристики взаємодії БСА з поверхнею твердої фази використовували смуги валентних ОН-коливань (3750 см^-1), а також «Амід І» (1650 см^-1) та «Амід ІІ» (1550 см^-1). В результаті адсорбції альбуміну на поверхні дисперсних оксидів смуга 3750 см^-1 зникає при рН 4,8, а при рН 2,5 та 7,0 дещо зменшується. Крім того, адсорбція білка призводить до появи широкої смуги поглинання при 3300 см^-1 та смуги валентних С=О- та N-Н-коливань (смуги «Амід І» та «Амід ІІ»). Це свідчить про утворення сильного водневого зв'язку між вільними силанольними групами поверхні кремнезему та карбоксильними і аміногрупами адсорбованого білка.

В ІЧ-спектрах досліджених зразків «нанооксид/альбумін» при всіх значеннях рН спостерігається низькочастотне плече при 1630 см^-1, що може свідчити про наявність фізично адсорбованої води та про можливий перехід білкової молекули зі згорнутої б-форми в в-форму, що визначається наявністю міжмолекулярних водневих зв'язків. Останнє узгоджується з літературними даними.

Щодо ІЧ-спектрів аміноцукрів (GlcNAc та D-GalN), адсорбованих на модифікованій БСА поверхні, то встановлено, що при їх адсорбції спостерігається зміщення смуги «Амід І» при 1650 см^-1 та «Амід ІІ» при 1550 см^-1 як у високо-, так і в низькочастотній області, що, вірогідно, вказує на зміну орієнтації молекули альбуміну при адсорбції аміноцукру (рис. 1). При цьому проявляються смуги поглинання, характерні як для аміноцукру, так і для БСА. В ІЧ-спектрах обох адсорбованих аміноцукрів в області 2700-3600 см^-1 спостерігається поява широкої смуги поглинання, що зумовлено одночасним проявом зв'язку N-Н, валентними коливаннями С-Н- та О-Н-груп. Викладене підтверджує зміну просторового розташування альбуміну при його адсорбції на кремнеземах та аміноцукрів на поверхні НК «нанооксид/білок».

У п'ятому розділі наведено особливості термолізу біомолекул у конденсованому стані та адсорбованих на поверхні як вихідних, так і модифікованих альбуміном дисперсних носіїв. При розкладі БСА в конденсованому стані спостерігається поява піку 34 а.о.м., яка інтерпретується як маса молекули сірководню, що утворюється внаслідок розкладу залишків сірковмісних амінокислот у складі білка. Адсорбція білка призводить до розширення максимуму термічного виділення 34 а.о.м. від 30 єС до 60 єC і більше. Це зумовлено зменшенням кількості ОН-груп поверхні. Інтенсивність даного піку залежить від кількості адсорбованого білка. При термолізі в усіх експериментах спостерігається три максимуми дегідратації (рис. 2). Перший - близько 100 єC, але найінтенсивнішим він є для конденсованого БСА та для модифікованого білком алюмокремнезему. Другий - близько 200 єC, який за локалізацією та кінетикою співпадає з виділенням сірководню. А третій - лежить в межах 250-300 єC та корелює з температурними максимумами піків 27 та 28 а.о.м.

Щодо аміноцукрів, то раніше в Інституті хімії поверхні ім. О.О. Чуйка НАН України було показано, що при термолізі галактозаміну в конденсованому стані (на відміну від адсорбованого) відбувається виділення в молекулярній формі оксазолу. Однак не вивчено особливості термічного розкладу НК з альбуміном. Встановлено, що термоліз обох аміноцукрів відбувається у вузькому діапазоні температур (від 100 єС до 200 єС). Їх адсорбція на поверхні вихідних та модифікованих білком зразків призводить до зміщення початку термолізу у низькотемпературну область та до розширення температурного діапазону термолізу, порівняно з їх конденсованим станом (рис. 3).

