Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії

УДК 57.08 : 54-126 : 615.4 : 616-089.843

02.00.10 - біоорганічна хімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Оцінка біологічної активності та біосумісності модифікованих полімерів як потенційних імплантаційних матеріалів

Кулєш Дмитро Володимирович

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі полімерів медичного призначення Інституту хімії високомолекулярних сполук НАН України, м. Київ.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Галатенко Наталія Андріївна, Інститут хімії високомолекулярних сполук НАН України, завідувач відділу полімерів медичного призначення.

Офіційні опоненти:

- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Верьовка Сергій Вікторович, ДУ Інститут отоларингології ім. О.С. Коломійченка АМН України, завідувач лабораторії біохімії;

- доктор медичних наук, старший науковий співробітник Жирнов Віктор Валентинович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу сигнальних систем клітини.

Захист відбудеться 23 жовтня 2009 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України за адресою: 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1).

Автореферат розісланий 23 вересня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк.

Анотація

Кулєш Д.В. Оцінка біологічної активності та біосумісності модифікованих полімерів як потенційних імплантаційних матеріалів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. - Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2009.

Дисертацію присвячено проблемі оцінки біологічної активності, біосумісності та ефективності модифікованих полімерів на основі сітчастого поліуретану, поліакриламідного гелю. Проведено іммобілізацію нестероїдного протизапального препарату піроксикаму та протитуберкульозного препарату ізоніазиду на поліуретановому носії. Вивчено характер динаміки вивільнення лікарських речовин з полімерного матеріалу в умовах in vivo та in vitro. Показано, що піроксикам пролонговано вивільняється з поліуретанового носія в умовах in vivo. При імплантації в організм експериментальних тварин поліуретанові зразки з піроксикамом сприяють зменшенню виразності клітинних реакцій в оточуючих тканинах, знижують рівень активності кислої та лужної фосфатаз, мають антипроліферативну активність, а також інгібують місцевий процес судиноутворення. Встановлено, що ізоніазид пролонговано вивільняється з сітчастого поліуретану протягом тривалого часу в умовах in vitro. При імплантації в організм експериментальних тварин отримані поліуретанові зразки з ізоніазидом стимулюють макрофагальні елементи на всіх етапах асептичного запалення. Проведено насичення поліакриламідного гелю, модифікованого полівінілпіролідоном, протитуберкульозним препаратом, вивчено динаміку вивільнення ізоніазиду з поліакриламідного гелю в умовах in vitro. Показано можливість регулювання вивільнення ізоніазиду з поліакриламідного гелю за рахунок відсоткового вмісту полівінілпіролідону. Проведено модифікацію методу тканинної культури, за допомогою якого визначений ступінь токсичності гідрогелевих матеріалів. Розроблено комплексну систему медико-біологічних методів, що дала змогу оцінити біологічну активність, біосумісність та ефективність імплантаційних полімерних матеріалів. Показано, що полімерні матеріали з піроксикамом та ізоніазидом біосумісні, нетоксичні та можуть бути рекомендовані для проведення клінічних випробувань.

Ключові слова: біологічна активність, біосумісність, ефективність, сітчастий поліуретан, поліакриламідний гель, піроксикам, ізоніазид, іммобілізація.

Аннотация

Кулеш Д.В. Оценка биологической активности и биосовместимости модифицированных полимеров в качестве потенциальных имплантационных материалов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. - Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертация посвящена проблеме оценки биологической активности, биосовместимости и эффективности модифицированных полимеров на основе сетчатого полиуретана, полиакриламидного геля с пролонгированным действием нестероидного противовоспалительного и противотуберкулезного препаратов. Проведена иммобилизация нестероидного противовоспалительного препарата пироксикама и противотуберкулезного препарата изониазида на полиуретановом носителе. Изучен характер динамики высвобождения лекарственных веществ из полимерного материала в условиях in vivo и in vitro. Показано, что пироксикам пролонгировано высвобождается из полиуретанового носителя в условиях in vivo. Методом ИК-спектроскопии установлено, что иммобилизация пироксикама на полимерном носителе происходит преимущественно за счет образования водородных связей. При имплантации в организм экспериментальных животных полиуретановые образцы с пироксикамом уменьшают выраженность клеточных реакций в окружающих тканях, снижают уровень активности кислой и щелочной фосфатаз, обладают антипролиферативной активностью, а также ингибируют местный процесс сосудообразования. Установлено, что изониазид пролонгировано высвобождается из сетчатого полиуретана на протяжении продолжительного времени в условиях in vitro. При имплантации в организм экспериментальных животных полученные полиуретановые образцы с изониазидом стимулируют макрофагальные элементы на всех этапах асептического воспаления. Проведено насыщение полиакриламидного геля, модифицированного поливинилпирролидоном, противотуберкулезным препаратом в цитратно-фосфатном буферном растворе при рН 5,0, изучено динамику высвобождения изониазида из полиакриламидного геля в модельную среду (физиологический раствор) при температуре 37°С в условиях in vitro. Показана возможность регулирования высвобождения изониазида из полиакриламидного геля за счет процентного содержания поливинилпирролидона. Проведена модификация метода тканевой культуры, который позволяет быстро и точно оценить гистотоксическое действие различных веществ на фибробластические элементы. Проведенные количественные расчеты параметров тканевых культур позволили установить показатели гистотоксичности для гидрогелевых материалов. Показано, что исследуемые полимеры относятся к нетоксичным и биосовместимым полимерным материалам и могут найти широкое применение в медицинской практике. При гистологическом изучении тканевых реакций на имплантацию полиакриламидных гелей в организм лабораторных крыс было установлено, что вокруг всех образцов образовывалась соединительнотканная капсула уже на ранних этапах исследования. Показано, что модификация полиакриламидного геля поливинилпирролидоном способствовала стабилизации структуры полимерного материала при продолжительном пребывании в живом организме, что является важным моментом, например, при пластических операциях. Гистологические исследования показали, что гидрогелевые материалы являются биосовместимыми, стабильными, стойкими к миграции, вызывают воспалительные процессы в месте имплантации по типу асептического воспаления. Разработана комплексная система медико-биологических методов, которая позволила оценить биологическую активность, биосовместимость и эффективность имплантационных полимерных материалов. Показано, что полимерные материалы с пироксикамом и изониазидом являются биосовместимыми, нетоксичными и могут быть рекомендованы для проведения клинических испытаний.

