Механізми захисту дріжджів Saccharomyces cerevisiae від стресу під впливом слабких органічних кислот

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ЮРІЯ ФЕДЬКОВИЧА

Автореферат

МЕХАНІЗМИ ЗАХИСТУ ДРІЖДЖІВ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ВІД СТРЕСУ ПІД ВПЛИВОМ СЛАБКИХ ОРГАНІЧНИХ КИСЛОТ

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Прикарпатському національному університеті імені Василя Стефаника Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор Лущак Володимир Іванович, Прикарпатський національний університет імені Василя Стефаника, завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Федорович Дарія Василівна, Інститут біології клітини НАН України (м. Львів), провідний науковий співробітник відділу молекулярної генетики і біотехнології

доктор біологічних наук, професор Волков Роман Анатолійович, Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, завідувач кафедри молекулярної генетики та біотехнології

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича за адресою: 58012, м. Чернівці, вул. Лесі Українки, 23.

Автореферат розісланий “24” вересня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради У.В. Легета

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Оцтова і пропіонова кислоти - поширені компоненти середовищ, де ростуть мікроорганізми (Luttic A. et al., 2000; Wolfe A., 2005). Водночас є достатньо інформації щодо антимікробного впливу цих кислот, що зумовлює їх широке використання при консервуванні харчових продуктів і напоїв (Brul S., Coote P., 1999; Davidson Р. et al., 2002). Негативний вплив оцтової кислоти на мікроорганізми пов'язують з тим, що вона може призводити до однониткових розривів ДНК (Ribeiro G. et al., 2006), порушення гомеостазу (Bracey D. et al., 1998) та ендогенної продукції активованих форм кисню (АФК) (Guaragnella N. et al., 2007; Giannattasio S. et al., 2008). Причиною токсичної дії пропіонової кислоти часто є зниження внутрішньоклітинного вмісту АТФ (Epstein C. et al., 2001). Це вказує на можливий негативний вплив слабких органічних кислот (СОК) у складі харчових консервантів на організм людини (Piper P., 1999). Проте багато мікроорганізмів стійкі до дії цих органічних кислот. Esсherichia coli, Bacillus subtilis та Saccharomyces cerevisiae - типові приклади мікроорганізмів з високою стійкістю до СОК (Brul S., Coote P., 1999; Davidson P. et al., 2002). Відомості про механізми, що забезпечують резистентність окремих мікроорганізмів до стресу, індукованого СОК, досі суперечливі (Papadimitriou M. et al., 2007). Зручною модельною системою для вивчення захисних систем еукаріотів у відповідь на кислотний стрес є дріжджі S. cerevisiae (Sychkova H., 2004). Транспортний білок Pdr12 вважають одним із важливих компонентів системи захисту S. cerevisiae від дії СОК, зокрема сорбінової та бензойної (Holyоak C. et al., 1999). Проте його участь у захисті клітин дріжджів від стресу, спричиненого оцтовою та пропіоновою кислотами, досі не з'ясована. Оскільки дія СОК часто супроводжується збільшенням концентрації АФК (Guaragnella N. et al., 2007), то актуальним є вивчення участі антиоксидантної системи у відповіді клітин на кислотний стрес. У даній роботі досліджено роль транспортних білків та антиоксидантної системи у захисті дріжджів S. сerevisiae від стресу під впливом оцтової та пропіонової кислот.

Зв'язок даної роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась з 2005 по 2008 рік на кафедрі біохімії Прикарпатського національного університету імені Василя Стефаника і є частиною наукової тематики кафедри “Вивчення механізмів пристосування організмів до несприятливих умов середовища з метою розробки методів підвищення їх адаптаційного потенціалу”, номер держреєстрації - 0107U001367.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - встановити роль транспортної та антиоксидантної систем у захисті дріжджів S. сerevisiae від стресу, спричиненого оцтовою та пропіоновою кислотами. Для реалізації мети були поставлені наступні завдання:

1) дослідити особливості виведення флуоресцеїну (субстрат для транспортного білка Pdr12) з клітин S. сerevisiae;

2) вивчити вплив оцтової та пропіонової кислот на динаміку транспортування флуоресцеїну з клітин дріжджів за різних експериментальних умов;

3) дослідити вплив оцтової та пропіонової кислот на життєздатність клітин, вміст карбонільних груп білків, активність антиоксидантних ферментів у різних штамів S. сerevisiae, а також участь цих кислот у пошкодженні мітохондріальної ДНК дріжджів;

4) визначити чутливість дріжджів до оцтової кислоти за умов попередньої обробки їхніх клітин пероксидом водню.

Об'єкт дослідження - система захисту дріжджів S. сerevisiae від кислотного стресу.

Предмет дослідження - виживання S. сerevisiae, дефектних за транспортним білком Pdr12 та компонентами антиоксидантного захисту, швидкість виходу флуоресцеїну, вміст продуктів вільнорадикального окислення білків та активність антиоксидантних ферментів у клітинах дріжджів за дії оцтової та пропіонової кислот.

