Нові флуоровмісні аналоги природних амінокислот як F ЯМР мітки для дослідження пептидів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

02.00.03 - органічна хімія

НОВІ ФЛУОРОВМІСНІ АНАЛОГИ ПРИРОДНИХ АМІНОКИСЛОТ ЯК ¹⁹F-ЯМР МІТКИ ДЛЯ ДОСЛІДЖЕННЯ ПЕПТИДІВ

МИХАЙЛЮК ПАВЛО КОСТЯНТИНОВИЧ

Київ - 2008

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

мітка пептид твердотільний мембранопроникний

Актуальність теми. Відомо, що пептиди є одним з найважливіших класів природних сполук, функції яких варіюються в широких межах (каталітична, мембранопроникна, протимікробна, фузогенна, сигнальна, імуномодуляторна тощо). Отже, вивчення будови та механізмів дії цих сполук є актуальною проблемою. Одним з відомих підходів до визначення будови та динамічної поведінки мембраноактивних пептидів є твердотільна ¹⁹F-ЯМР спектроскопія, яка базується на використанні флуоровмісних амінокислот як ¹⁹F-ЯМР міток. Слід, однак, зазначити, що використання цього методу є обмеженим. По-перше, на даний момент відомо недостатньо ¹⁹F-міток, які не в змозі забезпечити заміну всіх протеїногенних амінокислот у пептидах. До того ж ці мітки мають недоліки - вони не відповідають тим критеріям, які висуваються до “гарних” ¹⁹F-міток. Таким чином, очевидним є не тільки необхідність покращення вже відомих, але і створення нових міток для заміни певних природних амінокислот у пептидах. Нестача ефективних ¹⁹F-міток обумовлена передусім відсутністю ретельного та обґрунтованого дизайну цільових структур, що має передувати хімічному синтезу. Незначна кількість загальних методів отримання конформаційно утруднених CF₃-заміщених аналогів природних амінокислот є ще однією перепоною для розвитку цього напрямку досліжень. Розробка таких підходів безперечно є актуальною проблемою, при вирішенні якої потрібно враховувати стереоселективність запропонованих підходів, оскільки більшість природних амінокислот є хіральними сполуками.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в рамках договорів 06БФ037-04 „Розробка методів енантіоселективного синтезу конформаційно утруднених аналогів проліну та глутамінової кислоти виходячи з ахіральних похідних кетонів” та DEU/1054096 про партнерське наукове співробітництво між Київським національним університетом імені Тараса Шевченка (Київ, Україна) та Університетом Карлсруе (Карлсруе, Німеччина) за підтримки фонду Олександра фон Гумбольдта.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи є одержання нових ¹⁹F-ЯМР міток для заміни Ala, Leu, Ile, Val, Met та Pro в пептидах та дослідження з їх допомогою мембранопроникного пептиду SAP методом твердотільного ЯМР.

Для досягнення поставленої мети було необхідно розв'язати наступні задачі:

дизайн нових ¹⁹F-ЯМР міток - СF₃-заміщених конформаційно утруднених аналогів Ala, Leu, Ile, Val, Met та Pro;

розробка методів одержання цільових структур;

практичне тестування синтезованих ¹⁹F-ЯМР міток;

визначення структури пептиду SAP у біологічній мембрані за допомогою синтезованих ¹⁹F-ЯМР міток.

Об'єкт дослідження - конформаційно жорсткі та утруднені CF₃-заміщені аналоги Ala, Leu, Ile, Val, Met та Pro, мембранопроникний пептид SAP.

Предмет дослідження - підходи до синтезу конформаційно утруднених та жорстких аналогів Ala, Leu, Ile, Val, Met та Pro, ¹⁹F-мічених пептидів, їх фізико-хімічні властивості.

Методи дослідження - органічний синтез, ЯМР, ІЧ-спектроскопія, круговий дихроїзм, мас-спектрометрія, елементний аналіз, поляриметрія, рентгеноструктурний аналіз, хроматографія.

Наукова новизна одержаних результатів.

Cинтезовано нову ¹⁹F-ЯМР мітку для заміни залишків Ala, Leu, Ile, Val та Met в пептидах та показано її високу ефективність.

