Гідрогелеві кальцій-фосфатні нанокомпозити

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук

Спеціальність 02.00.11 - колоїдна хімія

Гідрогелеві кальцій-фосфатні нанокомпозити

Суходуб Людмила Борисівна

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка Національної академії наук України

Науковий керівник: доктор хімічних наук, старший науковий співробітник Самченко Юрій Маркович, Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка Національної академії наук України, провідний науковий співробітник

Офіційні опоненти:

доктор хімічних наук, професор, Третиник Вікентій Юрійович, Інститут колоїдної хімії і хімії води ім. А.В. Думанського Національної академії наук України, провідний науковий співробітник

доктор фізико-математичних наук, професор Покровський Валерій Олександрович, Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка Національної академії наук України, заступник директора з наукової роботи

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.209.01, доктор технічних наук В.А. Прокопенко

Анотація

акриловий мономер протезування нанокомпозит

Суходуб Л.Б. Гідрогелеві кальцій-фосфатні нанокомпозити. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.11 - колоїдна хімія. - Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України, Київ, 2009.

Дисертація присвячена - створенню гідрогелевих кальцій-фосфатних нанокомпозитів на основі акрилових мономерів, як нового біоматеріалу, призначеного для лікування та протезування кісткових тканин.

Гідрогелеві матриці на основі акрилових мономерів, характерною ознакою яких є наявність локальних об'ємів, спроможних виконувати функції своєрідних нанореакторів по відношенню до інкорпорованих прекурсорів (наприклад, гідроксилапатиту), були використані в різних консистентних станах для отримання нового композитного матеріалу. Сумарний вміст зшитого полімеру в гідрогелях варіювався в діапазоні від 5 до 50 %, а концентрація зшиваючого агенту ((N,N'-метилен-біс-акриламіду) - від 0,01 до 1 %. Гелеутворення відбувалося при кімнатній температурі, ініціювання полімеризації здійснювалося з використанням окиснювально-відновної системи. Зустрічна дифузія кальцієвих та фосфатних іонів у пористу гідрогелеву матрицю приводила до утворення різних ортофосфатів кальцію : трикальційфосфату (Са₃(РО₄)₂, брушиту СаНРО₄ ·2Н₂О, монетиту СаНРО₄ та гідроксилапатиту (ГА). В результаті проведених досліджень були знайдені умови утворення стехіометричного (Са/Р= 1,67) ГА в гідрогелевих матрицях. Формування в зазначених матрицях нанокристалічного ГА було підтверджено різними сучасними інструментальними методами (ЯМР ³¹Р, ІЧ коливальна спектроскопія, ЕМ) та, перш за все, рентгеноструктурним аналізом з використанням бази даних JCPDS. Отримані нанокомпозитні системи з використанням синтезованих високодисперсних гідрогелевих матриць мають гідрофільні характеристики, подібні до таких для мінералізованих колагенових природних фібрил.

Ключові слова: гідрогелі, колаген, нанокомпозити, гідроксилапатит, набухання, іонний обмін, адсорбція, мінералізація.

Аннотация

Суходуб Л.Б. Гидрогелевые кальций-фосфатные нанокомпозиты. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата химических наук по специальности 02.00.01 - коллоидная химия. - Институт биоколлоидной химии им. Ф.Д. Овчаренко НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертационная работа посвящена созданию гидрогелевых кальций-фосфатных нанокомпозитов на основе акрилових мономеров, как нового биоматериала, предназначенного для лечения и протезирования костных тканей.

Гидрогелевые матрицы на основе акриловых мономеров, характерной особенностью которых является наличие локальных объемов, способных выполнять функции своеобразных нанореакторов по отношению к инкорпорированным прекурсорам (гидроксилапатит), были использованы в различных консистентных состояниях для получения нового композитного материала. Суммарное содержание сшитого полимера варьировалось в диапазоне от 5 до 50 %, а концентрация сшивающего агента (N,N'-метилен-бис-акриламида) - от 0,01 до 1 %. Гелеобразование осуществлялось при комнатной температуре. Полимеризация инициировалась окислительно-восстановительной системой. Встречная диффузия ионов кальция и фосфат-ионов в пористую гидрогелевую матрицу приводила к образованию различных ортофосфатов кальция: трикальцийфосфата (Са₃(РО₄)₂, брушита (СаНРО₄2Н₂О), монетита (СаНРО₄) и гидроксилапатита (ГА). В результате проведенных исследований были найдены условия образования стехиометрического (Са/Р=1,67) ГА в гидрогелевых матрицах. Было продемонстрировано, что превалирующее формирование нанокристаллического ГА наблюдалось в случае высокодисперсных гидрогелевых матриц с диаметром частиц около 0,05мкм, а также при уменьшении суммарного содержания сшитого полимера (уменьшении соотношения дисперсной фазы к дисперсионной среде до значения 5: 9,5).

Формирование в указанных матрицах нанокристаллического ГА было подтверждено различными современными инструментальными методами (ЯМР ³¹Р, ИК - спектроскопия, ЭМ) и, прежде всего, рентгеноструктурным анализом с использованием базы данных JCPDS. Оценка размеров кристаллитов инкорпорированного ГА показала, что они, имея размеры до 15 нм вдоль оси с и 5 нм в перпендикулярном направлении, соразмерны с кристаллитами биогенного апатита. Полученные с использованием синтезированных высокодисперсных гидрогелевых матриц нанокомпозитные системы, имеют гидрофильные характеристики, близкие к таковым для природных минерализованных коллагеновых матриц.

Для коллагеновых матриц (фибрилл) установлено, что в результате минерализации их уровень гидратации существенно уменьшается (при ОВ 86% приблизительно в 4 раза), и этот феномен отражает критическое влияние процесса осаждения гидроксилапатитных нанокристаллитов внутри трехмерной (3D) коллагеновой спирали на состояние гидратации фибриллярной структуры. Пьезогравиметрические исследования показали, что сорбционная способность ГА значительно уступает таковой для коллагена. Количественные параметры гидратации были получены с использованием модели Д'Арси и Ватта, которая учитывает гетерогенность адсорбента. В результате трактовки полученных данных, была построена модель минерализации с обозначением двух специфических структур гидратного окружения коллагена. Показано, что особенности гидратации минерализованных природних коллагеновых матриц, в целом, соответствуют особенностям набухання синтетических гидрогелевых систем, полученных в данной работе.

