Особливості функціонування 5-ліпоксигенази з використанням ліпофільних нітроксильних сполук

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

АВТОРЕФЕРАТ

ОСОБЛИВОСТІ ФУНКЦІОНУВАННЯ 5-ЛІПОКСИГЕНАЗИ З ВИКОРИСТАННЯМ ЛІПОФІЛЬНИХ НІТРОКСИЛЬНИХ СПОЛУК

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, відділ молекулярних механізмів регуляції метаболізму клітини

Науковий керівник

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Харченко Ольга Володимирівна, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, старший науковий співробітник відділу молекулярних механізмів регуляції метаболізму клітини

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, професор Кібірєв Володимир Костянтинович Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, провідний науковий співробітник відділу хімії білків та пептидів

Кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Шалак В'ячеслав Федорович Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу механізмів трансляції генетичної інформації

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

Автореферат розісланий 24 вересня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Ліпоксигенази (лінолеат:кисень оксидоредуктази, КФ 1.13.11.12.) - група ферментів, які каталізують введення кисню до 1,4-цис,цис-пентадієнового фрагменту поліненасичених жирних кислот з утворенням відповідних гідропероксидів. Ці поширені ферменти ліпідного обміну займають ключове місце у метаболізмі рослинних та тваринних організмів. Дана реакція є першою ланкою розгалуженого ферментативного каскаду в результаті якого утворюються біологічно-активні сполуки широкого спектру регуляторної дії, серед яких найбільш потужні - лейкотрієни, ліпоксини та жасмонова кислота і її похідні [Rokach J., 1989; Гречкин А.Н., 1999]. Ліпоксигеназні метаболіти приймають участь у формуванні відповіді організму на дію стресових факторів, процесах старіння; з їх гіперпродукцією в тваринних клітинах пов'язують такі патологічні стани як алергія, запальні, атеросклеротичні, ішемічні процеси, канцерогенез та ін.

Ліпоксигеназний каталіз це також один з шляхів утворення окиснених ліпідних похідних та модифікації мембранних структур. З дією цих ферментів пов'язують окиснення ліпопротеїнів малої щільності [Heydeck D. et al., 2001; Schewe T., 2002] та ліпідів мембранного матриксу на перших етапах апоптозу [Maccarrone M. et al., 2001; Feussner I. et al., 1998] і при гіперчутливій відповіді рослинних клітин на дію стресу [Croft K. et al., 1990; Jalloul A. et al., 2002]. Окиснення за участю ліпоксигеназ мембран мітохондрій, ендоплазматичного ретикулума та хлоропластів викликає утворення пор, яке ініціює руйнування органел; збільшує концентрацію Са²⁺ у цитоплазмі; впливає на активність мембранозв'язаних ферментів, порушуючи узгодженість у ланцюгах дихання та фотофосфорилювання, що формує у клітині стан окисного стресу [Van Leyen K. et al., 1998; Grullich C. et al., 2001; Vijayvergiya C. et al., 2004]. Визначальна роль окисного стресу у розвитку багатьох патологічних станів рослинних та тваринних організмів надає особливу актуальність питанню залучення ліпоксигеназ до перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ). Крім безпосереднього утворення гідропероксидів поліненасичених жирних кислот в результаті ліпоксигеназного каталізу, відбувається також ініціація процесів аутоокиснення інтермедіатами радикальної природи, які дифундують з активного центру ферменту, внаслідок передчасної дисоціації фермент-субстратного комплексу [Butovich I.A. et al., 2000, 2001; Ivanov I. et al., 2005]. Однією з причин такої зміни у функціонуванні ліпоксигенази може бути взаємодія з алостеричним ефектором, який викликає певні конформаційні перебудови молекули ферменту. На сьогоднішній день показана здатність ряду природних та синтетичних сполук взаємодіяти з регуляторною ділянкою ліпоксигеназ за алостеричним механізмом, але розглядається лише аспект впливу ефекторів на активність ферменту [Бутович И.А. и др., 1990; Ruddat V.C. et al., 2003; Sailer E-R. et al., 1998].

Літературні дані, щодо участі ліпоксигеназ у ПОЛ у більшості досить суперечливі, що обумовлено складністю визначення ферментативного або неферментативного чи частково ферментативного походження окиснених ліпідних похідних. Перспективним у вивчені функціонування даної групи ферментів та визначенні чинників здатних впливати на утворення короткоіснуючих радикалів під час ліпоксигеназного каталізу є застосування нітроксильних сполук, яким притаманна висока реакційна здатність по відношенню до короткоіснуючих радикалів, що утворюються при аутоокисненні поліненасичених сполук [Харченко О.В. и др., 2001; Cimato A.N. et al., 2004; Nilsson U.A. et al., 1989].

Беручи до уваги вище зазначене, актуальним є визначення участі ліпоксигеназного каталізу в ініціації вільнорадикального окиснення ненасичених сполук та вивчення ролі алостеричної регуляції у функціонуванні ферменту.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною науково-дослідних робіт Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (тема: "Вивчення механізмів дії та регуляції ферментів каскаду поліненасичених жирних кислот у системах, що моделюють біологічні мембрани", державний реєстраційний номер 0103U005437; тема: "Молекулярна асоціація, функціональні властивості та шляхи регуляції активності ферментів каскадів поліненасичених жирних кислот", державний реєстраційний номер 0106U004305). естер арбоновий нітроксильний каталіз

Мета та завдання дослідження. Метою роботи є встановлення особливостей функціонування 5-ліпоксигенази з застосуванням 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних карбонових кислот та значення алостеричних ефекторів у ліпоксигеназному каталізі. Для досягнення мети вирішувались наступні завдання:

Визначити придатність 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних карбонових кислот для дослідження вільнорадикальних процесів під час 5-ліпоксигеназного каталізу, зокрема, вивчити їх взаємодію з неіонними міцелами та мембранними структурами природного походження; дослідити вплив гідрофобних нітроксильних сполук на перебіг 5-ліпоксигеназного каталізу та з'ясувати механізм їх дії.

