Тритерпенові глікозиди кусонії волотистої Сussonia paniculata Eckl. et Zeih

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ФІЗИКО-ХІМІЧНИЙ ІНСТИТУТ ім. О.В. БОГАТСЬКОГО

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

02.00.10 - біоорганічна хімія

Тритерпенові глікозиди Кусоніп волотистоп Cussonia paniculata Eckl. et Zeih

ДОВГИЙ Ілларіон Ігорович

Одеса - 2008

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

В наш час в медицині зростає зацікавленість до препаратів, які виготовляються на основі лікарських рослин. Основою цих препаратів в більшості випадків є речовини, які відносяться до різних багато чисельних класів вторинних метаболітів. Тритерпенові глікозиди, або сапоніни, один із класів вторинних метаболітів, до яких здавна прикована увага вчених. Зацікавленість до тритерпенових глікозидів обумовлена широким використанням в медицині препаратів на основі рослин, що їх вміщують. В медицині застосовуються препарати кінського каштану (Aesculus hippocastanum), солодки голої (Glycyrrhiza glabra), примули медичної (Primula officinalis) та ін. При цьому багато рослин вже століття використовуються в традиційній східній медицині і поступово починають використовуватися в традиційній західній медицині. Рослини родини аралієвих знаходять широке застосування в сучасній медицині. Препарати на основі аралії (Aralia elata і Aralia mandshurica), женьшеню (Panax ginseng), заманіхи (Oplopanax elatus), плюща (Hedera helix), елеутерококу (Eleutherococcus senticosus) входять до державної фармакопеї багатьох країн, встановленню будови тритерпенових глікозидів, відповідних за лікарські властивості цих рослин, а також встановленню залежності будова-активність цих речовин присвячені десятки публікацій. Але багато видів рослин родини аралієвих дотепер або вивчені слабо, або не вивчені взагалі, тому дослідження складу невивчених видів є актуальним завданням.

Актуальність теми. Рід Cussonia є відносно великим в родині аралієвих і включає біля 40 видів і цілу низку підвидів. Рослини цього роду використовуються в офіціальній і народній Африканській медицині для лікування широкого спектра захворювань. Не дивлячись на це до сьогоднішнього дня існує зовсім невелика кількість публікацій, що присвячені встановленню будови сполук, котрі відповідають за біологічну активність рослин цього роду. Фрагментарно вивчалось лише декілька рослин, немає даних про біологічну активність багатьох сполук, виділених із вивчених видів. У наукової літературі немає даних про вивчення складу вторинних метаболітів, зокрема тритерпенових глікозидів Cussonia paniculata. Крім того, попередні експерименті виявили значній вміст тритерпенових глікозидів, а також то, що при первинному ТШХ аналізі екстрактів різних органів багато глікозидів не було ідентифіковано порівняно з відомими зразками глікозидів з рослин інших родів родини аралієвих.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Вивчення тритерпенових глікозидів кусонії волотистої проводилось в рамках науково-дослідної роботи кафедри органічної та біологічної хімії Таврійського національного університету ім. В. І. Вернадського у відповідності до держбюджетної теми «Вивчення будови і біологічних властивостей вуглеводів і вуглеводовмісніх сполук та біополімерів» (№ держ. реєстрації 0101U005083 - 2001-2005 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи є встановлення повної будови і вивчення біологічної активності тритерпенових глікозидів із листя, квіткових бутонів та стебел Cussonia paniculata.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Виділення і очищення суми тритерпенових глікозидів із рослинної сировини.

2. Розподіл сум тритерпенових глікозидів з різних органів.

3. Встановлення будови індивідуальних тритерпенових глікозидів.

4. Вивчення біологічної активності тритерпенових глікозидів.

Об'єкт дослідження: листя, квіткові бутони та стебла Сussonia paniculata Eckl. et Zeih. (Araliaceae).

Предмет дослідження: тритерпенові глікозиди.

Методи дослідження: хроматографічні методи (розподіл тритерпенових глікозидів, ідентифікація продуктів хімічних перетворень), хімічні методи (визначення структурних фрагментів, що входять до складу тритерпенових глікозидів), біохімічні методи (модифікація глікозидів з використанням ферментів), одновимірні і двовимірні методики ЯМР спектроскопії (встановлення повної будови глікозидів).

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Вперше вивчено глікозидний склад різних органів Cussonia paniculata.

2. Встановлено повні структури 33 тритерпенових глікозидів, 18 із яких є новими.

3. Вперше у роді Cussonia знайдені гликозиди 23-гідроксибетулінової кислоти.

4. Вперше в складі тритерпенових глікозидів рослин родини аралієвих знайдено глікозиди з 2-O-ацетил-, 3-O-ацетил- та 4-О-ацетил--L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозильними вуглеводними фрагментами.

5. На основі даних літератури і одержаних результатів показана близькість Cussonia paniculata і Fatsia japonica (родина аралієвих) за хемотаксономічним ознакам.

6. У низці монодесмозидних глікозидів з Cussonia paniculata знайдена та вивчена молюскоцидна активність.

7. При вивченні молюскоцидної активності глікозидів виявлено, що прояв цього виду активності обумовлюється як природою аглікону (наявність активності у глікозидів в-аміринового ряду та відсутність у глікозидів б-аміринового та лупанового рядів), так і вуглеводного фрагменту глікозида (зменшення активності зі збільшенням полярності вуглеводного фрагменту).

Практичне значення одержаних результатів.

1. Показано, що листя, квіткові бутоні та стебла Cussonia paniculata багаті на тритерпенові глікозиди що может бути використано для фармацевтичної та іншої мети.

2. Показано, що Cussonia paniculata може бути практично використана як джерело відомих та нових глікозидів та тритерпеноїдів б-, в-аміринового і лупанового рядів.