Ключевые слова: гидрогели, коллаген, нанокомпозиты, гидроксилапатит, набухание, ионный обмен, адсорбция, минерализация.

Summary

Sukhodub L.B. Hydrogel calcium phosphate nanocomposites. - Manuscript

Dissertation for the scientific degree of candidate of chemical sciences on speciality 02.00.11 - colloidal chemistry. - F.D. Ovcharenko Institute of biocolloidal chemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

Dissertation is dedicated formation of hydrogel calcium phosphate nanocomposites, based on acryl monomers, as a novel biomaterial for healing and prosthetics bone tissues.

Hydrogel matrixes, based on acryl monomers, which are characterized by the presence of the local spaces ,that are able to perform a nanoreacor's function for incorporated precursors (for example, hydroxylapatite (HA)) have been used in various consistent states for obtaining a novel composite material. Summary content of the binded polymer in hydrogels was varied in the range from 5 to 50% and a concentration of a binding agent (N,N'-methylen-bis-acrylamid) was changed in the range 0,01-1%. Gelformation was performed at the room temperature, initiation of polymerization was created using an oxidation-reduction system. Meet diffusion calcium and phosphate ions into porous hydrogel matrix led to the creation different calcium orthophosphates: tricalciumphosphate (Са₃(РО₄)₂, brushite СаНРО₄ ·2Н₂О, monetite СаНРО₄ and HA. Creation conditions for stechiometric (Са/Р= 1,67) HA in hydrogel matrixes were obtained, as a result of the investigations. The formation in mentioned matrixes nanocrystal HA was confirmed by various modern instrumental methods (NMR ³¹Р, IR spectroscopy, EM), but, first of all, by x-ray diffraction with the using data base JCPDS. Obtained nanocomposite systems with using synthesized high dispersion hydrogel matrixes, were characterized by the level of hydration similar to the level for mineralized natural collagen fibrils.

Keywords: hydrogels, collagen, nanocomposites, hydroxylapatite, hydration, ion exchange, adsorption, mineralization.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність роботи. В останні роки багато досліджень пов'язано з отриманням наночастинок різних матеріалів, завдяки їх унікальним фізико-хімічним та біологічним властивостям. Для подібних об'єктів, наприклад, наночастинок благородних металів, характерна висока реакційна здатність і тому для їх стабілізації необхідні певні умови утримання. Останнє можливо з використанням полімерних сполук різного хімічного складу. Зокрема, дуже перспективним є використання високодисперсних гідрогелів, синтезованих на основі акрилових мономерів. Подібні структури використовують як реактори для синтезу наночастинок благородних металів, магнетиту та інших сполук з подальшим їх утриманням у порах просторово зшитого полімеру. В даному дослідженні вирішувалась проблема інкорпорування кальцій-фосфатних частинок ( у т.ч. гідроксилапатиту) у пори гідрогелевих матриць.

Гідроксилапатит (ГА) є основним неорганічним компонентом кісткової тканини, якому притаманні такі цінні властивості, як біосумісність, біоактивність, остеопровідність та відсутність запальних і токсичних ефектів. Однак, практичне застосування ГА при ендопротезуванні обмежується через його твердість, крихкість та значну кристалічність. Тому використання гідрогелевих кальцій-фосфатних нанокомпозитних матеріалів, що об'єднують корисні властивості полімерної та неорганічної складових, є актуальним та перспективним при протезуванні кісткової тканини.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно з планами відомчих тем відділу біофізики і мас-спектрометрії Інституту прикладної фізики НАН України “Вивчення термодинамічної стабільності і мікро елементного складу біооб'єктів за допомогою розробок м'якої іонізаційної мас-спектрометрії та ядерного мікрозонду” (№ Держреєстрації 0100U000068, 2000-2002 рр..); “Наноструктури, іони-домішки та вільні радикали в кісткових тканинах та їх синтетичних аналогах: in vivo дослідження імплантованих матеріалів з використанням комплементарних інструментальних методів”, DFG Mercator-Stipendiums (Gastgeber: Dr. Sulkio-Cleff), 2002-2003 р.р.; науково-дослідної роботи ДУ „Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України „Дослідження супрамолекулярних комплексів протимікробних сполук з допоміжними та модельними речовинами” (№ Держреєстрації 0104U002956, галузевий шифр теми АМН 56/2004, 2004-2006р.р.),а також Інституту біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України в рамках Комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України “Наносистеми, наноматеріали та нанотехнології”: “Гідрогелеві нанореактори для отримання високодисперсних колоїдних металів” (№ Держреєстрації 0103V006027, 2006 р.,); “Створення матеріалів, біосумісних з клітинами кісткової тканини на основі гідроксилапатиту та металів (срібло, золото, платина) з використанням гідрогелевих нанореакторів” (№ Держреєстрації 0103V006028, 2007-2009 рр.).

Мета роботи - створення гідрогелевих кальцій-фосфатних нанокомпозитів на основі акрилових мономерів, як нових біоматеріалів, призначених для лікування та протезування кісткових тканин.

Для реалізації поставленої мети були визначені задачі:

Провести дослідження процесів інкорпорації нанорозмірних частинок кальцій-фосфатних сполук в гідрогелеві матриці, отримані радикальною співполімеризацією акрилових мономерів: акриламіду (АА), акрилонітрилу (АН) та акрилової кислоти (АК).

Дослідити структурно-фізичні характеристики та фазовий склад синтезованого ГА та його катіон-заміщених (Ті⁴⁺, V³⁺, Co²⁺, Al³⁺) аналогів з використанням рентгенівської дифракції та інших фізичних методів.