Методи дослідження - мікробіологічні (аналіз кривих росту культур дріжджів, оцінка життєздатності клітин у культурі), фізико-хімічні (визначення інтенсивності флуоресценції), біохімічні (визначення активності ферментів та вмісту карбонільних груп білків), математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що виведення флуоресцеїну (субстрат для Pdr12) з клітин S. cerevisiae відбувається як у присутності глюкози, так і за її відсутності в середовищі інкубації. Зафіксовано вихід флуоресцеїну з клітин дріжджів, які дефектні за транспортним білком Pdr12. Отримані результати вказують на те, що транспортування флуоресцеїну може відбуватися і без участі білка Pdr12. Вперше виявлено, що в клітинах S. cerevisiae система, яка відповідає за транспортування флуоресцеїну, має більшу спорідненість з оцтовою кислотою у присутності білка Pdr12. Визначено, що під дією оцтової кислоти у дріжджів зростає рівень карбонільних груп білків, які є показником вільнорадикального окислення в клітинах S. cerevisiae. Вперше встановлено, що регуляторний білок Yap1 бере участь у відповіді клітин на кислотний стрес через посилення експресії генів антиоксидантної системи, зокрема супероксиддисмутази (СОД) (КФ 1.15.1.1). Виявлено, що попередня обробка пероксидом водню в сублетальних концентраціях підвищує резистентність дріжджів до наступної дії оцтової кислоти летальних концентрацій. Пропіонова кислота не здійснює прооксидантного впливу на S. cerevisiae.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані дані щодо механізмів впливу СОК можуть слугувати основою для раціонального вибору сполук з антимікробною дією. В роботі показано, що попередня обробка клітин дріжджів низькими концентраціями пероксиду водню підвищує їх стійкість до дії оцтової кислоти високих концентрацій. Ці дані можна використовувати при розробці технологій промислового культивування дріжджів. Результати роботи включені в навчальну програму і використовуються при читанні лекцій з біохімії дріжджів та курсу “Вільнорадикальні процеси в біології” на кафедрі біохімії Прикарпатського національного університету імені Василя Стефаника.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження виконане під керівництвом доктора біологічних наук, професора Лущака В.І. на базі кафедри біохімії Прикарпатського національного університету імені Василя Стефаника. Частина експериментальної роботи виконана на факультеті біохімії, біофізики і біотехнології Ягелонського університету (Краків, Польща) за сприяння фонду королеви Ядвіги. Дисертантом самостійно проведений аналіз наукової літератури, виконана експериментальна частина роботи і статистична обробка даних. Планування роботи, аналіз отриманого матеріалу і підготовка рукописів статей проводилися з науковим керівником і к.б.н. Семчишин Г.М.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення, висновки дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на ІІІ та IV міжнародній конференції студентів і аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2007, 2008), VI Парнасівській конференції “Molecular mechanisms of cellular signalling” (Краків, 2007), II міжнародній конференції молодих учених “Біологія: від молекули до біосфери” (Харків, 2007), VIII Всеукраїнській конференції студентів, аспірантів та молодих науковців “Біологічні дослідження молодих вчених в Україні” (Київ, 2008), V міжнародній науково-практичній конференції “Найновите научни постижения” (Софія, 2009), XII з'їзді мікробіологів України (Ужгород, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць: 4 статті у фахових наукових виданнях та 7 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, трьох розділів результатів досліджень та їх обговорення, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків та списку літератури, що включає 196 джерел. Робота викладена на 124 сторінках машинописного тексту і містить 25 рисунків та 9 таблиць. сerevisiae антиоксидантний флуоресцеїн клітина

Основний зміст роботи

Огляд літератури

У цьому розділі роботи узагальнені сучасні дані щодо впливу слабких органічних кислот (СОК) на клітини мікроорганізмів, зокрема дріжджів S. cerevisiae. Наведені основні шляхи транспортування та перетворення СОК в клітинах. Описані механізми, які відповідають за стійкість мікроорганізмів до дії слабких кислот. Розглянуті відомості про роботу транспортних білків та антиоксидантної системи S. cerevisiae.

Матеріали і методи досліджень

У роботі використовували наступні штами S. cerevisiae: W303-1A (дикий тип, MATa ura3-1 leu2-3,112 his3-11,15 trp1-1 ade2-1 can1-100); ДPDR12 (W303-1A pdr12D::hisG-URA3-hisG), дефектний за транспортним білком Pdr12; ДWAR1 (W303-1A war1D::HIS3), дефектний за регуляторним білком War1; YPH250 (дикий тип, MATa trp1-D1 his 3-D200 lys2-801 leu2-D1 ade2-101 ura3-52); ДSOD1ДSOD2 (YPH250 sod1D::URA3 sod2D::TRP1), дефектний за цитозольною та мітохондріальною СОД; ДCTA1ДCTT1 (YPH250 ctt1::URA3 cta1::TRP1), дефектний за цитозольною та пероксисомною каталазами; ДYAP1 (YPH250 yap1D::HIS3), дефектний за регуляторним білком Yap1. Штами W303-1A, ДPDR12, ДWAR1 люб'язно надані професором K. Kьchler (Віденський університет, Австрія); YPH250, ДSOD1ДSOD2, ДCTA1ДCTT1, ДYAP1 - професором Y. Inoue. (Кіотський інститут сільського господарства, Японія).

Клітини культивували при 28єС на шейкері (175 коливань за хвилину) в рідкому напівсинтетичному живильному середовищі YPD (рН 6,25), яке містило 2% глюкози, 2% пептону і 1% дріжджового екстракту. Для експериментів, в яких вивчали вплив оцтової та пропіонової кислот на транспортування флуоресцеїну з клітин S. cerevisiae, дріжджі вирощували за тих самих умов у середовищі YPD, попередньо закисленому соляною кислотою до рН 4,5, яке містило 50 мМ оцтову кислоту. Вплив кислот на виведення флуоресцеїну оцінювали вносячи їх до суспензії дріжджів за 5 хв до початку реєстрації інтенсивності флуоресценції. Для індукції кислотного стресу клітини обробляли оцтовою або пропіоновою кислотами різних концентрацій протягом 120 хв при температурі 28°С в середовищі YPD (рН 3,0). Для блокування синтезу білка, культуру дріжджів у середовищі росту попередньо інкубували з циклогексимідом (15 мкг/мл) протягом 60 хв (Grollman A., 1966; Branco M. et al., 2004). В дослідах з преадаптації клітин пероксидом водню дріжджі піддавали дії Н₂О₂ різних концентрацій протягом 30 хв, а далі інкубували з оцтовою кислотою 120 хв у середовищі YPD (рН 3,0). Для підрахунку кількості життєздатних клітин використовували метод серійних розведень (Мейнел Дж., Мейнел Э., 1967).

