При збільшенні вмісту левоміцетину інтенсивність смуги вільних силанольних груп (н = 3748 см^-1) зменшується, що обумовлено утворенням водневих зв'язків між електронодонорними групами молекул антибіотика та протонами гідроксильних груп кремнезему. Аналіз УФ спектрів поглинання водних і спиртових розчинів левоміцетину та спектрів відбиття порошків нанокомпозиту і вихідного антибіотика показує, що їх максимум (л_max = 278 нм) співпадає з максимумом спектра молекулярної форми вихідного левоміцетину та його водного розчину. Це свідчить про те, що сорбція відбувається лише за рахунок утворення водневих зв'язків між молекулярними формами левоміцетину та силанольними групами кремнезему без утворення комплексів з переносом протону.

Для вимірювання стабільності отриманих нанокомпозитів досліджено швидкість вивільнення левоміцетину, адсорбованого на поверхні нанокремнезему, коли концентрація антибіотика складала 1 ммоль/г в різні типи рідин: воду, фізіологічний розчин (0,9 % NaCl), етиловий спирт (96 %-ний), розчин соляної кислоти (рН=1,5). Майже повне вивільнення левоміцетину з поверхні кремнезему у воду, розчин соляної кислоти, що відповідає кислотності шлунку та фізіологічний розчин, відбувається більше ніж за 2 години, а в етиловий спирт - менш ніж за годину, що обумовлено більшою ліпофільністю етанолу в порівнянні з водними системами. Таким чином, для нанокомпозитів левоміцетин/кремнезем спостерігається ефект довгострокового утримування органічної речовини на кремнеземній поверхні, що робить їх перспективними для вивчення впливу кремнеземної матриці на біологічну активність композитного лікарського препарату.

Будову гідратної оболонки частинок кремнезему, з закріпленим левоміцетином вивчено методом низькотемпературної ¹Н ЯМР спектроскопії з пошаровим виморожуванням рідкої фази. Спектри являють собою одиночний сигнал, максимум якого має хімічний зсув 4,8 м.ч., що співпадає з хімічним зсувом рідкої води. Аналогічний вигляд мають спектри інших зразків, записані при різних температурах.

Поверхнева енергія адсорбційно модифікованого кремнезему із збільшенням концентрації модифікатора зменшується майже вдвічі - від 200 до 110 мДж/м², що свідчить про зменшення в процесі модифікування гідрофільних властивостей нанокомпозитів. Імовірно, це обумовлено тим, що в органо-кремнеземних частинках частина гідрофільних центрів молекул левоміцетину бере участь у формуванні водневих зв'язків з поверхнею кремнезему, тому частина ліпофільних центрів молекул взаємодіє з водою, що і знижує гідрофільність композиту.

Для зразка, що містить на поверхні 0,4 ммоль/г левоміцетину, досліджено вплив концентрації адсорбованої води на характеристики її зв'язування з поверхнею. Зміну концентрації адсорбованої води здійснювали в інтервалі 0,24 - 3,6 г/г (табл. 1).

Таблиця 1 Залежність характеристик шарів зв'язаної води від певної концентрації води в системі з кремнезему і левоміцетину (0,4 ммоль/г)

Як видно з даних табл. 1, для порошків з ростом концентрації води (С_Н2О) концентрація сильнозв'язаної води (C_UW^S) залишається сталою в широкому інтервалі зміни концентрації модифікатора, а кількість адсорбованої води змінюється лише за рахунок збільшення концентрації слабозв'язаної води (C_UW^W). Максимальна гідратованість порошку відповідає заповненню водою всіх порожнин в міжчастинкових зазорах практично без зміни відстані між окремими частинками.

Із зменшенням концентрації твердої фази величина поверхневої енергії (г_SL) швидко збільшується, що відповідає росту гідратованості частинок. Це обумовлено розривом певної кількості міжчастинкових зв'язків. Оскільки система знаходиться в рівноважних умовах, при розведенні суспензії зміна величини поверхневої енергії частинки-вода повинна компенсувати зміну енергії міжчастинкових взаємодій. Тоді різниця в величині поверхневої енергії при переході від концентрованих до розбавлених суспензій відображає енергію міжчастинкових взаємодій, яка близька до 35 мДж/м².