Вивчити колоїдно-хімічні механізми впливу мінералізації гідроксилапатитом колагенових фібрил на їх гідратацію з використанням даних п'єзогравіметрії, інфрачервоної спектроскопії та рентгенівської дифракції.

Дослідити колоїдно-хімічні та структурні властивості гідрогелевих кальцій-фосфатних нанокомпозитів, провести порівняння гідрофільних характеристик отриманих матеріалів з колагеновими фібрилами та синтетичним ГА з метою з'ясування закономірностей іммобілізації та утворення ГА в гідрогелях й очікуваної поведінки отриманих матеріалів in vivo.

Об'єкт дослідження - процеси інкорпорації (утворення) гідроксилапатиту в полімерних акрилових матеріалах, колагенових фібрилах.

Предмет дослідження - створення гідрогелевих кальцій-фосфатних нанокомпозитів на основі акрилових мономерів, близьких за своїми колоїдно-хімічними властивостями до біогенного гідроксилапатиту, що є складовою нативної кісткової тканини.

Методи досліджень - метод синхронної мінералізації колагенових фібрил, метод гравіметрії для дослідження набухання гелів, метод рентгенівської дифракції для фазового аналізу кальцій-фосфатних сполук та інкорпорованих апатитів, метод інфрачервоної спектроскопії для вивчення гідратації композитів, метод мас-спектрометрії для дослідження процесів катіонного заміщення в ГА, метод ЯМР-спектрометрії для прямої ідентифікації інкорпорованих апатитних фаз в гідрогелях, метод п'єзогравіметрії для отримання ізотерм гідратації, метод растрової електронної мікроскопії для морфологічних досліджень та виміру Са/P співвідношень.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблені наукові основи синтезу акрилових гідрогелевих систем з інкорпорованими частинками ГА, близьких за своїми колоїдно-хімічними та кристалічними властивостями до біогенного апатиту. Встановлено залежність ефективності мінералізації з формуванням тих чи інших кальцій-фосфатних фаз в порах гелів від хімічного складу полімеру та загальної частки зшитого полімеру. Встановлено, що співвідношення Са/Р в нанокристалітах гідроксилапатиту, інкорпорованого в пори гомополіакриламідного гелю, відповідає стехіометричному співвідношенню Са/P = 1,67. Визначено фазовий склад катіон-заміщених (Ті⁴⁺, V³⁺, Co²⁺, Al³⁺) гідроксилапатитів з використанням рентгенівської дифракції та інших фізичних методів. Побудовано фізичну модель ранньої мінералізації колагенових фібрил з урахуванням молекул води, адсорбованих як всередині, так і на поверхні колагенових фібрил.

Практичне значення одержаних результатів. В результаті проведених досліджень створено гідрогелевий кальцій-фосфатний нанокомпозитний біоматеріал, перспективний для використання в медицині, зокрема - при протезуванні кісткової та зубної тканин. Результати вивчення катіон-заміщених гідроксилапатитів є важливими при використанні металевих імплантатів в практичній ортопедії та стоматології, а також для модифікації кальцій-фосфатів при створенні нових біоматеріалів.

Особистий внесок здобувача полягає у плануванні та виконанні основних експериментальних досліджень та теоретичних розрахунків, наведених в дисертації. Визначення проблеми та задач дослідження, аналіз отриманих результатів та формування висновків проводились спільно з науковим керівником роботи д.х.н., с.н.с., пр.н.с. Самченком Ю.М.. Критичний огляд наукової літератури, підготовка та оформлення публікацій, написання тексту дисертації виконано дисертантом особисто. Рентгеноструктурні дослідження гідрогелевих зразків проведено у співпраці з к.ф.-м.н., с.н.с. Данільченко С.М. (Інститут прикладної фізики НАН України, м. Суми). Дослідження методами інфрачервоної та ЯМР-спектроскопії проведено у співпраці з к.ф.-м.н., с.н.с. Болдескулом І.Є. (Інститут прикладної фізики НАН України, м. Суми). Результати досліджень, виконаних у співпраці, отримані за участю автора на всіх етапах.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідались на міжнародних та українських конференціях: The Second Sumy-Cracow-Muenster Simposium on Nuclear Analytical Methods (Cracow, Poland, 2001); Школі-семінарі “Мас-спектрометрія в хімічній фізиці, біофізиці і екології” (Звенигород, Росія, 2002 р.); V11 International Conference on Molecular spectroscopy (Wroclaw, Poland); І Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики” (Харків, 2004 р.); ІІІ Міжнародній конференції по колоїдній хімії та фізико-хімічній механіці (Москва, Росія, 2008 р.); Третьому міжнародному симпозиумi “Методи хімічного аналізу” (Севастополь, Україна, 2008 р.); Науково-практичній конференції «Биологически-активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый свет, Крым, Украина, 2009); на наукових радах інститутів (Інститут ядерної фізики Університету Мюнстера, Німеччина; Інститут прикладної фізики НАН України; Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечнікова АМН України, Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України).

Основний зміст роботи викладено у 14 наукових працях, з них у 6 статтях у наукових фахових виданнях, у 1 статті у науковому виданні, у 7 тезах доповідей на вітчизняних та міжнародних конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 114сторінках та складається зі вступу, 5 розділів, висновків і списку використаної літератури, що включає 130 джерел на 15 сторінках, 1 додатку. Робота проілюстрована 17 таблицями, 35 рисунками.

2. Основний зміст роботи

У вступі обґрунтовано актуальність теми роботи, визначено мету та задачі роботи, об'єкт та предмет дослідження, а також зазначено наукову новизну отриманих результатів, їх фундаментальне та практичне значення.

В першому розділі приведено критичний огляд наукової літератури, в якому основний акцент приділено сучасним підходам та уявленням щодо формування та використання гідрогелевих систем для інкорпорації наночастинок різних речовин з метою одержання біосумісних матеріалів для потреб медицини. Також подано огляд літератури щодо феномену біомінералізації, зокрема колагенових фібрил - найнижчого рівня в ієрархії будови кісткової тканини.