За допомогою 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних кислот провести порівняльне дослідження реакцій окиснення лінолевої кислоти та лінолевого спирту, що каталізуються 5-ліпоксигеназою.

Дослідити вплив алостеричного ефектора - додецилсульфату натрію на термодинамічні параметри термоінактивації 5-ліпоксигенази.

Визначити кінетичний механізм дії природних фосфоліпідів на перебіг реакції окиснення лінолевої кислоти, що каталізується 5-ліпоксигеназою.

Об'єкт дослідження - ферментативне окиснення поліненасичених жирних сполук за каталітичної дії ліпоксигеназ.

Предмет дослідження - закономірності утворення вільних радикалів в процесі ліпоксигеназного каталізу та роль алостеричних ефекторів у функціонуванні 5-ліпоксигенази.

Методи дослідження - фізико-хімічні методи (хроматографія, електрофорез) застосовували при очищенні 5-ліпоксигенази; метод електронно-парамагнітного резонансу використовували для вивчення властивостей нітроксильних сполук в гетерофазних системах та їх взаємодії з короткоіснуючими радикалами; УФ-спектрофотометрія використана для дослідження кінетики ферментативного окиснення; математичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Показано, що 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилові естери гідрофобних карбонових кислот в міцелярній системі інгібують реакцію окиснення поліненасичених жирних сполук, що каталізується 5-ліпоксигеназою; ступінь інгібування залежить від хімічної природи субстрату реакції. За результатами кінетичних досліджень запропоновано механізм дії 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних кислот при ліпоксигеназному каталізі, який полягає у взаємодії даних сполук з ітермедіатами радикальної природи, що утворюються під час каталітичного циклу ферменту. Вперше, за допомогою ліпофільних нітроксильних сполук показано, що взаємодія 5-ліпоксигенази з алостеричним ефектором - додецилсульфатом натрію збільшує кількість короткоіснуючих радикалів за умов ферментативного окиснення лінолевої кислоти або лінолевого спирту.

Визначено енергію активації термоінактивації 5-ліпоксигенази та продемонстровано її збільшення при взаємодії ферменту з алостеричним ефектором.

Встановлено, що вплив природних фосфоліпідів - фосфатидилхоліну та фосфатидилінозиту на активність 5-ліпоксигенази здійснюється за алостеричним механізмом.

Практичне значення отриманих результатів. Результати дослідження показали, що 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилові естери гідрофобних кислот можуть використовуватись як інструмент в дослідженні функціонування ліпоксигеназ. Запропонований механізм інгібування ферментативного окиснення поліненасичених жирних сполук дозволяє розглядати 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилові естери гідрофобних кислот як потенційні інгібітори вільнорадикального окиснення ліпідів. Результати, отримані при дослідженні функціонування 5-ліпоксигенази з використанням ліпофільних нітроксильних сполук, дають підстави застосовувати 5-ліпоксигеназний каталіз у присутності додецилсульфату натрію за міцелярних умов як модель перекисного окиснення ліпідів для скрінінгу інгібіторів вільнорадикальних процесів та антиоксидантів. Висновки, отримані при дослідженні регуляторного впливу природних фосфоліпідів можуть бути використані для цілеспрямованого дизайну сполук, здатних контролювати рівень ліпоксигеназних метаболітів у клітині.

Одержані результати розширюють уявлення про функціонування ліпоксигеназ і є важливими в розумінні ролі даних ферментів у ПОЛ та зв'язку між ферментативним і неферментативним окисненням.

Особистий внесок здобувача. Експериментальна частина роботи та обробка отриманих результатів виконані здобувачем особисто. Планування та обговорення роботи, а також формулювання висновків відбувалось спільно з науковим керівником кандидатом біологічних наук Харченко О. В. Друковані праці були підготовлені за безпосередньої участі дисертанта.

Апробація результатів дисертаційної роботи. Результати роботи представлені на конференціях з біоорганічної хімії та нафтохімії ІБОНХ НАН України (Київ, 2003, 2005, 2006 рр.), конференції FEBS (Барселона, червень 1996), ХХ Українській конференції з органічної хімії (Одеса, 2004), Міжнародній конференції „Современная физиология растений: от молекул до экосистем” (Сиктивкар, 2007), 2-му Міжнародному симпозіумі “Регулятори росту рослин: внутрішньоклітинна гормональна сигналізація та застосування у сільському господарстві” (Київ, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 11 праць з них 6 статей у фахових виданнях та 5 тез наукових доповідей.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, опису отриманих результатів та їх обговорення, висновків та списку використаних джерел (158 найменуваннь). Дисертаційна робота викладена на 122 сторінках друкованого тексту і містить 19 рисунків та 11 таблиць.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. Розділ присвячено сучасним уявленням про будову, каталітичні механізми та особливості функціонування ліпоксигеназ. Розглянуто значення продуктів ліпоксигеназного ферментативного каскаду у метаболізмі живих організмів та роль взаємодії з мембранними структурами в регуляції активності ферменту.

Матеріали та методи дослідження. 5-ліпоксигеназу (5-ЛО) було отримано з бульб Solanum tuberosum сорту “Луговська”. Частково очищений препарат ферменту (препарат І) отримували за схемою, яка складалась з екстракції, висолювання 25-50% сульфатом амонію, хроматографії на Sephadex G-25 та С₁₈-картріджі. Високоочищений препарат 5-ЛО (препарат ІІ) отримували за схемою, яка складалась з екстракції, висолювання 25-50% сульфатом амонію, діалізу, іонообмінної хроматографії на DEAE-Toyоpearl та гідрофобної хроматографії на Butyl-Sepharose. Згідно результатів електрофорезу у поліакріламідному гелі за нативних умов [Ornstein M., Davis J., 1964], чистота препарату ІІ складала 87 %.