Ключевые слова: биологическая активность, биосовместимость, эффективность, сетчатый полиуретан, полиакриламидный гель, пироксикам, изониазид, иммобилизация.

Summary

Kulyesh D.V. Estimation of biological activity and biocompatibility of the modified polymers as potential implants. - Manuscript.

Dissertation for the candidate of biological science degree in specialty 02.00.10 - bioorganic chemistry. - Institute of Bioorganic chemistry and Petrochemistry of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2009.

Dissertation is devoted a problem of an estimation of biological activity, biocompatibility and efficiency of the modified polymers on the basis of mesh polyurethane, polyacrilamid gel. It is spent immobilization of not steroid anti-inflammatory preparation piroxicam and an antitubercular preparation isoniazid on polyurethane. Character of dynamics of liberation of medicinal substances from a polymeric material in vivo and in vitro is studied. It is shown that piroxicam has prolonged action and it is liberated from polyurethane in vivo. At implantation in an organism of experimental animals polyurethane with piroxicam reduce cellular reactions in surrounding fabrics, level of activity sour and alkaline phosphatases, own antiproliferative activity, slow down local process of angiogenesis. It is established that isoniazid it is prolonged it is liberated from mesh polyurethane throughout long time in vitro. At implantation in an organism of experimental animals received polyurethanes with isoniazid stimulate macrophages at all stages of inflammation. It is spent saturation of polyacrilamid gel modified polyvinyl pyrrolidone, an antitubercular preparation, it is studied dynamics of liberation isoniazid from polyacrilamid gel in vitro. Possibility of regulation of liberation isoniazid from polyacrilamid gel at the expense of percentage polyvinyl pyrrolidone is shown. Updating of a method of fabric culture with which help toxicity degree hydrogel materials is defined is spent. The complex system of medical and biologic methods which has allowed to estimate biological activity, biocompatibility and efficiency polymeric materials for implantation is developed. It is shown that polymeric materials with piroxicam and isoniazid are biocompatible, nontoxic and can be recommended for carrying out of clinical tests.

Key words: biological activity, biocompatibility, efficiency, mesh polyurethane, polyacrilamid gel, piroxicam, isoniazid, immobilization.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Швидкий та динамічний розвиток хімії полімерів привів до того, що полімерні матеріали з успіхом використовуються в медичній практиці як імплантати. Актуальною проблемою є надання полімерним імплантаційним матеріалам біологічної активності, що дало б змогу проводити лікування та профілактику різних патологічних станів в організмі. Створення таких біологічно активних матеріалів вимагає від дослідників комплексного підходу в оцінці їхньої біологічної активності, біосумісності та ефективності. Відомо, що введення до складу полімеру будь-якого нового інгредієнта може докорінно змінювати властивості матеріалу та впливати на його біосумісність. Багатофакторність впливу на живий організм біологічно активних полімерних систем вимагає створення моделей, в яких би біологічно активна речовина знаходилася на раніше вивчених і дозволених до використання полімерних носіях. Це дасть змогу розробити нові та вдосконалити вже відомі методи оцінки ефективності біологічно активних полімерів і встановити основні закономірності взаємодії імплантатів з живим організмом.

Місцеве використання полімерних матеріалів з біологічно активними речовинами, в тому числі полімерів з іммобілізованими лікарськими препаратами, дає змогу досягти вираженої біологічної активності безпосередньо в зоні розвитку запального процесу. Таким матеріалам, як правило, притаманна пролонгована дія, що дає можливість тривалий час підтримувати стабільну і визначену концентрацію діючої речовини в організмі.

Медична практика потребує впровадження нових полімерних імплантаційних матеріалів з іммобілізованими нестероїдними протизапальними препаратами, які зменшували б інтенсивність запалення в місці імплантації та в цілому організмі завдяки пролонгованому вивільненню лікарської речовини. Також у зв'язку з поширенням епідемії туберкульозу дуже гострою є потреба в нових імплантаційних матеріалах з іммобілізованими протитуберкульозними препаратами, які б не тільки заміщували порожнини та дефекти хірургічно видалених, ушкоджених туберкульозом тканин, а й мали б досить високу терапевтичну активність у місці імплантації.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у відповідності з планами науково-дослідних робіт Інституту хімії високомолекулярних сполук НАН України "Створення нових гідрофільних полімерних матриць на основі поліуретанів, полі-N-вінілпіролідону і гідрогелів як ендогенних носіїв лікарських препаратів" (2001-2003 рр.), № держ. реєстрації 0101U000170; "Створення нового покоління гідрофільних поліуретанів та полімерних композицій на їх основі, що володіють лікарською дією" (2004-2006 рр.), № держ. реєстрації 0104U000068.

Мета та завдання дослідження. Метою роботи є оцінка біологічної активності та біосумісності модифікованих полімерів на основі сітчастого поліуретану, поліакриламідного гелю з пролонгованою дією нестероїдного протизапального та протитуберкульозного препаратів.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися такі завдання:

1. Провести іммобілізацію нестероїдного протизапального препарату піроксикаму та протитуберкульозного препарату ізоніазиду на сітчастому поліуретані.

2. Розробити методику визначення динаміки вивільнення піроксикаму та ізоніазиду з сітчастого поліуретану в умовах in vivo тa in vitro.

3. Дослідити процес біодеградації біологічно активних імплантаційних матеріалів на основі сітчастого поліуретану в умовах in vivo тa in vitro.

4. Дослідити антипроліферативну активність, активність кислої та лужної фосфатаз при імплантації полімерних зразків з піроксикамом в організм експериментальних тварин.

5. Провести іммобілізацію ізоніазиду на поліакриламідному гелі.

6. Дослідити динаміку вивільнення ізоніазиду з поліакриламідного гелю, модифікованого полівінілпіролідоном.

7. Вивчити біосумісність нового поліакриламідного гелю з ізоніазидом методом культури тканин.

8. Дослідити отримані полімерні матеріали за допомогою імплантаційного тесту, провести морфометричну оцінку розвитку тканинної відповіді на імплантацію полімерних матеріалів.

Об'єкт дослідження - полімерні матеріали на основі сітчастого поліуретану з пролонгованою дією піроксикаму та ізоніазиду, гідрофільний поліакриламідний гель, модифікований полівінілпіролідоном, з пролонгованою дією ізоніазиду.