В другому розділі наведено обґрунтування та опис основних об'єктів дослідження. Детально висвітлено методи синтезу та експериментальні методи, які були використані в роботі для дослідження колоїдно-хімічних та фізико-хімічних властивостей мінералізованих гідрогелевих систем та колагенових фібрил.

При синтезі гідрогелевих матриць використовували акриламід (АА), акрилонітрил (АН), акрилову кислоту (АК) та зшиваючий агент N,N'-метилен-біс-акриламід (МБА). Виробник - фірма “Merck” (Німеччина). Для ініціювання радикальної полімеризації використовували окисно-відновну систему персульфат калію - метабісульфіт натрію (“Sigma”, США). Створення наночастинок ГА - Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ - в гідрогелевій матриці проводилось шляхом послідовної обробки матриці розчинами кальцій нітрату, амоній гідрофосфату, амоніаку.

При синтезі як ГА, так і катіон-заміщених зразків ГА, використовували хімічну реакцію з вихідними розчинами кальцій нітрату та амоній гідрофосфату без- та у присутності іонів металів Ті⁴⁺, V³⁺, Co²⁺, Al³⁺. Необхідний рівень рН підтримували додаванням 25 % водного розчину амоніаку. Іони металів додавали у вигляді розчинів їх солей: титан (ІІІ) хлориду (виробник “Alfa Aesar”) (20 % розчин ТіСl₃ у HCl), ванадій (ІІІ) хлориду (VCl₃), кобальт (ІІ) нітрат гексагідрату (Со(NO₃)₂ 6Н₂О), алюміній хлориду (виробник “Aldrich”) (AlCl₃) у межах від 0,5 % до 20 %, які додавали до розчину кальцій нітрату за 10 хвилин до внесення амоній гідрофосфату.

Для приготування системи колаген-ГА були використані синтезовані зразки ГА, які пройшли термічну обробку при температурі 1000°С протягом 1 години. Використовували колаген (тип I), отриманий із двох різних джерел: а) колаген, виділений із хвостів щурів (біологічний факультет Харківського національного університету, Україна) та б) колаген, виділений із телячої шкіри, ліофілізований та кислотно-розчинний (виробник “Sigma”). Концентрація колагену в розчинах складала 2,5 мг/мл. Мінералізацію колагену здійснювали двома методами: а) додаванням ГА, у вигляді дрібнодисперсного порошку, до розчину колагену та б) синхронною мінералізацією.

Для визначення кристалічних фаз отриманих в роботі порошкових зразків, використовували метод рентгенівської дифракції (XRD). Основні експерименти були проведені з використанням дифрактометра Siemens D5000 в Інституті ядерної фізики (Університет Мюнстера, Німеччина) та дифрактометра ДРОН-4 (Росія). Дифрактограми отримували в інтервалі значень кута дифракції 2и від 5 до 90^о з розміром кроку 0,02^о і часом вимірювання 1 с/крок. Рентгенівське випромінювання забезпечувалось мідною трубкою (Cu-K_б випромінювання) при струмі 30 мА і напрузі 40 кВ з поглинанням Cu-K_в радіації фільтром з металевого нікелю. Ідентифікація кристалічних фаз здійснювалась шляхом порівняння отриманих дифрактограм з довідковою базою даних JCPDS.

Як для вивчення морфології гідрогелевих зразків, так і отримання даних про їх елементний склад, використовували растрову електронну мікроскопію з рентгенівським мікроаналізатором (прилад РЕММА 102, “Селмі”, Україна).

В мас-спектрометричних дослідженнях використовували метод з іонізацією уламками поділу ²⁵²Cf (PDMS), технічно реалізований на приладі МСБХ (“Селмі”, Україна) з параметрами: діапазон мас - 25000 а.о.м., розрізнювальна здатність 1000 по кластерам цезій йодиду, гранична чутливість - 1 пмоль по граміцидину S, точність визначення молекулярної маси ± 0,8 а.о.м. в діапазоні до 5500 а.о.м.

Методика п'єзогравіметрії, що базується на залежності резонансної частоти кварцового кристалу від маси матеріалу на його поверхні, була використана для отримання ізотерм гідратації, тобто залежності кількості сорбованої води (n) при заданій відносній вологості (ВВ) в грамах на грам сорбенту (або моль води на моль сорбенту Gly-X-Y - структурної одиниці колагену).

Спектри ІЧ-поглинання сухих гідрогелів у вигляді порошку, пресованого в таблетку з калій бромідом, були отримані з використанням ІЧ-Фур'є-спектрометра Vertex 70 (фірма “Bruker”, Німеччина). В експериментах з гідратації плівки чистого та мінералізованого колагену висушували в вакуумі (10^-2 тор), а потім зволожували до фіксованої вологості в інтервалі ВВ 0 ч 86 % , завдяки їх інкубації в атмосфері пари насичених сольових розчинів в умовах термодинамічної рівноваги з використанням як H₂O, так і D₂O. Для отримання ІЧ-спектрів в інтервалі 900 ч 3700 см^-1 використовували двопроменевий прилад (“Karl Zeiss”, Jena, Німеччина) з використанням призми із натрій хлориду при кімнатній температурі.

Спектри ЯМР ³¹Р подрібнених зразків гідрогелів були отримані методом високої роздільної здатності у твердому тілі при обертанні під магічним кутом (MAS) і реєструвались з Фур'є-перетворенням на спектрометрі Avance 4000 (фірма “Bruker”, Німеччина).