3. Розроблені схеми виділення, очищення і розподілу тритерпенових глікозидів із Cussonia paniculata на індивідуальні сполуки та хроматографічно нерозподілені суміші можуть бути використані для виділення глікозидів як з цього виду, так із інших видів цього роду у прикладних цілях.

4. Глікозиди з молюскоцидною активністю можуть бути використані у подальшому для розробки молюскоцидних препаратів.

5. Отримані дані по глікозидному составу, що допоможуть вирішувати спірні питання систематики в родині Araliaceae.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача полягає в проведені аналізу наукової літератури, обрані загальної методики і основних методів дослідження, розподілу та очистки тритерпенових глікозидів та попередньому визначенню будови на основі хімічних і біохімічних методів аналізу, зроблена підготовка зразків тритерпенових глікозидів для біологічних випробувань. Постановка завдання дослідження та інтерпретація ЯМР спектрів глікозидів здійснювалась разом з науковим керівником.

Спектри ЯМР глікозидів були одержані д.х.н. проф. Шашковим О.С. і к.х.н. Качалою В.В. (Інститут органічної хімії ім. М.Д. Зелінського РАН, м. Москва).

Вивчення молюскоцидної активності глікозидів виконано спільно з к.х.н., доц. Яковішиним Л.О. (Севастопольський національний технічний університет, лабораторія біоорганічної хімії, м. Севастополь).

Апробація результатів дисертації.

Матеріали дисертаційної роботи були представлені на: IV, V Міжнародних симпозіумах з хімії природних сполук (Іспарта, Туреччина, 2001; Ташкент, Узбекистан, 2003); 11-тому Європейському симпозіумі з вуглеводів (Лісабон, Португалія, 2001); ХVI Міжнародному симпозіумі з глікокон'югатів (Гаага, Нідерланди, 2001); I Міжнародній конференції Молдавського хімічного товариства «Досягнення і перспективи сучасної хімії» (Кишинів, Молдова, 2003), в матеріалах Всеукраїнської науково-технічної конференції студентів, аспірантів і молодих вчених «Актуальні питання теоретичної і прикладної фізики і біофізики» (Севастополь, Україна, 2005), а також IV Всеукраїнської науково-технічної конференції «Актуальні питання теоретичної і прикладної біофізики, фізики та хімії» (Севастополь, Україна, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 7 статей і 9 тез доповідей на симпозіумах і конференціях.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, трьох розділів, висновків, двох додатків і списку використаних джерел, який нараховує 108 найменувань. Дисертація викладена на 153 сторінках, містить 37 таблиць, 15 рисунків та 2 додатки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми, визначено завдання дослідження, розкрито наукову і практичну новизну отриманих результатів, особистий внесок здобувача, наведено інформацію про апробацію та публікації результатів дослідження.

У першому розділі проведено аналіз використаних джерел з тритерпенових глікозидів б-аміринового і лупанового рядів, що входять до складу рослин родини аралієвих, а також тритерпенових глікозидів, що виділені з рослин роду Cussonia, та їх біологічна активність.

У другому розділі описані експериментальні методи, які були використані при виконанні роботи.

У третьому розділі обговорюється встановлення будови глікозидів, їх розподіл у вивчених органах та результати дослідження біологічної активності.

У додатку А приведені данні ¹³С ЯМР спектрів глікозидів, а у додатку В данні ¹Н ЯМР спектрів.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

1. Матеріали і методи дослідження

Виділення тритерпенових глікозидів проводили знежирюванням ретельно подрібленої рослинної сировини бензолом і екстракцією глікозидів 80% ізопропиловим спиртом з наступним упарюванням спиртового екстракту, розчиненням в бутанолі та промиванням водою для вилучення фенольних сполук, вільних цукрів і солей.

Хроматографічний розподіл очищеної суми глікозидів з листя проводили на силікагелі при градієнтному елююванні системою розчинників хлороформ-ізопропиловий спирт, насичених водою. При розподілі суми глікозидів з листя було отримано 12 фракцій тритерпенових глікозидів, позначених від L-А до L-L в порядку елюювання (перша літера L позначає листя). За ТШХ фракції L-A, L-B, L-C, L-D, L-F, L-H, і L-K представлялись хроматографічно індивідуальними глікозидами, тоді як фракції L-E, L-G, L-I, L-J і L-L були групами близьких за полярністю глікозидів. Фракції L-E, L-G, L-I рехроматографували на мікросферичному силікагелі «Silpearl», в результаті чого отримали глікозиди L-E₁, L-E₂, L-G₁, L-G₂, L-G₃, L-I₁, L-I₂ і L-I₃. Фракції L-J і L-L за даними ТШХ в різних системах розчинників представляли собою суміші кислих та нейтральних тритерпенових глікозидів. Їх рехроматографували на основному карбонаті магнію, при цьому одержали глікозиди L-J₁, L-J₂, L-L₁ і L-L₂. Розподіл кислих і нейтральних глікозидів в цих умовах досягається завдяки тому, що нейтральні глікозиди практично не сорбуються на цьому сорбенті і завжди елююються першими.

Хроматографічний розподіл очищеної суми глікозидів з квіткових бутонів проводили на силікагелі при градієнтному елююванні системою розчинників хлороформ-ізопропиловий спирт, насичених водою. В результаті було отримано 10 фракцій тритерпенових глікозидів, позначених від Fl-А до Fl-J в порядку елюювання (Fl позначає бутони). Фракції Fl-А, Fl-В, Fl-С, Fl-Е, Fl-G, Fl-H, Fl-I і Fl-J представлялись індивідуальними сполуками за ТШХ-аналізом в різних системах розчинників. Фракції близьких за полярністю глікозидів Fl-D і Fl-F були розділені на мікросферичном силікагелі «Silpearl» при елююванні системами розчинників хлороформ-ізопропиловий спирт, насичених водою, в результаті були отримані глікозиди Fl-D₁, Fl-D₂, Fl-F₁ і Fl-F₂.