В усіх випадках попередньо модифікованих білком зразків при розкладі спостерігається утворення сірководню, що вказує на розклад білка в зразку.

Встановлено, що перша стадія термолізу GlcNAc характерна лише при адсорбції на ВДК, а друга - зміщується у високотемпературну область. При термолізі D-GalN 31 а.о.м. спостерігається лише при його адсорбції на ВДК. В присутності БСА при розкладі D-GalN відсутня стадія утворення 31 а.о.м. При термолізі обох аміноцукрів спостерігається три стадії виділення води: фізично адсорбованої води (близько 100 єС); води, що утворюється в результаті дегідратації аміноцукру та білка (близько 150 єС та 200-270 єС, відповідно).

Виявлено, що при розкладі GlcNAc в конденсованому стані пік виділення оксазолу (99 а.о.м.) відсутній, на відміну від адсорбованого GlcNAc на поверхні попередньо модифікованих БСА адсорбентів, при всіх досліджених рН. Слід зазначити, що даний пік не спостерігається у випадку термолізу НК «нанооксид/білок» та «нанооксид/GlcNAc», що свідчить про стабілізацію молекули GlcNAc після адсорбції. Що стосується D-GalN, то пік 99 а.о.м. спостерігається при його термолізі в конденсованому стані та адсорбованого на поверхні «нанооксид/БСА» при рН 4,8, а також «ТК20/БСА» при рН 2,5 та 7,0, що теж зумовлено стабілізацією молекули D-GalN. Отже, сказане свідчить про різний механізм адсорбції та термолізу D-GalN, порівняно з GlcNAc.

У шостому розділі описані релаксаційні процеси поблизу поверхні дисперсних оксидів як вихідних, так і модифікованих БСА у водному середовищі, а також зміни стану води в репродуктивних клітинах бика (нативних гаметах бика) та вплив на її структуру органічних розчинників.

Методом ТСД показано відмінність ТСД-спектрів систем «БСА/вода» і «нанооксид/БСА/вода» від систем «нанооксид/вода», що полягає в зворотному співвідношенні величин струмів у низько- (T < 160-170 K) і високотемпературній (T > 160-170 K) областях спектрів ТСД. Для водних дисперсій оксидів характерні більші струми ТСД в першій області (рис. 4), а для систем «БСА/вода» і «нанооксид/БСА/вода» - у другій (рис. 5). Міжмолекулярні взаємодії для систем за участю БСА, порівняно з водними дисперсіями оксидів, приводять в цілому до зростання часу, енергії та вільної енергії активації дипольної релаксації та зростання діелектричної проникності відповідних структур. Однак струми ТСД в системах «нанооксид/БСА/вода» нижчі в 1,5-5 раз, ніж у випадку розчину БСА (при тій же, або близькій, концентрації), в результаті сильних адсорбційних взаємодій макромолекул з активними центрами поверхні. Така взаємодія призводить до утворення агрегатів і до зменшення об'єму зв'язаної води в системі.

Одержані результати свідчать про зміну будови води, зв'язаної нанооксидами і БСА; більш суттєві зміни спостерігаються для систем «складний нанооксид (АК1 або ТК20)/БСА/вода».

Методом низькотемпературної ¹Н ЯМР-спектроскопії встановлено, що у вихідному зразку (рис. 6, а) реєструється широкий сигнал води, хімічний зсув якого (д_Н = 5 м.ч.) співпадає з хімічним зсувом рідкої води (сильноасоційована вода). Зі зниженням температури інтенсивність сигналу зменшується внаслідок часткового замерзання внутрішньоклітинної води. Сигнал сильноасоційованої води перестає реєструватися при T < 230 K. При додаванні хлороформу (рис. 6, б, в), який дозволяє визначити поведінку води (є модельна система), крім основного сигналу, з'являється сигнал слабкоасоційованої води з хімічним зсувом д_Н?? ? 2 м.ч.

