Методы исследования органических соединений. Биологически важные классы поли- и гетерофункциональных соединений. Химия аминокислот и пептидов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Лабораторная работа по дисциплине: «Цветные реакции на аминокислоты и белки»

Методы исследования органических соединений. Биологически важные классы поли- и гетерофункциональных соединений. Химия аминокислот и пептидов



Задача 1

Нингидриновая реакция.

Описание работы:

Белки, полипептиды и свободные б-аминокислоты дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином. Нингидрин, являясь сильным окислителем, при нагревании вызывает окислительное дезаминирование б-аминокислоты, приводящее к образованию аммиака, двуокиси углерода, соответствующего альдегида и восстановленной формы нингидрина. Восстановленный нингидрин связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака с образованием продуктов конденсации, окрашенных в синий, фиолетовый, красный, а в случае пролина - в желтый цвет (пурпур Руэмана), поскольку пролин - иминокислота, аминогруппа которой включена в состав гетероцикла.

Реакция идет по схеме:

Реакция с нингидрином используется для визуального обнаружения б-аминокислот на хроматограммах и для колориметрического определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски продукта реакции. Данная реакция не специфична, так как ее дают некоторые амины и амиды кислот.

Оборудование и химреактивы:

Пробирки, штативы, пипетки, спиртовка, пробиркодержатели.

0,1% водный раствор нингидрина.

Исследуемый материал:

1% растворы белков (овальбумин, зеин, желатин).

1% растворы аминокислот (аргинин, пролин).

Ход работы:

1. В пробирки налить по 1 мл 1% растворов белков (зеина, овальбумина, желатина) и аминокислот (аргинина и пролина) согласно схеме в таблице 1.

2. К растворам белков и аминокислот прилить по 0,5 мл 0,1% водного раствора нингидрина.

3. Пробирки прогреть на спиртовке.

Таблица 1 Инкубационные смеси

1 пробирка	2 пробирка	3 пробирка	4 пробирка	5 пробирка
1мл 1% зеина	1мл 1% овальбумина	1мл 1% желатина	1мл 1% аргинина	1мл 1% пролина
+0,5мл 0,1% нингидрина	+0,5мл 0,1% нингидрина	+0,5мл 0,1% нингидрина	+0,5мл 0,1% нингидрина	+0,5мл 0,1% нингидрина
прогреть	прогреть	прогреть	прогреть	прогреть

Оформление работы:

Результаты опыта перенести в таблицу 2.

Таблица 2 Результаты опыта

НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ
Материал исследования	Употребляемые реактивы	Окраска продукта	Чем обусловлена реакция

Задача 2

Биуретовая реакция.

Описание работы:

Биуретовая реакция - качественная реакция на пептидную связь. В щелочной среде раствор белка при добавлении разбавленного раствора CuSO₄ окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Окраска обусловлена образованием комплексов ионов меди с пептидными группами белка. Биуретовую реакцию дают все белки, а также ди-, олиго- и полипептиды.

Если несколько кристаллов мочевины поместить в пробирку и осторожно нагреть, образуется биурет:

Если добавить в эту пробирку 10% раствор NaOH и несколько капель 1% раствора CuSO₄, развивается сине-фиолетовое окрашивание. Биурет в щелочной среде претерпевает полную енолизацию по схеме:

Две молекулы диенольной формы биурета взаимодействуют с гидроксидом меди и образуют в щелочной среде комплексное соединение, в котором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота аминных групп:

2 HN=COH--NH--COH=NH + CuSO₄ + NaOH

Аналогично построено комплексное соединение меди с енолизированными пептидными группами любого полипептида. Комплексы такого типа обладают преимущественно красной окраской. В случае образования медных комплексов при участии трех или двух атомов азота окраска их преимущественно фиолетовая или синяя. Поэтому окраска растворов при проведении биуретовой реакции варьирует от синей до красной с преобладанием фиолетовой.

Оборудование и химреактивы:

Пробирки, штативы, пипетки.

10% раствор NaOH, 1% раствор CuSO₄

Исследуемый материал:

1% растворы белков (овальбумина, зеина и желатина).

Ход работы:

1. В три пробирки налить по 1 мл 1% растворов овальбумина, зеина и желатина согласно схеме, приведенной в таблице 3.

2. Добавить к растворам белков по 1 мл 10% раствора NaOH и 2 капли 1 % раствора CuSO₄. Перемешать. При перемешивании появляется окрашивание.