При розподілі суми глікозидів із стебел було отримано 9 фракцій тритерпенових глікозидів: St-А, St-В, St-С, St-D, St-Е, St-F, St-G, St-H, St-I (St позначає стебла). Фракція St-I була розділена на нейтральний глікозид St-I₁ і кислий глікозид St-I₂ на основному карбонаті магнію при елююванні системою розчинників хлороформ-ізопропиловий спирт, насичених водою. Усі отримані глікозиди представлялись індивідуальними сполуками за ТШХ-аналізом в різних системах розчинників.

За ТСХ-аналізом глікозидів, отриманих із різних органів, було знайдено, що наступні глікозиди мают однакову хроматографичну рухливість та колір хроматографічної зони при детектуванні фосфорновольфрамовою кислотою: L-B та Fl-А (2); L-C, Fl-В та St-А (3); L-D та Fl-С (15); L-E₁ та Fl-D₁ (13); L-E₂ та Fl-D₂ (14); L-Н та Fl-G (4); L-G₃ та Fl-F₂ (8); L-F та Fl-E (9); L-I₁ та St-F(20); L-I₂, Fl-Н та St-H (6); L-I₃ та Fl-I (18); L-K та Fl-J (16); L-L₁ та St-I₁ (17); L-L₂ та St-I₂ (23), а також глікозиди L-G₂, Fl-F₁ (10) і St-Е (хоча при детектуванні глікозид St-Е відрізнявся більш темним кольором хроматографічної зони від глікозидів L-G₂ і Fl-F₁).

Будову глікозидів встановлювали хімічними методами і ЯМР спектроскопією. ЯМР спектри одержані на приладі Bruker DRX-500 (500 МГц для ¹Н і 125 МГц для ¹³С) в дейтеропіридині. Для двовимірних експериментів HSQC, HMBC, COSY, TOCSY і ROESY використані пакети стандартних програм фірми «Bruker».

Молюскоцидну активність вивчали на Planorbis corneus, Planorbis corneus var. rubra (родина Planorbidaе) і Melanoides tuberculata (родина Melaniidае). Використовували розчини натрієвих солей глікозидів, які отримували їх розчиненням у 100%-вому надлишку 2% розчину Na₂CO₃ при нагріванні з наступним розбавленням дистильованою водою до потрібної концентрації. Для вивчення дії кожного глікозиду було взято по 10 равликів. Равликів поміщали в розчини глікозидів і визначали тривалість - , на протязі якої проходив 100% летальний кінець. Кінцеві концентрації LD₁₀₀ і наведені в таблиці 5.

2. Встановлення будови глікозидів кусонії волотистої

Ідентифікація відомих глікозидів кусонії волотистої

Глікозид L-А (1) був ідентифікований як 3-О-в-D-глюкопіранозид в-ситостерину. Будова відомих глікозидів L-B₁ і Fl-А₁ (2а); L-B₂ і Fl-А₂ (2b); L-C, Fl-В і St-А (3); L-H₁ і Fl-G₁ (4а); L-H₂ і Fl-G₂ (4b); St-D (5); L-I₂, Fl-Н і St-Н (6); St-Е₂ (10а); L-D і Fl-С (15); L-K і Fl-J (16); L-L₁ і St-I₁ (17); L-I₁, St-F (20); St-G (21); L-J₂ (22); L-L₂ і St-I₂ (23) (див. табл. 1) встановлена на основі результатів кислотного, лужного та м'якого лужного гідролізів. Крім того, глікозиди та їх прогеніни ідентифіковані за ТШХ у порівнянні з відомими зразками.

При аналізі ¹³С ЯМР спектрів деяких глікозидів було встановлено, що вони представляють собою суміші глікозидів з ізомерними агліконами (позначені літерами а і b). Будова вилучених сполук була підтверджена порівнянням величин хімічних зсувів сигналів їх ¹³С-атомів з наведеними в літературі даними.

Встановлення будови нових глікозидів

Як показало встановлення будови багатьох невідомих глікозидів, вони представляли собою суміші хроматографічно нероздільних ацильованних глікозидів, в яких ацетильна група локалізована у С-2 або С-3 атома залишку рамнози трисахаридного фрагмента Rha>⁴Glc>⁶Glc>²⁸. Встановлення будови цих глікозидів продемонструємо на прикладі глікозидів L-G₃ та Fl-F₂ (8).

В кислотному гідролізаті 8 були ідентифіковані арабіноза, глюкоза, рамноза і аглікон, які співпадають за ТШХ з відомими зразками моносахаридів та хедерагеніном. Прогенін цього глікозиду, одержаний при лужному гідролізі, ідентичний з ТШХ 3-О--L-арабінопіранозиду хедерагеніну.

Таблиця 1. Структури відомих тритерпенових глікозидів з Cussonia paniculata

Глікозид	Тип аглікону	R1	R2	R3
2а	А	Ara>	Н	H
2b	В	Ara>	Н	H
3	А	Ara>	ОН	H
4а	А	Ara>	Н	<Glc6<Glc4<Rha
4b	В	Ara>	Н	<Glc6<Glc4<Rha
5	А	Ara>	ОН	<Glc6<Glc
6	А	Ara>	ОН	<Glc6<Glc4<Rha
10а	А	H	ОН	<Glc6<Glc4<Rha
15	А	Glc>2Ara>	Н	H
16	А	Glc>2Ara>	Н	<Glc6<Glc4<Rha
17	А	Glc>2Ara>	ОН	<Glc6<Glc4<Rha
20	А	GlcUA>	Н	H
21	А	GlcUA>	ОН	H
22	А	GlcUA>	ОН	<Glс
23	А	Glc>2GlcUA>	Н	<Glc

Примітка. Умовні позначення: Glc - -D-глюкопіранозил, Rha - -L-рамнопіранозил, Ara - -L-арабінопіранозил, GlсUA - -D-глюкуронопіранозил.