Особливості впливу кремнезему на життєдіяльність дріжджових клітин і стан зв'язаної води в зоні їх контакту. Для визначення ступеня впливу кремнезему на життєдіяльність дріжджових клітин було визначено абсолютні величини і динаміку виділення вуглекислого газу в процесі бродіння дріжджів в поживному середовищі, до складу якого входила глюкоза, при використанні чистої суспензії дріжджів і суспензій, що містили добавки 0,034, 0,06 і 0,1 % мас кремнезему. На початковій стадії бродіння за умови наявності достатньої кількості поживних речовин відбувається активний процес поділу клітин. Нами зроблено припущення, що однією з причин такого впливу може бути утворення на міжфазній границі клітина/кремнезем умов для формування шару води, властивості якої істотно відрізняються від об'ємних.

Вимірювання проводили в середовищі слабополярного дейтерохлороформу, присутність якого істотно зменшувала ширину сигналів ¹Н ЯМР, дозволяло точно визначати хімічний зсув (_Н) зв'язаної води і, частково, стабілізувало стан води на міжфазній границі дріжджових клітин і частинок кремнезему.

Сигнал води в дріжджових клітинах, які містять 11-27 % мас зв'язаної води, спостерігається у вигляді одиночного сигналу з хімічним зсувом _Н 1,3 м.ч., що відповідає хімічному зсуву слабоасоційованої води, яка практично не приймає участі в утворенні водневого зв'язку. Отже, вся внутріклітинна вода є слабоасоційованою. Для композитних систем, що містили клітинну масу і кремнезем, висушених при тих самих умовах, що і суспензія кремнезему при С_Н2О=12 % мас, більше 90 % загальної кількості зв'язаної води відноситься до слабоасоційованої. Однак, на відміну від зразка 1, при додаванні фіксованих порцій води до зразка 3, інтенсивний сигнал сильноасоційованої води реєструється при значно меншій концентрації зв'язаної води, ніж це мало місце для частково дегідратованої клітинної маси. В зразку 5 до слабоасоційованої відноситься близько 30 % води, а в зразку 6 - близько 20 % від загальної кількості зв'язаної води. таким чином, додавання до клітинної маси кремнезему привело до суттєвої стабілізації слабоасоційованих форм зв'язаної води.

Характеристики шарів зв'язаної води узагальнено в табл. 2, з якої випливає, що гідратація композитного матеріалу відбувається інакше, ніж його компонентів. В присутності кремнезему із зростанням гідратованості системи спостерігається суттєве зменшення кількості слабоасоційованої води і ріст концентрації сильноасоційованої води. Причому останній ефект удвічі більший: при переході від зразка 4 до зразка 6 кількість слабоасоційованої води зменшується на 55 мг/г, в той час як сильноасоційованої - зростає на 160 мг/г. Для сильноасоційованої води збільшення гідратованості супроводжується появою і значним ростом концентрації слабозв'язаної води. Оскільки при аналогічних умовах вся внутріклітинна вода в зразках 1, 2 є сильнозв'язаною але слабоасоційованою, то закономірності, які спостерігаються, відносяться до води, зосередженої на міжфазній границі клітини/кремнезем. Той факт, що для зразка 6, який містить максимальну кількість води, вся слабоасоційована вода стає сильнозв'язаною, може бути обумовлено залежністю проникності клітинних мембран від гідратованості міжфазного шару і, як наслідок, проникненням частини води з зони контакту клітини-частинки всередину клітин, де вона стає слабоасоційованою.

Таблиця 2 Характеристики шарів зв'язаної води в частково дегідратованих дріжджових клітинах, порошку кремнезему та композитних матеріалах, які містять клітинну масу і кремнезем

Отже, при включенні кремнезему в клітинну суспензію, значна частина води в зоні контакту частинка-клітина із сильноасоційованого стану, здатна переходити в слабоасоційований стан, що можливо визначає його стимулюючу біологічну активність.

Розрахунки розподілу пор (внутрішніх порожнин) за розмірами, показують, що спостерігається тенденція зсуву максимуму f(R) для сильноасоційованої води в сторону більших значень. В присутності кремнезему зсув максимуму при збільшенні гідратованості відбувається в сторону, протилежну для зразку, що містить індивідуальні клітини. Це вказує на істотний вплив кремнезему на внутріклітинну воду.

Вивчення антимікробних та гемолітичних властивостей нанокомпозиту. Для встановлення впливу отриманих нанокомпозитів на мікроорганізми та клітини крові, проведено ряд біометричних досліджень.