Його інтенсивність не перевищує 12% від інтенсивності сигналу сильноасоційованої води і слабко змінюється зі зменшенням температури до 210 К. Тому вся слабкоасоційована вода може бути віднесена до сильнозв'язаної.

Зі зростанням концентрації внутрішньоклітинної води (рис. 6, г) ширина сигналів зменшується, що зумовлено зростанням рухливості молекул води і помітні два сигнали слабкоасоційованої води при д_Н = 1,3 і 2 м.ч. Крім того, в спектрах спостерігаються сигнали CHCl₃ (д_Н = 7,16 м.ч.) і ТМС (д_Н = 0 м.ч.), що використовуються як стандарт при вимірюванні хімічного зсуву. Відповідно, хлороформ легко проникає в частково дегідратовані репродуктивні клітини і впливає на формування кластерів слабкоасоційованої води.

Таким чином, глибока дегідратація репродуктивних клітин не є обов'язковою умовою переходу всієї внутрішньоклітинної води в сильнозв'язаний стан. Навпаки, доля сильнозв'язаної води в клітинах, що містять 30 мас.% залишкової води, вище, ніж для клітин, які містять лише 10 мас.% води. Вірогідно, це викликано тим, що основна кількість сильнозв'язаної води може знаходитись тільки в порожнинах з визначеною геометрією і властивостями поверхні, які змінюються при підвищенні дегідратації. Саме в таких порожнинах вода утворює з органічними молекулами кластерні структури різної стехіометрії. В їх формуванні можуть брати участь як полярні, так і неполярні органічні молекули, що визначає зміну внесків сильно- і слабкоасоційованої води.

При введенні в систему ДМСО, що широко використовується як кріопротектор, крім сигналів сильно- і слабкоасоційованої води, з'являється сигнал при д_Н = 3,5 м.ч., який може бути віднесений до асоціатів (CD₃)₂SO…НОН. Інтенсивність цього сигналу збільшується зі зростанням концентрації ДМСО.

При використанні такого слабкополярного розчинника як хлороформ при зникненні його об'ємної фази (в результаті повільного випаровування) спостерігається перерозподіл інтенсивностей сигналів всіх типів води, зростання хімічного зсуву сильноасоційованої води зі зниженням температури її замерзання. Це свідчить про зміну будови кластерів, що відповідають за сигнал сильноасоційованої води. Такі зміни можуть відбуватися і внаслідок включення в кластери молекул ДМСО.

У сьомому розділі представлені дослідження біологічної активності НК на основі дисперсних оксидів, БСА та N-ацетил-D-глюкозаміну.

Як метод для оцінки біоактивності використано лазерно-кореляційну спектроскопію. Встановлено, що найбільший відсоток рухливих клітин спостерігається для змішаних оксидів, порівняно з ВДК (рис. 7, а). На відміну від АК1 він більше майже в 1,5 рази для ТК20. Для всіх зразків дисперсних оксидів їх більш високі концентрації в кріосередовищі зумовлюють пригнічення рухливості клітин.

Модифікування поверхні досліджених кремнеземів білком суттєво змінює параметри руху клітин, що залежать також від особливостей поверхні вихідних дисперсних оксидів. Так, для НК «ВДК/БСА» рухливість клітин збільшується в 1,6-1,8 рази, порівняно з вихідним ВДК при концентрації 0,002-0,01% (рис. 7, в). Але у випадку змішаних оксидів з альбуміном вона зменшується майже в 1,8-3,7 та 1,5 рази відповідно для «ТК20/БСА» і «АК1/БСА» в межах 0,002-0,15%. Останнє може бути пов'язане зі зменшенням кислих містків на поверхні змішаних оксидів, що, вірогідно, приймають участь в адсорбції БСА.