В ¹³С ЯМР спектрі 8 за даними літератури були віднесені сигнали атомів вуглецю -L-арабінопіранозильного фрагмента, а також хедерагеніну. Після віднесення цих сигналів аналіз ¹³С ЯМР спектра 8 в області сигналів аномерних С-атомів (95-108 м.ч.) показав наявність ще п'яти сигналів, але оцінка хроматографічної рухливості глікозиду показала, що він повинен мати чотири вуглеводних залишки.

Вочевидь, що в 8 знаходяться ізомерні глікозиди з різними вуглеводними фрагментами, що мають по ацетильній групі, тому як в ¹³С ЯМР спектрі спостерігалися сигнали двох О-ацетильних груп (метильного и карбонільного атомів) при 21,0, 21,2, 171,1 і 171,2 м.ч. Від сигналів аномерних С-атомів по двовимірному спектру HSQC (рис. 1) були знайдені сигнали відповідних аномерних протонів. З урахуванням даних повного кислотного гідролізу і величин КССВ сигналів аномерних протонів (чотири сигнали з J_1,2 по 8 Гц і два сигнали з J_1,2 по 1.5 Гц) встановили, що в кожному із ізомерних трисахаридних ланцюгів є по два залишки глюкози і одному залишку рамнози. Крім того, ізомери розрізняються лише положенням ацетильної групи. На основі двовимірного спектра TOCSY від сигналів аномерних протонів знайдені сигнали інших скелетних протонів кожного із залишків глюкопіраноз, а сигнали залишків рамнопіраноз знайдені, перш за все, від двох близько розташованих дублетних сигналів протонів Н-6 у високопольній області спектра.

Аналіз спектра COSY (рис. 2) дозволив виконати однозначне віднесення сигналів до кожного протона в кожному із шести моносахаридних залишків. Після виконання віднесень сигналів всіх Н-атомів на основі спектра HSQC (рис. 3) були виконані і повні віднесення сигналів С-атомів.

При цьому аналіз величин хімічних зсувів сигналив С- і Н-атомів в вуглеводних залишках показав, що вони близькі до хімічних зрушень сигналів залишків глюкопіраноз в трисахаридному фрагменті Rha>⁴Glc>⁶Glc>, типовому для рослин родини аралієвих, але хімічні зсуви сигналів залишків рамнопіраноз суттєво відрізнялися. З цього було ясно, що ацетильна група знаходиться як раз в залишках рамнопіраноз. При цьому аналіз величин хімічних зсувів сигналів Н-атомів залишків рамнопіраноз показав, що для одного із них в порівнянні з неацетильованим трисахаридом в незвичайно низькому полі (Дд більше 1 м.ч.) розташований сигнал Н-2, а в другому ізомерному залишку - сигнал Н-3.

(Ara>³Hed²⁸<Glc'⁶<Glc''⁴<Rha'''²<OAc) (8а)

[Ara>³Hed²⁸<Glc'⁶<Glc''⁴<Rha'''³<OAc] (8b)

Рис. 1. Фрагмент спектра HSQC глікозидів 8а і 8b (область аномерних атомів).

Аналіз величин хімічних зсувів сигналів С-атомів показав, що у одного залишку рамнози для атома С-2 спостерігається позитивний -ефект (1,7 м.ч.), а на сусідніх С-атомах - негативні -ефекти на С-2 (2,5 м.ч.) і С-4 (2,2 м.ч.), тоді як в другому залишку для рамнози позитивний -ефект (2,4 м.ч.) спостерігається для сигналу С-3, а негативні -ефекти на С-2 (2,5 м.ч.) і С-4 (2,2 м.ч.). За допомогою спектра HMBC, за спостереженням кореляцій від аномерних протонів були визначені і типи глікозидних зв'язків моносахаридних залишків і вуглеводних фрагментів з агліконом. На основі цих даних вуглеводними фрагментами по атому С-28 аглікону є 2-O-ацетил- і 3-О-ацетил--L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозильні фрагменти. Додатково локалізація ацетильної групи була підтверджена на основі даних спектру HMBC, в якому спостерігався крос-пік між протоном Н-2 і карбонільним С-атомом одного із залишків оцтової кислоти в одному глікозиді і протоном Н-3 рамнози і карбонільним С-атомом другого залишку оцтової кислоти в ізомерному глікозиді.

Таким чином, 8 є сумішшю двох ізомерних хроматографічно нерозподілених глікозидів позначених 8а і 8b, які представляють собою 3-О--L-арабінопіранозил-28-О-(2-О-ацетил- і 3-О-ацетил--L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозиди хедерагеніну, відповідно.

(Ara>³Hed²⁸<Glc'⁶<Glc''⁴<Rha'''²<OAc) (8а)

[Ara>³Hed²⁸<Glc'⁶<Glc''⁴<Rha'''³<OAc] (8b)

Рис. 2. Фрагмент спектра COSY глікозидів 8а і 8b (вуглеводна частина).

(Ara>³Hed²⁸<Glc'⁶<Glc''⁴<Rha'''²<OAc) (8а)

[Ara>³Hed²⁸<Glc'⁶<Glc''⁴<Rha'''³<OAc] (8b)

Рис. 3. Фрагмент спектра HSQC глікозидів 8а і 8b (вуглеводна частина).

Аналогічним чином було визначено будову інших глікозидів, які містять описані вище ацетильовані вуглеводні фрагменти. Будова нових глікозидів приведена у таблиці 2.

