Антиоксидантний захист у щурів за інтоксикації тетрахлорметаном та дії біомаси каротиновмісних дріжджів phaffia rhodozyma

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

АНТИОКСИДАНТНИЙ ЗАХИСТ У ЩУРІВ ЗА ІНТОКСИКАЦІЇ ТЕТРАХЛОРМЕТАНОМ ТА ДІЇ БІОМАСИ КАРОТИНОВМІСНИХ ДРІЖДЖІВ PHAFFIA RHODOZYMA

Колісник Мар'яна Іванівна

Львів-2009

Анотація

Колісник М.І. Антиоксидантний захист у щурів за інтоксикації тетрахлорметаном та дії біомаси каротиновмісних дріжджів Phaffia rhodozyma. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія.- Інститут біології тварин УААН, Львів, 2009.

Дисертація присвячена вивченню дії біомаси каротиновмісних дріжджів P.rhodozyma та в-каротину на процеси перекисного окиснення ліпідів, білків та систему антиоксидантного захисту у щурів за стандартних умов утримання та при моделюванні оксидативного стресу введенням тетрахлорметану. Встановлено, що згодовування ураженим щурам біомаси дріжджів P.rhodozyma або в-каротину зменшувало токсичну дію тетрахлорметану, знижувало накопичення продуктів пероксидного окиснення ліпідів і білків та нормалізувало активність ферментів системи антиоксидантного захисту в печінці, серці, головному мозку та клітинах еритроїдного і гранулоцитарно-моноцитарного рядів кісткового мозку. Порівняльний аналіз антиоксидантної дії каротиновмісних добавок засвідчує сильніший захисний ефект біомаси дріжджів Р.rhodozyma.

Ключові слова: оксидативний стрес, антиоксидантна система, дріжджі Phaffia rhodozyma, каротиноїди.

Аннотация

Колиснык М.И. Антиоксидантная защита у крыс при интоксикации тетрахлорметаном и действии биомассы каротинсодержащих дрожжей Phaffia rhodozyma. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биологии животных УААН, Львов, 2009.

Диссертация посвящена изучению действия биомассы каротинсодержащих дрожжей P.rhodozyma и в-каротина на процессы перекисного окисления липидов, белков и систему антиоксидантной защиты в организме крыс в стандартных условиях их содержания и при моделировании окислительного стресса введением тетрахлорметана. Установлено, что скармливание крысам биомассы дрожжей P.rhodozyma или в-каротина уменьшало токсическое действие тетрахлорметана, снижало накопление продуктов перекисного окисления липидов и белков, нормализировало активность ферментов системы антиоксидантной защиты в печени, серце, головном и костном мозге.

Сравнительный анализ антиоксидантного действия каротинсодержащих добавок свидетельствует о более выраженном защитном эффекте биомассы дрожжей P. rhodozyma.

Ключевые слова: окислительный стресс, антиоксидантная система, дрожжи Phaffia rhodozyma, каротиноиды.

Summary

каротин дріжджі ліпід rhodozyma

Kolisnyk M.I. Antioxidative defense in rats under toxication with tetrachlormethane and influence of carotene-containing yeasts Phaffia rhodozyma. - Manuscript.

Thesis for PhD degree in Biology by speciality 03.00.04 - biochemistry. - Institute of Animal Biology UAAS, Lviv, 2009

Dissertation presents results of investigation of corrective influence of carotenoproducting yeasts P. rhodozyma biomass and в-carotene on processes of lipid and protein peroxidation as well as on antioxidant defense in rats under standard conditions and under tetrachlormethane-induced oxidative stress. Feeding with carotene-containing additive under standard conditions had almost no influence on prooxidant-antioxidant balance, but it increased total antioxidant activity in liver, brain tissue and myocardium of rats. Addition of yeast biomass to the ration of rats led to decrease of accumulation of lipid peroxidation products and increased content of reduced glutathione. Feeding rats with в-carotene had a versatile impact, inasmuch as it leads to decrease in content of TBA-reactive substances in granulomonocytic cells of bone marrow and increased level of dien conjugate in erythroid cells.

Injections of tetrachlormethane caused development of oxidative stress as far as it increased accumulation of lipid and protein peroxidation products, decreased activity of antioxidant defense enzymes, reduced the concentration of reduced glutathione and total antioxidant activity in liver, brain and heart tissue. It has been revealed that feeding with carotenoproducting yeasts P. rhodozyma biomass and в-carotene reduced toxic effect of tetrachlormethane. It was observed that activity of aminotransferases and middle mass molecules concentration in serum was decreased. Level of dien conjugate, lipid peroxidation products, TBA-reactive substances and level of carbonyl protein groups was diminished, whereas antioxidant enzymatic activity (superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase) in heart, brain tissue and myocardium was normalized.

Intoxication with tetrachlormethane promoted free radical processes in granulomonocytic and erythroid bone marrow cells. Hence concentration of dien conjugates and TBA-reactive substances increased whereas activity of superoxide dismutase was lowered and activity of catalase and glutathione peroxidase rose. Addition of carotene-containing yeasts or в-carotene to ration promoted reduction of peroxidation processes activity and normalization of prooxidant-antioxidant balance in investigated cells.

Comparative analysis of carotene-containing yeasts and в-carotene corrective influence on lipid, protein peroxidation and activity of antioxidant enzymes has revealed that biomass of P. rhodozyma had better effect on defense against free radical in rat organism. That is most probably due to a complex of factors including presence of carothenoid astaxanthin. Obtained results enable further research of carotenoproducing yeast P. rhodozyma biomass to be used for correction of metabolic disorders under oxidative stress.