На поверхні «ТК20/БСА» максимальна кількість рухливих клітин спостерігається при його концентрації 0,15%, а для зразка «АК1/БСА» - при 0,01%, що може бути зумовлене максимальною адсорбцією БСА та нахиленим розташуванням молекул білка на поверхні вихідного ТК20. Крім того, як і у випадку вихідних зразків ВДК та АК1, зі збільшенням концентрації НК «ВДК/БСА» і «АК1/БСА» характерне зменшення кількості рухливих клітин. Це також може бути зумовлено пласкою конформацією молекул альбуміну на вихідних зразках ВДК та АК1. Сказане узгоджується з адсорбційними та ІЧ-спектроскопічними даними.

Отже, біоактивність вихідних та модифікованих білком кремнеземів по відношенню до кількості рухливих клітин збільшується в ряду: ВДК < ВДК/БСА < АК1/БСА < ТК20/БСА < АК1 < ТК20.

Енергія руху клітин найбільша в присутності змішаних оксидів, порівняно з ВДК. При цьому вказаний параметр для вихідних ТК20 та АК1 має незначну відмінність (рис. 7, б). Після адсорбції альбуміну на їх поверхні спостерігається підвищення енергії руху клітин для «ВДК/БСА» майже у 1,5 рази (при його концентрації 0,01%), але для змішаних оксидів, навпаки, відзначено падіння активності клітин за цим параметром для «ТК20/БСА» та «АК1/БСА» відповідно майже в 3,5 та 1,5 рази при тій концентрації, що і у випадку НК «ВДК/БСА» (рис. 7, г). Це зумовлено тим, що активні центри поверхні зв'язані з білком водневим зв'язком, що зумовлює зниження життєздатності клітин. Встановлено, що залежність НК «ВДК/БСА» від концентрації виражена куполоподібною кривою з максимумом його концентрації при 0,01%. Тобто при співставленні з ВДК відмічено зміщення максимальної активності в область більших концентрацій. Для змішаних оксидів така форма кривої не спостерігається. Вірогідно, при адсорбції білка на поверхні вказаних оксидів приймають участь не лише силанольні групи поверхні, а також і бренстедівські та льюїсівські кислотні центри. Отже, енергія руху клітин збільшується в ряду: ТК20/БСА < ВДК < АК1/БСА < ВДК/БСА < АК1 < ТК20. В усіх випадках за винятком «ТК20/БСА» при збільшенні концентрації НК спостерігається зменшення енергії руху досліджених клітин.

Таким чином, встановлено, що, виходячи з параметрів руху клітин, не тільки ВДК, але і змішані оксиди на його основі, а саме ТК20 та АК1 здатні стимулювати, в межах певних концентрацій, життєздатність деконсервованих гамет бика. Наявність білка на поверхні змішаних оксидів, на відміну від ВДК, зменшує вказані параметри, що свідчить про важливу роль бренстедівських та льюїсівських кислотних центрів в прояві біоактивності титано- та алюмокремнеземів.

Щодо аміноцукру GlcNAc, то встановлено, що в межах досліджуваних концентрацій спостерігається підвищення енергії руху гамет, порівняно з контрольною суспензією (рис. 8). Найбільша активність характерна для НК «ВДК/GlcNAc». Для «ВДК/GlcNAc» та «ВДК/БСА (рН 4,8)/GlcNAc» оптимальними були концентрації 0,15%.

Встановлено, що іммобілізація аміноцукру GlcNAc також сприяє підвищенню життєздатності гамет. Однак, попередня обробка поверхні ВДК білком дещо знижує рухливість гамет в присутності таких НК (рис. 8). Одержані дані добре узгоджуються з результатами по адсорбції. Зменшення кількості рухливих клітин для НК «ВДК/БСА/GlcNAc» може бути зумовлене повним екрануванням молекулами білка силанольних груп, а також надто міцним зв'язуванням GlcNAc з закріпленим на поверхні адсорбенту БСА. Останнє підтверджується результатами ІЧ-спектроскопії.