Синтезовано бібліотеку нових ¹⁹F-ЯМР міток - конформаційно утруднених CF₃-заміщених ізомерних аналогів Pro. Один з ізомерів запропоновано як найоптимальніший для заміни проліну в структурних дослідженнях проліновмісних пептидів.

Оптимізовано метод трифлуорометилциклопропанування алкенів за допомогою трифлуорометилдіазометану в присутності металокаталізаторів.

Синтезовано нові CF₃-заміщені аналоги протимікробних пептидів GS та PGLa, вивчено вплив введення атомів флуору на конформаційні та протимікробні властивості цих пептидів.

Оптимізовано методику отримання мембранопроникного пептиду SAP та синтезовано нові аналоги SAP, до складу яких входять попередньо отримані трифлуорометилвмісні амінокислоти.

Вивчено конформаційні властивості флуоромічених аналогів SAP, що дозволило встановити структуру SAP в модельній біомембрані.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено новий підхід до синтезу трифлуорометилциклопропілвмісних амінокислот, які використовуються для вивчення структури мембраноактивних пептидів в ліпідному оточенні. Цей підхід може бути використаний в лабораторній практиці для отримання інших флуоровмісних амінокислот, а також різноманітних класів флуоровмісних сполук.

Одержано ряд нових конформаційно утруднених та жорстких трифлуорометилзаміщених амінокислот та продемонстровано їх використання як ¹⁹F-ЯМР міток. Ці мітки є досить перспективними для структурних досліджень пептидів, оскільки їх властивості оптимізовані саме для цієї мети.

Встановлено структуру мембранопроникного пептиду SAP в модельній біомембрані, що є важливою інформацією для повного розуміння механізму дії цього пептиду.

Особистий внесок здобувача. Систематизацію літературних даних, основний обсяг експериментальної роботи, узагальнення та оформлення отриманих результатів, аналіз результатів спектральних досліджень та встановлення будови одержаних сполук було проведено здобувачем особисто. Постановка завдання дослідження та обговорення результатів проводились з д.б.н. Афоніним С., проф. Ульріх A. та разом з науковим керівником, проф. Комаровим І. В. Синтез частини сполук було проведено разом з Майснер А. та Гвоздовською Н. П. Рентгеноструктурний аналіз здійснено у співробітництві з групами д.х.н. Шишкіна О. В. та д.х.н. Чернеги О. М.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації було апробовано на національних та міжнародних конференціях: VI Всеукраїнській конференції «Сучасні проблеми хімії» (Київ, 2005 р.), 8-й міжнародній конференції з органічної хімії (Тулуза, Франція 2005 р.), 6-му та 8-му Тетраедронівських симпозіумах „Challenges in organic and bioorganic chemistry” (Бордо, Франція 2005 р. та Берлін, Німеччина 2007 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті у провідних міжнародних фахових журналах та 5 тез доповідей на конференціях.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 158 сторінках і складається зі вступу, п'яти розділів, висновків, переліку використаних джерел (208 найменувань) та додатку; містить 66 рисунків та 10 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність роботи, сформульовано мету та задачі дослідження, відображено практичне значення отриманих результатів.

Перший розділ присвячено аналізу наукової літератури за темою дисертаційної роботи. Розглянуто поняття „біомембрана“ та „мембраноактивні пептиди” з акцентом на проблему структурного аналізу мембраноактивних пептидів. Обговорено використання твердотільної ¹⁹F-ЯМР спектроскопії в структурних дослідженнях пептидів. Проведено детальну оцінку відомих ¹⁹F-ЯМР міток та проаналізовано їх недоліки. Зроблено огляд відомих моно-трифлуорометилвмісних аналогів Val, Leu, Ile, Ala, Met та Pro та оцінено можливість їх використання як ¹⁹F-ЯМР міток.

У другому розділі описано отримання нової конформаційно жорсткої трифлуорометилзаміщеної б-амінокислоти - ¹⁹F-ЯМР мітки для заміни неполярних ациклічних б-амінокислот у пептидах.