Для визначення швидкості виходу флуоресцеїну з клітин S. cerevisiae осаджені промиті клітини ресуспендували в 50 мМ буфері HEPES-NaOH, що містив 5 мМ 2-дезокси-D-глюкозу, 50 мкМ флуоресцеїндиацетат (ФДА) у 5 мМ диметилсульфоксиді, та інкубували на шейкері (175 коливань за хвилину) при 30°С протягом 20 хв (Holyоak C. et al., 1999). При обробці ФДА у суспензії було 10⁸ кл/мл. Навантажені ФДА клітини осаджували, промивали і ресуспендували у 50 мМ буфері HEPES-NaOH (рН 7,0). Проби об'ємом 250 мкл відбирали з інтервалом 1,5 хв, осаджували і протягом 4,5 хв визначали інтенсивність флуоресценції в супернатанті при довжині хвилі збудження і випромінювання 435 нм і 525 нм відповідно (Holyоak C. et al., 1999). Швидкість виходу флуоресцеїну з клітин виражали у відносних одиницях, які відповідали тангенсу кута нахилу прямої, яка характеризує залежність інтенсивності флуоресценції від часу.

Для визначення біохімічних показників клітини збирали центрифугуванням, промивали 50 мМ калій-фосфатним буфером (КФБ) (рН 7,0) і руйнували на вортекс-міксері зі скляними кульками в середовищі, що містило 50 мМ КФБ, 0,5 мМ ЕДТА і 1 мМ фенілметилсульфонілфторид. Вміст карбонільних груп білків визначали спектрофотометричним методом при довжині хвилі 370 нм за кількістю динітрофенілгідразонів, утворених при взаємодії цих груп з 2,4-динітрофенілгідразином (Levine R., 2000). Активність ферментів визначали в безклітинних екстрактах дріжджів спектрофотометричним методом. Активність СОД (КФ 1.15.1.1) визначали за ступенем інгібування реакції окислення кверцетину супероксид-аніоном при довжині хвилі 406 нм (Семчишин Г.М. и др., 2005). Активність каталази (КФ 1.11.1.6) вимірювали реєструючи зміну оптичного поглинання пероксидом водню при довжині хвилі 240 нм (Aebi Н., 1984).

Концентрацію білка визначали методом Бредфорд (Bradford М.М., 1976), використовуючи як стандарт альбумін сироватки бика. Для статистичної обробки отриманих даних та аналізу кінетичних параметрів використовували комп'ютерні програми “Mynova” та “Kinetics” (Brooks S., 1992). Дані представлені як середнє арифметичне ± похибка середнього арифметичного.

Результати досліджень та їх обговорення

Підбір умов культивування S. cerevisiae. У ході досліджень було встановлено, що ріст дріжджів супроводжується зниженням рН середовища культивування впродовж експоненційної фази росту, тоді як з переходом клітин на стаціонарну фазу рН середовища повертається до базального рівня. Оцтова кислота в концентрації 80 мМ на 95% знижувала виживання дріжджів штаму W303-1A на експоненційній фазі (9-а година), зумовлювала сублетальну дію на ранній стаціонарній (24-а година) і не впливала на виживання на стаціонарній фазі росту (48-а година) (рис. 1) У зв'язку з цим для проведення експериментів у присутності СОК були обрані клітини S. cerevisiae на ранній стаціонарній фазі росту.

Роль білка Pdr12 у захисті S. сerevisiae від стресу, спричиненого оцтовою та пропіоновою кислотами. Важливим механізмом первинного захисту мікроорганізмів від дії СОК є виведення останніх з клітин. Відомо, що АВС-транспортер Pdr12 відіграє важливу роль у транспортуванні СОК з клітин S. cerevisiae (Piper P. et al., 1998; Holyоak C. et al., 1999; Papadimitriou M. et al., 2007). Транспортування флуоресцеїну використовують як модельну систему для дослідження механізмів виведення аніонів СОК з клітин за участю білка Pdr12 (Holyоak C. et al., 1999). Це пов'язано з тим, що Pdr12 активно експортує молекули флуоресцеїну з клітин дріжджів (Breeuwer P. et al., 1995; Holyоak C. et al., 1999). На рис. 2 показана динаміка розподілу флуоресцеїну в клітинах S. сerevisiae та позаклітинному просторі протягом різного часу навантаження їх флуоресцеїндиацетатом (ФДА). ФДА - електронейтральна молекула, що пасивно проникає всередину клітин, де розщеплюється до флуоресцеїну, який має флуоресцентні властивості (Breeuwer P. et al., 1995). З рисунка видно, що максимум накопичення флуоресцеїну всередині клітин спостерігався при інкубуванні S. сerevisiae штаму W303-1A з ФДА протягом 20-30 хв. З часом рівень флуоресцеїну в клітинах знижувався і при інкубуванні більше 60 хв був близьким до нуля. Разом з цим рівень позаклітинного та загального флуоресцеїну продовжував зростати в часі. Можна припустити, що протягом перших 20-30 хв навантаження S. сerevisiae ФДА процеси накопичення та виходу флуоресцеїну з клітин дріжджів певним чином урівноважуються. При тривалому навантаженні ФДА (60-180 хв) рівновага між цими двома процесами зсувається в бік екскреції флуоресцеїну. Тому для максимального накопичення флуоресцеїну всередині клітин у наступних експериментах дріжджі навантажували ФДА протягом 20 хв.