Предмет дослідження - іммобілізація піроксикаму та ізоніазиду на сітчастому поліуретані та поліакриламідному гелі, біологічна активність, біосумісність та ефективність отриманих біологічно активних полімерних матеріалів.

Методи дослідження - ІЧ-спектроскопія (вивчення структури полімерів, їх взаємодії з лікарськими речовинами та біодеградації), фізико-механічні (аналіз властивостей полімерів, оцінка їх біодеградації), спектрофотометричні (вивчення динаміки вивільнення лікарських речовин), біохімічні та цитохімічні (визначення активності ферментів), гістологічні та імплантаційний тест (вивчення тканинної реакції організму експериментальних тварин на імплантацію полімерних матеріалів), медико-біологічні (вивчення біологічної активності та біосумісності полімерних матеріалів).

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше розроблено методику визначення динаміки вивільнення нерозчинної лікарської речовини з полімерного імплантата в умовах in vivo, на прикладі піроксикаму. Вперше встановлено, що ізоніазид пролонговано вивільняється з сітчастого поліуретану протягом тривалого часу, стимулюючи макрофагальні елементи на всіх етапах асептичного запалення. Розроблена методика насичення поліакриламідного гелю, модифікованого полівінілпіролідоном, протитуберкульозним препаратом, вивчена динаміка вивільнення ізоніазиду в умовах in vitro. Проведено модифікацію методу тканинної культури, за допомогою якого визначена ступінь токсичності гідрогелевих матеріалів. Розроблено комплексну систему медико-біологічних методів, що дала змогу оцінити біологічну активність, біосумісність та ефективність імплантаційних полімерних матеріалів. Показано, що полімерні матеріали з піроксикамом та ізоніазидом біосумісні і нетоксичні та можуть бути рекомендовані для проведення клінічних випробувань.

Практичне значення отриманих результатів полягає у модифікації полімерних матеріалів на основі сітчастого поліуретану та поліакриламідного гелю нестероїдним протизапальним препаратом піроксикамом і протитуберкульозним препаратом ізоніазидом. Проведена комплексна оцінка отриманих біологічно активних полімерних матеріалів дає змогу рекомендувати їх для проведення клінічних випробувань.

Особистий внесок автора дисертації полягає у безпосередній участі у плануванні етапів досліджень, отриманні полімерних зразків, вивченні їхньої структури та основних властивостей, імплантації всіх дослідних зразків в організм експериментальних тварин, заборі матеріалу, його обробці, постановці гістологічних, біохімічних та інших біологічних досліджень, обробці та інтерпретації експериментальних даних, участі в обговоренні результатів, їх узагальненні, формулюванні висновків. Постановка досліджень, написання статей і доповідей здійснювалися у творчій співпраці з науковим керівником д.б.н. Галатенко Н.А.. У проведенні медико-біологічних досліджень брали участь Рожнова Р.А., Нечаєва Л.Ю., Шпанагель Н.М., Савицька О.С.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи було представлено на XX Українській конференції з органічної хімії (м. Одеса, 21-25 вересня 2004), X Українській конференції з високомолекулярних сполук (м. Київ, 12-14 жовтня 2004), ІІІ Всеукраїнській конференції молодих вчених та студентів з актуальних питань хімії (м. Харків, 17-20 травня 2005), IX Міжнародній конференції з хімії та фізико-хімії олігомерів "Олігомери 2005" (м. Одеса, 13-16 вересня 2005), International Conference "Nanomaterials in Chemistry, Biology and Medicine" (Kiev, September 14-17, 2005), І Всеукраїнській конференції студентів, аспірантів та молодих вчених з хімії та хімічної технології (м. Київ, 27-29 квітня 2006), Baltic Polymer Symposium (Birini Castle, Latvia, September 20-22, 2006), ІІІ Всеросійській науковій конференції "Фізико-хімія процесів переробки полімерів" (м. Іваново, 10-12 жовтня 2006), Ukrainian-German Symposium on Nanobiotechnology (Kyiv, December 14-16, 2006), Третій Санкт-Петербурзькій конференції молодих вчених з міжнародною участю "Современные проблемы науки о полимерах" (м. Санкт-Петербург, 17-19 квітня 2007), ІІ Всеукраїнській конференції студентів, аспірантів і молодих вчених з хімії та хімічної технології (м. Київ, 26-28 квітня 2007), Всеукраїнській з міжнародною участю конференції молодих вчених "Наноматеріали в хімії, біології та медицині" (м. Київ, 15-17 травня 2007), Восьмій всеукраїнській конференції студентів та аспірантів "Сучасні проблеми хімії" (Київ, 21-23 травня 2007), Baltic Polymer Symposium (Druskininkai, Lithuania, September 19-21, 2007), Одинадцятій українській конференції з високомолекулярних сполук (м. Дніпропетровськ, 1-5 жовтня 2007), Четвертій Санкт-Петербурзькій конференції молодих вчених з міжнародною участю "Современные проблемы науки о полимерах" (м. Санкт-Петербург, 15-17 квітня 2008), VI відкритій українській конференції молодих вчених з високомолекулярних сполук ВМС-2008 (м. Київ, 30 вересня-3 жовтня 2008).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 7 статей у наукових фахових журналах, 1 патент України, 17 тез доповідей на міжнародних та українських конференціях.

Обсяг і структура роботи. Дисертація викладена на 168 сторінках друкованого тексту та складається зі вступу, 3 розділів, висновків, списку використаних джерел (197 найменувань) і містить 20 таблиць та 46 рисунків.

2. Основний зміст

Біологічно активні полімерні матеріали на основі сітчастого поліуретану з пролонгованою дією нестероїдного протизапального та протитуберкульозного препаратів

Об'єктами досліджень були поліуретанові композиції на основі макродіізоціанату (МДІ), отриманого на основі поліоксипропіленгліколю (ПОПГ) і суміші ізомерів 2,4- та 2,6-толуїлендіізоціанату (ТДІ). Для надання біологічної активності у полімерні композиції вводили нестероїдний протизапальний препарат піроксикам в різній відсотковій концентрації (0,6% ваг.; 1% ваг.; 2% ваг.) і протитуберкульозний препарат ізоніазид (4% ваг.). Вміст лікарських речовин на полімерних носіях не перевищував дозволених терапевтичних доз.