Дизайн. Принцип дизайну цільової сполуки базувався на аналізі недоліків та переваг вже відомих ¹⁹F-ЯМР міток 1-3 з урахуванням критеріїв, які висуваються до ідеальної ¹⁹F-мітки. По-перше, СF₃-група має бути чітко фіксованою в просторі відносно амінокарбоксилатної частини для однозначної інтерпретації ¹⁹F-ЯМР даних. По-друге, ¹⁹F-мітка повинна бути структурно подібною до амінокислот, які будуть нею заміщуватися, щоб не змінювати характеристики пептидів, що досліджуються. Також СF₃_заміщена амінокислота має бути хімічно стійкою, несхильною до рацемізації та достатньо реакційноздатною для введення в пептиди стандартними методами пептидного синтезу. Навіть в оптимізованих умовах Fmoc-твердофазного синтезу відомі ¹⁹F-мітки рацемізувалися (1), елімінували HF (2) або мали низьку реакційну здатність (3).

В процесі пошуку конформаційно жорсткої б-амінокислоти, яка б задовольняла усім вищенаведеним вимогам, вибір було зупинено на похідних біцикло[1.1.1]пентану. При розміщенні CF₃-групи та амінокарбоксилатної частини у вузлових положеннях цього скелету утворюється цільова ¹⁹F-мітка 4. Зв'язки C_б-С_в та C-CF₃ в 4 є колінеарними, і бічний ланцюг може обертатися тільки навколо них, що, в свою чергу, фіксує в просторі положення CF₃-групи відносно амінокарбоксилатної частини. На відміну від 1, CF₃-група та С_б в 4 розділені насиченим каркасом. Це повинно зменшити здатність 4 до рацемізації, оскільки передача електронних ефектів вздовж біцикло[1.1.1]пентанового каркасу є меншою, ніж через ароматичне кільце. Розклад з виділенням HF (як у випадку 2) чи низька реакційна здатність внаслідок стеричних перешкод (як у випадку 3) не повинні спостерігатися для сполуки 4 в процесі твердофазного пептидного синтезу.

Синтез. Синтез 4 було розпочато з дихлороізобутилену 5, з якого в три стадії за літературними методиками було отримано йодид 6.

Генерування карбаніону з 6 за допомогою t_BuLi та наступна реакція з метилформіатом дозволили отримати альдегід 7, разом з яким також утворювалися значні кількості напівацеталю 8. Суміш 7 та 8 була введена в реакцію Штрекера з (R)-б-фенілгліцинолом як хіральним індуктором, що дозволило отримати ізомери 9 та 10. Утворені сполуки були розділені хроматографічно, а їх конфігурація була встановлена за допомогою рентгеноструктурного дослідження ізомеру 10. Хоча співвідношення сполук 9:10 в реакційній суміші складало 1:1, ізомеризація чистого продукту 9 в MeOH приводила до формування суміші похідних 9:10 у співвідношенні 1:4, яка знову була розділена хроматографічно. Повторення циклу ізомеризація-розділення дозволило отримати 10 з виходом 90%. Кінцева амінокислота 4 була отримана окисненням 10 та наступним гідролізом інтермедіату 11 в кислому середовищі.

Підтвердження оптичної чистоти 4. Оскільки гідроліз сполуки 11 проводився в досить жорстких умовах (2 год, 110 єС, 20% HCl), то оптичну чистоту сполуки 4 необхідно було перевірити. Для цього було використано лантаноїдний зсуваючий реагент 12. Потрібні для аналізу енантіомерні метилові естери 13, 14 було отримано з відповідних амінокислот 4, 15 за стандартниии методиками (сполука 15 була синтезована з похідної 9).

Результати експериментів, проведених з естерами 13, 14 наведені в табл. 1. Вони є прямим доказом того, що естер 13, а отже і амінокислота 4, є індивідуальними енантіомерами.

Третій розділ присвячено отриманню бібліотеки конформаційно утруднених ¹⁹F-ЯМР міток для заміни проліну в пептидах.