Вважалося, що вихід флуоресцеїну з клітин є АТФ-залежним процесом і індукується глюкозою (Holyоak C. et al., 1999). В роботі досліджено динаміку виходу флуоресцеїну з клітин S. cerеvisiae в присутності 10 мМ глюкози в середовищі інкубації і без неї (рис. 3). Глюкозу додавали за 5 хв до початку реєстрації інтенсивності флуоресценції. Швидкість виходу флуоресцеїну з клітин дріжджів лінійно залежала від часу протягом перших 4,5 хв інкубування. Тангенс кута нахилу прямої, що описує цю залежність, характеризує відносну початкову швидкість виходу флуоресцеїну з клітин. З рисунка видно, що вихід флуоресцеїну відбувався як у присутності, так і за відсутності глюкози в середовищі інкубації. Ці дані не узгоджуються з результатами, отриманими іншими дослідниками. Так, Holyоak С. зі співавторами показали, що вихід флуоресцеїну з клітин дріжджів відбувався тільки після додавання глюкози до середовища інкубації (Holyоak C. et al., 1999). Автори зробили висновок про те, що вихід флуоресцеїну потребує забезпечення енергією. Згідно з нашими спостереженнями, додавання 10 мМ глюкози призводило до зростання початкової швидкості виведення флуоресцеїну у дикого штаму лише в 1,7 рази (рис. 3). Щодо нестимульованого глюкозою виходу, який ми спостерігали на відміну від англійських вчених, то він, імовірно, відбувався за рахунок енергіїі внутрішніх ресурсів і, частково, пасивного транспортування флуоресцеїну. Тому надалі вивчали два процеси - незалежний від глюкози і стимульований нею вихід флуоресцеїну. Щоб дослідити можливі механізми, які забезпечують енергією вихід флуоресцеїну з клітин, використали ряд інгібіторів: 1) інгібітор АТФ-аз - ортованадат (Holyоak C. et al., 1999), 2) інгібітор гліколізу - йодоцтову кислоту (Newcomb L. et al., 2003) та 3) інгібітор окисного фосфорилювання - ціанід калію (Rosenfeldt E., Beauvoit B., 2003) (рис. 4). Ортованадат в середовищі без глюкози призводив до зниження швидкості виходу флуоресцеїну на 34% у батьківського штаму W303-1A (рис. 4А). Водночас йодоцтова кислота не впливала, а ціанід знижував швидкість виходу флуоресцеїну на 75% за тих же умов. Можливо, в середовищі без глюкози вихід флуоресцеїну з клітин залежав від внутрішньоклітинної концентрації АТФ, синтез молекул яких в основному відбувався за рахунок окисного фосфорилювання. З рис. 4А також видно, що у присутності глюкози ортованадат та ціанід не впливали на транспортування флуоресцеїну, а йодоцтова кислота повністю інгібувала його вихід з клітин дріжджів штаму W303-1A. Ймовірно, у дикого штаму для забезпечення транспорту флуорофору за таких умов гліколітичний шлях набував критичного значення. У мутантних штамів ДPDR12 та ДWAR1, які дефектні за транспортним білком Pdr12 та його транскрипційним фактором War1 відповідно, йодоцтова кислота та ціанід призводили до зменшення базальної швидкості виходу флуоресцеїну (рис. 4Б, В). Можна припустити, що за відсутності транспортного білка Pdr12 і гліколіз, і окисне фосфорилювання забезпечують клітини енергією для виведення флуоресцеїну назовні клітин в середовищі без глюкози. У середовищі з глюкозою у штамах ДPDR12 та ДWAR1, подібно до батьківського, ортованадат не впливав на швидкість виходу флуоресцеїну, а йодоцтова кислота повністю інгібувала його (рис. 4Б, В). На відміну від W303-1A, в обох мутантних штамів ціанід знижував швидкість виходу флуоресцеїну в присутності глюкози. Можливо у клітинах ДPDR12 та ДWAR1 штамів вихід флуоресцеїну через мембрану назовні клітин забезпечує інший шлях, який потребує затрат енергії, але не залежить від Pdr12.

Показано, що транспортний білок Pdr12 активно викачує аніони сорбінової та бензойної кислот з клітин S. cerevisiae (Holyоak C. et al., 1999). Проте його участь у транспортуванні аніонів оцтової кислоти досі залишалася дискусійним питанням (Papadimitriou M. et al., 2007). Тому наступним етапом роботи було вивчення впливу оцтової кислоти на швидкість транспортування флуоресцеїну з клітин дріжджів. Відомо, що ріст S. cerevisiae при низьких значеннях рН та в присутності пропіонової, сорбінової і бензойної кислот призводив до збільшення експресії гену PDR12 (Piper P. et al., 1998; de Nobel H. et al., 2001; Shьller C. et al., 2004). Водночас, зниження внутрішньоклітинного рН у дріжджів викликало незначне зростання експресії гену PDR12 навіть за відсутності СОК (Piper P. et al., 1998). Для індукції Pdr12 у наступних експериментах клітини дріжджів дикого штаму W303-1A і його ізогенних похідних ДPDR12 та ДWAR1 вирощували при рН 4,5 без або в присутності 50 мМ оцтової кислоти. Вважали, що 50 мМ оцтова кислота здійснює субінгібуючий вплив на ріст клітин дріжджів (Holyоak C. et al., 1999). Наявність останньої в середовищі росту не впливала на швидкість виведення флуоресцеїну (рис. 5). Це може вказувати на відсутність різниці в індукції Pdr12 за умов росту при низьких значеннях рН середовища культивування без і в присутності йонів ацетату. Наші результати не суперечать даним інших дослідників, які показали, що оцтова кислота не призводить до збільшення експресії гену PDR12 (Hatzixanthis K. et al., 2003). Проте стрес, індукований 200 мМ оцтовою кислотою за 5 хв до початку вимірювання флуоресценції, призводив до інгібування швидкості виходу флуоресцеїну в середовищі з глюкозою і без неї з клітин батьківського штаму (рис. 5). Несподіваним виявилось те, що ефекти, отримані на дефектних штамах, які не можуть синтезувати білок Pdr12 (Kren A. et al., 2003), були подібними до таких у батьківського. Оцтова кислота в концентрації 200 мМ призводила до зниження швидкості базального і стимульованого глюкозою виходу флуоресцеїну в клітинах S. cerevisiae штамів ДPDR12 та ДWAR1, які росли при рН 4,5 без оцтової кислоти або за її присутності в субінгібуючій концентрації. Можна припустити, що аніони оцтової кислоти, інгібуючи вихід флуоресцеїну, транспортуються Pdr12, але в цьому процесі беруть участь також інші транспортні білки. На користь цього припущення свідчить той факт, що в усіх трьох досліджуваних штамів швидкість виходу флуоресцеїну при додаванні оцтової кислоти в концентрації 25-400 мМ знижувалась. У середовищі без глюкози константи половинного інгібування швидкості виходу флуоресцеїну в батьківського та обох дефектних штамів достовірно не відрізнялися між собою (табл. 1). Проте цей показник у штаму W303-1A в середовищі, яке містило глюкозу, був на 65% нижчий порівняно з дефектними штамами ДPDR12 та ДWAR1. Константи половинного інгібування виходу флуоресцеїну у дефектних штамів у присутності глюкози були близькими до таких у середовищі без неї.