При адсорбції GlcNAc на поверхні «ВДК/БСА» частина молекул води в гідратній оболонці альбуміну може заміщуватись молекулами аміноцукру. При цьому відбувається зміна конформації білкових молекул, а також, вірогідно, зменшується їх гідрофільність та концентрація незамерзаючої води в клітині. Сказане впливає на зниження рухливості деконсервованих гамет бика та підтверджується даними розділу 6.

Оптимальні концентрації НК, одержані на основі вимірювання енергії руху гамет, підтверджуються і іншими параметрами, а саме швидкістю руху та частотою обертання клітин. Однак, найбільша кількість рухливих клітин реєструвалась при більш низьких концентраціях НК: для «ВДК/GlcNAc» С_досл = 0,01%, для «ВДК/БСА (рН 4,8)/GlcNAc» - 0,15%. Це можна пояснити тим, що в суспензії клітин завжди знаходяться клітини в різних фізіологічних станах, відповідно, їх чутливість по відношенню до однієї і тієї ж концентрації НК може бути різною. Не виняток, що нанокомпозити з іммобілізованим вуглеводом можуть проявляти вибіркову взаємодію з певними фрагментами клітинної поверхні і, таким чином, впливати на активність ферментів, вбудованих в мембрану, які відповідають за рух клітин.

ВИСНОВКИ

Проведено експериментальні дослідження сорбційних процесів взаємодії аміноцукрів із поверхнею вихідних та модифікованих бичачим сироватковим альбуміном (БСА) високодисперсного кремнезему та змішаних оксидів на його основі. Проаналізовано особливості будови поверхневого шару нанокомпозитів та зміни внутрішньоклітинного стану води в частково дегідратованих нативних гаметах бика. Визначені шляхи практичного застосування утворених нанокомпозитів, зокрема у біотехнології для збереження генофонду сільськогосподарських тварин.

1. Вперше доведено, що титано- та алюмокремнеземи, як і високодисперсний кремнезем, адсорбують на вихідній та модифікованій альбуміном поверхні аміноцукри (N-ацетил-D-глюкозамін та D-галактозамін). Найбільша адсорбція N-ацетил-D-глюкозаміну спостерігається на поверхні всіх зразків титанокремнезему, а D-галактозаміну - на поверхні вихідного алюмокремнезему та з білком при рН 4,8, а також титанокремнезему з білком (рН 2,5 та 7,0) за рахунок наявності активних центрів різної природи (силанольні групи, бренстедівські та льюїсівські кислотні центри).

2. Методом ІЧ-спектроскопії встановлено, що завдяки адсорбції білка на поверхні досліджених кремнеземів (на відміну від його стану у водному розчині) відбувається перехід молекул альбуміну зі згорнутої конформації до розгорнутої, на що вказує поява плеча у смузі поглинання «Амід І» при 1630 см^-1. Це сприяє утворенню нових активних центрів поверхні кремнезему з білком для подальшого зв'язування на ній аміноцукру.

3. Методом температурно-програмованої десорбційної мас-спектрометрії вивчено особливості термолізу одержаних нанокомпозитів на основі кремнеземів із біомолекулами. Визначено, що пік виділення сірководню (якому відповідає компонента з а.о.м. 34) може слугувати тестовим експрес-методом при аналізі складу та кількості зразків будь-яких нанокомпозитів із білковим покриттям.

4. Встановлено, що термічний розклад аміноцукрів у вільному стані відбувається у вузькому діапазоні температур (від 100 до 200 єС), а їх адсорбція на поверхні як вихідних, так і модифікованих білком кремнеземів приводить до зміщення початку термолізу утворених нанокомпозитів у низькотемпературну область та до розширення температурного діапазону їх стабільності, що є суттєвим для визначення ступеня зв'язування аміноцукрів із адсорбентом та їх термостійкістю. Підтверджено також зміну стабільності існуючої конформації аміноцукрів за рахунок дії поверхні кремнеземів. Важливо, що при іммобілізації аміноцукрів на поверхні композиту «нанооксид/БСА» структура сорбованого білка не змінюється.