Дизайн. На момент виконання даної роботи в літературі не були відомі флуоровмісні амінокислоти, які можна було б використовувати як ¹⁹F-мітки для заміни проліну в пептидах з метою дослідження останніх за допомогою твердотільного ¹⁹F-ЯМР. Тому нами було запропоновано бібліотеку CF₃-заміщених конформаційно утруднених аналогів проліну 16-18. В сполуках 16-17 конформаційна рухливість СF₃-групи є утрудненою завдяки наявності жорсткого циклопропанового циклу. Амінокислота 18 також містить СF₃_групу, яка чітко зафіксована в просторі по відношенню до амінокарбоксилатної частини, але вже завдяки безпосередньому розташуванню при С_б. Це, в свою чергу, може зменшити реакційну здатність сполуки 18 та впливати на конформацію мічених пептидів.

Трифлуорометилциклопропанування алкенів. Для синтезу сполук 16 та 17 був спеціально розроблений метод побудови CF₃-заміщених циклопропанових похідних, виходячи з алкенів. Дане перетворення планувалося провести за допомогою CF₃CHN₂ в присутності металокаталіза-торів. В якості модельних субстратів були вибрані сполуки 19-23 з різною електронною природою подвійного С=С зв'язку.

Циклопропанування електронозбагачених алкенів 19 та 20 відбувалось м'яко навіть при використанні гетерогенного каталізатора CuCl, хоча в присутності Rh₂(ОАc)₄ швидкість реакції була помітно вищою. Кінцеві сполуки ()24(а,б) та ()25(а,б) були отримані з виходами 82% та 91% відповідно, причому в кожному випадку транс- (24а, 25а) та цис- (24б, 25б) ізомери були розділені за допомогою колонкової хроматографії.

У випадку алкену 21 реакція відбувалась тільки в присутності Rh₂(ОАc)₄, а використання CuCl не приносило бажаних результатів. Очікувані циклопропани ()26(а,б) були отримани з виходом 63%. Слід зауважити, що висока леткість продуктів реакції завадила провести їх препаративне хроматографічне розділення, хоча ТШХ показувала наявність двох сполук з різними R_f.

У випадку циклогексену 22 жоден з каталізаторів PdCl₂, CuCl, Cu(acac)₂, Cu(CH(CF₃CO)₂)₂, Cu(CF₃COCHCOCH₃)₂, Rh₂(ОАc)₄ не приводив до утворення цільових продуктів. При використанні CuOTf як каталізатора, цільові CF₃_циклопропани ()27(а,б) все ж таки були отримані, хоча і з досить помірним виходом (40%). Як і у випадку сполук ()26(а,б), висока леткість ізомерів ()27(а,б) завадила їх препаративному хроматографічному розділенню.

Для демонстрації можливостей даної стратегії нами було синтезовано обидва діастереомери трифлуороноркоронамової кислоти у вигляді рацематів. Норкоронамова кислота 28 є природною сполукою, що входить до складу токсину норкоротину, виділеного з Pseudomonas syringae. Трифлуорометилциклопропанування відповідного ненасиченого прекурсору 23 в присутності Rh₂(ОАc)₄ в СН₂Сl₂ приводило до утворення очікуваних продуктів ()29(а,б), які були легко розділені хроматографічно.

Цікаво, що при використанні CuCl як каталізатора основним продуктом реакції несподівано виявилась сполука 30.

Гідрохлорид транс-трифлуороноркоронамової кислоти ()31а був кількісно отриманий кислотним гідролізом ()29а. цис-Трифлуороноркоронамову кислоту ()31б було отримано з ()29б за аналогічною методикою.

3,4- та 4,5-(Трифлуорометилметано)проліни. Після розробки методу трифлуорометилциклопропанування алкенів даний підхід було застосовано для синтезу амінокислот 16 та 17.

Перетворення алкену 32 на відповідні похідні циклопропану виявилось досить чутливим до природи каталізатора. Так, в присутності CuCl або Rh₂(ОАc)₄ реакція відбувалась досить повільно і приводила до утворення виключно продукту заміщення Boc-групи на CF₃CH₂OCO-залишок (33).

Використання CuOTf як каталізатора підвищувало активність C=С зв'язку, і циклопропанові похідні 34(а,б) були отримані. Низький вихід цільових сполук (15%) пов'язаний, перш за все, з утворенням неідентифікованих побічних продуктів.

Кислотний гідроліз 34а та 34б приводив до утворення кінцевих амінокислот 16а, 16б, які було виділено з реакційної суміші за допомогою катіонообмінної хроматографії на смолі КУ-2.