Таблиця 1 Константи половинного інгібування (мМ) базального (без глюкози) і стимульованого глюкозою виходу флуоресцеїну з клітин S. cerevisiae у присутності оцтової кислоти різних концентрацій

Примітка. Дріжджі вирощували в середовищі YPD при рН 4,5 в присутності 50 мМ оцтової кислоти. *Вірогідно відмінне порівняно з диким штамом W303-1A з Р<0,05 (n = 4).

Як бачимо, наявність транспортного білка Pdr12 збільшувала спорідненість системи, що відповідає за транспортування флуоресцеїну, до оцтової кислоти в присутності глюкози. Ймовірно, досліджуваний білок бере участь у виведенні аніонів оцтової кислоти з клітин дріжджів, які росли при рН 4,5 без або в присутності 50 мМ оцтової кислоти.

Пропіонова кислота також інгібувала вихід флуоресцеїну з клітин дріжджів. Однак відсутність транспортного білка Pdr12 не впливала на константи інгібування виходу флуоресцеїну пропіоновою кислотою. Можна припустити, що в умовах нашого експерименту участь Pdr12 у транспортуванні аніонів пропіонової кислоти була незначною.

Роль антиоксидантної системи у відповіді дріжджів S. cerevisiae на кислотний стрес. Оскільки токсичність СОК може бути пов'язана з генерацією АФК в клітинах дріжджів (Guaragnella N. et al., 2007; Piper P.et al., 2001), то досліджували участь СОД і каталази як ферментів першої ланки антиоксидантного захисту у відповіді S. cerevisiae на кислотний стрес.

Показано, що інкубування клітин дріжджів з оцтовою кислотою в концентрації 200 мМ призводило до збільшення вмісту карбонільних груп у білках S. cerevisiae штамів W303-1А та ДWAR1 (табл. 2). Це може свідчити про порушення редокс-балансу в клітинах дріжджів та розвиток оксидативного стресу під дією оцтової кислоти. Підтвердженням цього слугують результати італійських дослідників, які зафіксували суттєве підвищення рівня супероксид-аніону та пероксиду водню в клітинах дріжджів під дією оцтової кислоти (Guaragnella N. et al., 2007).

Таблиця 2 Вміст карбонільних груп білків (нмоль/мг білка) у дріжджів S. сerevisiae W303-1A (дикий штам) та ДWAR1 за дії стресу, індукованого 200 мМ оцтовою кислотою протягом 120 хв при 28°С та рН 3,0

Примітка. Дріжджі вирощували в середовищі YPD при рН 6,25. *Вірогідно відмінне від відповідних контрольних значень (без оцтової кислоти) з Р<0,05 та порівняно з диким штамом W303-1A з ^‡Р<0,05 (n = 4).

Слід зазначити, що в умовах відсутності стресу вміст карбонільних груп білків у мутантного штаму був у два рази вищий порівняно з батьківським. Ймовірно, в дикого штаму W303-1A білок Pdr12 може брати участь у виведенні з клітин аніонів ендогенної оцтової кислоти і, як наслідок, запобігати окисному пошкодженню білків. Оскільки клітини, позбавлені War1, характеризуються низькою індукцією Pdr12 (Kren A. et al., 2003), то в них майже не відбувається транспортування аніонів ацетату. Це могло бути причиною вищого стаціонарного рівня карбонільних груп білків у ДWAR1 в умовах нашого експерименту.

Оцтова кислота в концентрації 150-200 мМ призводила до збільшення активності СОД у штамів W303-1A та ДWAR1, порівняно з контрольними клітинами, які не піддавали стресу і інкубували в середовищі з рН 6,25 та рН 3,0 (рис. 6А). У клітинах штаму ДPDR12 цей показник збільшувався лише при наявності ацетату у концентрації 200 мМ. Активність каталази в присутності 200 мМ оцтової кислоти у батьківського штаму W303-1A була вищою порівняно з такою в його клітинах, які інкубували без оцтової кислоти (рис. 6Б). Активність каталази у штамів ДPDR12 та ДWAR1 поступово зростала зі збільшенням концентрації ацетату. Можна припустити, що і СОД, і каталаза задіяні у відповіді дріжджів на дію АФК, які утворились внаслідок стресу, спричиненого оцтовою кислотою.

Для дослідження можливих механізмів, які забезпечують зростання активності СОД і каталази за дії оцтової кислоти, клітини дріжджів попередньо обробляли циклогексимідом - інгібітором синтезу білка в еукаріотів (Grollman A., 1966; Branco M. et al., 2004). В присутності циклогексиміду активність СОД у відповідь на інкубування дріжджів за низьких значеннь рН чи дії 200 мМ оцтової кислоти не змінювалася, а активність каталази зростала, подібно до експериментів без циклогексиміду. Таким чином, відповідь S. cerevisiae на дію оцтової кислоти за використаних нами умов може бути пов'язана із синтезом нових молекул СОД. На користь цього припущення свідчить той факт, що інактивація генів цитозольної і мітохондріальної СОД (штам ДSOD1ДSOD2) та регуляторного білка Yap1 (штам ДYAP1) знижувала виживання дріжджів за дії 200 мМ оцтової кислоти (рис. 7). Натомість інактивація генів, які кодують цитозольну і пероксисомну каталази в штаму ДСTA1ДCTT1, не впливала на чутливість дріжджів за цих умов (рис. 7). Оскільки раніше показано, що Yap1 не задіяний в регуляції експресії гену транспортного білка Pdr12 (Piper P. et al., 2001), то, можна припустити, що він бере участь у відповіді клітин на кислотний стрес через посилення експресії генів антиоксидантної системи, зокрема тих, що кодують СОД.