Третій розділ присвячено дослідженню структури ГА та його катіон-заміщених аналогів. Дифрактограми ГА, синтезованого за відсутності іонів металів, відповідали стехіометричному ГА (ASTM 9-0432) згідно бази даних JCPDS. В термічно оброблених (600 ^оС) та термічно не оброблених зразках мало місце перекриття основних піків спектру, завдяки малим розмірам кристалітів. Розділення піків спостерігалося після термообробки зразка при 900 ^оС, а термообробка при 1000 ^оС не лише збільшувала розмір кристалітів, а й призводила до появи у спектрі ще одного піку, який відповідав б-трикальційфосфату (б-ТКФ). Поява цієї фази обумовлена термічною декомпозицією залишкової кількості аморфної фази (АКФ), присутньої в порошку ГА. Додавання іонів металів призводило до структурних змін в зразках в процесі термічної обробки, що відображалося в дифрактограмах. В термічно не оброблених зразках мало місце зменшення кристалічності (що призводило до зниження інтегральної інтенсивності піків) та розміру кристалітів (що призводило до збільшення ширини піків). Прогрів зразків до 600 ^оС не показав утворення нових фаз. Подальше підвищення температури до 900 ^оС і 1000 ^оС викликало появу нових фаз, які включали ортофосфати кальцію зі співвідношенням Са/Р=1,5, головним чином б-ТКФ (ASTM-9-0348) і в-ТКФ (ASTM-9-0169). Останній кальцій-фосфат є кристалографічною модифікацією б-ТКФ та характеризується меншою стабільністю при високих температурах. Появу цієї фази можна пояснити термічною декомпозицією нестехіометричного ГА (Са/Р<1,67), який містить незначну кількість карбонат-іонів. Рис. 1 демонструє дифрактограму порошкового зразку ГА , отриманого з додаванням 4 % іонів титану (ІІІ), прогрітого при 1000 ^оС протягом 1 години.

З рис. 1 видно, що цей зразок характеризується значним вмістом б-ТКФ та в-TКФ. Ці дві модифікації TКФ спостерігалися в усіх прогрітих зразках, синтезованих у присутності іонів металів, за виключенням кобальту, для якого чиста фаза в-TКФ була заміщена на іншу з такою ж дифрактограмою як і в-TКФ, але з помітним зсувом позицій дифракційних піків. Цей результат свідчить про формування додаткової фази та фази в-TКФ з можливим частковим заміщенням іонів кальцію іонами кобальту. Таким чином, поява цих двох трикальційфосфатних фаз відображає порушення процесів кристалізації стехіометричного ГА через додавання іонів металів. Поява додаткових фаз (оксиду титану (IV), кальцій ванадату та інш.) при високих температурах свідчить про те, що іони металів не лише порушують процеси кристалізації стехіометричного ГА, але й мають властивість до включення у кристалічну гратку основної фази ГА, що призводить до утворення нестехіометричного ГА.

В результаті проведених досліджень можна зазначити, що всі досліджені нами іони металів (Ті⁴⁺, V³⁺, Co²⁺, Cr³⁺, Al³⁺) викликали:

1) зменшення кристалічності та розміру кристалів;

2) порушення стехіометричності апатитної фази (Са/Р < 1,67);

3) інкорпорацію іонів металів у різні кальційфосфатні фази.

Четвертий розділ містить результати вивчення колоїдно-хімічних механізмів впливу мінералізації гідроксилапатитом колагенових фібрил на їх гідратацію з використанням даних п'єзогравіметрії, інфрачервоної спектроскопії і рентгенівської дифракції. Був проведений детальний аналіз ізотерм гідратації та інфрачервоних спектрів як для чистих, так і мінералізованих колагенових фібрил.

Після мінералізації рівень гідратації колагенових фібрил суттєво зменшується (при ВВ 86 % приблизно в 4 рази) і цей феномен відображає критичний вплив утворення гідроксилапатитних нанокристалів всередині колагенової матриці при ранній мінералізації на гідратний стан фібрілярної структури. Із п'єзогравіметричних даних також випливає, що сорбційна здатність колагену з ГА набагато менша порівняно з чистим колагеном. Використовуючи підхід за моделлю Д'Aрсі і Ватта, в якій враховується гетерогенність адсорбента, було показано, що кількість адсорбованих молекул води при ВВ 86 % для чистого колагену складала 8,6 на фрагмент Gly-X-Y, а для мінералізованого - 2,3 молекули води. Більш того, детальний аналіз показав, що зменшення адсорбційної здатності системи колаген-ГА обумовлено як мультишаровою (ML) адсорбцією, так і адсорбцією, що описується законом Генрі (Н-адсорбція). При цьому кількість молекул води в ленгмюрівському моношарі (L) практично була незмінною.

При певних умовах проведення реакції мінералізації (рН, іонний склад) in vitro, місцем ранньої мінералізації якраз і є колагенові фібрили, які знаходяться у відповідній конформації. З цього випливає, що зразки, які досліджувалися в даній роботі, дозволяють вивчати вплив ГА на гідратацію та конформаційні зміни колагенової матриці. Типовий ІЧ-спектр даної мінералізованої системи є суперпозицією двох спектрів, в якому положення та інтенсивності головних смуг ГА та колагену в більшості випадків є незмінними. В той же час, були виявлені незначні, але важливі особливості отриманого спектру, які відображають взаємний вплив обох компонентів. Так, наприклад, має місце незначний високочастотний зсув (1039>1043 см^-1) і зменшення інтенсивності “плеча” (1097 см^-1) в спектрі ГА у випадку його входження в колагенову фібрилу. Амідні смуги відповідають СО- та NH-групам колагенової системи, які беруть участь у формуванні водневих зв'язків з молекулами води. Головною особливістю для обох груп є наявність низькочастотного зсуву коливань Амід І та високочастотного зсуву коливань Амід ІІ. Подібні зміни пов'язані з формуванням Н-зв'язків між молекулами води та карбонільними групами гліцину (Gly) і NH-групами проліну (X) та гідроксипроліну (Y).

П'єзогравіметричні дані показують, що при величині ВВ 80 % формування внутрішніх гідратних шарів всередині колагенових фібрил повністю завершується. Отримані результати досліджень були використані як базові дані при побудові моделі для пояснення феномену впливу мінералізації на гідратний стан колагенових фібрил. Загально відомо, що гідратація колагену є критичним фактором для утворення трьохспіральної конформації. В той же час, специфічна функція молекул води в кластеризації (утворення фібрил) окремих колагенових молекул не зовсім відома. Колагенові (тип І) фібрили мають періодичність вздовж довгої осі в 67 нм.