Конфігурація стереоцентрів в 16(а,б) була доведена за допомогою аналізу констант спін-спінової взаємодії в ¹Н-ЯМР спектрах та експериментів ЯЕО.

На відміну від алкену 32 в ізомері 35 подвійний C=C зв'язок виявився більш реакційноздатним по відношенню до CF₃CHN₂ порівняно з Boc-групою. Це обумовлено безпосередньою близкістю N_Boc фрагмента, який активує C=C зв'язок в сполуці 35. Цікаво, що найкращий вихід (66%) цільових циклопропанів 36(а,б,в) був отриманий при використанні гетерогенного каталізатора CuCl, в той час як у присутності Rh₂(ОАc)₄ та CuOTf спостерігалось утворення неідентифікованих побічних продуктів.

Слід зауважити, що при використанні надлишку CF₃CHN₂ утворювалась складна суміш, з якої, окрім вищезгаданих продуктів 36(а,б,в), була також виділена сполука 36г, будова якої була доведена рентгеноструктурним дослідженням (рис. 1).

Наступні стадії синтезу були стандартними - основний гідроліз СO₂Me-груп та наступне зняття Boc-груп (TFA/CH₂Cl₂) приводили до утворення цільових амінокислот 17(а,б,в)*TFA.

Конфігурація стереоцентрів у амінокислотах 17(а,б,в)*TFA була доведена за допомогою аналізу констант спін-спінової взаємодії в ¹Н-ЯМР спектрах, експериментів ЯЕО та рентгеноструктурного дослідження ізомеру 36б.

Цікаво, що в той час як сполуку 17а*TFA вдалося перевести в 17а за допомогою катіонообмінної хроматографії на смолі КУ-2, ізомери 17(б,в)*TFA за ідентичних умов зазнавали розкриття циклопропанового циклу.

2-Трифлуорометилпролін. Для синтезу амінокислоти 18 було випробувано два синтетичні підходи.

1. Даний підхід базувався на відомій реакції приєднання СF₃SiMe₃ до C=N зв'язку в присутності флуорид-аніонів. Вихідна сполука 37 була отримана з L_проліну в дві стадії за описаними в літературі методиками. Взаємодія 37 з СF₃SiMe₃, однак, неочікувано відбувалася за участю CО₂Me-групи, і замість цільового продукту 38 була отримана суміш сполук 39 та 40.

2. Цей підхід базувався на відомій трансформації г_галогенокетонів у відповідні циклічні амінонітрили взаємодією зі сполукою 41. Вихідний кетон 42 був синтезований з г-бутиролактону в дві стадії за модифікованими літературними методиками. Однак, ключова стадія синтезу - перетворення кетону 42 у 43(а,б) - відбувалася з дуже низьким виходом (~1%). Нами було зроблено припущення, що це є наслідком високої реакційної здатності карбонільної групи в 42, і тому остання реагує з будь-якими нуклеофілами, наявними у реакційній суміші. Дана гіпотеза повністю підтвердилась виділенням сполуки 44.

Вибір оптимальної ¹⁹F-ЯМР мітки для заміни Pro. Серед усіх синтезованих амінокислот 16(а,б) та 17(а,б,в)*TFA в якості ¹⁹F-мітки для подальших досліджень було обрано сполуку 17а.

Такий вибір обумовлений тим, що амінокислоти 16(а,б) не є вдалими кандидатами, враховуючи занадто низький вихід їх синтезу. Ізомери 17(б,в)*TFA також не підходили для використання їх як міток, бо вони розкладалися в процесі очищення на катіонообмінній смолі КУ-2, що є ознакою їх низької стабільності в кислому середовищі. Сполука ж 17а була стабільною як в кислотних, так і в основних умовах.

У четвертому розділі описано практичне застосування ¹⁹F-міток 4 та 17а. Спочатку для перевірки придатності мітки 4 в пептидних дослідженнях її було введено в добре вивчені протимікробні пептиди GS та PGLa. Синтезовані аналоги GS та PGLa було проаналізовано за допомогою протимікробних тестів та спектроскопії кругового дихроїзму для дослідження впливу заміщень Val/4, Leu/4, Ile/4, Ala/4 в обраних пептидах на їх біологічну активність та структуру. Після того, як було показано, що сполука 4 є дійсно ефективною міткою, вона разом із амінокислотою 17а була використана для визначення структури мембранопроникного пептиду SAP в модельній мембрані.