Key words: oxidative stress, antioxidative defense, yeasts P. rhodozyma, carothenoids.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Клітини аеробних організмів у окисновідновних процесах постійно генерують активні метаболіти кисню (АМК), які проявляють широкий спектр фізіологічної дії та відіграють важливу роль у підтриманні гомеостазу організму (Антоняк Г. Л., 2000; Дубинина Е. Е., 2001; Турпаев К. Т., 2002). За нормальних фізіологічних умов концентрація АМК у тканинах невисока, оскільки вони знешкоджуються системою антиоксидантного захисту (САЗ), що забезпечує збалансований перебіг окиснювальних процесів.

Під дією шкідливих чинників (йонізуючі та інші види випромінювань, токсичні речовини, важкі метали) в організмі інтенсифікуються окиснювальні процеси, порушується збалансованість антиоксидантної та прооксидантної систем, що спричиняє розвиток оксидативного стресу (Воробець Н.М., 2004; Гуніна Л.М. зі співавт., 2006). Посилення вільнорадикальних процесів є однією із патогенетичних ланок радіаційних пошкоджень, онкозахворювань, патологій серцево-судинної та бронхо-легеневої систем, алергічних та нейродегенера-тивних захворювань, хімічних інтоксикацій (Гулий М.Ф., 2000; Кліщ І.М., 2002; Mantovani G. еt al., 2003). Перебіг цих захворювань супроводжується, зазвичай, зниженням активності системи антиоксидантного захисту та вираженим синдромом ліпопероксидації (Єлисєєва О.П. зі співавт., 2003; Гуніна Л.М., Олійник С.А., 2006).

В умовах недостатньої активності ендогенної антиоксидантної системи ефективним способом захисту клітин від пошкоджуючої дії вільнорадикального окиснення є введення екзогенних антиоксидантів, які попереджують негативні зміни в організмі (Гонський Я.І. зі співавт., 1994; Губский Ю.И., 1999). До сполук з антиоксидантними властивостями належать каротиноїди, які є важливими компонентами неферментної ланки САЗ (Куртяк Б.М., Янович В.Г., 2004; Влізло В. В. зі співавт., 2007). Одним із джерел каротиноїдів є дріжджі Phaffia rhodozyma (Johnson E.A. et al., 1980), біомасу яких використовують як кормову добавку до раціону тварин для посилення пігментації м'яса лососевих риб та жовтка яєць птиці. Цінність біомаси цих дріжджів зумовлена їхньою здатністю синтезувати широкий спектр каротиноїдів, значну частку котрих (до 80%) становить астаксантин, який проявляє значно сильнішу, ніж -каротин антиоксидантну дію (Miki W.,1991). Вплив біомаси дріжджів P.rhodozyma на організм ссавців та можливість їхнього використання з метою корегування порушень системи САЗ не з'ясовані.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є частиною наукової тематики лабораторії біотехнології мікроорганізмів Інституту біології тварин УААН «Розроблення біотехнології одержання біомаси дріжджів, збагаченої каротиноїдами і застосування їх як пробіотичного препарату з метою профілактики захворювань с.-г. тварин», № держреєстрації 0106U003036, у якій автор досліджувала процеси перекисного окиснення ліпідів і білків та активність САЗ у щурів за умов згодовування біомаси дріжджів P.rhodozyma та -каротину.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було з'ясувати вплив біомаси каротиновмісних дріжджів P.rhodozyma та в-каротину на процеси перекисного окиснення ліпідів і білків та стан САЗ в тканинах печінки, головного мозку, серця і клітинах гранулоцитарно-моноцитарного та еритроїдного рядів кісткового мозку щурів за умов оксидативного стресу, індукованого тетрахлорметаном (ТХМ).

Відповідно до мети, були поставлені наступні завдання:

дослідити вплив ТХМ на інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів та білків і активність ензимів системи АОЗ в тканинах печінки, головного мозку, серця та клітинах кісткового мозку щурів;

вивчити інтенсивність процесів окисної модифікації ліпідів та білків у тканинах печінки, головного мозку, серця та клітинах з високим рівнем проліферації при згодовуванні щурам біомаси дріжджів P.rhodozyma та в-каротину у разі утримання їх у стандартних умовах віварію;

дослідити активність супероксиддисмутази, каталази, глутатіон-пероксидази та окремих компонентів неферментної ланки САЗ у організмі щурів при згодовуванні їм біомаси дріжджів P.rhodozyma та в-каротину;

з'ясувати ефективність застосування біомаси дріжджів P.rhodozyma та в-каротину для корегування порушень прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу у тканинах печінки, головного мозку, серця та клітинах кісткового мозку щурів за оксидативного стресу, зумовленого введенням тетрахлорметану.

Об'єкт дослідження - оксидативний стрес за дії тетрахлорметану та коригувальний ефект біомаси дріжджів P. rhodozyma та в-каротину.

Предмет дослідження - вміст продуктів окисної модифікації білків та ліпідів, активність антиоксидантних ферментів і окремих показників неферментної ланки САЗ у тканинах печінки, головного мозку, серця та клітинах кісткового мозку щурів.