5. Методом термостимульованої деполяризації встановлено, що для водних дисперсій досліджених кремнеземів характерні більші струми релаксації в низькотемпературній області, порівняно з іншими композитами (а саме «БСА/вода» і «нанооксид/БСА/вода»), для яких ці струми спостерігаються лише у високотемпературній зоні. Одержані результати свідчать також про зміну станів води в розчині альбуміну на поверхні кремнеземів та в системах «нанооксид/БСА/вода».

6. Методом низькотемпературної ¹Н ЯМР-спектроскопії встановлено, що глибока дегідратація нативних гамет бика не є обов'язковою умовою переходу всієї внутрішньоклітинної води в сильнозв'язаний стан. Навпаки, доля такого стану води в клітинах, що містять 30 мас.% її залишку, вища, ніж для клітин, які містять лише 10 мас.% води.

7. Нанокомпозити досліджених кремнеземів із альбуміном та N-ацетил-D-глюкозаміном виявляють різну біологічну активність в системах із деконсервованими репродуктивними гаметами бика. Показано, що життєздатність клітин визначається особливостями біомолекул на поверхні дисперсних оксидів. Встановлено, що вихідні дисперсні оксиди, а також нанокомпозит «високодисперсний кремнезем/аміноцукор», підвищують життєздатність гамет бика, однак присутність альбуміну в їх складі дещо знижує біоактивність вказаних клітин.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Температурно-програмована десорбційна мас-спектрометрія бичачого сироваткового альбуміну в конденсованому стані і адсорбованого на поверхні високодисперсних оксидів / Н.Ю. Клименко, Н. П. Галаган, Б. Г. Місчанчук, В. І. Зарко, В. О. Покровський // Химия, физика и технология поверхности : межвед. сб. науч. трудов / Ин-т химии поверхности им. А. А. Чуйко НАН Украины; гл. ред. Н. Т. Картель. - К.: Наукова думка, 2008. - Вып. 14. - С. 456-466.

Здобувачем досліджено адсорбцію бичачого сироваткового альбуміну на поверхні дисперсних оксидів в залежності від рН розчину білка.

2. Кластеризация воды, связанной в лиофилизированных гаметах быка, содержащих добавки органических веществ / В. В. Туров, Н. П. Галаган, В. М. Гунько, С. И. Ковтун, С. В. Керусь, Н.Ю. Клименко, А. В. Туров // Химия, физика и технология поверхности : межвед. сб. науч. трудов / Ин-т химии поверхности им. А. А. Чуйко НАН Украины; гл. ред. Н. Т. Картель. - К.: Наукова думка, 2008. - Вып. 14. - С. 494-501.

Здобувачем проведено спектрофотометричний аналіз вмісту білка в надосадовій рідині.

3. Адсорбция бычьего сывороточного альбумина на поверхности кремнезема, модифицированного триметилсилильными группами / И. В. Сиора, Н.Ю. Клименко, Н. П. Галаган, В. М. Богатырев // Химия, физика и технология поверхности : межвед. сб. науч. трудов / Ин-т химии поверхности им. А. А. Чуйко НАН Украины; гл. ред. Н. Т. Картель. - К.: Наукова думка, 2009. - Вып. 15. - С. 98-110.

Здобувачем проведено дослідження адсорбційної взаємодії бичачого сироваткового альбуміну на поверхні високодисперсного кремнезему з водного розчину при рН 4,8.

4. Процессы низкотемпературной дипольной релаксации в системах бычий сывороточный альбумин-нанооксид-вода / В. М. Гунько, В. И. Зарко, Е. В. Гончарук, Н.Ю. Клименко, Н. П. Галаган // Поверхность : сб. науч. трудов / Ин-т химии поверхности им. А. А. Чуйко НАН Украины; гл. ред. Н. Т. Картель. - К.: Наукова думка, 2009. - Вып. 1 (16). - С. 14-25.

