Подготовка биологического материала для биохимических исследований

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение в биохимический практикум

Подготовка биологического материала для биохимических исследований

Подготовка материала для биохимических исследований

Комплексная цель

Дать представление о видах биологического материала, используемого для анализа, сформировать навыки получения и подготовки биологического материала для биохимических исследований.

Содержание

При проведении биохимических исследований на экспериментальных животных (мыши, крысы, морские свинки, кролики) в качестве биологического материала может использоваться кровь, гомогенаты тканей, субклеточные фракции тканей, моча.

К субклеточным фракциям тканей относятся митохондриальная, микросомальная (образуется из мембран эндоплазматического ретикулума), ядерная, из нервной ткани выделяют миелиновую фракцию.

При клинико-биохимических исследованиях в качестве биологического материала чаще всего используют биологические жидкости - сыворотку и плазму крови, клеточные элементы крови (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты), слюну, слезную и потовую жидкость, а также бронхо-легочный лаваж, выдыхаемый воздух и биопунктаты.

1.1 Получение плазмы крови

При взятии крови с антикоагулянтами (гепарин, цитрат натрия) можно отделить с помощью центрифугирования клеточные элементы от жидкой межклеточной среды - плазмы крови. Плазма крови представляет собой кровь, лишенную клеточных элементов, но содержащую фибриноген и факторы свертывания крови.

Забор крови производят в стеклянные центрифужные пробирки с добавлением раствора гепарина (25 ЕД/мл) или 3,8 % раствора цитрата натрия (1 мл на 10 мл крови), центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут. Плазму крови отбирают пастеровской пипеткой или дозатором (V=l мл) и хранят в холодильнике при +4єС.

1.2 Получение сыворотки крови

Кровь набирают в стеклянные центрифужные пробирки без антикоагулянта и помещают в термостат при +37°С на 1 час. Затем стальной иглой обводят сгусток и коагулированную кровь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин, после чего отбирают надосадочную жидкость - сыворотку. эритроцит гемолизат супернатант воуum

Сыворотка крови представляет собой кровь, лишенную клеточных элементов и фибриногена (предшественника фибрина). Сыворотку крови хранят в холодильнике при +4єС.

1.3 Приготовление суспензии эритроцитов и гемолизатов

После отделения плазмы крови осадок эритроцитов ресуспендируют в 10 мл охлажденного физиологического раствора или забуференного 0,01М трис-HCl буфером рН 7,4 раствора 0,15М NaCl, затем центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Осадок трижды промывают физиологическим раствором, из полученного плотного осадка эритроцитов готовят суспензии необходимой концентрации на забуференном рН 7,4 физиологическом растворе. Разведение суспензии эритроцитов производят в соответствии с концентрацией общего белка.

Для получения гемолизатов к 0,1 мл осадка отмытых эритроцитов приливают 10 мл холодной дистиллированной воды и энергично встряхивают. Через 30 мин - 1 час в гемолизатах определяют содержание гемоглобина и активность ферментов.

Реактивы:

1. Забуференный 0,01М трис-HCl буфером рН 7,4 раствор 0,15М NaCl

а) приготовление 0,1М трис-HCl буфера рН 7,4: 50 мл 0,1М трис(гидроксиметил)аминометана (12,114 г/л) + 42 мл 0,1М НС1, разбавляют водой до 100 мл.

б) 10 мл 0,1М трис-HCl буфера разбавляют 50 мл Н₂О, добавляют 0,89г NaCl. После растворения соли раствор разводят водой до 100 мл.

1.4 Выделение лимфоцитов, нейтрофилов и тромбоцитов

Принцип метода. Для разделения клеточных элементов периферической крови используют ее центрифугирование в градиенте плотности.

Реактивы

1. Полиглюкин

2. Гепарин, 5000 ед.

3. Среда с градиентом плотности 1,077.

Фиколл растворяют в теплой воде и готовят 9% раствор (плотность 1,025). Верографин (урографин, уротраст) - готовят 36,17% раствор (плотность 1,2) по схеме:

20 мл 60% раствора + 13,18 мл воды или

20 мл 76% раствора + 22,02 мл воды.

Соединяют 7 частей раствора верографина и 16 частей раствора фиколла (28 мл и 64 мл).

4. Среда Хенкса, рН 7,4

5. Раствор Версена

6. NaCl, 18% раствор

Необходимо работать с силиконированными или полиэтиленовыми пробирками.