Вибір піроксикаму (4-гідрокси-2-метил-N-2-піридиніл-2Н-1,2-бензотіазин-3-карбоксамід-1,1-діоксиду) (рис. 1) як об'єкта для іммобілізації, зумовлений його протизапальними властивостями - активність піроксикаму пов'язана з попередженням розвитку або зниженням інтенсивності запалення. Ізоніазид (піридин-4-карбогідразид) (рис. 2) належить до протитуберкульозних препаратів, механізм його дії пов'язаний з пригніченням дихання мікобактерій туберкульозу.

Рис. 1. Структурна формула піроксикаму

Також відома здатність ізоніазиду блокувати активність ферментів біосинтезу колагену, впливаючи, таким чином, на розвиток місцевого запального процесу. Поліуретанові композиції без вмісту лікарських речовин використовували як контрольні. Полімерні композиції були отримані при послідовному механічному перемішуванні олігоефіруретандіізоціанату, лікарської речовини (піроксикаму, ізоніазиду) та прискорювача полімеризації 2,4,6-трис-(диметиламінометил)фенолу (ПП-606/2) за кімнатної температури. Отримані суміші сушили в термостаті за температури 70⁰С. Отверднені поліуретанові композиції, в які додавали ПП-606/2, мали вигляд дрібнопористих губок білого або жовтуватого (у випадку з лікарською речовиною) кольору. Для отримання поліуретанових композицій у вигляді монолітних плівок ПП-606/2 не використовувався, а після перемішування всіх компонентів, проводили їх вакуумування.

Рис. 2. Структурна формула ізоніазиду

Вивчення біодеградації поліуретанових зразків з піроксикамом та ізоніазидом в умовах in vitro та in vivo. Біодеградацію отриманих полімерних матеріалів оцінювали за зміною основних фізико-механічних показників (міцності при розриві, відносного подовження) після їх перебування в модельних середовищах і в організмі експериментальних тварин. Введення піроксикаму та ізоніазиду в структуру поліуретану призводило до зниження основних фізико-механічних показників. При інкубації поліуретанових зразків у модельних середовищах найсильнішу гідролітичну дію мало середовище 199, яке за хімічним складом моделює плазму крові, та реактив Фентона, що моделює умови запального процесу при контакті матеріалу з кров'ю. При інкубації полімерних зразків у цих середовищах впродовж 180 діб спостерігалося поступове зменшення показника відносного подовження (рис. 3).

Після імплантації поліуретанових зразків в організм експериментальних тварин було виявлено, що показник відносного подовження зменшувався майже у всіх зразках, а показник міцності при розриві дещо зростав, що можна пояснити перерозподілом надмолекулярних структур у поліуретанових зразках.

Для більш детального вивчення розподілу лікарських речовин у структурі сітчастого поліуретану та процесу біодеградації поліуретанових зразків були проведені мікроскопічні дослідження. Піроксикам у кількості 2% ваг. рівномірно розподілявся в структурі поліуретану. При імплантації в організм експериментальних тварин спостерігався швидкий та динамічний процес руйнування полімерних зразків, який проявлявся характерним "розтріскуванням" полімеру. Слід зазначити, що після імплантації полімерних зразків з 4% ваг. ізоніазиду таке руйнування майже не спостерігалося, що свідчило про відносну стабільність структури поліуретанових зразків з ізоніазидом.

Рис. 3. Динаміка вивільнення піроксикаму (ПІР) з поліуретанових зразків в умовах in vivo

Дослідження динаміки вивільнення піроксикаму та ізоніазиду з поліуретанових композицій в умовах in vivo та in vitro. Значний інтерес представляло оцінити динаміку вивільнення депонованих лікарських речовин із поліуретанових зразків. Піроксикам належить до лікарських речовин, що важкорозчинні у воді. Тому була розроблена методика визначення динаміки вивільнення піроксикаму в умовах in vivo. Кількість лікарської речовини, що вивільнялася в організм експериментальних тварин, розраховували за різницею між відомою кількістю піроксикаму, введеного в структуру поліуретану до імплантації, та його кількістю після імплантації, знайденого за калібрувальним графіком. УФ-спектр піроксикаму має інтенсивний максимум поглинання при довжині хвилі = (358±2) нм. Показано, що піроксикам, іммобілізований на сітчастому поліуретані, пролонговано вивільнявся в оточуючі тканини експериментальних тварин впродовж 90 діб. При цьому понад 50% введеного піроксикаму вивільнялося вже до 14 доби дослідження, що мало важливе значення для зменшення процесу запалення в місці імплантації.

Динаміку вивільнення протитуберкульозного препарату з поліуретанових зразків у фізіологічний розчин вивчали спектрофотометричним методом в умовах in vitro. УФ-спектр ізоніазиду має інтенсивний максимум поглинання при довжині хвилі л = (262±0,1) нм. Показано, що протягом одного року дослідження відбувалося пролонговане та рівномірне вивільнення ізоніазиду, введеного в структуру поліуретану. При цьому в перші 3 доби вивільнялася ударна доза протитуберкульоз-ного препарату - понад 18%.

Дослідження антипроліферативної активності поліуретанових зразків з піроксикамом при їх імплантації в організм експериментальних тварин. Відомо, що піроксикам при пероральному введенні призводить до зменшення проліферативної активності. Ефективність пролонгованої дії піроксикаму в складі поліуретанових зразків на проліферативні процеси в зоні розвитку запалення оцінювали за допомогою моделі ватної гранульоми. В проведених дослідженнях поліуретанові зразки з піроксикамом проявляли високу антипроліферативну активність у зоні розвитку запалення. Маса грануляційно-фіброзної тканини, утвореної навколо ватної кульки в організмі експериментальних тварин, яким додатково імплантували поліуретанові зразки з 2% ваг. піроксикаму, становила 30,4 мг, тоді як у контролі - 48,5 мг (табл. 1), тобто спостерігалося зменшення проліферативної активності на 37%.

поліуретан імплантаційний протизапальний біодеградація

Таблиця 1

Дослідження антипроліферативної активності поліуретанових зразків з піроксикамом

Примітка. * - відмінності у порівнянні з контролем достовірні (р < 0,05)

Отримані результати свідчать про те, що піроксикам, іммобілізований на полімерному носії, не втрачає своєї терапевтичної дії, ефективності та має антипроліферативну активність, пригнічуючи утворення грануляційної тканини та впливаючи на перебіг процесу запалення в місці розміщення імплантата в організмі експериментальних тварин.