Здобувачем здійснено підготовку зразків для дослідження їх методом термостимульованої деполяризації.

5. Клименко Н.Ю. ІЧ-спектроскопічне дослідження високодисперсного кремнемнезему, титано- та алюмокремнеземів, модифікованих білком / Н.Ю. Клименко, Н. П. Галаган // Укр. хим. журн. - 2010. - Т. 76, № 6. - С. 89-93.

Здобувачем вивчено адсорбцію альбуміну на поверхні високодисперсних оксидів методом ІЧ-спектроскопії та проаналізовано одержані результати.

6. Получение биофункциональных наноматериалов на основе высокодисперсного кремнезема, белка и аминоуглеводов / Н. П. Галаган, Н.Ю. Клименко, И. Л. Орел, А. А. Новикова, В. В. Туров // Biopolymers and Cell. - 2010. - V. 26, № 3. - С. 205-213.

Здобувачем синтезовано нанокомпозити «високодисперсний кремнезем/N-ацетил-D-глюкозамін» та «високодисперсний кремнезем/альбумін/N-ацетил-D-глюкозамін» і охарактеризовано їх методом ІЧ-спектроскопії.

7. Мас-спектрометричне дослідження термолізу аміноцукрів, адсорбованих на поверхні модифікованих білком пірогенних оксидів / Н.Ю. Клименко, Н. П. Галаган, Б. Г. Місчанчук, В. О. Покровський // Методы и объекты химического анализа. - 2010. - Т. 5, № 4. - С. 218-225.

Здобувачем виконано підготовку зразків для мас-спектрометричного дослідження та інтерпретовано одержані мас-спектри.

8. Здатність N-ацетилнейрамінової кислоти до адсорбції на високодисперсному кремнеземі з адсорбованим білком / Н. П. Галаган, І. В. Сіора, І. Л. Орел, Н.Ю. Клименко, Б. Г. Місчанчук // Наноматеріали в хімії, біології та медицині : всеукр. з міжнар. участю конф. молодих учених, 15-17 трав. 2007 : автореф. доп. - К., 2007. - С. 151-152.

Здобувачем проведено адсорбцію бичачого сироваткового альбуміну з водного розчину на поверхні високодисперсного кремнезему.

9. Взаємодія БСА з наносистемами Аl₂O₃/SiO₂ та TiO₂/SiO₂ / Н.Ю. Клименко, Л. С. Андрійко, В. І. Зарко, Н. П. Галаган // Нанорозмірні системи. Будова - властивості - технології : ІІ міжнар. конф., 21-23 лист. 2007 : тези конф. - К., 2007. - С. 427.

Здобувачем виконано адсорбційні експерименти та прийнято участь в інтерпретації одержаних результатів.

10. Клименко Н.Ю. Порівняльне вивчення адсорбційної взаємодії білка бичачого сироваткового альбуміну із високодисперсним кремнеземом та алюмокремнеземом / Н.Ю. Клименко, Н. П. Галаган // Сучасні проблеми хімії: дев'ята всеукр. конф. студентів та аспірантів, 14-16 трав. 2008 : зб. тез доп. - К., 2008. - С. 27.

Здобувачем досліджено адсорбцію альбуміну на поверхні високодисперсного кремнезему та алюмокремнезему, одержані нанокомпозити охарактеризовано методом ІЧ-спектроскопії.

11. Клименко Н.Ю. Дослідження адсорбції N-ацетил-D-глюкозаміну на поверхні вихідного та модифікованого білком високодисперсного кремнезему та алюмокремнезему / Н.Ю. Клименко, Н. П. Галаган // Хімія, фізика та технологія поверхні наноматеріалів : всеукр. конф. з міжнар. участю, 28-30 трав. 2008 : автореф. доп. - К., 2008. - С. 164.