Протимікробний пептид GS є природною сполукою, яку вперше було виділено з Bacilus Brevis.

За допомогою твердофазного пептидного синтезу нами був одержаний СF₃_мічений аналог GS (45), в якому обидва залишки Leu замінені на ¹⁹F-мітку 4.

Синтез пептиду 45 було розпочато на 2-хлоротритильній смолі, виходячи з Fmoc-^DPhe. Після зняття Fmoc-групи з ^DPhe, ¹⁹F-мітку 4 було введено в пептид за допомогою Fmoc-похідної 46 та стандартних активаторів TBTU/6Cl-HOBt. Наступні амінокислоти було введено аналогічним чином.

Зняття Fmoc-групи з 47 та “зрізання” зі смоли дало лінійний декапептид 48. Цільова сполука 45 була отримана циклізацією 48 в розчині та наступним зняттям захисних ivDde-груп із залишків орнітину.

Потрібно зауважити, що ¹⁹F-мітка 4 виявилась повністю сумісною зі стандартними методами твердофазного пептидного синтезу.

Конформацію пептидів GS та 45, було порівняно за допомогою кругового дихроїзму. Як видно з рис. 2, спектри кругового дихроїзму GS та 45, майже не відрізняються один від одного, що свідчить про ідентичність конформацій обох пептидів. Очевидним є висновок, що ¹⁹F-мітка 4 не порушує конформацію GS при заміні Leu/4.

Протимікробний пептид PGLa є природною сполукою, яку було знайдено на шкірі жаби Xenopus laevis.

Мічення PGLa залишком амінокислоти 4 було проведено у положеннях 9 (Ile), 10 (Ala), 13 (Ile) та 14 (Ala), а синтез відповідних пептидів 49-52 було здійснено, використовуючи стандартну методику твердофазного пептидного синтезу на смолі „Rink-amide resin”.

PGLa: Gly-Met-Ala-Ser-Lys-Ala-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Lys-Ile-Ala-Lys-Val-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-NH₂

49: Gly-Met-Ala-Ser-Lys-Ala-Gly-Ala- 4 -Ala-Gly-Lys-Ile-Ala-Lys-Val-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-NH₂

50: Gly-Met-Ala-Ser-Lys-Ala-Gly-Ala-Ile - 4 - Gly-Lys-Ile-Ala-Lys-Val-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-NH₂

51: Gly-Met-Ala-Ser-Lys-Ala-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Lys- 4 -Ala-Lys-Val-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-NH₂

52: Gly-Met-Ala-Ser-Lys-Ala-Gly-Ala-Ile-Ala-Gly-Lys-Ile - 4 - Lys-Val-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-NH₂

Амінокислота 4 легко вводилась в пептидну послідовність, використовуючи Fmoc-похідну (46) та стандартні активатори HCTU/HOBt. Введення амінокислот, які слідували за ¹⁹F-міткою 4, також відбувалось без ускладнень.

Для відповіді на питання про те, чи не вплинуло введення ¹⁹F-мітки 4 на конформацію PGLa, були виміряні та порівняні спектри кругового дихроїзму 49-52 та PGLa. Як видно з рис. 3, спектри всіх пептидів є практично однаковими, а це свідчить про те, що ¹⁹F-мітка 4 не порушує конформацію PGLa при заміні Ile/4 та Ala/4.

Рис. 3. Спектри кругового дихроїзму PGLa та 49-52 (30 мM) у воді в присутності міцел натрій-додецилсульфату (5 мM) при 20 °С.

Мембранопроникний пептид SAP є синтетичною сполукою, яку вперше було отримано в 2004 році.

Для дослідження структури SAP були використані ¹⁹F-мітки 4 та 17а. ¹⁹F_мітка 4 була введена в положення 3 (Leu), 7 (Val), 9 (Leu), 13 (Val) та 15 (Leu), а мічення залишком 17а було проведено в 11-му (Pro) положенні SAP.