Методи досліджень - при виконанні роботи використано біохімічні (визначення вмісту карбонільних груп білків, дієнових кон'югатів, гідропероксидів ліпідів, відновленого глутатіону, вітамінів А і Е, сумарної антиоксидантної активності, тіобарбітурактивних (ТБК-активних) продуктів і активності ензимів) та статистичні (біометричне оброблення результатів) методи досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше з'ясовано, що за інтоксикації щурів ТХМ посилюються процеси перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) не тільки у тканинах печінки, але й у клітинах гранулоцитарно-моноцитарного та еритроїдного рядів кісткового мозку.

Встановлено, що при згодовуванні щурам біомаси дріжджів P.rhodozyma змінюється антиоксидантний статус їх організму. Зокрема, у печінці, серці та головному мозку підвищувалася загальна антиоксидантна активність, знижувався рівень дієнових кон'югатів і карбонільних груп білків, а також зростала активність глутатіонпероксидази у головному мозку та супероксиддисмутази у серці. У клітинах гранулоцитарно-моноцитарного і еритроїдного рядів кісткового мозку щурів, яких утримували на раціонах з добавкою біомаси дріжджів, зменшувалося нагромадження продуктів ПОЛ.

Встановлено, що додавання до раціону щурів біомаси дріжджів P.rhodozyma гальмує розвиток оксидативного стресу, зумовленого введенням ТХМ, що проявлялося зниженням рівня продуктів окисної модифікації білків і ліпідів, підвищенням активності ферментів-антиоксидантів у печінці, головному мозку та серці тварин. Згодовувана щурам біомаса дріжджів та в-каротин призводять до зменшення токсичної дії ТХМ на клітини кісткового мозку, внаслідок чого знижується вміст продуктів ліпопероксидації та підвищується активність ферментів-антиоксидантів. Корегуюча дія біомаси дріжджів P.rhodozyma на прооксидантно-антиоксидантний гомеостаз у організмі щурів є ефективнішою, ніж в-каротину.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано спосіб профілактики оксидативного стресу та нормалізації процесів ПОЛ у тварин шляхом введення у раціон біомаси дріжджів P.rhodozyma у кількості 2% від маси корму (патент України № 29167). Результати досліджень розширюють та поглиблюють існуючі уявлення про вплив каротиноїдів на стан системи антиоксидантного захисту і можуть бути теоретичною основою для дальших досліджень та вдосконалення наявних і розроблення нових ефективних способів профілактики метаболічних порушень при оксидативному стресі.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведено пошук та аналіз наукової літератури, виконано експериментальну частину роботи, статистичне опрацювання результатів, написання та оформлення дисертації. Планування досліджень, аналіз та інтерпретацію результатів роботи і підготовку рукописів статей проведено за участю наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Головні положення дисертаційної роботи представлені на науково-практичній конференції молодих науковців і спеціалістів “Сучасний стан тваринництва та перспективи його розвитку” (Львів, 2006), VІІ Міжнародній конференції “Биоантиоксидант” (Москва, 2006), ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), ІІ з'їзді Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007), науково-практичній конференції молодих науковців і спеціалістів “Актуальні проблеми біології, тваринництва та ветеринарної медицини” (Львів, 2007), ІV Міжнародній науковій конференції “Молодь і поступ біології” (Львів, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей у фахових наукових виданнях, 3 тези доповідей у збірниках матеріалів з'їздів і конференцій та отримано 1 патент на корисну модель.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів досліджень, аналізу й узагальнення отриманих результатів, висновків та практичних рекомендацій. Робота викладена на 145 сторінках друкованого тексту і містить 8 рисунків та 21 таблицю, які займають 12 сторінок. Список використаної літератури включає 330 джерел, у тому числі українською та російською мовами - 104, іншими мовами - 226.

1. Основний зміст роботи

Огляд літератури. У цьому розділі розглянуто механізми утворення АМК у клітині, охарактеризовано роль ферментної та неферментної ланок САЗ у попередженні пошкоджень молекул вільнорадикальними процесами, висвітлено сучасний стан знань про механізми біологічної та антиоксидантної дії каротиноїдів, охарактеризовано дріжджі P.rhodozyma, як джерело астаксантину.

Матеріали та методи досліджень. Дослідження виконані на самцях білих щурів лінії Вістар із початковою масою тіла 120-130 г, яких утримували в умовах віварію на стандартному раціоні. У роботі використовували селекціонований у Інституті біології тварин УААН штам дріжджів P.rhodozyma ІМВ Y-5026, у біомасі якого вміст каротиноїдів становив 20 мг/г сухої біомаси, в т.ч. астаксантину - 13 мг/г сухої біомаси.

Перша серія дослідів проведена на 3-х групах щурів по 4 тварини у кожній: 1 - контрольна група; 2 - щури, яким згодовували біомасу дріжджів P.rhodozyma (2% від маси корму); 3 - тварини, яким згодовували в-каротин у дозі 40 мг/100 г комбікорму (кількість еквівалентна вмісту каротиноїдів у біомасі дріжджів, що споживали щури 2 групи). Через 19 днів тварин забивали під легким ефірним наркозом та відбирали зразки тканин печінки, головного мозку, серця, крові та кісткового мозку для досліджень.