Внесення в середовище чистого антибіотика в концентрації, що відповідає кількості закріпленого левоміцетину, приводить до зниження кількості клітин E.сoli в 4 рази, а закріпленого на кремнеземі антибіотика - більше ніж в 15 разів. Це свідчить про значне підвищення антимікробної активності нанокомпозиту в порівнянні з чистим левоміцетином. Враховуючи той факт, що антимікробний вплив чистого ВДК у вибраному діапазоні концентрацій не проявляється, причина підвищеної активності композиту може бути пов'язана з декількома факторами: стабілізацією структури антибіотика, пролонгуванням його дії, формуванням на міжфазній границі нанокомпозиту з клітинами міжфазних шарів води з характеристиками, що відрізняються від об'ємних і сприяють проникненню антибіотика в клітини.

Досліджено вплив різних концентрацій левоміцетину, закріпленого на кремнеземі, на приріст біомаси клітин E.coli та St.aureus. Збільшення концентрації левоміцетину в нанокомпозиті недоцільно, оскільки воно не приводить до подальшого зниження приросту біомаси клітин.

Для дослідження гемолітичної активності нанокомпозитів проведено серію гемолітичних тестів in vitro. Хоча левоміцетин не викликає суттєвого гемолізу еритроцитів, метою дослідження була перевірка здатності тонких адсорбційних плівок модифікатора запобігати руйнуванню цих специфічних клітин. Для нанокомпозитів спостерігається деяке зниження гемолітичної активності, пропорційне поверхневій концентрації модифікатора, пов'язане із зменшенням ймовірності адсорбції мембранних білків на кремнеземній поверхні.

Стан води в нанорозмірних порах гідрофобного кополімеру стиролдивінілбензолу та вплив на нього органічних молекул. У шостому розділі представлено результати вивчення фізико-хімічних властивостей індивідуальних органічних речовин та їх сумішей з водою в нанорозмірних порах пористого полімеру стиролдивінілбензолу. Оскільки внутрішньоклітинний простір (особливо частково дегідратованих клітин) являє собою сукупність заповнених водою нанорозмірних порожнин, обмежених біополімерними стінками, обраний адсорбент максимально точно моделював особливості внутрішнього устрою частково дегідратованих клітинних матеріалів, але на відміну від останніх, мав стійку структуру пор, стабільну в широкому діапазоні рН та гідратованості поверхні.

Серед органічних розчинників використовувались диметилсульфоксид (DMSO та DMSO-d₆), хлороформ (CHCl₃ і CDCl₃) та метан (CH₄), перший з яких є добре розчинним в воді, другий - таким, що слабо змішується з водою, а третій - може формувати гідрати при високому тиску. Для вивчення взаємного впливу водної і органічної компоненти, органічні речовини адсорбувались після передадсорбції певної кількості води (зазвичай меншої ніж об'єм пор). Частинки адсорбенту стиролдивінілбензолу мають мікропори R<1 нм та вузькі мезопори 1<R<10 нм. Широкі мезопори 10<R<25 нм і макропори R>80 нм дають незначний вклад в пористість (табл. 3).

Таблиця 3 Струкутрні характеристики мікро- мезопористого полімеру стиролдивінілбензолу, розраховані в наближенні циліндричної форми пор

В спектрі реєструються два сигнали з хімічними зсувом 4,5 й 5 м.ч., відповідно вода в порах стиролдивінілбензолу знаходиться в сильноасоційованому стані, аналогічному стану рідкої воді. Реєстрація одночасно двох сигналів сильноасоційованої води пов'язана з широким розподілом пор за розміром (0,13 нм), в яких можливе формування поліасоціатів з різним середнім числом молекул води. Ймовірно, сигнал в сильних магнітних полях обумовлений водою в порах відносно меншого радіусу. Стан води змінюється у випадку часткового заповнення об'єму пор. При цьому для адсорбованої води спостерігається значне збільшення хімічного зсуву з підвищенням температури. Причому при Т=210 К величина хімічного зсуву досягає свого максимального значення (7 м.ч.), яке є характерним для льодоподібних структур, що свідчить про можливість існування високої впорядкованості води в порах полімеру стиролдивінілбензолу. Необхідно відмітити, що вода в порах полімеру є сильнозв'язаною. Оскільки не замерзає на всьому температурному інтервалі, навіть до 210 К, що відповідає зниженню вільної енергії Гіббса (G) води в порах полімеру на 2 кДж/моль.