Дані щодо впливу оцтової кислоти на активність СОД і каталази у штамів YPH250 і ДYAP1 певним чином обґрунтовують дану гіпотезу (рис. 8). Оцтова кислота в концентрації 150-200 мМ призводила до зростання активності СОД і каталази у штамі YPH250. У клітинах штаму ДYAP1 активність каталази в присутності оцтової кислоти у високих концентраціях зростала в 1,5 рази (рис. 8Б), тоді як змін у активності СОД за цих же умов не було (рис. 8А). Отже, Yap1 може бути задіяний у процесі адаптації до кислотного стресу через індукцію синтезу нових молекул СОД.

Існує припущення, що АФК у низьких концентраціях можуть бути медіаторами для попередження загибелі клітин, спричиненої дією СОК (Godon C. et al., 1998). Обробка дріжджів сублетальними концентраціями пероксиду водню істотно підвищує стійкість клітин до його дії в летальних концентраціях (Flattery-O'Brien J. et al., 1993; Forman H., 2007). Нами показано, що попередня обробка суспензії дріжджів пероксидом водню низьких концентрацій (0,10-0,25 мМ) підвищувала виживання диких штамів S. cerevisiae за дії 200 мМ оцтової кислоти (рис. 9). Можна припустити, що у відповіді S. cerevisiae на дію оцтової кислоти задіяні механізми, пов'язані з участю антиоксидантної системи. На користь цього служить той факт, що при дії пероксиду водню в низьких концентраціях у клітинах дріжджів зростає активність антиоксидантних ферментів, зокрема СОД та каталази (Байляк М. та ін., 2006). Разом з тим, преадаптація пероксидом водню істотно підвищувала виживання мутантних штамів, дефектних за регуляторними білками War1 та Yap1, порівняно з їх батьківськими штамами (рис. 9). Можливо, попередня обробка дріжджів пероксидом водню задіює цілу низку клітинних шляхів, які забезпечують адаптацію клітин до негативної дії оцтової кислоти. Ми не виключаємо того, що поряд зі стимуляцією антиоксидантної системи пероксид водню може безпосередньо чи опосередковано активувати систему, яка відповідає за викачування аніонів оцтової кислоти і протонів з клітин. Відомо, що пероксид водню в невисоких концентраціях призводить до змін в експресії більше 115 генів з наступним підвищенням резистентності дріжджів не тільки до оксидативного, але й інших видів стресу (Godon C. et al., 1998).

При дії пропіонової кислоти змін у вмісті карбонільних груп білків (дані не наведені) та активності антиоксидантних ферментів (табл. 3) до і після індукції стресу не спостерігали. Очевидно пропіонова кислота не здійснює прооксидантного впливу на клітини дріжджів S. cerevisiae.

Таблиця 3 Активність СОД і каталази у дріжджів S. cerevisiae штамів W303-1A та YPH250 за дії пропіонової кислоти різних концентрацій протягом 120 хв при 28°С та рН 3,0 (n = 4). Дріжджі вирощували в середовищі YPD при рН 6,25.

Підсумовуючи отримані дані, можна дійти висновку, що роль транспортних білків мембран та ферментів антиоксидантної системи у забезпеченні захисту клітин S. cerevisiae від оцтової кислоти відрізняється порівняно з їх участю у захисті від пропіонової. Такий ефект, ймовірно, пов'язаний із різницею в механізмах впливу цих кислот на клітину.

У відповіді S. cerevisiae на дію оцтової кислоти задіяний транспортний білок Pdr12, а також СОД і каталаза, які належать до ферментів першої лінії антиоксидантного захисту (рис. 10). Білок Pdr12 попереджує накопичення аніонів оцтової кислоти у клітинах дріжджів і, як наслідок, продукцію АФК, що утворюються при дії кислотного стресу. Проте транспортування аніонів ацетату з клітин дріжджів у позаклітинне середовище відбувається і без участі цього транспортера. СОД і каталаза не беруть участі у безпосередньому знешкодженні аніонів оцтової кислоти, а відповідають за детоксикацію супероксид-аніону та пероксиду водню, концентрація яких зростає під дією стресу, спричиненого ацетатом. При цьому збільшення активності СОД за дії оцтової кислоти відбувається шляхом синтезу молекул цього ферменту de novo.

Рис. 10. Можливі шляхи впливу аніонів оцтової кислоти на S. cerevisiae та відповіді клітин дріжджів на їх дію. ДPDR12 - відсутність транспортного білка Pdr12, ДWAR1 - відсутність регуляторного білка War1, ЦГ - циклогексимід, ДYAP1 - відсутність регуляторного білка Yap1, ДSOD1ДSOD2 - відсутність цитозольної та мітохондріальної СОД, ДCTA1ДCTT1 - відсутність пероксисомної та цитозольної каталаз.

Пропіонова кислота не здійснює прооксидантного впливу на клітини дріжджів. Участь транспортного білка Pdr12 у транспортуванні аніонів пропіонової кислоти в умовах нашого експерименту була незначною.

Висновки

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і вирішення окремих аспектів проблеми захисту S. cerevisiae від кислотного стресу, спричиненого оцтовою та пропіоновою кислотами. Виявлено відмінності у впливі цих органічних кислот на клітини S. cerevisiae і, як наслідок, різницю в механізмах захисту дріжджів у відповідь на їхню дію.