Стаціонарну швидкість (V_st) ліпоксигеназного каталізу визначали спектрофотометрично за кінетикою оптичного поглинання =235 нм, що відповідає максимальному поглинанню спряженого дієнового хромофору в молекулі гідропероксиду [Gibian M., Vanderberger B., 1987]. Стандартна реакційна суміш містила: натрій-фосфатний буферний розчин (0,1 М, рН 6,3), 0,02 % Lubrol PX, 0,1 мМ лінолевий спирт (ЛС) або 0,1 мМ лінолеву кислоту (ЛК). 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилові естери гідрофобних кислот додавали у 5 мкл 98% етилового спирту. Реакцію ініціювали 6-10 мкг 5-ЛО (препарат І) або 2,5 мкг препарату ІІ. Термоінкубацію 2,5 мкг 5-ЛО (препарат ІІ) проводили при 25єС, 37єС, 42єС та 50єС. Реакцію ініціювали 0,1 мМ ЛК, з попереднім охолодженням до 25єС. При побудові кінетичних залежностей використовували середні значення V_st, які визначали мінімум з трьох вимірювань (різниця між величинами становила не більше 5 %).

Константу іонізації бромтимолового синього (БТС) визначали спектрофотометрично при =620 нм [Гордон Дж., 1979] в інтервалі рН 4,5-10,0.

ЕПР-спектри нітроксильних сполук реєстрували на спектрометрі Е-3 (Varian) в ампулах діаметром 1,5 мм. Концентрація нітроксильного радикала в ампулі складала 0,01-0,05 мМ. Час кореляції обертальної дифузії (_с) нітроксильних радикалів вкладався в область «швидкого» дифузійного обертання [Witte F.M., Engberts J.B.F.N., 1988].

Динаміку ЕПР-спектрів нітроксильних сполук досліджували в реакційній суміші, яка містила: 0,05-0,1 мМ нітроксильна сполука, натрій-фосфатний буферний розчин (0,1 М, рН 6,3), 0,02% Lubrol PX, 0,1 мМ ЛС та 0,1 мМ ДДС, або 0,1 мМ ЛК; реакцію ініціювали 6 мкг 5-ЛО (препарат І).

Використання 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних кислот для вивчення функціонування 5-ліпоксигенази

В останні роки особлива увага науковців зосереджена на участі ліпоксигеназ у ПОЛ та формуванні окисного стресу у клітині. Для спостереження за утворенням вільних радикалів під час ліпоксигеназного каталізу нами запропоновано використовувати нітроксильні сполуки, які характеризуються високою реакційною здатністю до короткоіснуючих радикалів типу НОя, НООя, Rя, ROOя, ROя [Cimato A.N. et al., 2004; Nilsson U.A. et al., 1989]. Враховуючи гетерофазний характер 5-ліпоксигеназного каталізу при вивченні функціонування ферменту доречно застосовувати нітроксильні сполуки, які мають у своєму складі ліпофільний фрагмент. В роботі були використані 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинил-4-ові естери октадеканової (І), додеканової (ІІ), 3-метиладамантан-1-карбонової (ІІІ), 3-метиладамантил-1-оцтової (ІV), адамантан-1-карбонової (V), адамантил-1-оцтової (VІ), 1-біциклооктан карбонової (VII) кислот та біс(1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинил-4-ові) естери 5,7-диметиладамантан-1,3-дикарбонової (VIII) і фталевої (ІX) кислот.

Сполуки були синтезовані та охарактеризовані в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України к.х.н. Бабій Л.В. та к.х.н. Хільчевським О.М.

Придатність вищенаведених сполук для вивчення функціонування 5-ліпоксигенази потребувала вивчення їх взаємодії з неіонними міцелами, які застосовуються при дослідженні ліпоксигеназного каталізу in vitro; реакційної здатності по відношенню до короткоіснуючих радикалів та визначення механізму їх впливу на перебіг ферментативного окиснення.

Взаємодія 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних кислот з міцелами та мембранними структурами природного походження. Дослідження кінетики ферментів ліпідного обміну in vitro передбачає застосування систем, що моделюють умови гетерофазного каталізу. В даній роботі ми використовували міцели, створені 0,34 мМ неіонним детергентом Lubrol PX, які були охарактеризовані раніше [Бутович И.А. и др., 2001, 1991].

Показано, що у міцелярному розчині (рН 6,3) форма ЕПР-спектрів ліпофільних нітроксильних сполук І, ІІ, VI-VIII порівняно з 4-гідрокси-2,2,6,6,-тетраметилпіперидинил-1-оксилом (4-гідрокси-ТЕМРО) значно змінюється: спостерігається розширення ліній ЕПР-спектра, збільшення відстані між ними та втрата симетричності. Час кореляції обертальної дифузії (ф_с) сполук І, ІІ, VI-VIII склав 1,27?10^-10ч6,8?10^-10с, що у 5-10 разів вище, порівняно з 4-гідрокси-ТЕМРО. Збільшення значення ф_с вказує на обмеження рухливості ліпофільних нітроксильних радикалів, обумовлене їх фізичною іммобілізацією на поверхні міцели [Лихтенштейн Г.И., 1974; Бинюков В.И. и др., 1971]. Присутність 0,1 мМ ЛС; 0,1 мМ ДДС або 0,046 мг/мл 5-ЛО (препарат І) несуттєво змінюють ф_с, а отже не впливають на іммобілізацію нітроксильних сполук. Незначні відхилення ф_с в ряду ліпофільних нітроксильних сполук свідчать значення часу кореляції обертальної дифузії (ф_с) нітроксильних сполук у міцелярному розчині що відмінності у хімічній будові та розмірах гідрофобного замісника незначно впливають на рухливість радикалу, а, отже, і на здатність сорбуватись на поверхні міцели.

Уповільнення рухливості ліпофільних нітроксильних сполук спостерігалось нами також в присутності хлоропластів, отриманих за методом [Yasnikov A.A. et al., 1980]. Час кореляції обертальної дифузії 0,1 мМ сполуки VІ у присутності 0,15мг/мл хлоропластів склав 9,76·10^-11с, що є більшим, порівняно з водою (ф_с=6,9·10^-11с) або буферним розчином у відсутності хлоропластів (ф_с= 7,1·10^-11с). Це вказує на часткову іммобілізацію сполуки VІ, яка відбувається за рахунок гідрофобних взаємодій між ліпофільним фрагментом та мембраною хлоропластів.