Забор крови

8 мл крови забирают в пробирку с 3 мл полиглюкина и 2 каплями гепарина.

Выделение клеток

Кровь отстаивают в течение 60 мин при температуре 25° С. Слой плазмы, обогащенный лейкоцитами, наслаивают на 2 мл среды с градиентом плотности и центрифугируют в течение 35 мин при 1500 об/мин.

После центрифугирования удаляют верхний слой плазмы, переносят кольцо клеток с мононуклеарами (лимфоциты и моноциты) и тромбоцитами в чистую пробирку и удаляют оставшийся слой среды. На дне пробирки остается осадок нейтрофилов и немного эритроцитов.

Затем к суспензии мононуклеаров и тромбоцитов добавляют равный объем раствора Версена и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. При этом лимфоциты и моноциты окажутся в осадке, а тромбоциты - в супернатанте. В отдельную пробирку снимают верхний слой с тромбоцитами и используют его для работы. Осадок мононуклеаров ресуспендируют в 1 мл среды Хенкса и подсчитывают количество клеток

К осадку нейтрофилов с эритроцитами добавляют 2 мл воды и ровно через 30 с добавляют 2 мл 1,8% раствора NaCl и перемешивают. Центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин, супернатант сливают, а нейтрофилы ресуспендируют в 1 мл среды Хенкса и подсчитывают количество клеток.

Подсчет клеток

Количество клеток в суспензии считают в камере Горяева. Если клеток много, суспензию предварительно разводят в 5 раз физиологическим раствором. Количество клеток в 25 больших квадратах умножают на 2500 -получается количество клеток в 1 мл суспензии. Разводят суспензию таким образом, чтобы в 1 мл содержалось 4 млн. клеток [3].

1.5 Выделение лимфоцитов в градиенте плотности фиколл-верографина по методу Воуum (1968)

Выделение чистой популяции лимфоцитов осуществляется на фиколл-верографиновом градиенте, который готовится следующим образом:

1. 76% верографин - 40 мл приливают к 84 мл дистиллированной воды

2. Фиколл - 18г растворяют в 200 мл дистиллированной воды.

Растворы 1 и 2 смешивают в соотношении 7:16 (84 мл верографина и 182 мл фиколла). Плотность готового раствора должна составлять 1,077, если плотность выше, то долить дистиллированной воды, если ниже - то раствор 1.

Смесь стерилизуют в пробирках или флаконах с обратным холодильником. Стерилизацию проводят трехкратно в течение трех дней. Не следует закрывать флаконы ватно-марлевой пробкой.

Для выделения клеток в центрифужные пробирки разливают градиент из расчета 1:1 к объему разведенной крови. К крови добавляют физиологический раствор в соотношении 1:1. Разведенную кровь наслаивают по стенке пробирки на градиентную смесь. При этом определяется четкая граница, однако уже в первую минуту можно видеть, как эритроциты начинают оседать на дно.

Центрифугирование проводят 45 мин при 1500 об/мин. После центрифугирования наблюдается следующая картина (рис.1):

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1

Полученное кольцо с лимфоцитами собирают с помощью дозатора в другую пробирку, доливают физиологический раствор до 10 мл и центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин [2]

1.6 Приготовление гомогенатов тканей

Ткань крысы (печень, мозг и др.) промывают в ледяном физиологическом растворе, если необходимо перфузируют для удаления крови, затем обсушивают фильтровальной бумагой и делают навеску. Затем навеску ткани (1г) измельчают и помещают в гомогенизатор или фарфоровую ступку, где ткань тщательно растирают на холоду с последующим добавлением (порциями) необходимого объема (10 мл) соответствующего буфера (например, 0,01М трис-HCl буфер, рН 7,4) или забуференного 0,01М трис-HCl буфером рН 7,4 физиологического раствора. Полученный гомогенат ткани используют для биохимического анализа.

1.7 Выделение субклеточных фракций печени крысы

1.7.1 Гомогенизация ткани

Первым этапом фракционирования органелл клеток является гомогенизация - процедура превращения ткани в гомогенат, или суспензию субклеточных частиц. Гомогенизация должна предусматривать разрушение всех клеток, находящихся в гомогенизаторе, без повреждения их субклеточных структур. Для гомогенизации чаще используют растворы сахарозы различной концентрации, которые способны сохранять интактными большую часть субклеточных структур гомогенатов тканей. Большое значение для успеха фракционирования субклеточных частиц имеет рН среды. Показано, что степень загрязнения гомогената целыми клетками и их оболочками резко возрастает, если рН среды меньше 7,0. В интервале рН от 7,4 до 7,8 число неразрушенных клеток минимально.