Дослідження впливу поліуретанових зразків з піроксикамом на рівень фосфатазної активності. Одними з найбільш швидко реагуючих на пошкодження органів і тканин організму ферментативних систем є фосфатази. Цитохімічне визначення активності кислої та лужної фосфатаз, у більшості випадків, може слугувати надійним лабораторним тестом, що відображає характер перебігу патологічного процесу в організмі. Об'єктами дослідження були мазки периферичної крові, яку відбирали з хвостової вени лабораторних щурів кожен день з 1-ої по 7-у добу, а також на 14-у та 30-у добу після операції.

Активність лужної фосфатази в нейтрофілах периферичної крові щурів, яким імплантували поліуретанові зразки без піроксикаму, різко збільшувалася вже на 1-у добу, а на 2-у добу досягала максимуму, збільшуючись на 66% у порівнянні з активністю лужної фосфатази в інтактних тварин (127,0±6,32 од). З 5-ї доби активність лужної фосфатази залишалася стабільно високою до кінця експерименту. Активність лужної фосфатази у тварин, яким імплантували поліуретанові зразки з піроксикамом, знижувалася в перші декілька діб експерименту, ймовірно, за рахунок терапевтичного ефекту піроксикаму. Після 7 доби рівень її активності збільшувався, що пояснюється участю лужної фосфатази в регуляції відновлювальних процесів у тканинах (вона інактивує глюкокортикоїди, що інгібують проліферацію фібробластів).

Активність кислої фосфатази різко збільшувалася у щурів, яким імплантували поліуретанові зразки без піроксикаму в перші 2 доби після операції, що, певно, пов'язано з післяопераційною травмою. З 3-ї по 5-у добу, рівень активності кислої фосфатази становив приблизно такий рівень, як у інтактних тварин (109,0±4,72 од.). На 7-у добу після операції активність кислої фосфатази досягала максимуму, поступово знижувалася на 14-у та 30-у добу, але все ж таки залишалася високою. При імплантації поліуретанових зразків з піроксикамом активність кислої фосфатази до 4-ї доби після операції була в межах нормальних величин, що можна розцінювати як послаблення процесу запалення в місці імплантації та в цілому організмі за рахунок пролонгованого вивільнення піроксикаму. Високий рівень кислої фосфатази на більш пізніх термінах може свідчити про активний процес біодеградації полімерного матеріалу, посилення фагоцитозу з боку клітинних елементів у місці імплантації, про подразнюючу дію імплантованих зразків.

Таким чином, зменшення активності лужної та кислої фосфатаз на етапах асептичного запалення свідчить про ефективність імплантованих зразків з пролонгованим вивільненням піроксикаму.

Гістологічні дослідження тканин експериментальних тварин після імплантації поліуретанових зразків пористої структури з різним відсотковим вмістом піроксикаму. Для вивчення взаємодії полімерних матеріалів з тканинами організму проводили імплантаційний тест і вивчали механізми адаптивних перебудов, закономірності регенераторного процесу в оточуючих імплантати тканинах.

Для визначення ефективної фармакологічної дози було проведене порівняльне вивчення тканинних реакцій на імплантацію поліуретанових зразків пористої структури з різним відсотковим вмістом піроксикаму (0,6% ваг.; 1% ваг.; 2% ваг.). Через 1 добу після операції навколо всіх досліджуваних зразків виявлявся товстий лейкоцитарний шар, що складався, переважно, з поліморфно-ядерних лейкоцитів і лімфоїдних елементів. Можна стверджувати, що досліджувані полімерні матеріали з піроксикамом у перші три доби після операції сприяли зменшенню явищ альтерації та ексудації, що приводило до прискорення процесів регенерації та формування сполучнотканинної капсули, яка вже через 30 діб після операції характеризувалася високим ступенем зрілості. Недостатньо зріла капсула та велика кількість кровоносних судин спостерігалися навколо поліуретанових зразків без піроксикаму.

Поліуретановий зразок з 2% ваг. піроксикаму проявляв найбільш ефективну дію на оточуючі тканини серед інших зразків, сприяв зменшенню товщини сполучнотканинної капсули, кількості новоутворених кровоносних судин за рахунок інгібування запальних процесів у місці імплантації. Тому подальші дослідження проводилися зі зразками поліуретану, що містили 2% ваг. піроксикаму.

Гістологічні дослідження тканин експериментальних тварин після імплантації монолітних поліуретанових зразків з піроксикамом. Для морфологічної оцінки розвитку тканинної відповіді на імплантацію монолітних поліуретанових зразків була проведена імплантація зразків поліуретану без лікарської речовини та поліуретану з 2% ваг. піроксикаму в організм експериментальних тварин. За даними гістологічного аналізу виявилося, що навколо поліуретану з піроксикамом, вже через 7 діб сполучнотканинна капсула була тонкою та зрілою, у той час як процес дозрівання капсули й зменшення виразності запальної реакції в контрольній групі прогресував тільки на 14-у добу після імплантації. При імплантації зразків поліуретану з піроксикамом на ранніх термінах відмічалися запальні явища, пов'язані з операційною травмою, котрі практично повністю нівелювалися вже до 14-ої доби дослідження. Такі реакції закономірні на ранніх термінах і послідовно змінюються зменшенням площ інфільтратів, своєчасною редукцією судинного русла, що закінчується утворенням зрілої сполучної тканини навколо імплантата без явищ хронічного запалення. На фоні дозрівання сполучнотканинної капсули у контрольній групі відбувалося деяке збільшення виразності запальної реакції за рахунок появи вогнищ лейкоцитарної інфільтрації, що складалися з поліморфно-ядерних лейкоцитів, макрофагів і лімфоцитів. На більш пізніх термінах відбувалося збільшення кількості колагенових волокон і стабілізація тканинної реакції на імплантат. Таким чином, можна зробити висновок, що досліджувані монолітні полімерні зразки з піроксикамом сприяли зменшенню явищ альтерації та ексудації, як і у випадку імплантації пористих поліуретанових зразків з піроксикамом. Монолітність полімерного зразка в цьому випадку не впливала на "приживлення" імплантата, а піроксикам сприяв більш швидкому формуванню навколо імплантата тонкої та зрілої сполучнотканинної капсули вже до 7-ої доби дослідження.