Здобувачем виконано експерименти по адсорбції N-ацетил-D-глюкозаміну на кремнеземах.

12. Клименко Н.Ю. Адсорбция N-ацетил-D-глюкозамина на поверхности исходного и модифицированного белком высокодисперсного кремнезема / Н.Ю. Клименко, Н. П. Галаган // Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности. Приоритетная проблема - синтез нанопористых материалов : материалы ХІІІ Всерос. симпозиума с участием иностр. ученых, 20-24 апр. 2009. - Москва - Клязьма, 2009. - С. 113.

Здобувачем вивчено адсорбцію аміноцукру на поверхні вихідного та модифікованого білком високодисперсних кремнеземів.

13. Клименко Н.Ю. Адсорбція N-ацетил-D-глюкозаміну на поверхні титанокремнезему / Н.Ю. Клименко, Н. П. Галаган // ІІ Міжнародна (ІV Всеукраїнська) конференція студентів, аспірантів та молодих вчених з хімії та хімічної технології, 20-24 квіт. 2009 : зб. тез доп. - К., 2009. - С. 148.

Здобувачем проведено модифікування N-ацетил-D-глюкозаміном поверхні вихідного та модифікованого альбуміном титанокремнеземів.

14. Дослідження взаємодії білку САЛ із N-ацетил-D-глюкозаміном методом лазерно-десорбційної мас-спектрометрії / Н.Ю. Клименко, Т. Ю. Громовий, Н. П. Галаган, І. Л. Орел, О. А. Новікова // Сучасні проблеми хімії : десята всеукр. конф. студентів та аспірантів, 19-22 трав. 2009 : зб. тез доп. - К., 2009. - С. 150.

Здобувачем проведено спектрофотометричні дослідження розчинів альбуміну та аміноцукру в залежності від концентрації вуглеводу в розчині.

15. Клименко Н.Ю. Взаємодія N-ацетил-D-глюкозаміну з поверхнею модифікованих білком високодисперсних оксидів кремнію, титану та алюмінію / Н.Ю. Клименко, Н. П. Галаган // Хімія, фізика та технологія модифікування поверхні : всеукр. конф. за участю іноземних учених, 20-22 трав. 2009 : автореф. доп. -К., 2009. - С. 69-70.

Здобувачем досліджено взаємодію аміноцукру з поверхнею високодисперсних оксидів, модифікованих альбуміном, методом ІЧ-спектроскопії.

16. Klymenko N. Y. Dependence of D-galactosamine adsorption upon the surface structure of ultrafine oxide / N. Y. Klymenko, N. P. Galagan // Modern problems of surface chemistry and physics : International symposium devoted to the 80th anniversary of academician O. O. Chuiko, 18-22 May 2010 : abstracts book. - K., 2010. - P. 500.

Здобувачем виконано адсорбційні експерименти.

17. Galagan N. P. About biological activity of nanocomposites used for optimization of cryomedia in technology of long-term preservation of gene pool of agricultural / N. P. Galagan, N. Y. Klymenko, S. I. Kovtun // Physics and chemistry of nanostructures and on nanobiotechnology : Ukrainian-German symposium, 6-10 Sept. 2010 : book of abstracts - Beregove, The Crimea, Ukraine, 2010. - P. 212.

Здобувачем синтезовано зразки для дослідження біологічної активності в системах із деконсервованими репродуктивними гаметами бика.

18. Клименко Н.Ю. Нанобіокомпозити з аміноцукрами як компоненти кріосередовища в біотехнології зберігання генофонду / Н.Ю. Клименко, О. А. Новікова, Н. П. Галаган // Укр. біохім. журн. - Т. 82, № 4 (додаток 2) : матеріали Х Укр. біохім. з'їзду, 13-17 вер. 2010 : спец. випуск - Одеса, 2010. - С. 260.

Размещено на Allbest.ru