Другу серію дослідів проводили на 4 групах щурів по 4 тварини у кожній: 1 - інтактні тварини; 2 - щури, яким вводили ТХМ при згодовуванні стандартного раціону; 3 - щури, яким згодовували біомасу дріжджів P.rhodozyma (2% від маси корму); 4 - тварини, яким згодовували в-каротин у дозі 40 мг/100 г комбікорму (кількість еквівалентна вмісту каротиноїдів в біомасі дріжджів, які додавали до раціону щурів 3-ї групи). Тваринам 2, 3 і 4-ї груп на 14-й день досліду внутріочеревинно вводили ТХМ двічі через день у дозі 0,2 мл/100 г маси тіла у вигляді 50% олійного розчину. Забій тварин проводили через 48 год після останнього введення токсиканту. Для аналізів відбирали такий же матеріал, як і в першій серії досліджень. З тканин органів готували гомогенати у 0,02 М Tris-HCl буфері рН 7,4.

Клітини кісткового мозку виділяли зі стегнових кісток шляхом аспірації, фракціонували центрифугуванням суспензії клітин у тришаровому градієнті густини суміші фікол-верографіну (d₁=1,03 г/см³, d₂= 1,09 г/см³, d₃=1,1 г/см³, Сибирная Н. А. c соавт., 1991). Для одержання лізатів клітини руйнували шляхом заморожування у рідкому азоті.

Інтенсивність процесів ПОЛ оцінювали за такими показниками: вмістом дієнових кон'югатів (Романова Л.А., Стальная И.Д., 1977), гідроперекисів ліпідів (Мирончик В.В., 1984), ТБК-активних продуктів (Лущак В.І. зі співавт., 2004). Вміст карбонільних груп білків визначали спектрофотометричним методом при л=370 нм за кількістю динітрофенілгідразонів, утворених при взаємодії цих груп з 2,4-динітрофенілгідразином (Лущак В.І. зі співавт., 2004), концентрацію молекул середньої маси - за методом В. В. Николайчика зі співавт. (1991). Активність супероксиддисмутази (СОД, КФ 1.15.1.1) визначали за методом Чевари С. зі співавт. (1991), активність каталази (КФ 1.11.1.6) - за зменшенням інтенсивності забарвлення утвореного комплексу Н₂О₂ з солями молібдену (Королюк М.А. зі співавт., 1988), активність глутатіонпероксидази (ГПО, КФ 1.11.19) - за методом Моіна (Моин В.И., 1986). Визначення активності аланін- (АлАТ, КФ 2.6.1.2) та аспартат-амінотрансферази (АсАТ, КФ 2.6.1.1) проводили методом S. Reitman і S. Frankel (1957). Загальну антиоксидантну активність визначали, використовуючи модельну систему, в якій субстратом окиснення була ліноленова кислота (Промыслов М.Ш., Демчук М.Л., 1990). Концентрацію білка досліджували спектрофотометрично (Lowry О.Н. et al., 1951), відновленого глутатіону - з реактивом Елмана (Thomas D.S. et al., 1960), а вітамінів А та Е - за В.Н. Скуріхіним (Скурихин В.Н.,1991). Статистично опрацювали результати за загальноприйнятими методиками варіаційної статистики (Лакин Г.Ф., 1990), використовуючи критерій Стьюдента. Дані подано як середнє ± похибка середнього (М ± m).

Стан системи антиоксидантного захисту у печінці, головному мозку та серці щурів при згодовуванні їм Я-каротину та біомаси дріжджів Р. rhodozymа. У першій серії дослідів, при утриманні щурів у стандартних умовах віварію, встановлено, що введення в-каротину та біомаси дріжджів P.rhodozyma у раціон суттєво не впливало на вміст ТБК-активних продуктів і гідропероксидів ліпідів у печінці, головному мозку та серці, проте рівень дієнових кон'югатів у цих органах при згодовуванні біомаси дріжджів знижувався відповідно на 25% (р<0,01), 14% (р<0,05) і 13% (р<0,05), а при додаванні до раціону в-каротину - на 6%, 17% (р<0,05) та 28% (р<0,05), що може свідчити про пригнічення вільнорадикального окиснення на початковій стадії ліпопероксидації.

Надійним маркером окисного ушкодження компонентів клітини є продукти окиснення білків (Лущак В. І. зі співавт., 2004). У тварин, яким згодовували біомасу дріжджів P. rhodozyma, кількість 2,4-динітрофеніл-гідразонів знижувалася, порівняно з контролем, у тканинах печінки на 18% (р<0,05), головного мозку - на 9% (р<0,05). При додаванні до раціону в-каротину вміст сполук окисної модифікації білків у печінці та серці щурів суттєво не відрізнявся від тварин контрольної групи, а у головному мозку щурів - був вищим на 8% (р<0,05). Результати дослідження ферментів-антиоксидантів, засвідчують, що при згодовуванні біомаси дріжджів P.rhodozyma та в-каротину щурам за стандартних умов утримання суттєво не змінюється активність ферментної ланки САЗ, окрім підвищення активності СОД у серці (на 21%, р<0,01) та глутатіонпероксидази в головному мозку (на 15%, р<0,05) тварин, яким згодовували біомасу каротиносинтезувальних дріжджів. Каротиноїди можуть підвищувати активність ферментів-антиоксидантів (Ляхович В.В. зі співавт., 2006). Одержані нами результати, очевидно, можна пояснити достатньою активністю досліджуваних ферментів у тканинах щурів за умов проведеного досліду для підтримання прооксидантно-антиоксидантної рівноваги.