Початкова адсорбція мінеральних частинок починається в так званих геп-зонах і продовжується в зонах перекривання. Було показано, що гідратований стан колагенових фібрил з 8-9 молекулам води на структурний фрагмент є важливим фактором для біомінералізації (рис. 3б). Дві гідратні підсистеми, вірогідно, є задіяними в отриманих ізотермах для чистого колагену. Перша з них (W_L+W_H,ML всередині фібрил), найбільш вірогідно, локалізована в зонах з відносно високою гідрофобністю та доступним простором [A.J. Hodge, J.A. Petruska, 1963; М.J. Glimcher, 2006], де специфічні водневі кластери оточують N-, C-термінальні інтерфейсні зони (telopeptides) з властивостями, близькими до об'ємної води. Друга гідратна підсистема (W_L+W_H,ML на поверхні фібрил), так звана “cylinder water shell” [J. Bella et al., 1995], характеризується більш сильною взаємодією у порівнянні з молекулами води всередині фібрил, завдяки водневим місткам за участю ОН-груп гідрокси-L-проліну (Hyp) і СО-груп молекули колагену. Ймовірно, гідратні сили певною мірою ініціюють адсорбцію і подальше зростання кристалів апатиту. Тобто, W_L+W_H,ML всередині фібрил є більш придатною для ранньої стадії мінералізації, завдяки меншій стабільності водних кластерів у зонах розривів та перекриття колагенових молекул. Підтвердженням цьому є Рамановські ОН-спектри з характерними піками 3250 та 3450 см^-1 гідратованого колагену, які близькі до об'ємної води [S. Leikin et al., 1997]. В рамках запропонованої моделі число молекул води (W_L+W_H,ML) на поверхні фібрил залишається практично незмінним. Частина молекул W_L всередині фібрил також зберігається, вірогідно з іншою структурою (рис. 3в). Але ж більшість молекул води із цих зон витісняються нанокристалітами апатиту, що й відображається на відповідних ізотермах гідратації.

П'ятий розділ присвячено дослідженням колоїдно-хімічних та структурних властивостей гідрогелевих кальцій-фосфатних нанокомпозитів, а також порівнянню гідрофільних характеристик отриманих матеріалів з колагеновими фібрилами та синтетичним ГА з метою з'ясування закономірностей іммобілізації та утворення ГА в гідрогелях та очікуваної поведінки отриманих матеріалів in vivo. Характерною ознакою гідрогелевих матриць є наявність локальних об'ємів, спроможних виконувати функцію своєрідних мікро- та нанорозмірних реакторів по відношенню до інкорпорованих прекурсорів з наступним утворенням композитів з різним ступенем кристалічності та аморфності. Гідрогелеві нанореакторні матриці на основі акрилових мономерів були використані для отримання композитного матеріалу з інкорпорованим гідроксилапатитом. Сумарний склад зшитого полімеру в гідрогелях варіювався в діапазоні від 5 до 50 %, а концентрація зшиваючого агента (N,N'-метилен-біс-акриламід) - від 0,01 до 1 %. Гелеутворення відбувалося при кімнатній температурі, ініціювання полімеризації здійснювалося з використанням окиснювально-відновної системи. Зустрічна дифузія кальцієвих і фосфатних іонів у пористу гідрогелеву матрицю є багатофакторним процесом, який приводить до утворення різних ортофосфатів кальцію, а саме: трикальційфосфату Са₃(РО₄)₂, брушиту СаНРО₄ 2Н₂О, монетиту СаНРО₄, ГА та інш.. В результаті дослідження були знайдені умови отримання стехіометричного ГА (Са/P = 1,67) в гідрогелевій матриці. Враховуючи той факт, що співвідношення концентрацій реагентів у момент реакції при просочуванні гідрогелю не постійне, а варіюється в залежності від ступеню проникнення реагентів, добитися зсуву рівноваги саме у бік утворення стехіометричного гідроксилапатиту (Са/Р=1,67) в рамках даного процесу складно. За результатами рентгенівської дифракції було вироблено рекомендації, які дозволяють забезпечити переважне утворення гідроксилапатиту у гідрогелевих матрицях. Так, було продемонстровано, що зниження вмісту зшитого полімеру в гідрогелі (зменшення співвідношення дисперсної фази до дисперсійного середовища) призводить до переважного утворення гідроксилапатиту.

Це можна пояснити збільшенням проникності реагентів через рідкозшиту і низькоконцентровану полімерну сітку, притаманну, наприклад, мазеподібним пластичним гідрогелям зі співвідношенням дисперсної фази до дисперсійного середовища 5:9,5. Зсуву рівноваги процесу у бік утворення нанокристалічного гідроксилапатиту сприяє також збільшення об'єму міжланцюгового простору в гідрогелях, спричинене їх набуханням, що призводить до збільшення дифузійної проникності реагентів (кальцієвих та фосфорних прекурсорів). Так, у гідратованому високодисперсному поліакриламідному гелі при насиченні його сумішшю 3 частин 3М розчину Ca(NO₃)₂ + 5 частин 1М розчину НСI + 3 частин 1,8М розчину (NН₄)₂НРО₄ утворюється нанокристалічний ГА, чого не спостерігається у разі обробки тіє ж самої гідрогелевої матриці з її попередньою дегідратацією. Привертає до себе увагу той факт, що коли обробку амоніаком на заключній стадії формування фосфатів кальцію виконують з попередньою сушкою гідрогелевої матриці, яка призводить до її колапсу та зниження проникності реагентів, рівновага зсувається в сторону утворення монетиту.

Формування в зазначених матрицях нанокристалічного ГА підтверджується різними інструментальними методами і, перш за все, рентгенофазовим аналізом за даними JCPDS (PDF-number 9-0432).