Встановлення будови нового глікозиду L-G₁ (7)

В повному кислотному гідролізаті 7 за ТШХ ідентифікували глюкозу, арабінозу, рамнозу і хедерагенін. Прогенін, який утворюється при лужному гідролізі 7, за ТШХ ідентичний 3-О--L-арабінопіранозиду хедерагеніну. При витримуванні глікозиду 7 на ТШХ-пластинці в парах аміаку, спостерігалося зменшення хроматографічної рухливості глікозиду внаслідок його дезацетилювання. З даних літератури в ¹³С ЯМР спектрах 7 були віднесені сигнали залишків б-L-арабінопіранози і дизаміщеного хедерагеніну. Віднесення решти сигналів, котрі належать вуглеводному фрагменту по атому С-28 аглікону, проводилося аналогічно описаному вище для 8. При цьому в ¹³С ЯМР спектрі глікозиду 7 в області аномерних С-атомів були знайдені ще три сигнали, за якими із спектра HSQC були найдені дублетні сигнали аномерних протонів. Дублети при 4,99 и 6,19 м.ч. з КССВ по 8 Гц належать залишкам глюкопіраноз, а дублет при 5,84 м.ч. з КССВ біля 1,5 Гц - залишку рамнопіранози. Повні віднесення сигналів Н-атомів вуглеводної частини по атому С-28 аглікону були здійснені на основі аналізу двовимірних спектрів COSY і TOCSY.

На основі даних протонного спектра і з використанням спектра HSQC було виконано віднесення сигналів в ¹³С ЯМР спектрі. Сигнали С-атомів при 21,2 і 170,9 м.ч. були віднесені до естерної ацетильної групи. Аналіз б- і в-ефектів заміщення на Н- і С-атомах вуглеводної частини 7 в порівнянні з незаміщеним трисахаридним фрагментом показав наявність О-ацетатної групи по атому С-4 залишку рамнози. Додатково локалізація ацетатної групи була підтверджена на основі даних спектра HMBC по крос-піку між Н-4 рамнози і карбонільним С-атомом залишку оцтової кислоти. Типи глікозидних зв'язків також були визначені на основі спектра HMBC.

Таким чином, 7 представляє собою 3-О--L-арабінопіранозил-28-О-(4-O-ацетил--L-рамнопіранозил)-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозид хедерагеніну.

Встановлення будови нового глікозиду L-G₂, Fl-F₁ (10)

В результаті повного кислотного гідролізу в складі глікозиду 10 були ідентифіковані глюкоза, рамноза, а також аглікон, котрий співпадає за хроматографічною рухливістю з хедерагеніном, але відрізняється від нього кольором хроматографічної зони при детектуванні фосфорновольфрамовою кислотою.

Прогенін, який утворюєтся при лужному гідролізі, співпадав за хроматографічною рухливістю з агліконом, що вказувало на відсутність вуглеводного ланцюга по гідроксильній групі у атома С-3 аглікону. Для ідентифікації глікозиду 10 обробкою ферментом із шлункового соку виноградного слимака глікозиду Н₂ із листя плюща кримського, було одержано 28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозид хедерагеніну. Цей глікозид також співпадав за ТШХ з 10, але відрізнявся кольором при детектуванні фосфорновольфрамовою кислотою. На основі одержаних даних було зроблено припущення, що в склад глікозиду 10 входить близький до хедерагеніну по полярності аглікон, котрий містить дві гідроксогрупи та припустимо -L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозильний фрагмент.

В ¹³С ЯМР спектрі 10 були легко віднесені сигнали -L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозильного фрагмента шляхом порівняння з багаточисленними даними літератури. Встановлення будови аглікону проводилось наступним чином. На основі однакової з хедерагеніном хроматографічної рухливості було зроблено припущення, що аглікон є ізомером хедерагеніну. Це підтверджувалось і близькістю хімічних зсувів атомів вуглецю кілець А і В аглікону сигналам атомів кілець А і В хедерагеніну. Також було відмічено, що сигнали атомів вуглецю кілець С, D і Е аглікону близькі сигналам атомів вуглецю кілець С, D і Е урсолової кислоти. Виходячи з цього, для аглікону була запропонована структура 23-гідроксіурсолової кислоти, яка потім була підтверджена порівнянням підспектра агліконної частини глікозиду 10 з даними літератури.

Однозначне віднесення сигналів атомів вуглецю в¹³С ЯМР спектрі в агліконній частині 10 було додатково підтверджено спільним аналізом двовимірних спектрів HSQC, COSY і TOCSY, починаючи від низки однозначно віднесених сигналів С-атомів (С-2, С-3, С-7, С-12, С-18, С-21 та ін.).

Таким чином, глікозид 10 представляє собою 28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозид 23-гідроксіурсолової кислоти. Аналіз ¹³С ЯМР спектра глікозиду St-Е показав, що він представляє собою суміш ізомерних глікозидів 10 і відомого 28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозиду хедерагеніну позначеного 10а.

Аналогічним чином була встановлена будова глікозидів St-В (11) та St-С (12).

Будови нових тритерпенових глікозидів Cussonia paniculata приведені у табли-ці 2.

Таблиця 2. Структури нових тритерпенових глікозидів Cussonia paniculata

Глікозид	Тип аглікону	R1	R2	R3
7	А	Ara>	ОН	<Glc6<Glc4<Rha4<OAc
8а	А	Ara>	ОН	<Glc6<Glc4<Rha2<OAc
8b	А	Ara>	ОН	<Glc6<Glc4<Rha3<OAc
9а	А	Ara>	Н	<Glc6<Glc4<Rha2<OAc
9b	А	Ara>	Н	<Glc6<Glc4<Rha3<OAc
9с	В	Ara>	Н	<Glc6<Glc4<Rha2<OAc
9d	В	Ara>	Н	<Glc6<Glc4<Rha3<OAc
10	В	H	ОН	<Glc6<Glc4<Rha
Глікозид	Тип аглікону	R1	R2	R3
11	В	Н	ОН	<Glc
12	В	Н	ОН	<Glc6<Glc
13а	С	H	ОН	<Glc6<Glc4<Rha2<OAc
13b	С	H	ОН	<Glc6<Glc4<Rha3<OAc
14а	А	H	ОН	<Glc6<Glc4<Rha2<OAc
14b	А	H	ОН	<Glc6<Glc4<Rha3<OAc
18а	А	Glc>2Ara>	Н	<Glc6<Glc4<Rha2<OAc
18b	А	Glc>2Ara>	Н	<Glc6<Glc4<Rha3<OAc
19а	А	Glc>2Ara>	ОН	<Glc6<Glc4<Rha2<OAc
19b	А	Glc>2Ara>	ОН	<Glc6<Glc4<Rha3<OAc