SAP: Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-Arg-Leu-Pro-Pro -Pro-Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro

53: Val-Arg - 4 - Pro-Pro-Pro-Val-Arg-Leu-Pro-Pro -Pro-Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro

53: Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro - 4 - Arg-Leu-Pro-Pro -Pro-Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro

55: Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-Arg - 4 - Pro-Pro -Pro-Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro

56: Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-Arg-Leu-Pro-17a-Pro-Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro

57: Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-Arg-Leu-Pro-Pro -Pro - 4 - Arg-Leu-Pro-Pro-Pro

58: Val-Arg-Leu-Pro-Pro-Pro-Val-Arg-Leu-Pro-Pro -Pro-Val-Arg - 4 - Pro-Pro-Pro

Синтез CF₃-мічених пептидів 53-58 було проведено на 2-хлоротритильній смолі з використанням стандартних методів твердофазного пептидного синтезу. ¹⁹F-мітка 17а була введена в пептиди у формі Fmoc-похідної 59, а 4 - у формі 46. Ні розкладу, ні рацемізації або пониженої реакційної здатності для 4 та 17а не було помічено.

Для вивчення впливу 4 та 17а на конформацію SAP були зареєстровані і порівняні спектри кругового дихроїзму 53-58 та SAP (рис. 4).

З рис. 4 видно, що ¹⁹F-мітка 4 не порушує PP II конформацію SAP (конформація поліпроліну, тип II), оскільки спектри кругового дихроїзму пептидів 53, 54, 55, 57, 58 та SAP є майже однаковими. Щодо ¹⁹F-мітки 17а, то вона навіть стабілізує конформацію PP II, оскільки при л = 203 та 223 нм крива кругового дихроїзму 56 знаходиться відповідно нижче та вище кривої SAP.

Для визначення структури SAP при зв'язуванні з біомембранами було виміряно твердотільні спектри сполук 53-58 в подвійному ліпідному шарі (DMPC/DMPG = 3/1) (рис. 5).

З рис. 5 видно, що всі пептиди знаходяться в орієнтованому стані, про що свідчить наявність характерних триплетів (диполь-дипольна взаємодія в CF₃-групі). Цікаво, що в спектрах всіх пептидів присутні декілька триплетів, які відповідають різним орієнтаціям молекули в подвійному ліпідному шарі. У кожному випадку, однак, наявний основний триплет, константа диполь-дипольної взаємодії якого була визначена для всіх пептидів. З отриманих даних і була розрахована структура SAP у модельній мембрані. Вона, як і у розчині, також має конформацію PP II. Пептид розташований паралельно поверхні ліпідного шару, причому ліпофільні залишки Val та Leu знаходяться у внутрішній, а гідрофільні залишки Arg на зовнішній стороні поверхні ліпідного шару (рис. 6).

П'ятий розділ є експериментальною частиною дисертаційної роботи, в якій наведено методики синтезу усіх нових сполук, описаних у роботі, а також їх характеристики.

ВИСНОВКИ

Здійснено дизайн, сплановано та проведено синтез нової ¹⁹F-ЯМР мітки - (2S)_2_аміно-2-[3-(трифлуорометил)біцикло[1.1.1]пент-1-ил]етанової кислоти - для заміни валіну, лейцину, ізолейцину, метіоніну та аланіну в пептидах.

Синтезовано бібліотеку нових ¹⁹F-ЯМР міток - конформаційно утруднених 3,4_ та 4,5-(трифлуорометилметано)-пролінів для заміни проліну в пептидах.

Розроблено метод трифлуорометилциклопропанування алкенів за допомогою трифлуорометилдіазометану, який полягає у проведенні реакції в присутності металокаталізаторів.

Синтезовано аналоги протимікробних пептидів GS та PGLa, які мічені залишком (2S)-2-аміно-2-[3-(трифлуорометил)біцикло[1.1.1]пент-1-ил]етанової кислоти. Показано, що вона повністю відповідає критеріям, які висуваються до „гарної” ¹⁹F-ЯМР мітки.