1. Показано, що флуоресцеїн транспортується через мембрану назовні клітин S. cerevisiae як у присутності, так і за відсутності глюкози. Вихід флуоресцеїну з клітин дріжджів у позаклітинне середовище забезпечується двома шляхами, що потребують затрат енергії. В одному із них задіяний Pdr12, а в іншому - ні.

2. Вперше встановлено, що оцтова та пропіонова кислоти інгібують вихід флуоресцеїну з клітин дріжджів, вирощених при низьких значеннях рН середовища культивування. Присутність транспортного білка Pdr12 збільшує спорідненість системи, що відповідає за транспортування флуоресцеїну, до оцтової кислоти в середовищі з глюкозою, але не впливає на спорідненість до пропіонової кислоти за цих умов.

3. Показано, що оцтова кислота у високих концентраціях призводить до збільшення вмісту карбонільних груп білків та активності супероксиддисмутази і каталази у клітинах S. cerevisiae, тоді як пропіонова кислота не впливає на ці показники. Це свідчить про різні механізми впливу даних кислот на клітини дріжджів та участь оцтової кислоти в індукції оксидативного стресу.

4. Виявлено, що зростання активності супероксиддисмутази при дії оцтової кислоти блокується інгібітором синтезу білка циклогексимідом у штаму W303-1A. Водночас не відбувається змін активності цього ферменту за умов кислотного стресу у штаму, дефектному за регуляторним білком Yap1. Відсутність супероксиддисмутази або Yap1 підвищує також чутливість дріжджів до дії оцтової кислоти у концентрації 200 мМ. Очевидно Yap1 бере участь у відповіді клітин S. cerevisiae на кислотний стрес через посилення експресії генів антиоксидантної системи, зокрема тих, що кодують супероксиддисмутазу.

5. Встановлено, що попередня обробка суспензії дріжджів пероксидом водню в концентрації 0,10-0,25 мМ підвищує виживання S. cerevisiae за дії 200 мМ оцтової кислоти.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Абрат О. Б. Кислотний стрес збільшує активність супероксиддисмутази і каталази у дріжджів Saccharomyces cerevisiae / О. Б. Абрат, Г. М. Семчишин, В. І. Лущак // Український біохімічний журнал. - 2007. - Т. 79, № 2. - С. 17-23. (Дисертант брала участь у плануванні роботи, здійснювала моделювання умов кислотного стресу, визначала всі показники, статистично обробила дані та написала рукопис статті).

2. Транспортування флуоресцеїну та антиоксидантна система дріжджів Saccharomyces cerevisiae за дії кислотного стресу / О. Б. Абрат, Г. М. Семчишин, Я. Медзобродські, В. І. Лущак // Український біохімічний журнал. - 2008. - Т. 80, № 3. - С. 70-77. (Експериментальна частина роботи, статистична обробка даних та написання рукопису статті здійснені дисертантом).

3. Pdr12p-dependent and -independent fluorescein extrusion from baker's yeast cells / V. Lushchak, O. Abrat, J. Miкdzobrodzki, H. Semchyshyn // Acta biochimіca polonica. - 2008. - Vol. 55, N 3. - P. 595-601. (Дисертант здійснювала експериментальну частину роботи, статистичну обробку даних та брала участь у написанні рукопису статті).

4. Абрат О. Б. Кислотний стрес у дріжджів Saccharomyces cerevisiae / О. Б. Абрат, Г. М. Семчишин, В. І. Лущак // Український біохімічний журнал. - 2008. - Т. 80, № 6. - С. 19-31. (Дисертантом проведений аналіз наукової літератури та написаний рукопис статті).

5. Абрат O. Б. Стан антиоксидантної системи дріжджів Saccharomyces cerevisiae за умов стресу, спричиненого дією оцтової кислоти / O. Б. Абрат // зб. тез доповідей III Міжнар. наук. конф. студ. і аспір. [“Молодь та поступ біології”], (Львів, 23-27 квіт. 2007 р.). - Л.: ЛНУ ім. І. Франка, 2007. - С. 31.

6. Semchyshyn H. The role of regulatory proteins War1 and Yap1 in yeast protection against acetic acid stress / H. Semchyshyn, O. Abrat, V. Lushchak // 6-th Parnas conference. Abstracts [“Molecular mechanism of cellular signalling”], (Krakow, 30-th may-2-nd june, 2007). - Acta biochimіca polonica. - Vol. 54, N2., 2007. - P. 32.

7. Абрат O. Вплив оцтової кислоти на транспорт флуоресцеїну з клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae / O. Абрат // матеріали. доповідей II Міжнар. конф. молодих учених [“Біологія: від молекули до біосфери”], (Харків, 19-21 лист. 2007 р.) - Х.: ХНУ ім. В. Каразіна, 2007. - С. 28.

8. Кангіна Т. Преадаптація дріжджів Saccharomyces cerevisiae пероксидом водню до кислотного стресу / Т. Кангіна, О. Данилюк, О. Абрат // зб. тез доповідей IV Міжнар. наук. конф. студ. і аспір. [“Молодь і поступ біології”], (Львів, 7-10 квіт. 2008 р.). - Л.: ЛНУ ім. І. Франка, 2008 - С. 31.

9. Абрат O. Роль білка Pdr12 у відповіді дріжджів Saccharomyces cerevisiae на стрес, індукований оцтовою кислотою / О. Абрат // Матеріали VIII Всеукраїнської наук. конф. студ., аспір. та молодих науковців [“Біологічні дослідження молодих вчених в Україні”], (Київ, 25-26 вер. 2008 р.) - К.: КНУ ім. Т. Шевченка, 2008. - С. 4-5.

10. Абрат O. Механізми захисту дріжджів Saccharomyces cerevisiae від стресу під впливом оцтової та пропіонової кислот / О. Абрат // Материали за V международна научна практична конференция [“Найновите научни постижения”], (София, 17-25 март 2009 г.) - София: Бял ГРАД-БГ, 2009. - С. 67-70.