3. Глікозидний склад листя, бутонів та стебел Cussonia paniculata

Проведене дослідження виявило, що вміст тритерпенових глікозидів у стеблах та бутонах менш, ніж у листя. При цьому у стеблах Cussonia paniculata не знайдено ацетильованних глікозидів, які виявлені у великій кількості в бутонах та листях. Вміст глікозидів у вивчених органах приведено у табл. 3.

У листях поблизу вміст глікозидів олеанолової кислоти та хедерагеніну. У бутонах у великій кількості існують глікозиди олеанолової кислоти. У стеблах - глікозиди хедерагеніну, олеанолова кислота входить у склад двох кислих глікозидів. Також у стеблах не визначені глікозиди урсолової та 23-гідроксіурсолової кислоти, які були визначені у листях та бутонах. У цілому треба відмітити, що аглікони, що входять до складу глікозидів дуже різноманітні за своєю будовою. У якості агліконів знайдені тритерпеноїди в-амірінового ряду - олеанолова кислота та хедерагенін, б-амірінового ряду - урсолова та 23-гідроксіурсолова кислота та лупанового ряду - 23-гідроксібетулінова кислота. У більшості глікозидів входять аглікони в-амірінового ряду. Основним глікозидом в у листях та бутонах є - 28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозид 23-гідроксіурсолової кислоти (10), однак у стеблах з нім по вмісту порівнює 3-О--L-арабінопіранозил-28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозид хедерагеніну (6). 23-Гідроксібетулінова кислота входить у склад лише двох ацетильованних глікозидів, які виділенні з листя та квіткових бутонів (13а та 13b).

Більшість глікозидів, що виділенні з різних органів є бідесмозидні. У виділених монодесмозідних глікозидах вуглеводні ланцюги знаходяться як по С-3 атому аглікону, так і у більш незвичному положенні - по С-28 атому аглікону. Основними вуглеводними фрагментами по атому С-3 аглікону у глікозидах є б-L-арабінопіранозильний та -D-глюкопіранозил-(12)-O--L-арабінопіранозильний фрагменти, а в кислих глікозидах - в-D-глюкуронопіранозильний та в-D-глюкопіранозил-(1>2)-О-в-D-глюкуронопіранозильний фрагменти. Вуглеводні фрагменти по С-28 атому аглікону представлені більшою різноманітністю. У бідесмозидних глікозидах и монодесмозидних глікозидах, які мають вуглеводної ланцюги по С-3 атому аглікона, знайдено розповсюджений у глікозидах рослин родини аралієвих -L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозильний фрагмент, а у мінорних глікозидах -D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозильний та -D-глюкопіранозильний фрагменти.

Іншою відмінністю глікозидного складу є наявність більшої кількості ацетильованних глікозидів, у яких ацетильна група находиться у атому С-2, С-3 або С-4 залишку рамнози у трисахаридному фрагменті Rha>⁴Glc>⁶Glc>²⁸. При цьому усі глікозиди, які ацетильовані по С-2 або С-3, були виділенні у виді сумішей, у яких вони знаходились у мольному співвідношенні 1:1.

Раніше глікозиди з такими вуглеводними фрагментами були виділенні лише воднораз. Однак, тільки з листя був виділено єдиний глікозид ацетильованний по атому С-4 залишку рамнози (глікозид 7), однак раніше глікозиди з такими вуглеводними фрагментами не виділялись. Як було вказано при встановлені будови, багато з глікозидів, що були виділені з Cussonia paniculata, раніше були виділені з різних органів Fatsia japonica, що вказує на близькість цих рослин за хемотаксономічною ознакою.

Таблица 3. лікозидний склад листя, бутонів та стебел Cussonia paniculata

Глікозид	Вміст, %	Глікозид	Вміст, %
	Листя	Бутоні	Стебла		Листя	Бутоні	Стебла
2а	1,2	4,2	-	12	-	-	5,6
2b	0,8	2,8	-	13а	2,4	1,6	-
3	5,3	2,6	8,3	13b	2,4	1,6	-
4а	3,2	7,3	-	14а	2,5	1,8	-
4b	2,1	4,8	-	14b	2,5	1,8	-
5	-	-	6,0	15	3,1	6,5	-
6	7,9	4,5	19,0	16	3,2	9,8	-
7	0,4	-	-	17	1,4	-	5
8а	8,4	4,7	-	18а	2,9	4,2	-
8b	8,4	4,7	-	18b	2,9	4,2	-
9а	2,4	6,4	-	19а	0,9	-	-
9b	2,4	6,4	-	19b	0,9	-	-
9с	0,1	1,6	-	20	6,7	-	7,4
9d	0,1	1,6	-	21	-	-	8,1
10	17,3	15,3	18,6	22	1,4	-	-
10а	-	-	9,3	23	2,1	-	7
11	-	-	4,6

4. Молюскоцидна активность глікозидів кусонії волотистої

У глікозидів виділених із рослин роду Cussonia була знайдена молюскоцидна активність. Цей вид активності має інтерес для локального контролю тропічного захворювання - шистозоматозу (шистосомоз), яким в світі хворіють 250 мільйонів чоловік. Це захворювання викликається паразитом, переносниками якого є молюски родів Biomphlaria, Bulinus и Oncomelania.