У забезпеченні захисту організму від дії реакційноздатних кисневих метаболітів важливу роль відіграють неферментні антиоксиданти. Під час проведення дослідів не виявлено суттєвого впливу каротиновмісних добавок на концентрацію відновленого глутатіону та рівень вітамінів А і Е у печінці щурів, окрім підвищення вмісту вітаміну А на 62% (р<0,05) при згодовуванні в-каротину. Відомо, що астаксантин, який міститься у біомасі дріжджів P.rhodozyma, не метаболізується в організмі тварин до вітаміну А (Olson J. A., 1994), що узгоджується з одержаними даними.

Досліджуючи загальну антиоксидантну активність, яка відображає здатність організму протистояти активації ПОЛ, встановили, що введення біомаси каротиновмісних дріжджів у раціон щурів підвищувало рівень цього показника у печінці, головному мозку та міокарді на 7% (р<0,01), 13% (р<0,001) і 6% (р<0,01), відповідно. Добавка до раціону в-каротину підвищувала буферну ємність САЗ лише у тканині печінки (р<0,001).

Відомо, що чутливість клітин до дії ксенобіотиків залежить від їхньої метаболічної активності, стадії диференціювання та проліферативної активності. У зв'язку з цим кістковий мозок вважають одним із найчутливіших до оксидативного стресу. Згодовування щурам біомаси дріжджів P.rhodozyma зумовлювало зниження (табл. 1) рівня дієнових кон'югатів та ТБК-активних продуктів у клітинах еритроїдного (ЕР) і гранулоцитарно-моноцитарного рядів (ГМР). При додаванні до раціону щурів в-каротину зміни концентрації продуктів ПОЛ у клітинах кісткового мозку різних паростків не були однозначними: вміст дієнових кон'югатів у клітинах ЕР підвищувався на 11%, а у ГМР рівень ТБК-активних продуктів знижувався на 17%. Можливо, причиною таких змін є різна інтенсивність метаболізму та вища активність ферментів-антиоксидантів у клітинах ГМР. Не виключено, що в-каротин у процесі всмоктування та транспортування частково окиснювався, а продукти окиснення діяли як прооксиданти (Поляков Н. Э., 2006).

Введення біомаси дріжджів у раціон щурів спричиняло зниження активності СОД та каталази як у клітинах ЕР, так і у ГМР (табл. 1). Слід відзначити, що зниження активності СОД та каталази спостерігали на фоні зменшення нагромадження первинних та вторинних продуктів ПОЛ. Очевидно, прооксидантно-антиоксидантна рівновага за цих умов не порушувалася.

Утримання щурів на раціонах з додаванням біомаси дріжджів призводило до зростання концентрації відновленого глутатіону у клітинах ЕР та ГМР, відповідно, на 23% та 28% (р<0,05). Згодовування щурам в-каротину суттєво не впливало на вміст цього антиоксиданту в клітинах кісткового мозку.

Аналіз отриманих даних дає підставу вважати, що каротиновмісні добавки, введені до раціону щурів, впливають на стан пероксидного окиснення ліпідів у клітинах з високою проліферативною активністю. Однак характер впливу досліджуваних добавок є неоднаковим.

Таблиця 1. Вплив біомаси дріжджів P. rhodozyma та в-каротину на активність ферментів системи антиоксидантного захисту у клітинах кісткового мозку щурів, (M±m, n=4)

Примітка. У цій та наступних таблицях: *- різниця вірогідна відносно тварин контрольної групи (р<0,05-0,001); ⁺- різниця вірогідна відносно тварин другої групи (р<0,05-0,001)

Дія біомаси дріжджів Р.rhodozyma та Я-каротину на прооксидантно-антиоксидантний гомеостаз у щурів, інтоксикованих тетрахлорметаном. При отруєнні тварин ТХМ у сироватці крові зростала активність АсАТ у 3,8 раза, активність АлАТ - у 7,4 раза, а значення коефіцієнта де Рітіса (АсАТ/АлАТ) знижувалося з 1,31 до 0,67. Добавка до раціону біомаси каротиновмісних дріжджів або в-каротину зменшувала токсичну дію ТХМ. Активність АсАТ та АлАТ у сироватці крові щурів 3-ї групи знижувалася, порівняно з такою у 2-ій групі, на 68% (р<0,05) та 76% (р<0,001), відповідно. Згодовуваний щурам в-каротин також проявляв корегуючий вплив при ушкодженні ТХМ, однак активність амінотрансфераз у тварин цієї групи була вищою за фізіологічну норму.

Отруєння тварин ТХМ призводило до зростання концентрації первинних та вторинних продуктів ПОЛ у тканинах печінки, головного мозку та серця щурів (табл. 2). За умов згодовування біомаси дріжджів при інтоксикації щурів вміст дієнових кон'югатів зменшувався, порівняно з тваринами 2-ї групи, у печінці на 37%, у головному мозку - на 34%, серці - на 19%, а при додаванні до раціону в-каротину - на 19%, 17% та 49%, відповідно.

Добавки біомаси дріжджів або в-каротину до раціону нормалізували спричинене ТХМ зростання концентрації гідроперекисів ліпідів і ТБК-активних сполук у печінці, головному мозку та серці щурів. Порівняльний аналіз захисного впливу каротиновмісних добавок до раціону від дії ТХМ на процеси ПОЛ засвідчив, що у щурів, яких утримували на раціонах з додаванням біомаси дріжджів, порівняно до тварин, раціон яких містив в-каротин, виявлено нижчий рівень дієнових кон'югатів у печінці на 23% (р<0,05), у головному мозку - на 21% (р<0,01), менший вміст гідроперекисів ліпідів у печінці на 32% (р<0,01) і концентрації ТБК-активних продуктів у головному мозку - на 28% (р<0,01). Отже, біомаса дріжджів P.rhodozyma проявляла сильнішу захисну дію, ніж в-каротин.