Гістологічні дослідження тканин експериментальних тварин після імплантації монолітних поліуретанових зразків з ізоніазидом. Для морфологічної оцінки розвитку тканинної відповіді на імплантацію монолітних поліуретанових зразків була проведена імплантація поліуретану без ізоніазиду та поліуретану з 4% ваг. ізоніазиду в організм експериментальних тварин. Гістологічними методами встановлено, що навколо поліуретанових зразків з ізоніазидом спостерігалася досить виражена, розтягнута у часі (до 1 місяця) реакція за типом асептичного запалення. При цьому клітинний склад сполучнотканинної капсули свідчив про досить добру переносимість полімерного матеріалу з пролонгованим вивільненням ізоніазиду. Треба відмітити, що навколо поліуретанових зразків з ізоніазидом відбувалася більш виразна макрофагальна реакція, ніж навколо контрольних зразків. Саме макрофаги (клітини мезенхімального походження, здатні до активного захоплення та перетравлення чужорідних для організму часток) були присутні у великій кількості як в самій сполучнотканинній капсулі, так і в оточуючій полімерний матеріал сполучній тканині. Гістологічні дослідження показали, що ізоніазид, іммобілізований на сітчастому поліуретані, пролонговано вивільнявся в оточуючі тканини, стимулюючи малодиференційовані клітинні елементи на всіх етапах асептичного запалення. Початкова стимуляція моноцитів приводила до прискореного перетворення їх у макрофагальні елементи, велика кількість яких спостерігалася протягом всього терміну дослідження.

Біологічно активні полімерні матеріали на основі поліакриламідного гелю з пролонгованою дією протитуберкульозного препарату

Отримання нового полімерного носія лікарських речовин на основі поліакриламідного гелю (ПААГ). Велике значення для сучасної медицини має розробка і використання полімерів, які б не викликали патологічних змін як загального, так і місцевого характеру в організмі людини. Однак, такий недолік гідрогелевих матеріалів як нестабільність структури під впливом оточуючого середовища організму унеможливлює їх використання як імплантатів для усунення тканинних дефектів при проведенні відновлювальних оперативних втручань і спонукає науковців до пошуку та створення нових удосконалених біосумісних гідрогелевих матеріалів зі стабільною структурою. Великий інтерес спрямований на ПААГ, що широко використовується в пластичній та естетичній хірургії як основа при створенні біологічно активних полімерних матеріалів з пролонгованим вивільненням лікарських препаратів. У відділі полімерів медичного призначення Інституту хімії високомолекулярних сполук НАН України було синтезовано нові кополімерні гідрогелі на основі акрилових мономерів та полівінілпіролідону (ПВП) як носії лікарських препаратів. Біосумісні поліакриламідні гелі отримували шляхом вільної радикальної полімеризації акриламіду та N,N'-метилен-біс-акриламіду в натрій фосфатному буферному розчині (pH 8,0-9,5) за наявності окислювально-відновлювальної ініціюючої системи. Модифікацію гідрогелю ПВП здійснювали на етапі суміщення інгредієнтів у водному розчині. Для отримання полімерних зразків з ізоніазидом проводили насичення ПААГ у розчині ізоніазиду за кімнатної температури.

ІЧ-спектроскопічні дослідження ПААГ різного складу. Методом ІЧ-спектроскопії були зняті спектри: ПААГ, ПВП, ПААГ + ПВП, ізоніазиду, ПААГ + 5% ізоніазиду, ПААГ + ПВП + 5% ізоніазиду. Аналіз ІЧ-спектрів показав, що додавання ПВП до ПААГ приводило до змін інтенсивності піків нСН щодо нNH і нОH, що свідчить про різноманітну структуру поверхневого шару зразків ПААГ і ПААГ + ПВП. Поверхневий шар ПААГ формувався в більшій мірі з ОН і NH груп, у зразках ПААГ + ПВП збільшувалася частка СН груп на поверхні. В області 1500-1700 см-1 відбулася зміна інтенсивності дублетної смуги - 1650 / 1610 см-1. Смуга 1650 см-1 збільшувалася, оскільки ПВП має інтенсивну смугу нСО - 1680 см-1, то, очевидно, збільшення інтенсивності смуги 1650 см-1 відбувалося саме за її рахунок. Перерозподіл інтенсивності смуг дСН груп в області 1300-1480 см-1 пов'язано з додаванням СН груп ПВП. Аналогічно пояснюється поява смуги 1290 см-1 нCN ПВП.

На спектрах 4 та 5 подані ІЧ-спектри ізоніазиду та ПААГ + ізоніазид. Ізоніазид являє собою амід з кінцевою групою NH2 з одного боку та ароматичним кільцем з іншого. ІЧ-спектр характеризується смугами цих груп: смуга амід І (карбонільне поглинання С=О груп - 1636 см-1), амід ІІ (деформаційне поглинання NН груп - 1556 см-1), а також валентні та деформаційні коливання NH груп (NН, NН2) - 3000-3600 см-1 та 1550-1690 см-1. Ароматичне кільце дає ряд смуг у широкій області 600-1600 см-1. Порівнюючи спектри зразків ПААГ і ПААГ + ізоніазид видно, що додавання ізоніазиду в структуру ПААГ привело, як і в зразках ПААГ + ПВП, до перерозподілу інтенсивності смуг ОН і NH груп щодо СН груп на поверхневому шарі зразків. В області 700-1800 см-1 спектра ПААГ + ізоніазид особливих змін не спостерігалося, за винятком незначного перерозподілу інтенсивності дСН груп в області 1300-1480 см-1. Також відбувався розрив внутрішньомолекулярних зв'язків між молекулами ізоніазиду з утворенням нових водневих зв'язків між групою ізоніазиду та ОН, NH групами ПААГ, які слабше пов'язані, що в підсумку приводило до зміщення смуги 3114 см-1 у бік більших частот. В області 1500-1800 см-1 широка симетрична смуга з максимумом 1655 см-1 розділилася на 3 смуги, а також додатково з'явилися на гребені цієї смуги піки 1740 і 1615 см-1. У зразках ПААГ + ПВП + ізоніазид (рис. 10, спектр 6) з'явилася додаткова смуга нCN груп (1290 см-1). Також відбулося незначне зменшення інтенсивності смуг 1740 і 1615 см-1 на фоні збільшення інтенсивності смуги 1655 см-1, а також смуги 1240 см-1.