Оцінка розмірів кристалітів (L) ГА проводилась за формулою Селякова-Шерера ( 1 ). Розмір кристалітів складає 10-15 нм уздовж осі с і 3-5 нм у перпендикулярному напрямку.

(1)

де л - довжина хвилі, ж - кут дифракції, в_m - фізичне уширення лінії, К - константа ~ 1

Переважне формування нанокристалічного ГА виявлено у випадку високодисперсних гідрогелевих матриць, синтезованих у вигляді частинок з діаметром біля 0,05 мкм, які характеризуються підвищеним ступенем набухання та швидкістю поглинання рідини. Встановлено, що структура фосфатів кальцію, сформованих у гідрогелевій матриці, визначається концентрацією кальцій-фосфатних прекурсорів, використаних під час реакції. Ідентифікація відповідних продуктів була проведена співвіднесенням спектрів ЯМР ³¹Р з відповідними дифрактограмами. У разі насичення гідрогелевої матриці 12 %-им розчином Ca(NO₃)₂ і 5,8 %-им розчином (NН₄)₂НРО₄ у ЯМР-спектрі спостерігалося чотири сигнали з хімічними зсувами 0,4 (з найбільшою інтенсивністю); 2,0; -1,2 та -2,5 м.ч., які належать брушиту, гідроксилапатиту, монетиту та ортофосфату кальцію відповідно. По мірі розбавлення розчинів для насичення матриці інтенсивність сигналів, що відповідають монетиту та ортофосфату кальцію зменшувалась, а інтенсивність сигналу гідроксилапатиту (х.з.=2,2-2,4 м.ч.) зростала. У випадку використання розчинів Ca(NO₃)₂ та (NН₄)₂НРО₄ з концентрацією 5,1% та 2,5 % відповідно, у спектрі присутній лише один сигнал з хімічним зсувом близько 2,0 м.ч., що відповідає чистому ГА.

Інкорпорацію в гідрогелеву матрицю ГА підтверджено також даними коливальної спектроскопії. Перш за все відмітимо, що до основної спектральної особливості немінералізованих гомополіакриламідних гідрогелевих матриць можна віднести три максимуми: найбільш інтенсивний н_as(CH)=2930 см^-1 і менший - в області 2850 см^-1, та 2770 см^-1. Останній з них відповідає симетричному коливанню н_s(CH₂)_, у той час, як коливання з частотою н=2850 см^-1 можна віднести до непрореагованого акриламіду, у спектрі якого аналогічний максимум переважає на вказаній ділянці спектру.

У спектрах поліакриламідного гелю максимуми в області н (NH) =3407 см^-1 і 3189 cм^-1 відносяться до антисиметричних валентних коливань вільної та зв`язаної (включеної у систему водневих зв'язків) амідної групи. Для співполімерних зразків, що мають акрилонітрильні ланцюжки, спостерігаються малоінтенсивні максимуми в області поглинання нітрильної групи 2200-2340 см^-1.

В ІЧ-спектрах зразків ГА (рис. 7), синтезованих у гідрогелях, наявність фосфатних аніонів підтверджується появою нової широкої інтенсивної смуги поглинання з максимумами 1060 та 990 см^-1.

(дублет с перевагою за інтенсивністю низкочастотної компоненти і наявністю плеча 1123 см^-1), що належать тричі виродженому антисиметричному коливанню фосфат-аніона, а також дублет деформаційної моди д (ОРО)= 550-630 см^-1, уширений за рахунок накладення смуги лібраційних коливань ОН-груп. Як видно з співставлення ІЧ-спектрів мінералізованої і немінералізованої гідрогелевої матриці, у вихідному немінералізованому гідрогелі вказані смуги відсутні.

Таким чином, проведені дослідження дозволяють сформулювати критерії оптимізації процесу інкорпорування нанокристалічного гидроксилапатиту в гідрогелеві матриці на основі акрилових співполімерів та отримати біосумісні композитні матеріали для протезування кісткової тканини.

Висновки

1. У дисертації викладено вирішення наукової задачі щодо створення гідрогелевих нанокомпозитних систем на основі акрилових мономерів з інкорпорованими частинками гідроксилапатиту, як нових біоматеріалів для лікування та протезування кісткових тканин.

2. Вперше отримано гідрогелеві нанореактори на основі акрилових мономерів для утворення та іммобілізації в їх поровому просторі нанорозмірних (10-15 нм) кальцій-фосфатних частинок; досліджено їх колоїдно-хімічні властивості та фазовий склад у порівнянні з мінералізованими колагеновими фібрилами.

3. За результатами дослідження структурно-фізичних характеристик і фазового складу синтезованого ГА та його катіон-заміщених аналогів встановлено, що включення в кристалічну гратку ГА іонів Ті⁴⁺, V³⁺, Co²⁺, Al³⁺ сприяє зниженню кристалічності та розміру кристалітів, зменшенню стехіометричного відношення (Са/Р) апатитної фази.

4. Встановлено вплив мінералізації на гідратацію колагенових фібрил in vitro методами п'єзогравіметрії та інфрачервоної спектроскопії. Запропоновано модель мінералізації колагенових фібрил з введенням двох специфічних структур гідратного оточення колагену. Показано, що характер гідратації природних мінералізованих колагенових фібрил відповідає кривим набухання синтетичних акрилових гідрогелевих композитів.

5. Спорідненість інкорпорованого ГА в отриманих гідрогелевих нанокомпозитах та біологічного (кісткового) апатиту доведено методом рентгенівської дифракції.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Sukhodub L.F. Characterization and identification of hydroxyapatites obtained from aqueous solutions in presence of titanium ions by TOF PDMS / L.F. Sukhodub, V.V. Pilipenko, C. Moseke, A.N. Kalinkevich, L.B. Sukhodub, O. Boelling, B. Sulkio-Cleff // Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine. - 2002. - Т. 4. - С. 126-128. (Планування та проведення експерименту з синтезу титан-заміщених гідроксилапатитів та дослідження їх структурних особливостей, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні статті).