Під дією ТХМ у печінці, головному мозку та серці щурів зростав вміст карбонільних груп білків. При інтоксикації щурів, яких утримували на раціонах з каротиновмісними добавками, кількість 2,4-динітрофенілгідразонів у печінці та головному мозку була достовірно нижчою, порівняно з тваринами 2-ї групи, проте рівня контролю не досягала. Вміст карбонільних груп у серці інтоксикованих щурів, яким згодовували біомасу дріжджів або в-каротин, не відрізнявся від такого у інтактних тварин.

Окисна модифікація білків значно збільшує їхню доступність до дії протеаз і внаслідок протеолізу утворюються молекули середньої маси (МСМ). Отруєння щурів ТХМ призводило до значного зростання концентрації МСМ як у сироватці крові, так і у печінці. Згодовування інтоксикованим тваринам біомаси каротиновмісних дріжджів або в-каротину зменшувало вміст МСМ, порівняно з 2-гою групою, у сироватці крові на 26-27% (р<0,05), у печінці - на 40% (р<0,001) і 17% (р<0,001), відповідно. Отримані результати свідчать, що захисна дія дріжджів P.rhodozyma від окисної модифікації молекул білків у тканинах печінки та головного мозку інтоксикованих щурів виражена сильніше, порівняно з в-каротином.

Для нормального функціонування і життєдіяльності організму вільнорадикальні реакції повинні підтримуватися на певному постійному рівні за рахунок злагодженої дії ензимів антиоксидантної системи. При ураженні щурів ТХМ активність СОД знижувалася у печінці, головному мозку та серці, каталази - у печінці, а глутатіонпероксидази - у печінці та головному мозку (табл. 2).

Таблиця 2. Вплив біомаси дріжджів P. rhodozyma та в-каротину на активність ферментів-антиоксидантів у органах щурів за дії тетрахлорметану, (M±m, n=4)

Утримання щурів на раціонах з каротиновмісними добавками проявляло протекторну дію, спричиняючи підвищення СОД і ГПО у досліджуваних органах та каталази у печінці. Слід відмітити, що активність ГПО у головному мозку, а каталази у печінці щурів 3-ї групи була вірогідно вищою від інтактних тварин, що має, очевидно, компенсаторний характер і може свідчити про їхню підвищену адаптаційну здатність. Позитивна дія каротиноїдів позначається і на неферментній ланці САЗ (табл. 4). Утримання інтоксикованих щурів на раціонах з каротиновмісними добавками запобігало зниженню концентрації відновленого глутатіону, вітамінів А і Е у печінці та сумарної антиоксидантної активності.

Отже, згодовування біомаси дріжджів P.rhodozyma або в-каротину щурам, яким вводили тетрахлорметан, гальмує розвиток оксидативного стресу.

Таблиця 3. Вміст відновленого глутатіону, вітамінів А та Е і сумарної антиоксидантної активності у печінці щурів, (M±m, n=4)

Інтоксикація щурів ТХМ спричиняла значне підвищення вмісту продуктів ПОЛ у клітинах кісткового мозку. Згодовування тваринам корму з добавкою біомаси каротиновмісних дріжджів або в-каротину зменшувало токсичну дію ТХМ. Так, вміст дієнових кон'югатів під дією ТХМ у клітинах кісткового мозку ЕР у тварин 3-ї та 4-ї дослідних груп знижувався відповідно на 23% та 28%, порівняно з таким у щурів 2-ї групи, а у клітинах ГМР - на 28% та 21%, відповідно.

Захисна дія каротиноїдів виявлена і при дослідженні вторинних продуктів ПОЛ у клітинах кісткового мозку щурів. Так, у тварин 3-ї групи вміст ТБК-активних продуктів у клітинах ЕР та ГМР знижувався відповідно на 54% та 22%, порівняно з таким у тварин 2-ї групи.

При ураженні щурів ТХМ активність СОД у клітинах ЕР та ГМР знижувалася на 30% та 41%, а активність каталази і ГПО підвищувалася на 45% і 29% та 38% і 46%, відповідно, що, можливо, є захисною реакцією на посилення вільнорадикальних процесів.

Введення до раціону щурів біомаси дріжджів P.rhodozymа внормовувало активність ферментів САЗ у клітинах кісткового мозку. Так, активність СОД у клітинах ЕР та ГМР тварин 3-ї групи, порівняно з такою у тварин 2-ї групи, підвищувалася на 37% та 64%, активність каталази знижувалася на 18% і 31%, а ГПО - на 17% і 15% відповідно. Подібні закономірності виявлені і при дослідженні дії в-каротину на активність ферментів у клітинах кісткового мозку інтоксикованих щурів.

У щурів, інтоксикованих ТХМ, виявлено істотне збільшення вмісту відновленого глутатіону у клітинах кісткового мозку, порівняно з інтактними тваринами (у клітинах ЕР - на 64%, р<0,001, у ГМР - на 84%, р<0,001). Ряд авторів вважають (Ляхович В. В. зі співав., 2006), що існують механізми, завдяки яким клітини утримують і навіть підвищують вміст відновленого глутатіону у відповідь на оксидативний стрес. Така функція клітин є дуже важливою у попередженні ушкодження клітин і збереженні їхньої цілісності. Інтоксикація щурів, яким згодовували каротиновмісні добавки, не впливала на рівень відновленого глутатіону у клітинах кісткового мозку різних ростків.