ІЧ-спектроскопічні дослідження показали, що введення ПВП у ПААГ приводило до зростання кількості міжмолекулярних водневих зв'язків зі зменшенням кількості внутрішньомолекулярних зв'язків, що свідчить про отримання більш зшитої структури. При додаванні ізоніазиду до ПААГ відбувалася зміна спектра ПААГ, причому додаткові смуги не відповідали смугам самого ізоніазиду. Це можна пояснити руйнуванням кристалічної структури ізоніазиду та його взаємодією з ПААГ з утворенням нових зв'язків.

Іммобілізація ізоніазиду на ПААГ, вивчення динаміки вивільнення ізоніазиду з ПААГ, модифікованого ПВП. Насичення ПААГ ізоніазидом проводили в цитратно-фосфатному буферному розчині при рН 5,0. Було виявлено деяке зниження кількості поглинутого ізоніазиду зразком ПААГ з 0,3% ПВП у порівнянні зі зразком ПААГ. За 0,5 і 1,0% концентрації ПВП у структурі ПААГ кількість поглинутого ізоніазиду зростала за рахунок збільшення гідрофільності полімеру.

Представляло значний інтерес оцінити процес динаміки вивільнення ізоніазиду з гідрогелевих зразків у модельне середовище. Динаміку вивільнення ізоніазиду з ПААГ, модифікованого ПВП, у фізіологічний розчин вивчали спектрофотометричним методом. Спектри поглинання досліджуваних розчинів ізоніазиду до і після експозиції полімерних зразків у вказаних умовах ідентичні спектру самого ізоніазиду. Отримані результати свідчать про пролонговане вивільнення ізоніазиду в розчин протягом різних проміжків часу: зі зразка ПААГ - за 5 діб, зі зразків ПААГ + ПВП 0,3% та ПААГ + ПВП 0,5% - за 9 діб, зі зразка ПААГ + ПВП 1,0% - за 19 діб.

Отримані результати свідчать про можливість контролю за вивільненням ізоніазиду з полімерних систем за рахунок регулювання відсоткового вмісту ПВП у структурі ПААГ.

Вивчення біосумісності модифікованих гідрогелевих матеріалів методом культури тканин. На основі загальноприйнятих методів досліджень на лабораторних тваринах отримати відповідь на питання про можливість клінічного використання тих чи інших полімерних матеріалів часто важко у зв'язку з мобілізацією захисних систем організму за умов його контакту з полімерним імплантатом. Тому для вивчення ступеня біосумісності нових гідрогелевих матеріалів на основі ПААГ були проведені гістотоксичні дослідження за допомогою методу культури тканин, який дає змогу подолати фізичні, фізіологічні та біохімічні обмеження, притаманні живому організму.

Метод культури тканин дає можливість швидко та точно оцінити гістотоксичну дію різних речовин на фібробластичні елементи, які відіграють важливу роль у взаємодії полімерний імплантат - тканина. Метод культивування дуже чутливий при оцінці полімерних матеріалів, що відрізняються як токсикологічними характеристиками, так і фізико-хімічними властивостями.

Нами була проведена модифікація методу культури тканин, яка полягала в тому, що за допомогою гідрогелевих зразків (ПААГ + ПВП і ПААГ + ПВП + ізоніазид) проводили формування твердої фази для росту та розвитку клітинних елементів підшкірної тканини лабораторних щурів. В основу методу оцінки токсичності полімерних гідрогелевих матеріалів медичного призначення були покладені такі моменти: необхідність обрахунку відношення зон росту до периметра експлантата, загальної площі, що займають зростаючі клітини, і площі, що займає відповідна зона росту. З цією метою на 3, 7, 10 та 14-у добу культивування визначали межі компактної (К), сіткоподібної (С) зон, а також зони мігруючих елементів (М). Критерієм для визначення відповідних зон був характер розташування зростаючих клітин.

Для кожної зони росту за допомогою морфометричної сітки із заданим кроком вузлів визначали їх площі: Sк.з.р., Sс.з.р., Sм.з.р. за формулою

S = n · 25,

де n - кількість вузлових крапок у кожній зоні росту. За величину, що характеризує активність росту (АР), тобто ступінь проростання експлантата і наступного формування описаних вище зон росту у визначений термін спостереження, бралося відношення периметра експлантата, що відповідає кожній зоні, до периметра усього експлантата, а за показник, що дає змогу оцінити інтенсивність росту (ІР), - відношення площі росту, що припадає на одиницю периметра експлантата відповідної зони росту.

Параметри АР та ІР обчислювалися за формулами:

,

де Пз.р. - частина периметра експлантата, що відповідає визначеній зоні росту, мм;

Пекспл. - периметр експлантата, мм;

Sз.р. - площа відповідної зони росту, мм².

Поряд з параметрами активності та інтенсивності росту у зазначений термін оцінювався характер зональної дегенерації клітин (D) у балах (табл. 2).

Таблиця 2

Кількісні параметри росту тканинних культур на гідрогелевих підкладках у різні терміни культивування (n = 5)

На основі отриманих кількісних параметрів росту тканинних культур на гідрогелевих підкладках розраховували показник гістотоксичності (ПГТ) за формулою:

де - середнє значення величин зональних активностей росту фібробластів у досліді при термінах культивування, що спостерігалися;

та - сума величин середніх значень зональної інтенсивності росту фібробластів у досліді на 3, 7, 10 та 14-у добу культивування;

- сума середніх значень величин зональної дегенерації фібробластів у досліді на 3, 7, 10 та 14-у добу культивування при оцінці в балах;

n - кількість показників активності росту фібробластів.

Проведені кількісні розрахунки параметрів тканинних культур дали змогу встановити, що ПГТ для ПААГ + ПВП складає 0,76±0,01, для ПААГ + ПВП + ізоніазид - 0,73±0,01, а самі досліджувані зразки можуть бути віднесені до нетоксичних і біосумісних полімерних матеріалів та можуть знайти широке застосування у медичній практиці.