В результаті проведених досліджень показано, що 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилові естери гідрофобних карбонових кислот ефективно іммобілізуються на поверхні неіонних міцел, що дозволяє використовувати ці сполуки для дослідження гетерофазних процесів, зокрема ліпоксигеназного каталізу.

Вивчення взаємодії нітроксильних сполук з короткоіснуючими радикалами за умов 5-ліпоксигеназного каталізу методом ЕПР. Спостереження за динамікою ЕПР-спектрів 4-гідрокси-ТЕМРО, 2,2,6,6,-тетраметилпіперидинил-1-оксилу (ТЕМРО) та сполук I-ІІІ, V-VIII показало, що в процесі 5-ліпоксигеназного каталізу відбувається поступове зменшення інтенсивності ЕПР-сигналу нітроксильних сполук, яке не спостерігається у контрольних дослідах. Гасіння ЕПР-сигналу обумовлено взаємодією нітроксильної групи з короткоіснуючими радикалами, утворення яких в умовах досліду може відбуватися внаслідок перетворень гідропероксиду в реакціях розгалуження ланцюга окиснення або (та) витоку інтермедіатів радикальної природи з активного центру ферменту з подальшим ініціюванням ланцюгової реакції [Berry H., 1998; Butovich I.A. et al., 2000].

Нахил залежності відносної інтенсивності ЕПР-спектра від часу дозволяє визначити константу швидкості загибелі нітроксильного радикала псевдопершого порядку, що спостерігається (k₁^obs).

Найбільшим значенням k₁^obs характеризується динаміка ЕПР-сигналу нітроксильних сполук за умов ферментативного окиснення ЛС у присутності алостеричного ефектора 5-ЛО - ДДС. У відсутності алостеричного ефектора загибель радикалів не відбувалась, що обумовлено низькою швидкістю ферментативного окиснення даного субстрату [Butovich I.A. et al., 2000]. Швидкість утворення гідропероксиду при ферментативному окисненні ЛС суттєво менша, ніж при перетворенні ЛК, отже, ініціація вільнорадикальних процесів здійснюється переважно інтермедіатами радикальної природи, що утворюються внаслідок передчасної дисоціації фермент-субстратного комплексу.

При переході від 4-гідрокси-ТЕМРО та ТЕМРО до гідрофобних нітроксильних похідних k1obs збільшується у 10-60 разів при окисненні ЛС та у 3-9 рази при окисненні ЛК. Кореляцію між здатністю нітроксильної сполуки до іммобілізації та динамікою ЕПР-спектра проілюстровано. Цей зв'язок вказує на переважну локалізацію вільнорадикальних процесів на поверхні міцели. Хімічна будова ліпофільного замісника сполук I-ІІІ, V-VIII не впливає на динаміку ЕПР-спектра, про що свідчать незначні відхилення у значеннях k1obs у ряду ліпофільних нітроксильних сполук.

Таким чином, іммобілізовані на поверхні неіонних міцел 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилові естери гідрофобних карбонових кислот взаємодіють з короткоіснуючими вільними радикалами, що утворюються при окисненні ЛК та ЛС за каталітичної дії 5-ліпоксигенази.

Визначення механізму впливу 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних кислот на реакцію окиснення лінолевого спирту, що каталізується 5-ліпоксигеназою. З метою встановлення механізму дії ліпофільних нітроксильних сполук нами досліджено їх вплив на швидкість утворення продукту в реакції окиснення ЛС в присутності ДДС, що каталізується 5-ЛО (препарат І). У діапазоні концентрацій 1-11 мкМ сполуки I-IX викликають зменшення V_st реакції на 90-93 %. Форма інгібіторних залежностей сполук I-IX має загальний вигляд і складається з двох ділянок: початкове інтенсивне зменшення швидкості реакції та вихід на плато. Значення концентрації інгібітора, при якій V_st утворення продукту зменшується на 50 % (ІС₅₀) складають 0,20,28 мкМ та 0,110,12 мкМ для ліпофільних моно- та бірадикальних нітроксильних похідних, відповідно. 4-гідрокси-ТЕМРО та ТЕМРО демонструють менш ефективне пригнічення реакції та мають суттєво вищі значення ІС₅₀.

Незначні відхилення у значеннях ІС₅₀ та подібний вигляд інгібіторних залежностей в ряду сполук I-IX дозволяє припустити загальний механізм їх за умов 5-ліпоксигеназного каталізу.

ІС₅₀ сполуки ІІ в реакції ферментативного окиснення 60 мкМ, 120 мкМ та 240 мкМ ЛС, склали 0,20 мкМ, 0,22 мкМ та 0,30 мкМ, відповідно. Тобто, концентрація субстрату не має суттєвого впливу на значення ІС₅₀, що свідчить про відсутність конкуренції між інгібітором та субстратом за зв'язування в активному центрі ферменту [Келети Т., 1990].

Кінетика окиснення ЛС за каталітичної дії 5-ЛО характеризується позитивною кооперативністю до субстрату [Butovich I.A. et al., 1998], що передбачає наявність у складі ферменту додаткових (регуляторних) ділянок. Нітроксильна сполука VІ не змінює сигмоїдну форму залежності V_st 5-ліпоксигеназного окиснення від концентрації ЛС; значення коефіцієнту Хілла склали 1,83±0,27 у відсутності інгібітора та 1,67±0,34 у присутності сполуки VІ, тобто конкуренція між субстратом та інгібітором за зв'язування в регуляторній ділянці відсутня.