Порівняльний аналіз захисної дії каротиновмісних добавок свідчить про більшу ефективність біомаси дріжджів P.rhodozyma у корегуванні наслідків оксидативного стресу, індукованого введенням ТХМ. Захисна дія біомаси дріжджів на вільнорадикальні процеси, очевидно, зумовлена комплексом чинників, зокрема і наявністю астаксантину, який проявляє значно вищу антиоксидантну дію, ніж в-каротин (Miki W., 1991). Також у цих дріжджів виявлено сильний антиоксидант, фафіаол, який за хімічною будовою є 2,4-диметокси-6-гептадецилфенолом (Jinno S. et al., 1998). Захисну дію від пошкодження вільними радикалами можуть проявляти компоненти клітинної стінки дріжджів (Yang Y. et al., 2006). Проведені дослідження дають підставу вважати перспективним подальше вивчення дріжджів P. rhodozyma з метою використання їх біомаси для корегування метаболічних порушень, які виникають при оксидативному стресі.

Висновки

У дисертації теоретично узагальнені та по-новому вирішені окремі аспекти проблеми захисту організму тварин від оксидативного стресу, спричиненого дією тетрахлорметану, представлено нові наукові результати щодо корегуючого впливу біомаси каротиновмісних дріжджів P.rhodozyma та в-каротину на інтенсивність процесів перекисного окиснення білків і ліпідів та активність ферментів системи антиоксидантного захисту в організмі щурів. У результаті вирішення наукової проблеми зроблено такі висновки:

1. Введення до раціону щурів 2% біомаси дріжджів P.rhodozyma призводить до зростання загальної антиоксидантної активності у печінці, головному мозку, міокарді і підвищення активності супероксиддисмутази у міокарді (р<0,01) та глутатіонпероксидази у головному мозку (р<0,05), що супроводжується зменшенням вмісту дієнових кон'югатів у печінці - на 25% (р<0,01), серці - на 13% (р<0,05), головному мозку - на 14% (р<0,05) та рівня карбонільних груп білків у печінці - на 18% (р<0,05), головному мозку - на 9% (р<0,05).

2. При згодовуванні щурам біомаси каротиновмісних дріжджів у клітинах кісткового мозку еритроїдного та гранулоцитарно-моноцитарного рядів знижується вміст дієнових кон'югатів (на 15%, р<0,05 і 30%, р<0,001, відповідно), ТБК-активних сполук (на 22%, р<0,01 і 18% р<0,01, відповідно) та підвищується концентрація відновленого глутатіону (на 23%, р<0,01 і 28%, р<0,01, відповідно).

3. Додавання до раціону щурів в-каротину проявляє неоднозначну дію: кількість дієнових кон'югатів зменшується у головному мозку на 17% (р<0,05), серці - на 28% (р<0,05), а вміст окисно модифікованих форм білків у головному мозку підвищується на 8% (р<0,05). Введення у раціон щурів в-каротину на 17% (р<0,05) знижує вміст ТБК-активних сполук у клітинах гранулоцитарно-моноцитарного ряду, але підвищує рівень дієнових кон'югатів у еритроїдному ряді на 11% (р<0,05).

4. Інтоксикація щурів тетрахлорметаном посилює процеси окисної модифікації білків і ліпідів, знижує активність супероксиддисмутази та загальну антиоксидантну активність у печінці, серці та головному мозку. У печінці інтоксикованих щурів зменшується активність каталази у 2,0 рази (р<0,001) і глутатіонпероксидази у 1,8 раза (р<0,001), підвищується активність аланінамінотрансферази у 7,2 раза (р<0,001) та аспартат-амінотрансферази у 3,9 раза (р<0,001) і зростає концентрація молекул середньої маси у сироватці крові у 1,7 раза (р<0,01).

5. Введення тетрахлорметану посилює процеси перекисного окиснення ліпідів у клітинах кісткового мозку еритроїдного та гранулоцитарно-моноцитарного рядів: рівень дієнових кон'югатів (р<0,001) і ТБК-активних сполук (р<0,001) зростає, знижується активність супероксиддисмутази (на 30%, р<0,01 та 41%, р<0,01, відповідно) та підвищується активність глутатіонпероксидази (на 29%, р<0,05 та 46%, р<0,01, відповідно) і каталази (на 45%, р<0,01 і 38%, р<0,01, відповідно).

6. Утримання щурів на раціонах з добавкою біомаси дріжджів P.rhodozyma або в-каротину зменшує токсичний вплив тетрахлорметану: активність амінотрансфераз і коефіцієнт де Рітіса у сироватці крові нормалізуються, а концентрація молекул середньої маси знижується у печінці відповідно на 41% (р<0,001) і 17% (р<0,01), а у сироватці крові - на 26% (р<0,01) і 24% (р<0,01).

7. Згодовування біомаси дріжджів P. rhodozyma або в-каротину щурам, яким вводили тетрахлорметан, гальмує розвиток оксидативного стресу: знижує рівень дієнових кон'югатів, ТБК-активних продуктів, карбонільних груп білків, підвищує активність супероксиддисмутази, глутатіонпероксидази, каталази і сумарну антиоксидантну активність у печінці, головному мозку та серці тварин.