Таблица 3 Инкубационные смеси

1 пробирка	2 пробирка	3 пробирка
1мл 1% зеина	1мл 1% овальбумина	1мл 1% желатина
+1мл 10% NaOH	+1мл 10% NaOH	+1мл 10% NaOH
+2капли 1% CuSO4	+2капли 1% CuSO4	+2капли 1% CuSO4

Оформление работы:

Результаты опыта перенести в таблицу 4.

Таблица 4 Результаты опыта

БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ
Материал исследования	Употребляемые реактивы	Окраска продукта	Чем обусловлена реакция



Задача 3

Ксантопротеиновая реакция.

Описание работы:

Ксантопротеиновая реакция определяет наличие в белках циклических аминокислот, содержащих в своем составе бензольное кольцо (триптофана, фенилаланина, тирозина). Большинство белков при нагревании с концентрированной азотной кислотой дает желтое окрашивание, переходящее в оранжевое при подщелачивании. Реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца аминокислот с образованием нитросоединений желтого цвета по схеме:

При подщелачивании возникает хиноидная структура, окрашенная в оранжевый цвет. нингидрин пептидный енолизированный

Оборудование и химреактивы:

Пробирки, штативы, пипетки, спиртовки, пробиркодержатели.

Концентрированная HNO₃, 10% раствор NaOH.

Исследуемый материал:

1% растворы зеина, овальбумина, желатина, тирозина.

Ход работы:

1. В четыре пробирки налить по 1 мл 1% растворов белков (овальбумина, зеина, желатина) и аминокислоты тирозина согласно схеме, приведенной в таблице 5.

2. Добавить к растворам белков по 3-5 капель концентрированной HNO₃ до появления мути от денатурировавшего белка.

3. Нагреть до появления ярко-желтого окрашивания (осадок при этом постепенно растворяется в результате гидролиза белка). Отметить в таблице 6 наличие и интенсивность окрашивания в растворах белков.

4. Пробирки охладить. После охлаждения в пробирку налить по каплям 10% раствор NaOH (до появления оранжевого окрашивания вследствие образования натриевой соли динитротирозина).

Таблица 5 Инкубационные смеси

1 пробирка	2 пробирка	3 пробирка	4 пробирка
1мл 1% зеина	1мл 1% овальбумина	1мл 1% желатина	1мл 1% тирозина
+ 3-5 капель к.HNO3	+ 3-5 капель к.HNO3	+ 3-5 капель к.HNO3	+ 3-5 капель к.HNO3
Перемешать и прогреть до появления окраски
Записать наличие и интенсивность окраски в исследуемых растворах
+ 10% NaOH	+ 10% NaOH	+ 10% NaOH	+ 10% NaOH

Оформление работы:

Результаты опыта перенести в таблицу 6. Сделать вывод о наличии ароматических аминокислот в исследуемых растворах белков.

Таблица 6 Результаты опыта

КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ
Материал исследования	Употребляемые реактивы	Окраска продукта	Чем обусловлена реакция

Задача 4

Реакция Адамкевича.

Описание работы:

Триптофан в кислой среде реагирует со многими альдегидами, вследствие чего образуются цветные продукты конденсации с общей структурой:

Необходимый для протекания реакции альдегид можно получить из глиоксиловой кислоты, действуя на нее серной кислотой. Небольшое количество глиоксиловой кислоты находится в качестве примеси в концентрированной CH₃COOH:

Оборудование и химреактивы:

Пробирки, штативы, пипетки.

Концентрированная H₂SO₄, концентрированная HNO₃

Исследуемый материал:

1% растворы зеина, овальбумина, желатина и триптофана.

Ход работы:

1. В 4 пробирки налить по 1мл 1% растворов зеина, овальбумина, желатина и 1% раствора триптофана согласно схеме, приведенной в таблице 7.

2. В каждую пробирку добавить по 1мл концентрированной CH₃COOH.

3. В каждую пробирку, наклонив, аккуратно (по стенке) налить по 1мл концентрированной H₂SO₄, не допуская перемешивания жидкостей.

4. Оставить на некоторое время. При стоянии на границе двух жидкостей образуется красно-фиолетовое кольцо.



Таблица 7 Инкубационные смеси

1 пробирка	2 пробирка	3 пробирка	4 пробирка
1мл 1% зеина	1мл 1% овальбумина	1мл 1% желатина	1мл 1% триптофана
+ 1мл к.CH3COOH	+ 1мл к.CH3COOH	+ 1мл к.CH3COOH	+ 1мл к.CH3COOH
+ 1мл к.H2SO4	+ 1мл к.H2SO4	+ 1мл к.H2SO4	+ 1мл к.H2SO4

Оформление работы:

Результаты опыта перенести в таблицу 8. Сделать вывод о наличии триптофана в исследуемых растворах белков.