2. Pilipenko V.V. Hydroxyapatites Precipitated in the Presence of Titanium and Cobalt: XRD Iinvestigations / V.V. Pilipenko, L.B. Sukhodub, C. Moseke, О. Boelling, L.F. Sukhodub, B. Sulkio-Cleff // Mineralogical J. - 2003. - Т. 25, № 1. - С. 85-90. (Постановка та проведення експериментів з синтезу катіон-заміщених гідроксилапатитів та дослідження їх структурних особливостей, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні статті).

3. Sukhodub L.F. Collagen-hydroxyapatite-water interactions investigated by XRD, piezogravimetry, infrared and Raman spectroscopy / L.F. Sukhodub, C. Moseke, L.B. Sukhodub, B. Sulkio-Cleff, V.Ya. Maleev, M.A. Semenov, E.G. Bereznyak, T.V. Bolbukh // Mol. Structure. - 2004. - V. 704. - P. 53-58. (Планування та проведення експериментів з синтезу мінералізованих колагенових фібрил та дослідження їх ізотерм гідратації, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні статті).

4. Суходуб Л.Б. Ізотерми гідратації чистих та мінералізованих колагенових фібрил: дослідження з використанням п'єзогравіометрії та інфрачервоної спектроскопії / Л.Б. Суходуб, Ю.М. Самченко, Л.Ф. Суходуб // Доп. НАН України. - 2008. - № 5. - С. 155 - 160. (Планування та проведення експериментів з мінералізації колагенових фібрил та дослідження їх властивостей методами інфрачервоної спектроскопії та п'єзогравіметрії. Запропонована модель ранньої мінералізації колагенової матриці).

5. Самченко Ю.М. Гидрогелевые нанореакторы для формирования гидроксиапатита / Ю.М. Самченко, Л.Ф. Суходуб, С.М. Данильченко, Л.И. Береза, З.Р. Ульберг, Л.Б. Суходуб, А.Г. Шостенко // Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології. - 2008. - Т. 6, № 2. - С. 479 - 485. (Планування та проведення експериментів з синтезу гідрогелевих нанореакторів з інкорпорованим гідроксилапатитом та дослідження їх колоїдно-хімічних властивостей, участь у трактуванні результатів досліджень та написанні статті).

6. Болдескул И.Е. Применение колебательной спектроскопии для экспресс-анализа композитних материалов на основе акрилових гидрогелей и гидроксиапатита / И.Е. Болдескул, Ю.М. Самченко, Л.Б. Суходуб, З.Р. Ульберг, Л.Ф. Суходуб, Л.И. Береза // Методы и обьекты химического анализа. -2008.-Т. 3, № 2. - С. 147-156. (Планування експерименту, підготовка зразків для дослідження з використанням ІЧ спектроскопії, участь у трактуванні результатів та написанні статті).

7. Самченко Ю.М. Синтез и спектральная идентификация гидроксилапатит-содержащих гидрогелевых нанокомпозитов для протезирования костной ткани / Ю.М. Самченко, И.Е. Болдескул, Л.Б. Суходуб, С.Н. Данильченко, Л.И. Береза, З.Р. Ульберг // Наноструктурное материаловедение. - 2009. - Т. 1. - С. 81-88. (Планування та проведення експериментів з синтезу гідрогелевих кальцій-фосфатних нанокомпозитів та дослідження їх колоїдно-хімічних властивостей, участь у трактуванні результатів досліджень, та написанні статті).

8. Pilipenko V.V, Moseke C., Danilchenko S.N., Kalinkevich A.N., Sukhodub L.B., Boeling O., Sukhodub L.F., and Sulkio-Cleff B. Precipitation of Hydroxyapatite in Presence of Titanium Ions // The Second Sumy-Cracow-Muenster Simposium on Nuclear Analytical Methods. - Cracow (Poland). - 2001.-P.- 72.

9. Pilipenko V.V., Sukhodub L.B. TOF-PDMS and XRD Investigations of Ti-containing Hydroxyapatites // Материалы школы-семинара «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии. - Звенигород (Роcсия). - 2002.- С. 138.

10. Sukhodub L.F., Moseke C., SukhodubL.B., Sulkio-Cleff B. Collagen-hydroxyapatite-water interactions from the data of piezogravimetry, infrared and Raman spectroscopy // V11 International Conference on Molecular spectroscopy. - Вроцлав (Польща). - 2003.- С. 10-17.

11. Sukhodub L.B., Moseke C., Sukhodub L.F., Sulkio-Cleff B. Improved Thermal Substrate Method With Cooling System for Calcium Phosphate Thin Coatings on Titanium Substrates // Тези доповідей 1 Української наукової конференції «Проблеми біологічної і медичної фізики». - Харків (Україна).-2004. - С. 93.

12. Болдескул И.Е., Самченко Ю.М., Суходуб Л.Б., Суходуб Л.Ф., Береза Л.И., Полторацкая Т.П., Ульберг З.Р. Применение колебательной спектроскопи для экспресс-анализа композитних медико-биологических материалов на основе гидрогелевых нанореакторов с инкорпорированным гидроксилапатитом // Матеріали 111 міжнародного симпозіуму «Методи хімічного аналізу».- Севастополь (Україна).-2008.- С. 7-8.

13. Самченко Ю.М., Суходуб Л.Б., Суходуб Л.Ф., Данильченко С.Н., Ковзун И.Г., Ульберг З.Р. Гидрогелевые матрицы с иммобилизованными наночастицами биоматериалов // Материалы 111 международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике. - Москва (Роcсия). - 2008. - С. 59.

14. Болдескул И.Е., Самченко Ю.М., Суходуб Л.Б. Спектральная идентификация биологически активных аддуктов в процессе синтеза гидрогелевых матриц на основе полиакриламида с инкорпорированным гидроксилапатитом // Материалы научно-практической конференции «Биологически-активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения». - Новый свет, Крым (Украина).-2009.- С. 21.

Размещено на Allbest.ru