Тому нами було проведено дослідження тритерпенових глікозидів Cussonia paniculata на молюсках котушка рогова Planorbis corneus, ії різновидність котушка рогова червона Planorbis corneus var. rubra (родина Planorbidaе), а також меланія піщана (родина Melaniidае). Planorbis corneus належить до прісноводних сидячооких молюсків, які часто зустрічаються в прісних водоймах. Melanoides tuberculata зустрічається від Єгипту до Індонезії. На відміну від Planorbis corneus і багатьох інших молюсків, Melanoides tuberculata дихає не легенями, а зябрами.

Із даних літератури відомо, що практично всі бідесмозидні глікозиди не проявляють молюскоцидну активність, тому для вивчення були взяті монодесмозидні глікозиди 2а, 2b, 3, 15, 20 і 21 (див. табл. 4).

Таблиця 4. Структури глікозидів, для яких була вивчена молюскоцидна активність

Сполука	Тип аглікону	R1	R2	R3
2а	A	Ara>	H	Н
2b	B	Ara>	H	Н
3	A	Ara>	OH	Н
10р	B	H>	OH	Н
13р	C	H>	OH	Н
15	A	Glc>2Ara>	H	Н
17р	A	Glc>2Ara>	ОH	Н
20	A	GlcUA>	H	Н
21	А	GlcUA>	ОH	Н
23р	A	Glc>2GlcUA>	H	Н

Для вивчення молюскоцидної активності був виконаний розподіл глікозидів 2а та 2b. Спочатку глікозиди перевели в повні ацетати і розділяли на силікагелі L iмпрегнiрованим нітратом срібла при елююваннi системою розчинників бензол-гексан. Початкові глікозиди одержали дезацетилюванням. З практичної мети монодестозидні глікозиди легко одержати із бідесмозидних ферментацією, яка виникає при механічному пошкоджені свіжої рослини. Тому ж для дослідження біологічної активності були одержані прогеніни глікозидів 10, 13, 17 і 23 не виділені при розділенні очищених сум глікозидів. Прогеніни були одержані лужним гідролізом відповідних глікозидів і позначені як 10р, 13р, 17р і 23р.

Проведені дослідження показали, що глікозиди олеїнової кислоти більш активні, ніж глікозиди хедерагеніну, які мають аналогічну будову вуглеводних ланцюгів. Крім того, моноозидні глікозиди (утримуючі один вуглеводний залишок) більш активни ніж біозидні (утримуючі два вуглеводних залишку). Однак, для тритерпеноїдів -аміринового і лупанового рядів та їх глікозидів не знайдена молюскоцидна активність аж до концентрації 10^-3 моль/л. Отримані дані з молюскоцидної активності глікозидів добре співвідносяться з даними відносної гемолітичної активності. Крім того, було встановлено, що молюски, що дихають зябрами, більш чутливі до тритерпенових глікозидів ніж ти, що дихають легенями.

Таблиця 5. Молюскоцидна активність тритерпенових глікозидів

Сполука	LС100, моль/л	Тривалість експозиції tLC100, хв.
		Planorbis corneus	Planorbis corneus var. rubra	Melanoides tuberculata
2а	10-4	39	42	35
2b	10-3	-	-	-
3	10-4	46	49	44
10р	10-3	-	-	-
13р	10-3	-	-	-
15	10-4	93	97	89
17р	10-4	171	185	162
20	10-4	148	156	143
21	10-4	-	-	-
23р	10-4	161	170	154

Примітка: щільність експерименту складає 5%, знак «-» позначає відсутність токсичної дії протягом 240 хв.

тритерпеновий глікозид кусонія волотистий

ВИСНОВКИ

1. Показана можливість використання спектроскопії ЯМР для встановлення будови сумішей ізомерних тритерпенових глікозидів, що різняться будовою вуглеводного (8а і 8b, 13а і 13b, 14а і 14b, 18а і 18b, 19а і 19b), агліконного (2а і 2b, 4а і 4b, 10а і 10b) і вуглеводного й агліконного (9а, 9b, 9с, 9d) фрагментів структури.

2. Основним тритерпеновим глікозидом Cussonia paniculata являється новий раніш невідомий глікозид б-аміринового ряду 28-О--L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозид 23-гідроксіурсолової кислоти.

3. В листях та стеблах Cussonia paniculata переважають ізомерні бидесмозидні глікозиди з 2-O-ацетил- і 3-О-ацетил--L-рамнопіранозил-(14)-О--D-глюкопіранозил-(16)-О--D-глюкопіранозильними вуглеводними фрагментами по атому С-28 аглікону.

4. Виявлено якісну та кількісну різницю глікозидного складу листя, стебел та квіткових бутонів Cussonia paniculata, зокрема, високий вміст ацетильованих тритерпенових глікозидів у листях і квіткових бутонах та їх відсутність в стеблах.

5. Монодесмозидні тритерпенові глікозиди Cussonia paniculata є перспективними для розробки молюскоцидних препаратів і пошуку у них інших видів біологічної активності, що обумовлені мембранотропною дією.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Довгий И.И., Гришковец В.И. Тритерпеновые гликозиды листьев Cussonia paniculata // Учёные записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». - 2005. - Т. 18 (58), №2. - С. 38-42. (Виділення, розподіл та встановлення будови глікозидів хімічними методами. Участь у встановленні будови методами ЯМР спектроскопії).

Довгий И.И., Гришковец В.И., Качала В.В., Шашков А.С. Тритерпеновые гликозиды Cussonia paniculata. I. Выделение и установление строения гликозидов A, B₁, В₂, C, D, G₂, H₁ и H₂ // Химия природ. соедин. - 2005. - № 2. - С. 160-163. (Виділення, розподіл та встановлення будови глікозидів хімічними методами. Участь у встановленні будови методами ЯМР спектроскопії).