Таблица 8 Результаты опыта

РЕАКЦИЯ АДАМКЕВИЧА
Материал исследования	Употребляемые реактивы	Окраска продукта	Чем обусловлена реакция

Задача 5

Реакция Сакагучи.

Описание работы:

Реакция обусловлена присутствием в белке аминокислоты аргинина, имеющей гуанидиновую группировку:

В щелочном растворе в присутствии гипохлорита натрия гуанидиновая группа аргинина окисляется. Окисленный продукт, соединяясь с нафтолом, образует продукт конденсации розово-красного цвета:

Оборудование и химреактивы:

Пробирки, штативы, пипетки.

10% раствор NaOH, спиртовый раствор б-нафтола, гипохлорит натрия.

Исследуемый материал:

1% растворы зеина, овальбумина, желатина и аргинина.

Ход работы:

1. В 4 пробирки налить по 1мл 1% растворов зеина, овальбумина, желатина и 1% раствора аргинина согласно схеме, приведенной в таблице 9.

2. В каждую пробирку добавить по 1-2 капли 10% раствора NaOH.

3. В каждую пробирку добавить по 1-2 капли спиртового раствора б-нафтола.

4. В каждую пробирку добавить по 1-2 капли гипохлорита натрия. Перемешать. Развивается розово-красное окрашивание.

Таблица 9 Инкубационные смеси

1 пробирка	2 пробирка	3 пробирка	4 пробирка
1мл 1% зеина	1мл 1% овальбумина	1мл 1% желатина	1мл 1% аргинина
+ 1-2 капли 10% NaOH	+ 1-2 капли 10% NaOH	+ 1-2 капли 10% NaOH	+ 1-2 капли 10% NaOH
+ 1-2 капли б-нафтола	+ 1-2 капли б-нафтола	+ 1-2 капли б-нафтола	+ 1-2 капли б-нафтола
+ 1-2 капли гипохлорита натрия	+ 1-2 капли гипохлорита натрия	+ 1-2 капли гипохлорита натрия	+ 1-2 капли гипохлорита натрия

Оформление работы:

Результаты опыта перенести в таблицу 10. Сделать вывод о наличии аргинина в исследуемых растворах белков.

Таблица 10 Результаты опыта

РЕАКЦИЯ САКАГУЧИ
Материал исследования	Употребляемые реактивы	Окраска продукта	Чем обусловлена реакция

Задача 6

Реакция Фоля.

Описание работы:

Цистеин и белки, имеющие в своем составе цистеин, дают с нитропруссидом натрия пурпурное окрашивание.

Оборудование и химреактивы:

Пробирки, штативы, пипетки.

30% раствор NaOH, 1мл насыщенного раствора (NH₄)₂SO₄, 5% раствор нитропруссида натрия.

Исследуемый материал:

1% растворы зеина, овальбумина, желатина и цистеина.

Ход работы:

1. В 4 пробирки налить по 1мл 1% растворов зеина, овальбумина, желатина и 1% раствора цистеина согласно схеме, приведенной в таблице 11.

2. В каждую пробирку добавить по 1 мл 30% раствора NaOH.

3. В каждую пробирку добавить по 1 мл насыщенного раствора (NH₄)₂SO₄.

4. В каждую пробирку добавить по 2-3 капли раствора нитропруссида натрия. Перемешать. Развивается пурпурное окрашивание.

Таблица 11 Инкубационные смеси

1 пробирка	2 пробирка	3 пробирка	4 пробирка
1мл 1% зеина	1мл 1% зеина	1мл 1% зеина	1мл 1% зеина
+ 1мл 30% NaOH	+ 1мл 30% NaOH	+ 1мл 30% NaOH	+ 1мл 30% NaOH
+ 1мл (NH4)2SO4 насыщ.	+ 1мл (NH4)2SO4 насыщ.	+ 1мл (NH4)2SO4 насыщ.	+ 1мл (NH4)2SO4 насыщ.
+ 2-3 капли нитропруссида натрия	+ 2-3 капли нитропруссида натрия	+ 2-3 капли нитропруссида натрия	+ 2-3 капли нитропруссида натрия

Оформление работы:

Результаты опыта перенести в таблицу 12. Сделать вывод о наличии цистеина в исследуемых растворах белков.