11. Абрат О. Участь транспортних білків та антиоксидантної системи у захисті дріжджів Saccharomyces cerevisiae від кислотного стресу / О. Абрат // зб. тез доповідей XII з'їзд товариства мікробіологів України ім. С.М. Виноградського, (Ужгород, 25-30 травн. 2009 р.) - Ужгород: Патент, 2009. - С. 32.

Анотація

Абрат О.Б. Механізми захисту дріжджів Saccharomyces cerevisiae від стресу під впливом слабких органічних кислот. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Чернівецький національний університет ім. Ю. Федьковича, Чернівці, 2009.

Дисертація присвячена вивченню проблеми захисту дріжджів S. cerevisiae від стресу, спричиненого оцтовою та пропіоновою кислотами. Продемонстровано інгібування слабкими кислотами виходу флуоресцеїну (субстрат для транспортного білка Pdr12) з клітин дріжджів. Визначено, що присутність Pdr12 збільшує спорідненість системи, яка відповідає за транспортування флуоресцеїну, до оцтової кислоти, але не впливає на її спорідненість до пропіонової кислоти . Зроблено висновок, що Pdr12 задіяний у виведенні аніонів оцтової кислоти з клітин дріжджів, але цей процес може здійснюватись й іншими шляхами, не пов'язаними з Pdr12.

Виявлено відмінності у механізмах впливу досліджуваних кислот на S. cerevisiae та участь оцтової кислоти в індукції оксидативного стресу. Показано, що у відповідь на дію оцтової кислоти в дріжджів зростає рівень карбонільних груп білків та активність супероксиддисмутази (СОД) і каталази. Змін цих показників під дією пропіонової кислоти не відбувається.

Встановлено, що відсутність СОД збільшує чутливість дріжджів до стресу, індукованого оцтовою кислотою. Зростання активності СОД під дією ацетату блокується циклогексимідом або відсутністю транскрипційного фактора Yap1. Отримані дані свідчать, що СОД задіяна у відповіді дріжджів на стрес під дією оцтової кислоти. При цьому Yap1 бере участь у забезпеченні зростання активності СОД через синтез молекул цього ферменту de novo.

Аннотация

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. - биохимия. - Черновицкий национальный университет им. Ю. Федьковича, Черновцы, 2009.

Диссертация посвящена изучению проблемы защиты дрожжей S. cerevisiae от стресса, вызванного уксусной и пропионовой кислотами. Продемонстрировано ингибирование слабыми кислотами выхода флуоресцеина (субстрат для транспортного белка Pdr12) из клеток дрожжей. Определенно, что присутствие Pdr12 увеличивает сродство к уксусной кислоте, но не влияет на сродство к пропионовой кислоте системы, отвечающей за транспортировку флуоресцеина. Сделан вывод о том, что Pdr12 задействован в выведении анионов уксусной кислоты из клеток дрожжей, хотя этот процесс может осуществляться и другими путями, не связанными с Pdr12.

Обнаружены отличия в механизмах воздействия исследуемых кислот на S. cerevisiae и участие уксусной кислоты в индукции окислительного стресса. Показано, что в ответ на действие уксусной кислоты у дрожжей возрастает уровень карбонильных групп белков, активность супероксиддисмутази (СОД) и каталазы. Изменений этих показателей под действием пропионовой кислоты не происходит.

Установлено, что отсутствие СОД увеличивает чувствительность дрожжей к стрессу, индуцированному уксусной кислотой. В то же время увеличение активности СОД под действием ацетата блокируется циклогексимидом или отсутствием транскрипционного фактора Yap1. Полученые данные свидетельствуют о том, что СОД принимает участие в адаптации дрожжей к стрессу, вызванному уксусной кислотой. При этом активность СОД возрастает путем синтеза молекул этого фермента de novo, и этот синтез регулируется белком Yap1.

Summary

Abrat O.B. Mechanisms of defense of yeast Saccharomyces cerevisiae against weak acid stress. - Manuscript.

The thesis for the candidate's degree in speciality 03.00.04. - Biochemistry. - Chernivtsi National University named after Yu. Fed'kovych, Chernivtsi, 2009.

The thesis is devoted to the study of the problem connected with protection of the yeast S. cerevisiae against acid stress. It was found that аcetic and propionic acids inhibit the fluorescein (substrate for transport protein Pdr12) efflux from the yeast cells. The constant of inhibition of fluorescein efflux by exogenous acetic acid in all yeast strains in glucose-free medium were virtually the same. However, the constant of inhibition of glucose-stimulated fluorescein efflux by acetic acid is significantly lower in parental strain than in two mutants deficient in PDR12 (ABC-transporter Pdr12) and WAR1 (transcriptional factor of Pdr12). It can be suggested that membrane protein Pdr12 increased the sensitivity of fluorescein transport system in the yeast to acetic acid in the presence of glucose. The defect neither in PDR12, nor in WAR1 changes inhibition constant in the experiments where propionic acid was used.

It was established that both acids decrease the yeast survival in a concentration-dependent manner. The yeast exposure to acetic acid results in the increased level of protein carbonyl groups and elevates the activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase, whereas propionic acid does not change these parameters. It has been supposed that different mechanisms underlie the toxicity of these acids for S. cerevisiae cells and participation of acetate in induction of oxidative stress.

Pretreatment of the yeast cells by sublethal concentrations of hydrogen peroxide results in the increased resistance to followed acid-induced stress. Thus, it may be suggested that antioxidant system may be involved of the yeast protection against the stress induced by acetic acid.

It was found that defect in SOD expression increases yeast sensitivity to acetic acid-induced stress. The effect of acetic acid on SOD activity is cancelled by cycloheximide or inactivation of gene, encoding Yap1. It was concluded that SOD implicates in the yeast adaptation to acetic acid stress. Protein Yap1 is involved in SOD activation via synthesis of molecules of this enzyme de novo.

Размещено на Allbest.ru