Введення в пори крім води полярних або слабополярных органічних речовин у кількості, що не перевищує вільний об'єм пор, слабо впливає на величину хімічного зсуву адсорбованої води. Це дає підставу вважати, що водна й органічна фази в порах існують роздільно. Якщо для хлороформу, який погано розчинний у воді, це цілком природно, то для необмежено розчинного у воді ДМСО можна було б очікувати утворення в порах полімеру гомогенного розчину, у якому хімічний зсув води мав би проміжне значення між хімічними зсувом води, розчиненої в ДМСО (д=3,5 м.ч.), і рідкої води (д =5 м.ч.).

У випадку, коли кількість хлороформу істотно перевищує об'єм пор адсорбенту, вода, залишаючись сильноасоційованою, переходить із сильнозв'язаного в слабозв'язаний стан та замерзає близько 273 К. Це свідчить про те, що слабополярні молекули хлороформу легко витісняють воду з пор полімеру стиролдивінілбензолу, заповнюючи весь об'єм пор. При цьому в спектрах ¹Н ЯМР крім сигналу сильноасоційованої води (д =5 м.ч.), інтенсивність якого швидко зменшується із зниженням температури, спостерігається сигнал слабоасоційованої води (д=1,3 м.ч.), інтенсивність якого слабо залежить від температури. Складний вигляд спектра слабоасоційованої води обумовлений різною величиною магнітного сприйняття середовища в порах різного діаметру.

При спільній адсорбції води та метану спектр води докорінно змінюється (. Інтенсивність сигналу сильноасоційованої води зменшується в кілька разів, при відповідному збільшенні інтенсивності сигналу слабоасоційованої води. Слабоасоційована вода і метан мають близькі хімічні зсуви, що не дозволяє точно розрахувати їх кількості, проте на основі наведених спектрів можна зазначити, що залишкова кількість сильноасоційованої води становить не більше 25 % від початкового. Адсорбція метану виявилась відносно високою (до 10 % мас) завдяки істотному внеску мікропор (неповністю заповнених водою) і їх складній формі в адсорбенті стиролдивінілбензол.

Коли кількість адсорбованої води відповідає близько 30 % загального об'єму пор, ко-адсорбція води і слабополярного хлороформу спричиняє появу слабоасоційованої води. Чим більша кількість хлороформу, тим більший внесок слабоасоційованої води і менша кількість сильноасоційованої води. Таким чином, присутність в порах слабополярної органічної речовини приводить до структурного перегрупування адсорбованої води та зміни енергії її взаємодії зі стінками пор.

Вважаючи, що система пор пористого полімерного адсорбенту типу СДБ може слугувати досить адекватною моделлю внутріклітинного простору для частково дегідратованого клітинного матеріалу, можна сподіватись, що в клітинах при їх контакті з водно-органічними сумішами будуть здійснюватись аналогічні перетворення. Це підтверджується вимірюваннями залежності характеристик шарів зв'язаної води в дегідратованих клітинах в присутності органічних розчинників. Як і в полімерному адсорбенті, в клітинах слабополярні розчинники суттєво зменшують енергію взаємодії води з внутріклітинними границями. Можна сподіватись, що відмічені закономірності мають загальний характер і при відповідності морфології систем та гідрофобно-гідрофільних властивостей стінок пор, будуть спостерігатись однакові ефекти в матеріалах мінерального, полімерного та біологічного походження.

Трансформація будови внутріклітинної води під впливом зовнішніх чинників, зокрема деяких типів органічних речовин, може були відповідальною за синергетичні ефекти, що мають місце при застосуванні в якості фармпрепаратів нанокремнеземів з адсорбційно закріпленими на них слаборозчинними в воді органічними речовинами, які відносяться до традиційних лікарських засобів. Механізм взаємного підсилення активності обох субстанцій може полягати в наступному: і) - зміні будови міжфазного шару зв'язаної води, під впливом поверхні нанокремнезему, в результаті чого в зазорі клтина-нанооксид формується шар слабоасоційованої води з підвищеною проникністю для слабополярних речовин, зазвичай слабо розчинних в воді; іі) - швидкій десорбції лікарського препарату з поверхні та проникненню його всередину клітин; ііі) - впливу органічної речовини на внутріклітинний простір таким чином, що в ньому змінюється співвідношення різних форм внутріклітинної води; іv) - як результат підвищенню біологічної активності препарату та збільшенню його концентрації в біологічних рідинах, тобто зростанню його біодоступності.