Порівняльне вивчення місцевих тканинних реакцій на імплантацію ПААГ різного складу. Для морфологічної оцінки розвитку тканинних реакцій була проведена імплантація ПААГ різного складу в організм експериментальних тварин. Щоденна візуальна оцінка реакції епітелію на операційному місці показала, що рана загоювалася через 3-5 діб після операції без ознак запальної реакції. За морфологічними ознаками практично не було виявлено дегенеративних змін, пухлин, некрозу тканин ні у короткочасному, ні у віддаленому післяопераційному періоді. При гістологічному вивченні тканинних реакцій на імплантацію ПААГ різного складу в організм лабораторних щурів було встановлено, що навколо всіх зразків утворювалася сполучнотканинна капсула вже на ранніх термінах дослідження. Ступінь зрілості сполучнотканинної капсули був різним. На деяких ділянках спостерігалася тонка і зріла капсула, що складалася з колагенових волокон, орієнтованих вздовж імплантованого матеріалу, на інших ділянках - товста капсула з хаотичним розташуванням колагенових волокон і молодими формами фібробластів. Крім того, спостерігалася інфільтрація структури всіх без винятку імплантованих зразків круглоклітинними елементами, в основному макрофагальними.

Навколо майже всіх зразків розвивалася досить виразна реакція мікроциркуляторного русла. Хоча порівнюючи судинну реакцію треба відмітити деяку нормалізацію кровоносного русла та відносно невелику кількість судин навколо зразків з ізоніазидом. Наявність ПВП у складі ПААГ приводила до стабілізації структури полімерного матеріалу при довготривалому перебуванні в живому організмі, що є важливим моментом, наприклад, при пластичних операціях. При цьому спостерігалася міграція клітинних елементів у структуру імплантованого матеріалу без його фрагментації та без розплавлення в оточуючих тканинах. Таким чином, гістологічні дослідження ПААГ різного складу, в т.ч. з ізоніазидом, показали, що ці полімерні матеріали біосумісні, стабільні, стійкі до міграції, викликають запальні процеси в місці імплантації за типом асептичного запалення.

Висновки

1. Вперше розроблена методика визначення динаміки вивільнення нерозчинної лікарської речовини у складі полімерного імплантату в умовах in vivo, на прикладі піроксикаму. Встановлена залежність відсоткового вмісту піроксикаму у складі сітчастого поліуретану на гістоморфологічні процеси при імплантації.

2. Встановлено, що піроксикам у складі імплантату на основі сітчастого поліуретану значно зменшує рівень активності кислої та лужної фосфатаз, має антипроліферативну активність.

3. Вперше встановлено, що ізоніазид пролонговано вивільняється з сітчастого поліуретану протягом тривалого часу, стимулюючи макрофагальні елементи на всіх етапах асептичного запалення.

4. Розроблена методика насичення поліакриламідного гелю ізоніазидом, вивчена динаміка вивільнення ізоніазиду в умовах in vitro. Показано, що поліакриламідний гель, модифікований 1% ПВП, є перспективним матеріалом з пролонгованим вивільненням ізоніазиду.

5. Проведена модифікація методу тканинної культури, за допомогою якого визначена ступінь токсичності гідрогелевих матеріалів.

6. Розроблена комплексна система медико-біологічних методів дала змогу оцінити ефективність імплантаційних полімерних матеріалів. Показано, що полімерні матеріали з піроксикамом та ізоніазидом є біосумісними, нетоксичними та можуть бути рекомендовані для проведення клінічних випробувань.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Кулеш Д.В. Сравнительное изучение местных тканевых реакций на полимерный носитель с различным содержанием пироксикама / Д.В. Кулеш, Е.С. Савицкая, Н.А. Галатенко // Доповіді НАН України. - 2005. - №6. - С. 160-164.

2. Кулєш Д.В. Фосфатазна активність лейкоцитів крові при імплантації полімерних форм з піроксикамом / Д.В. Кулєш, Р.А. Рожнова, Н.А. Галатенко // Доповіді НАН України. - 2006. - №11. - С. 179-183.

3. Кулеш Д.В. Экспериментальное исследование сетчатого эндопротеза для восстановительной хирургии / Д.В. Кулеш, Н.А. Галатенко, Р.А. Рожнова, Р.П. Федоренко // Пластична та реконструктивна хірургія. - 2007. - №1 (7). - С. 31-34.

4. Кулєш Д.В. Експериментальні дослідження біологічно-активного полімерного матеріалу при імплантації / Д.В. Кулєш, Р.А. Рожнова, Н.А. Галатенко // Пластична та реконструктивна хірургія. - 2007. - №1 (7). - С. 35-41.

5. Кулеш Д.В. Морфологические особенности протекания тканевых реакций при имплантации биологически активных полимерных систем экспериментальным животным / Д.В. Кулеш, Р.А. Рожнова, Н.А. Галатенко // Вісник морфології. - 2007. - №13 (1). - С. 4-9.

6. Кулєш Д.В. Динаміка вивільнення нестероїдного протизапального препарату піроксикаму з полімерної композиції на основі олігоефіруретандіізоціанату in vivo / Д.В. Кулєш, Л.Ю. Нечаєва, Н.А. Галатенко // Доповіді НАН України. - 2008. - №6. - С. 130-133.

7. Галатенко Н.А. Сорбційні та десорбційні властивості ПААГ "Рінапласт" / Н.А. Галатенко, Р.А. Рожнова, І.М. Кебуладзе, Л.Ю. Нечаєва, Д.В. Кулєш // Пластична та реконструктивна хірургія. - 2009. - №1 (ХІІ). - С. 32-39.

8. Пат. №41791 А Україна, МПК7 A61L 24/00, C08L 75/00, C09J 175/04. Полімерний композиційний матеріал / Кулєш Д.В., Рожнова Р.А., Галатенко Н.А.; заявник і власник Інститут хімії високомолекулярних сполук НАН України. - №u200814787; заявл. 22.12.2008; опубл. 10.06.2009, Бюл. №11.

9. Кулеш Д.В. Получение полимерных пролонгированных форм с пироксикамом / Д.В. Кулеш, Е.С. Савицкая, Н.А. Галатенко // ХХ Укр. конф. з органічної хімії: тези доповідей, 12-14 жовт. 2004 р. - К., 2004. - С. 514.

10. Кулєш Д.В. Вивчення властивостей полімерних форм з нестероїдними протизапальними препаратами / Д.В. Кулєш, О.С. Савицька, Л.Ю. Нечаєва // Х Укр. конф. з високомолекулярних сполук: тези доповідей, 12-14 жовт. 2004 р. - К., 2004. - С. 115.