Залежність V_st ферментативного окиснення ЛС від рН має дзвоноподібну форму, що є результатом залучення до каталітичного циклу двох іоногенних груп активного центру ферменту (рК_а1=7,4±0,14 та рК_а2=4,9±0,13). Нітроксильні сполуки ІІ або VІ не змінюють форму кривої та не викликають зсув рН-оптимума реакції. рК_а іоногенних груп ферменту за дії сполук ІІ або VІ склали рК_а1=7,36±0,25; рК_а2=4,78±0,30 та рК_а1=7,38±0,15; рК_а2=4,86±0,15, відповідно. Очевидно, що інгібітор не впливає на іоногенні групи активного центру ферменту, які беруть участь у каталітичном циклі.

Присутність 0,01 мМ нітроксильної сполуки VIII у складі неіонних міцел суттєво не змінює значення константи іонізації солюбілізованого на поверхні міцел бромтимолового синього та значення поверхневого потенціалу міцел (табл. 1). Тобто вплив ліпофільних нітроксильних сполук на перебіг каталітичного процесу не пов'язаний із зміною поверхневого рН та заряду міцели.

Таблиця 1 Значення рК_а^obs та поверхневого потенціалу (ц_s) міцел

Підвищення ефективності інгібітора із введенням ліпофільного замісника узгоджується з результатами, отриманими методом ЕПР і обумовлено як збільшенням локальної концентрації інгібітора на поверхні міцели, так і перехопленням радикальних інтермедіатів в безпосередній близькості від активного центру ферменту, що запобігає ініціюванню ланцюгової реакції.

На підставі отриманих результатів та аналізу літературних даних, нами запропоновано схему дії 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних карбонових кислот при 5-ліпоксигеназному каталізі за умов міцелярної системи. Вона передбачає взаємодію ліпофільних нітроксильних сполук (RN-O ) з алкільними (S_L ) або пероксильними (S_LOO ) радикалами, які дифундують з активного центру ліпоксигенази (E(Fe³⁺) або E(Fe²⁺)) внаслідок передчасної дисоціації фермент-субстратного комплексу.

Локалізація інгібітора на поверхні міцели визначає ефективне перехоплення вільнорадикальних інтермедіатів, що запобігає ініціюванню та продовженню радикально-ланцюгового окиснення. Даний механізм дозволяє розглядати ліпофільні нітроксильні сполуки І-ІX як потенційні інгібітори перекисного окиснення ліпідів.

Отже, інгібування ферментативного окиснення 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидиниловими естерами гідрофобних кислот не пов'язано з безпосередньою взаємодією інгібітора з функціональними групами активного та регуляторного центрів 5-ЛО. Дані сполуки не впливають на каталітичні властивості ферменту, що робить їх придатними для дослідження рівня вільнорадикальних процесів, супроводжуючих ліпоксигеназний каталіз та визначення чинників, які можуть впливати на інтенсифікацію цих процесів.

Порівняльне дослідження реакцій окиснення лінолевої кислоти та лінолевого спирту, що каталізуються 5-ліпоксигеназою за допомогою 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних кислот

Досліджено вплив 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних кислот на перебіг окиснення ЛК за каталітичної дії 5-ЛО. V_st ферментативного окиснення ЛК в присутності сполук VI VIІІ, IX зменшувалась на 22-26 % від початкової. Взаємодія ферменту з алостеричним ефектором - ДДС посилює пригнічувальну дію нітроксильних сполук майже втричі. ІС₅₀ сполук ІІ, ІV, VI-IX в реакції окиснення ЛК в присутності 0,1 мМ ДДС склали 1,9; 0,3; 0,8; 2,5; 0,5; 1,7 мкМ, відповідно.

Згідно механізму дії 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних кислот, ефективність інгібування ліпоксигеназного каталізу цими сполуками корелює із кількістю короткоіснуючих вільних радикалів, що утворюються під час реакції. Інтенсивність інгібування визначається хімічною природою субстрату реакції та присутністю алостеричного ефектора і не залежить від кількості нітроксильних груп та хімічної будови ліпофільного замісника в молекулі інгібітора. Чистота препарата ферменту не впливає на ефективність пригнічення.

Найбільша кількість коротко- існуючих вільних радикалів супроводжує ферментативне окиснення ЛС у присутності ДДС, на що вказує висока ступінь інгібування нітроксильними сполуками окиснення цього субстрату. Переважність неферментативного окиснення підтверджує утворення в цій реакції еквімолярної суміші позиційних ізомерів гідропероксиду лінолевого спирту, що характерно для вільнорадикального окиснення ненасичених сполук [Butovich I.A. et. al., 2000].

ДДС збільшує ступінь інгібування ліпофільними нітроксильними сполуками окиснення ЛК майже втричі. Вплив алостеричної взаємодії на інтенсивність вільнорадикальних процесів при ліпоксигеназному каталізі характеризують залежності V_st окиснення ЛС або ЛК від концентрації ДДС в присутності 0,5 мкМ сполуки VIII. Залежності мають дзвоноподібну форму з максимумом при 0,1 мМ ДДС. Інгібування ферментативного окиснення сполукою VIII та активуючий вплив ДДС є процесами взаємозв'язаними - найефективніше інгібування реакції досягається при оптимальній концентрації алостеричного ефектора. Це дозволяє використовувати 5-ліпоксигеназний каталіз у присутності ДДС за міцелярних умов як модель аутоокиснення ліпідів для скрінінгу потенційних антиоксидантів та інгібіторів окисних процесів.

Ми передбачаємо, що інтенсифікація утворення короткоіснуючих радикалів в присутності ДДС обумовлена збільшенням витоку інтермедіатів радикальної природи з активного центру ферменту, внаслідок певних конформаційних перебудов молекули 5-ЛО при взаємодії з алостеричним ефектором.

Визначення впливу додецилсульфату натрію на термодинамічні параметри термоінактивації 5-ліпоксигенази

Термоінкубацію 5-ЛО проводили у натрій-фосфатному буферному розчині (0,1 М; рН 6,3) та за умов міцелярної системи, створеної Lubrol PX. Нахил кривих у кооординатах: логарифм залишкової активності ферменту від часу дозволяє обрахувати константу швидкості термоінактивації першого порядку (k₁) (табл. 2). Найнижчими значеннями k₁ харатеризується термоінкубація ферменту за умов міцелярного розчину у натрій-фосфатному буфері (0,1 М, рН 6,3). При інкубації 5-ЛО у присутності 0,1 мМ ДДС як за умов міцелярної системи, так і у буферному розчині, значення констант швидкості термоінактивації збільшуються.