Синтезовано аналоги мембранопроникного пептиду SAP, мічені в різних положеннях залишками (2S)-2-аміно-2-[3-(трифлуорометил)біцикло[1.1.1]пент-1-ил]етанової та (1R,3S,5R,6R)-6-(трифлуорометил)-2-азабіцикло[3.1.0]гексан-3-карбонової кислот.

Показано, що (1R,3S,5R,6R)-6-(трифлуорометил)-2-азабіцикло[3.1.0]гексан-3-карбонова кислота стабілізує конформацію поліпроліну II типу.

Встановлено структуру мембранопроникного пептиду SAP в модельній біомембрані за допомогою твердотільного ¹⁹F-ЯМР з використанням отриманих міток, а саме показано, що SAP існує у конформації поліпроліну II типу.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Mykhailiuk P. K. Conformationally rigid trifluoromethyl-substituted б-amino acid designed for peptide structure analysis by solid state ¹⁹F-NMR / P. K. Mykhailiuk, S. Afonin, A. N. Chernega, E. B. Rusanov, M. Platonov, G. Dubinina, M. Berditsch, A. S. Ulrich, I. V. Komarov // Angew. Chem. - 2006. - Vol. 118. - P. 5787-5789; Angew. Chem. Int. Ed. - 2006. - Vol. 45. - P. 5659-5661.

Afonin S. Evaluating the use of CF₃-bicyclopentylglycine as a label for ¹⁹F-NMR structure analysis of membrane-bound peptides / S. Afonin, P. K. Mykhailiuk, I. V. Komarov, A. S. Ulrich // J. Pept. Sci. - 2007. - Vol. 13 - P. 614-623.

Grage S. L. Solid state ¹⁹F NMR parameters of fluorine-labeled amino acids. Part II: Aliphatic substituents / S. L. Grage, U. H. N. Dьrr, S. Afonin, P. K. Mykhailiuk, I. V. Komarov // J. Magn. Res. - 2008. - Vol. 191. - P. 16-23.

Mykhailiuk P. K. A convenient route to trifluoromethyl-substituted cyclopropane derivatives / P. K. Mykhailiuk, S. Afonin, A. S. Ulrich, I. V. Komarov // Synthesis. - 2008. - Vol. 11. - P. 1757-1760.

Mykhailiuk P. K. Synthesis of a conformationally rigid trifluoromethyl-substituted б_amino acid for peptide studies by ¹⁹F-NMR / P. K. Mykhailiuk, I. V. Komarov // The third joint scientific conference in chemistry Kyiv national Taras Shevchenko university and Paul Sabatier university (Tolouse). - Kyiv, Ukraine, 2005. - P. 65.

Mykhailiuk P. K. Synthesis of a conformationally rigid trifluoromethyl-substituted б_amino acid for peptide studies by ¹⁹F-NMR / P. K. Mykhailiuk, S. Afonin, A. S. Ulrich, I. V. Komarov // 6^th Tetrahedron symposium “Challenges in organic chemistry”. - Bordeaux, France, 2005. - P. 176.

Михайлюк П. K. Синтез конформаційно жорсткої трифлуорометилзаміщеної б_амінокислоти для досліджень пептидів за допомогою ¹⁹F-ЯМР / П. K. Михайлюк, I. В. Koмаров // Шоста всеукраїнська конференція студентів та аспірантів «Сучасні проблеми хімії». - Київ, Україна, 2005. - C. 93.

Mykhailiuk P. K. Synthesis of ¹⁹F-NMR labels for structural studies of peptides - novel trifluoromethyl-substituted amino acids / P. K. Mykhailiuk, Afonin S., Gvozdovska N., Ulrich A. S., Komarov I. V. // 8^th Tetrahedron symposium “Challenges in organic chemistry”. - Berlin, Germany, 2007. - P. 2.29.

Afonin S. Structural investigations of the cell-penetrating peptide SAP in lipid membranes / S. Afonin, P. K. Mykhailiuk, S. L. Grage, J. Bьrck, U. Sternberg, P. Wadhwani, I. V. Komarov, A. S. Ulrich // 52^th Annual Meeting, Biophysical society/16^th IUPAB Congress. - Long Beach, CA., 2008. - P. S114.

Размещено на Allbest.ru

...