Гришковец В.И., Довгий И.И., Качала В.В., Шашков А.С. Тритерпеновые гликозиды Cussonia paniculata. II. Ацетилированные гликозиды из листьев Cussonia paniculata // Химия природ. соедин. - 2005. - № 4. - С. 351-356. (Виділення, розподіл та встановлення будови глікозидів хімічними методами. Участь у встановленні будови методами ЯМР спектроскопії).

Довгий И.И., Гришковец В.И., Качала В.В., Шашков А.С. Тритерпеновые гликозиды Cussonia paniculata. III. Выделение и установление строения гликозидов I₁, I₂, J_1а, J_1b, J₂, K, L₁ и L₂ из листьев Cussonia paniculata // Химия природ. соедин. - 2006. - № 2. - С. 149-152. (Виділення, розподіл та встановлення будови глікозидів хімічними методами. Участь у встановленні будови методами ЯМР спектроскопії).

Довгий И.И., Гришковец В.И., Качала В.В., Шашков А.С. Использование методов ЯМР-спектроскопии для установления строения тритерпеновых гликозидов Cussonia paniculata // Учёные записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». - 2006. - Т.19 (58), №1. - С. 141-146. (Участь у встановленні будови методами ЯМР спектроскопії).

Довгий И.И., Гришковец В.И. Яковишин Л.А. Моллюскоцидная активность тритерпеновых гликозидов, выделенных из куссонии метельчатой Cussonia paniculata // Учёные записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». - 2006. - Т.19 (58), №3. - С. 131-134. (Участь у вивченні молюскоцидної активності тритерпенових глікозидів).

Довгий И.И., Гришковец В.И., Качала В.В., Шашков А.С. Тритерпеновые гликозиды цветочных бутонов и стеблей Cussonia paniculata // Учёные записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». - 2006. - Т.19 (58), №4. - С. 235-240. (Виділення, розподіл та встановлення будови глікозидів хімічними методами. Участь у встановленні будови методами ЯМР спектроскопії).

Kachala V.V., Grishkovets V.I., Dovgy I.I., Shashkov A.S. Study of triterpene glycosides from Cussonia paniculata leaves // XVI International Symposium on Glycoconjugates. Hague (Netherlands), 19 - 24 August 2001. - Glycoconjugate journal. - 2001. - Vol.18, № 1/2. - P. 63. (Виділення, розподіл та встановлення будови глікозидів хімічними методами. Участь у встановленні будови методами ЯМР спектроскопії).

Dovgy I.I., Grishkovets V.I., Kachala V.V., Shashkov A.S. Triterpene glycosides from Cussonia paniculata leaves // 4-th International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds. Isparta, 6-8 June 2001. - Isparta (Turkey), 2001. - P. 95. (Виділення, розподіл та встановлення будови глікозидів хімічними методами. Участь у встановленні будови методами спектроскопії ЯМР).

Grishkovets V.I., Dovgy I.I., Kachala V.V., Shashkov A.S., Arnautov N.N., Chirva V.Ya. Triterpene glycosides from Cussonia paniculata leaves // 11-th European Carbohydrate Symposium. Lisboa, 2-7 September 2001. - Lisboa (Portugal), 2001. - P. B062. (Виділення, розподіл та встановлення будови глікозидів хімічними методами. Участь у встановленні будови методами ЯМР спектроскопії).

Dovgy I.I., Grishkovets V.I., Shashkov A.S., Kachala V.V., Arnautov N.N. Triterpene glycosides from Cussonia paniculata // 5-th International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds. Tashkent, 20-23 May 2003. - Tashkent (Uzbekistan), 2003. - P. 47. (Виділення, розподіл та встановлення будови глікозидів хімічними методами. Участь у встановленні будови методами ЯМР спектроскопії).

Grishkovets V.I., Dovgy I.I., Shashkov A.S., Kachala V.V., Chirva V.Ya. Acetylated triterpene glycosides from Cussonia paniculata // 5-th International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds. Tashkent, 20-23 May 2003. - Tashkent (Uzbekistan), 2003. - P. 48. (Виділення, розподіл та встановлення будови глікозидів хімічними методами. Участь у встановленні будови методами ЯМР спектроскопії).

Grishkovets V.I., Dovgy I.I., Shashkov A.S., Kachala V.V., Chirva V.Ya. Acetylated triterpene glycosides from Cussonia paniculata // The 1^st International Conference of the Moldavian Chemical Society. Chisinau, 6-8 October 2003. - Chisinau (Moldova), 2003. - P. 171. (Виділення, розподіл та встановлення будови глікозидів хімічними методами. Участь у встановленні будови методами ЯМР спектроскопії).

Довгий И.И., Гришковец В.И. Тритерпеновые гликозиды листьев Cussonia paniculata // Всеукраинская научно-техническая конференция «Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики». Севастополь, 4-9 апреля 2005 г. - Севастополь, 2005. - С. 126-127. (Виділення, розподіл та встановлення будови глікозидів хімічними методами. Участь у встановленні будови методами ЯМР спектроскопії).

Довгий И.И., Гришковец В.И. Ацетилированные гликозиды из листьев Cussonia paniculata // Всеукраинская научно-техническая конференция «Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики». Севастополь, 4-9 апреля 2005 г. - Севастополь, 2005. - С. 128-129. (Виділення, розподіл та встановлення будови глікозидів хімічними методами. Участь у встановленні будови методами ЯМР спектроскопії).

Довгий И.И., Гришковец В.И. Тритерпеновые гликозиды стеблей и цветочных бутонов куссонии метельчатой Cussonia paniculata // IV Всеукраинская научно-техническая конференция «Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии. ББФХ-2008». Севастополь, 21-26 апреля 2008 г. - Севастополь, 2008. - С. 207-209.

Размещено на Allbest.ru

...