Таблиця 2 Значення констант швидкості термоінактивації (k₁) та енергії активації термоінактивації (E_a) 5-ліпоксигенази (М±m, де n=3-4)

Енергію активації термоінактивації (Е_а) 5-ЛО розраховано згідно рівняння Арреніуса. Найнижчим значенням E_a характеризується термоінкубація ферменту у буферному розчині. Інкубація 5-ЛО в міцелярній системі приводить до збільшення E_a ферменту у 1,9 рази. Термоінкубація 5-ЛО у присутності 0,1 мМ ДДС викликає збільшення E_a у 2,6 та 1,9 рази у буферному розчині та за умов міцелярної системи, відповідно.

Це свідчить про певні конформаційні перебудови молекули ферменту при взаємодії з алостеричним ефектором та поверхнею міцел. Базуючись на дослідженнях впливу низьких концентрацій ДДС на структуру білків [Otzen D.E., 2002] можна припустити, що дана сполука викликає перебудову нативної структури, направлену на збільшення б-спіральних ділянок за рахунок зменшення частки в-складчастої паралельної та антипаралельної структур. Такі конформаційні перебудови збільшують рухливість молекули та можуть сприяти витоку радикальних інтермедіатів з активного центру ферменту.

Результати проведених досліджень свідчать, що взаємодія 5-ЛО з алостеричним ефектором впливає на термодинамічні параметри термоінактивації ферменту.

Механізм впливу фосфатидилхоліну та фосфатидилінозиту на реакцію окиснення лінолевої кислоти за каталітичної дії 5-ліпоксигенази

Транслокація ліпоксигенази з цитозолю на поверхню мембранних структур є необхідною передумовою каталізу і суттєвою ланкою в системі регуляції активності ферменту. Першорядну роль у забезпеченні взаємодії ферменту з поверхнею мембранних структур мають гідрофобні зв'язки між залишками ліпофільних амінокислот N-кінцевого домену ліпоксигеназ та ліпідною складовою мембрани.

Рис. Залежність стаціонарної швидкості (Vst) окиснення ЛК, що каталізується 5-ЛО (препарат ІІ) від концентрації субстрату (1); в присутності 0,065 мг/мл ФХ (2); 0,0375 мг/мл ФІ (3); 0,075 мг/мл ФІ (4)

Поширені фосфоліпіди (ФЛ) - фосфатидилхолін (ФХ) та фосфатидилінозит (ФІ) за умов міцелярної системи зменшують або збільшують Vst окиснення ЛК у присутності 5-ЛО, відповідно [Бутович И.А. и др., 1992]. З метою визначення механізму дії даних ФЛ отримано залежності Vst окиснення ЛК, що каталізується

5-ЛО від концентрації субстрату у присутності ФХ та ФІ. Залежність V_st ферментативного окиснення від концентрації ЛК має S-подібну форму (рис, крива 1), що свідчить про позитивну кооперативність ферменту до субстрату. В присутності ФХ (рис. крива 2) змінюється форма субстратної кривої та зменшується V_st.

Аналогічні зміни форми субстратної залежності спостерігаються і у присутності ФІ (рис. криві 3, 4); який на відміну від ФХ, прискорює утворення продукту реакції. Кінетичні константи даних реакцій наведені у табл. 3. Згідно значення коефіцієнту Хілла, 5-ЛО здатна одночасно приєднувати до 4-х молекул ЛК. За дії ФХ та ФІ відбувається зменшення кількості молекул субстрату, приєднаних до ферменту, що обумовлено заміною ЛК на ФЛ в регуляторному центрі ЛО; зменшення значення коефіцієнту Хілла корелює із збільшенням концентрації ФІ.

Таблиця 3 Кінетичні константи 5-ліпоксигеназного окиснення лінолевої кислоти у присутності фосфатидилхоліну та фосфатидилінозиту

ФЛ впливають на активність 5-ЛО за загальним алостеричним механізмом, але різнонаправленно змінюють значення V_max, зменшуючи та збільшуючи її у випадку ФХ та ФІ, відповідно. Очевидно, заряд молекули ФЛ може мати суттєве значення в протонозалежних стадіях каталітичного циклу 5-ЛО, що обумовлює різнонаправлений вплив ФХ та ФІ на максимальну швидкість реакції.

Таким чином, за умов модельної системи показано, що вплив алостеричних ефекторів на активність 5-ЛО може здійснюватись за декількома напрямками, які включають як забезпечення сорбції ферменту на поверхню мембрани, так і безпосередній вплив на каталітичний цикл та функціонування ферменту.

Висновки

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у встановленні особливостей функціонування 5-ліпоксигенази та значенні алостеричних ефекторів в ліпоксигеназному каталізі. В результаті роботи обґрунтовано використання ліофільних нітроксильних сполук у вивченні вільнорадикальних процесів, що супроводжують 5-ліпоксигеназний каталіз та визначено особливості механізму дії ферменту і участь алостеричних ефекторів у функціонуванні 5-ЛО.

1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилові естери гідрофобних кислот знижують швидкість окиснення лінолевої кислоти або лінолевого спирту, що каталізуються 5-ЛО. На підставі кінетичних досліджень запропоновано механізм дії 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних кислот, який полягає в перехопленні нітроксильними сполуками інтермедіатів радикальної природи, що утворюються під час каталітичного циклу, та не передбачає безпосередньої взаємодії нітроксильних сполук з ферментом.

Ступінь інгібування ферментативного окислення 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидиниловими естерами гідрофобних кислот не залежить від хімічної будови ліпофільного замісника і визначається хімічною природою субстрату реакції та присутністю алостеричного ефектора.