Таблица 12 Результаты опыта

РЕАКЦИЯ ФОЛЯ
Материал исследования	Употребляемые реактивы	Окраска продукта	Чем обусловлена реакция

Задача 7

Распределительная хроматография аминокислот на бумаге.

Описание работы:

Хроматографические метод анализа был открыт русским ученым М.С. Цветом в 1903г. В настоящее время многочисленные виды хроматографического анализа широко используются в различных областях химии и биологии.

Распределительная хроматография на бумаге основана на различной степени распределения компонентов смеси между двумя фазами (неподвижной водной фазой и подвижной фазой органического растворителя).

Органический растворитель, проходя через полоску фильтровальной бумаги, увлекает за собой аминокислоты, раствор которых нанесен на бумагу. Различные аминокислоты передвигаются по бумаге с неодинаковой скоростью. Скорость перемещения аминокислот зависит от многих факторов: строения молекулы, их способности растворяться в органическом растворителе, избирательной адсорбции на бумаге, типа бумаги, условий проведения анализа и т.д.

При восходящем способе хроматографического разделения растворитель поднимается снизу вверх. Положение отдельных аминокислот определяют путем обработки высущенной бумаги раствором нингидрина и последующего нагревания её при 100°С. На полоске бумаги (хроматограмме) отчетливо видны пятна фиолетового, синего, голубого, желтого, оранжевого, коричневого цвета.

Для каждой аминокислоты характерна скорость перемещения, которую выражают с помощью коэффициента R_f - отношения пути, пройденного аминокислотой (от места её нанесения на бумагу до середины пятна на хроматограмме), к расстоянию от места нанесения смеси аминокислот до фронта растворителя. Каждая аминокислота имеет определенное значение коэффициента R_f , которое может меняться в зависимости от типа бумаги, растворителя, температуры, рН среды и некоторых других факторов.

Оборудование и химреактивы:

Оборудование: фильтровальная бумага; фитиль; чашки Петри; вешалки для хроматограмм; пульверизатор; сушильный шкаф; ножницы; скальпели; стеклянные капилляры; толстая игла.

Реактивы: тирозин, 0,4%-ный раствор; глутаминовая кислота, 0,6%-ный раствор; валин, 0,5%-ный раствор; нингидрин, 0,2%-ный раствор (в ацетоне); смесь аминокислот (тирозин, глутамат, валин); система растворителей: бутиловый спирт, уксусная кислота и вода в соотношении 16 : 15 : 10.

Исследуемый материал:

Раствор смеси аминокислот

Ход работы:

1. Из хроматографической фильтровальной бумаги вырезают квадрат размером 11x11 см. На одном из углов квадрата делают петлю из нитки. Простым карандашом проводят диагонали и из точки их пересечения описывают окружность радиусом 10 мм, стороны квадрата нумеруют. Затем бумагу помещают на чашку Петри так, чтобы она лежала на краях чашки. В середину каждой дуги, ограниченной диагоналями, с помощью тонкого капилляра наносят растворы «свидетелей» и анализируемую смесь аминокислот (рис. 1).

2. Из небольшого треугольника фильтровальной бумаги скатывают фитилек и вставляют его в отверстие, проделанное толстой иглой в центре квадрата. Нижний конец фитилька должен касаться дна чашки, в которую наливают 10--15 мл смеси растворителей (дно чашки должно быть покрыто растворителем). Хроматограмму плотно прикрывают крышкой, диаметр которой равен диаметру основания чашки Петри (см. рис. 1). По фитильку растворитель поднимается вверх и распределяется по бумаге от центра к периферии листа. Когда фронт растворителя дойдет до краев чашки Петри, хроматограмму снимают, отмечают карандашом фронт растворителя, за петельку подвешивают на штатив и сушат в сушильном шкафу при 105 °С в течение 5 мин (до исчезновения запаха растворителя).

3. Высушенную хроматограмму проявляют-опрыскивают из пульверизатора раствором нингидрина в ацетоне и вновь помещают в сушильный шкаф. Через несколько минут на хроматограмме появляются пятна, указывающие положение аминокислот.

4. Для каждой аминокислоты рассчитывают значение Rf. Аминокислоты анализируемой смеси идентифицируют, сравнивая их Rf с Rf аминокислот-свидетелей.

Рис.1 Распределительная хроматография смеси аминокислот на бумаге.

Оформление работы:

Принцип метода бумажной хроматографии коротко описывают в протоколе. Полученную хроматограмму вклеивают в тетрадь; после расчета Rf аминокислот смеси и свидетелей на хроматограмму наносят названия аминокислот в смеси.

Размещено на Allbest.ru

...