Печень крысы промывают раствором холодной 0,25М сахарозы, приготовленной на 0,01М трис-HCl буфере рН 7,4. Затем делают навеску ткани и переносят ее в охлажденный стакан гомогенизатора и добавляют раствор сахарозы из расчета 1:9 (вес:объем). Кусочки ткани осторожно разминают тефлоновым пестиком в течение 1 мин до тех пор, пока они не начинают свободно продавливаться между пестиком и стенками стакана гомогенизатора. Затем соединяют пестик с моторчиком и продолжают гомогенизацию в течение 1 мин при 800-1200 об/мин при постоянном движении пестика вниз и вверх. Вся процедура проводится на холоду в погруженном в ледяную ванну стакане гомогенизатора. Приготовленный подобным образом гомогенат содержит не более 5% неразрушенных клеток и мало поврежденные субклеточные структуры.

1.7.2 Дифференциальное центрифугирование субклеточных структур в растворах сахарозы определенной плотности с выделением фракций в осадок

Принцип метода. Метод основан на поэтапном осаждении отдельных клеточных фракций, сравнительно мало отличающихся по удельному весу, но резко различных по размеру.

Выделение ядерной фракции (диаметр частиц 3000-8000ммк; плотность 1,286-1,328г/см³).

10 мл 10% гомогената (вес:объем) центрифугируют при 600g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость (супернатант) сливают; осадок же, содержащий ядра, неразрушенные печеночные клетки и эритроциты, дважды промывают, суспендируя каждый раз в 2,5 мл 0,25М сахарозы в трис-НС1 буфере рН 7,4 и центрифугируя при 600g 10 мин. Смывы объединяют. Промытый осадок суспендируют в сахарозе (конечный объем 2,5 мл) и обозначают как ядерную фракцию (разведение в 2,5 раза в расчете на исходную ткань).

Выделение митохондриальной фракции (диаметр частиц 300-1000ммк; плотность 1,188-1,221 г/см³)

Объединенные надосадочную жидкость и смывы центрифугируют при 8500g в течение 10 мин. Супернатант сливают, а осадок дважды промывают 0,25М сахарозой в 0,01М трис-HCl буфере рН 7,4 (по 2,5 мл), центрифугируют каждый раз при 8500g 10 мин. Полученный осадок суспендируют (конечный объем 2,5 мл) и обозначают как митохондриальную фракцию (разведение в 2,5 раза).

Выделение микросомной фракции (диаметр частиц 15-300 ммк; плотность 1,040-1,180 г/см³)

Данная фракция объединяет разнородные по морфологическому и биохимическому составу частицы. К ним относятся подфракция рибонуклеопротеидных частиц, участвующих в рибосомальном синтезе белка. Вторая подфракция содержит, главным образом, микросомальные мембраны, образующиеся из мембран эндоплазматического ретикулума.

Объединенный супернатант и промывные жидкости центрифугируют при 18000g в течение 60 мин. Полученный супернатант сливают, осадок суспендируют в 2,5 мл сахарозы и вновь центрифугируют при 18000g 60 мин. Осадок суспендируют в сахарозе (конечный объем 2,5 мл) и обозначают как микросомную фракцию (разведение в 2,5 раза).

Фракция супернатанта, или надосадочной жидкости

Полученный супернатант объединяют со смывом и доводят до объема 25 мл (разведение в 25 раз).

Реактивы

1. 0,05М трис-HCl буфер, рН 7,4

Готовят 0,2М трис - 24,2 г/л

Смешивают 25 мл 0,2М трис с 42,5 мл 0,1М НС1 и доводят до 100 мл водой; 0,05М трис-HCl буфер разводят в 5 раз.

2. Среда выделения: 0,25М сахароза в 0,01М трис-HCl буфере рН 7,4. 85,58г сахарозы растворяют в 1л 0,01М трис-HCl буфера.

Литература

1. Современные методы в биохимии /под ред. Ореховича В.Н. М: Медицина, 1968. С.5-59.

2. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Invest, 1968, V.21.S.97. -P.77-89.

3. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. Санкт-Петербург, 2000. - С.22-23.

Размещено на Allbest.ru