Взаємодія 5-ЛО з алостеричним ефектором - додецилсульфатом натрію приводить до збільшення кількості короткоіснуючих вільних радикалів під час каталітичного циклу. Висунуто припущення, що алостеричний ефектор викликає передчасну дисоціацію фермент-субстратного комплексу та виток радикальних інтермедіатів з активного центру ферменту, що дозволяє використовувати систему 5-ліпоксигеназного каталізу у присутності додецилсульфату натрію за умов міцелярної системи як модель перекисного окиснення ліпідів для скрінінгу потенційних інгібіторів.

Алостеричний ефектор - додецилсульфат натрію змінює термодинамічні параметри термоінактивації 5-ЛО та збільшує енергію активації термоінактивації ферменту.

Фосфатидилінозит та фосфатидилхолін при ферментативному окисненні лінолевої кислоти за умов міцелярної системи заміщують молекули субстрата, зв'язані з ферментом, що передбачає алостеричний механізм регуляції активності 5-ліпоксигенази цими фосфоліпідами.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Харченко О. В., Кулініченко (Харитоненко) Г. І., Бутович І. А. Кінетичні механізми окислення лінолевої кислоти 5-ліпоксигеназою із Solanum tuberosum L. // Укр. біохім. журн. - 1999. - Т. 17, № 4. - С. 40-44.

2. Вовк А. И., Харченко О. В., Харитоненко А. И., Кухарь В. П., Бабий Л. В., Казачков М. Г., Мельник А. К., Хильчевский А. Н. Гидрофобные нитроксильные радикалы - ингибиторы окисления линолевого спирта 5-липоксигеназой // Биоорг. химия. - 2004. - Т. 30, № 4. - С. 436-440.

3. Харченко О. В., Вовк А. И., Харитоненко А. И., Кухарь В. П., Бабий Л. В., Казачков М. Г., Мельник А. К., Хильчевский А. Н. Ингибирующие свойства стабильных нитроксильных радикалов в реакциях окисления линолевой кислоты и линолевого спирта, катализируемых 5-липоксигеназой // Укр. біохім. журн. - 2005. - Т. 77, № 1. - С. 82-87.

4. Вовк А. И., Мищенко И. Н., Харченко О. В., Бугас Р. В., Харитоненко А. И., Бабий Л. В., Самусь Н. В., Канивец Н. П., Мельник А. К. Влияние липофильных тиазолиевых солей на фотофосфорилирование в хлоропластах гороха. // Физиол. и биохим. культ. раст. - 2005. - Т. 37, № 2. - С. 106-116.

5. Харитоненко Г. І., Харченко О. В. Фосфатидилхолін та фосфатидилінозит - алостеричні регулятори 5-ліпоксигенази з бульб картоплі // Біополімери і клітина. - 2008. - Т. 24, № 3. - С. 254-259.

6. Харитоненко Г.І., Скатерна Т.Д., Мельник А.К., Бабий Л.В., Харченко О.В. Дослідження взаємодії 5-ліпоксигенази з алостеричним ефектором - додецилсульфатом натрію // Укр. біохім. журн. - 2008. - Т. 80, № 3. - С. 31-39.

7. Babenko V., Butovich I., Kazachkov M., Kulinichenko (Kharitonenko) A., Paliy T. Phospholipids as possible 5-lipoxygenase regulator on membrane level. // Abstr. of 24^th Meeting FEBS, Barcelona, Spain. -1996. - P. 210.

8. Вовк А.І., Міщенко І.В., Харченко О.В., Бугас Р.В., Бабій Л.В., Харитоненко Г.І. Вплив ліпофільних тіазолієвих катіонів на фотофосфорилювання в хлоропластах гороху // XX Українська конференція з органічної хімії. Тези доповідей. - Одеса, 2004. - С. 395.

9. Харитоненко A. И., Харченко О. В. Роль фосфатидилинозита и фосфатидилхолина в липоксигеназном катализе // Межд. конф. „Современная физиология растений: от молекул до екосистем”. Материалы докладов. - Сыктывкар, 2007. - С. 152-153.

10. Харченко О. В., Казачков М. Г., Скатерная Т. Д., Харитоненко A. И., Копич В. Н. Кинетические особенности ферментативного окисления линолевого спирта в присутствии 5-липоксигенази клубней картофеля (Solanum tuberosum L.) // Межд. конф. „Современная физиология растений: от молекул до екосистем”. Материалы докладов. - Сыктывкар, 2007. - С. 153-154.

11. Kharitonenko G.I., Kharchenko O. V. Phoshatidylcholine and phosphatidilinositol are allosteric regulators of 5-lipoxygenase from potato tuber // Abstr. of 2nd International Symposium Plant Growth Substances: Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture, Kyiv, Ukraine. - 2007. - P. 85.

Анотація

Харитоненко Г.І. Встановлення особливостей функціонування

5-ліпоксигенази з використанням ліпофільних нітроксильних сполук. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. - Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2008.

Обґрунтовано використання 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидинилових естерів гідрофобних кислот для вивчення особливостей функціонування ліпоксигеназ. 1-Оксил-2,2,6,6-тетраметилпіперидиниловi естери гідрофобних кислот в міцелярній системі зменшують швидкість окиснення лінолевої кислоти або лінолевого спирту, що каталізуються 5-ліпоксигеназою. Запропоновано механізм інгібування, який включає взаємодію ліофільних нітроксильних сполук з радикальними інтермедіатами, що утворюються в каталітичному циклі та блокування подальших радикальних перетворень. Показано, що ефективність інгібування визначається природою субстрату реакції та присутністю алостеричного ефектора - додецилсульфату натрію. Висунуто припущення, що взаємодія 5-ліпоксигенази з додецилсульфатом натрію посилює дисоціацію радикальних інтермедіатів з активного центру ферменту.

Визначено термодинамічні параметри термоінактивації 5-ліпоксигенази. Показано, що в присутності додецилсульфату натрію константи швидкості термоінактивації та енергія активації термоінактивації ферменту збільшуються.