8. При введенні до складу раціону щурів в-каротину або біомаси каротиносинтезувальних дріжджів P. rhodozyma в умовах інтоксикації ТХМ знижується інтенсивність процесів ліпопероксидації у клітинах гранулоцитарно-моноцитарного та еритроїдного рядів та нормалізується в них активність ферментів системи антиоксидантного захисту.

9. Отруєння щурів тетрахлорметаном призводить до зниження вмісту відновленого глутатіону (на 35%) та вітамінів А (на 29%) і Е (на 29%) у тканині печінки. Введення у раціон інтоксикованих тварин біомаси дріжджів P.rhodozyma або в-каротину спричиняє підвищення у печінці концентрації відновленого глутатіону на 65% (р<0,01) і 56% (р<0,001) та вітамінів А на 23% (р<0,05) і 34% (р<0,01) та Е на 28% (р<0,05) і 35% (р<0,05), відповідно.

10. Порівняльний аналіз корегувальної здатності досліджуваних добавок за умов отруєння щурів тетрахлорметаном свідчить про вищий захисний ефект біомаси дріжджів P. rhodozyma, порівняно з в-каротином.

Отримані результати можуть бути застосовані:

1) для розроблення нових та вдосконалення наявних засобів профілактики метаболічних порушень при оксидативному стресі, хіміо- та радіотерапії і лікуванні захворювань, пов'язаних з порушенням антиоксидантного статусу організму;

2) з метою профілактики розладів системи антиоксидантного захисту та для зменшення шкідливого впливу оксидативного стресу пропонується вводити у раціон тварин 2% біомаси дріжджів P. rhodozyma;

3) в курсах лекцій з біохімії, біотехнології та мікробіології.

Перелік наукових праць, опублікованих за матеріалами дисертації

1. Колісник М.І. Вплив каротиноїдів на стан системи антиоксидантного захисту головного мозку щурів при отруєнні тетрахлорметаном / М.І. Колісник // Експериментальна та клінічна фізіол. і біохім. - 2007. - № 3. - С. 62-66.

2. Колісник М.І. Вплив біомаси каротиносинтезуючих дріжджів Phaffia rhodozyma на стан антиоксидантної системи печінки при інтоксикації щурів тетрахлорметаном / М.І. Колісник, Н.І. Борецька, М.В. Камінська // Медична хімія. - 2007. - Т. 9, № 3. - С. 37-40. (Дисертантом проведено дослідження вмісту продуктів ПОЛ, активності ферментів-антиоксидантів, написано рукопис статті).

3. Колісник М.І. Стан вільнорадикального окиснення і антиоксидантної системи захисту у щурів при згодовуванні дріжджів Phaffia rhodozyma / М.І. Колісник, Н.І. Борецька, Л.І.Сологуб // Біологія тварин. - 2007. - Т.9, №1-2. - С.203-207. (Дисертант провела визначення вмісту карбонільних груп білків, тіобарбітуратактивних продуктів, дієнових кон'югатів, гідроперекисів ліпідів, активності ферментів-антиоксидантів, написала рукопис статті).

4. Колісник М.І. Дія тетрахлорметану на організм щурів за умов згодовування в-каротину та біомаси дріжджів Phaffia rhodozyma ІВМ Y-5026 / М.І. Колісник // Вісник Львівського університету. Серія біологічна. - 2008. - Вип. 46. - С. 65-70.

5. Колісник М.І. Стан системи антиоксидантного захисту у клітинах кісткового мозку щурів при згодовуванні біомаси дріжджів Phaffia rhodozyma / М.І. Колісник, В.В. Влізло // Біологія тварин. - 2008. - Т.10, №1-2. - С.122-127. (Дисертантом досліджено вміст продуктів ПОЛ, активність каталази, глутатіонпероксидази та супероксиддисмутази, сформульовано висновки, написано рукопис статті).

6. Патент 29167 Україна МПК А23К 1/16, А23К1/18. Спосіб профілактики оксидативного стресу та нормалізації процесів перекисного окиснення ліпідів у тварин / М.І. Колісник, Є.С. Шах, М.В. Камінська, Н. І. Борецька, заявник і патентовласник Інститут біології тварин УААН. - № 29167; заявл.09.07.2007; опубл.10.01.2008. Бюл. №1. (Дисертант провела дослідження вмісту продуктів ПОЛ, активності ферментів-антиоксидантів у органах щурів, брала участь у оформленні патенту).

7. Колиснык А.В. Антиоксидантное действие биомассы каротино-синтезирующих дрожжей Phaffia rhodozyma / А.В. Колиснык, М.В. Каминская, Н.И. Борецкая, М.И. Колиснык, Е.С. Шах // Тезисы докладов YІІ Международной конференции [“БИОАНТИОКСИДАНТ”]. - М: Изд-во РУДН.- 2006.- С. 158-159.

8. Камінська М.В. Корегуюча дія біомаси дріжджів Phaffia rhodozyma на порушення окиснювальних процесів в організмі щурів при оксидативному стресі / М.В. Камінська, М.І. Колісник, Н.І. Борецька // Збірник тез 2-го з'їзду Українського товариства клітинної біології. Київ, 2007. - С. 64.

9. Колісник М.І. Корегуюча дія астаксантиносинтезуючих дріжджів на процеси вільнорадикального окиснення у клітинах кісткового мозку / М.І. Колісник // Збірник тез ІY Міжнародної конференції студентів і аспірантів [“Молодь та поступ в біології”]. - Львів, 2008. - С.40-41.

Размещено на Allbest.ru