Встановлено, що фосфатидилхолін та фосфатидилінозит заміщують молекули субстрату в центрах зв'язування ферменту. Ці результати свідчать про алостеричний механізм регуляції активності 5-ліпоксигенази цими фосфоліпідами.

Аннотация

Харитоненко А. И. Установление особенностей функционирования 5-липоксигеназы с использованием липофильных нитроксильных соединений. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. - Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертация посвящена установлению особенностей функционирования 5-липоксигеназы и значения аллостерических эффекторов в липоксигеназном катализе.

Согласно результатам ферментативной кинетики и ЕПР-исследований обосновано применение 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперидиниловых эфиров гидрофобных карбоновых кислот для изучения свободнорадикальных процессов, которые сопровождают липоксигеназный катализ.

Методом ЕПР-спектроскопии показано связывание 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперидиниловых эфиров гидрофобных кислот с поверхностью неионных мицелл (Lubrol), проявляющееся в увеличении времени корреляции вращательной диффузии этих соединений в водных мицеллярных растворах. В процессе липоксигеназного катализа отмечено гашение ЕПР-сигнала нитроксильных соединений, обусловленное взаимодействием нитроксильной группы с короткоживущими свободными радикалами. Показано, что динамика ЕПР-сигнала зависит от химической природы субстрата реакции и наличия гидрофобного заместителя в молекуле нитроксильных содинений. Химическое строение липофильного заместителя не влияет на связывание поверхностью неионных мицелл и на динамику ЕПР-сигнала в процессе липоксигеназного катлиза.

Установлено, что 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперидиниловые эфиры гидрофобных карбоновых кислот в мицеллярной системе снижают скорость образования продуктов в реакциях окисления линолевой кислоты или линолевого спирта, катализируемых 5-липоксигеназой из клубней картофеля. Липофильные нитроксильные соединения не конкурируют с субстратом за связывание в активном и регуляторном центрах фермента; не влияют на ионогенные групы активного центра фермента и не изменяют потенциала поверхности мицелл. Предложен механизм действия 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперидиниловых эфиров гидрофобных кислот, заключающийся в перехватывании этими соединениями интермедиатов радикальной природы, образующихся во время липоксигеназного катализа и блокировании свободнорадикальных превращений. С использованием 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперидиниловых эфиров гидрофобных кислот проведено сравнительное исследование окисления линолевой кислоты и линолевого спирта, катализируемое 5-липоксигеназой. Обнаружено, что степень ингибирования 1-оксил-2,2,6,6-тетраметилпиперидиниловыми эфирами гидрофобных кислот липоксигеназного катализа зависит от химической природы субстрата реакции и присутствия аллостерического эффектора - додецилсульфата натрия (ДДС); химическое строение липофильного заместителя в молекуле нитроксильного соединения не влияет на эффективность ингибирования. Наибольшее снижение скорости реакции в присутствии нитроксильных соединений наблюдается при ферментативном окислении линолевого спирта, что свидетельствует о высокой интенсивности свободнорадикальных процессов, сопровождающих превращения этого субстрата. Степень ингибирования коррелирует с колличеством ДДС, увеличиваясь с ростом концентрации аллостерического эффектора. Выдвинуто предположение, что взаимодействие 5-липоксигеназы с ДДС по аллостерическому механизму стимулирует преждевременную диссоциацию фермент-субстратного комплекса, что приводит к утечке радикальных интермедиатов, инициирующих свободнорадикальные превращения.

Исследована термоинактивация 5-липоксигеназы в мицеллярной системе и буферном растворе и определены термодинамические параметры. Обнаружено, что в присутствии ДДС энергия активации термоинактивации фермента увеличивается.

Исследована кинетика окисления линолевой кислоты в мицеллярной системе, катализируемого 5-липоксигеназой в присутствии фосфатидилхолина и фосфатидилинозита. Обнаружено, что данные фосфолипиды изменяют форму субстратной зависимости фермента и максимальную скорость реакции. Согласно значениям кинетических констант, фосфатидилхолин и фосфатидилинозит соответственно, уменьшает или увеличивает максимальную скорость реакции, замещая молекулы субстрата в регуляторном центре фермента (коэффициент Хилла уменьшается от 4-х до 1-го). Полученные результаты свидетельствует об аллостерическом механизме действия этих фосфолипидов на активность 5-липоксигеназы из клубней картофеля.

Annotation

Kharitonenko G.I. Determination of features in functioning of 5 lipoxygenase using lipophilic nitroxyl compounds. - Manuscript.

Dissertation for the candidate of biological science degree in speciality 02.00.10 - Bioorganic chemistry. Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.

Application of 1-oxyl-2,2,6,6-tetramethylpiperidinyl esters of hydrophobic acids for study of features in functioning of lipoxygenases was based. 1-Oxyl-2,2,6,6-tetramethylpiperidinyl esters of hydrophobic acids caused decrease the velocity of linoleyl alcohol and linoleic acid oxidation in micellar system catalyzed by 5-lipoxygenase. The inhibition mechanism was proposed; it involves the interaction of lipophilic nitroxyl compounds with radical intermediate formed in catalytic process and the free radical transformation blocking. It is demonstrated that the inhibition effect of lipophilic nitroxyl compounds is determined by the substrate nature and presence of allosteric effector - sodium dodecyl sulfate. It is suggested that interaction of 5-lipoxygenase and sodium dodecyl sulfate intensifies the dissociation of radical intermediates from the active site of enzyme.

Thermodynamic parameters for thermoinactivation of 5-lipoxygenase was determined. It was show that thermoinactivation rate constants and activation energy of enzyme thermoinactivation were increased in the presence of sodium dodecyl sulfate.

It was found that phosphatidylcholine and phosphatidylinositol binding to 5-lipoxygenase results in the replacement of the substrate from the enzyme. It is imply the allosteric regulation of the 5-lipoxygenase activity by these phospholipids.

Размещено на Allbest.ru