Визначення СО2. Кількість поглинутого або вивільненого СО2 визначали методом інфрачервоного газового аналізу з використанням приладу СО2-meter (Quibit-system, Канада).

Потенціометричне титрування. Хлоропласти титрували розчинами 10 мМ КОН і 10 мМ НСl за допомогою автоматизованої установки на базі рН-метру 121, з'єднаної через інтерфейс з комп'ютером, у скляній термостатованій комірці об'ємом 5 мл при постійному продуванні нітрогеном. Концентрація хлорофілу складала 0,2 мг/мл, діапазон титрування від рН 9,0 до рН 4,0. Крива потенціометричного титрування зразка після віднімання фонової кривої могла бути представлена як крива титрування так і диференціальна крива - крива буферної ємності ?(pH).

Отримані результати оброблялися статистично. Експериментальні дані, що наведені в таблицях і на графіках, представлені у вигляді середнього арифметичного, стандартне відхилення якого визначено з урахуванням усіх повторів (М , n = 15, Р > 0,05).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Порівняльне дослідження буферної ємності хлоропластів різного ступеню цілісності. Інформація про буферні властивості інтактних хлоропластів має важливе значення для оцінки умов протікання біохімічних процесів темнової і світлової фази фотосинтезу, однак дотепер не було проведено повного аналізу буферних властивостей хлоропластів різного ступеню цілісності.

У даній роботі ставилося завдання визначити загальну кількість іоногенних груп і буферну ємність хлоропластів класів А, В, С і D, а також буферну ємність строми. У відповідності до номенклатури, запропонованої Холом (Hall, 1972), до класу А відносять ізольовані хлоропласти, що зберегли зовнішні оболонки і здатні фіксувати СО2 з високими швидкостями. У незруйнованих хлоропластів класу В оболонка є проникною для екзогенних акцепторів, вони підтримують світлозалежні реакції фотофосфорилювання екзогенного АДФ, відновлення фериціаніду і НАДФ проте нездатні до фіксації СО2. Хлоропласти, в яких видалена зовнішня оболонка, вважаються зруйнованими і відносяться до класів С, D, E і F залежно від способу виділення. Тилакоїди (хлоропласти класу С і D) отримують в результаті короткого осмотичного шоку (клас С) і багатократних промивок незруйнованих хлоропластів в гіпотонічному середовищі (клас D). Раніше в ряді робіт було показано, що буферні властивості хлоропластів залежать від їх функціонального стану (Oя та інш., 1988; Horton, 1985; Альберт та інш., 1964). Дослідження змін буферності та значень рН строми in vivo в темряві і на світлі має великий інтерес у зв'язку з функціонуванням відновлювального пентозофосфатного циклу і регуляцією клітинного метаболізму в цілому (Walz et al., 1974).

З кривих титрування, які надані на рис. 1 видно, що кількість груп, які зв'язують протони у діапазоні рН 4-9 знижується по мірі дезінтеграції хлоропластів. Хлоропласти класу В у порівнянні з хлоропластами класу А втрачають більшу частину водорозчинних низькомолекулярних компонентів строми в результаті порушення зовнішніх оболонок.

Так, якщо оцінювати величину буферної ємності строми за кривими кислотного титрування, її значення буде суттєво нижчим, ніж розраховане за кривими лужного титрування. Ця розбіжність вказує на гістерезис протонування-депротонування стромальних компонентів, який, можливо, пов'язаний з «гістерезисною» поведінкою деяких ферментів, яка властива окремим компонентам циклу Кальвіна (Horton, 1985). «Гістерезисні» властивості ферментів пояснюються існуванням двох форм (конформацій) молекули, яка повільно взаємоперетворюються, в наслідок чого для активації ферменту необхідно значно більше часу, ніж для одного оберту ферменту в каталітичному акті. В ході титрування ці форми можуть вносити свій вклад у гістерезис, що було спостережено. Активація ферментів циклу Кальвіна пов'язана також з відновленням їх функціонально важливих SH-груп (Hall, 1972). В даній роботі ця властивість світлової активації була промодельована за рахунок хімічного відновлення хлоропластів. Виявилося, що відновлення інтактних хлоропластів дітіонітом призводить до відповідного зростання кількості іоногенних груп з рК 6,5 - 9,0. Це дозволило припустити, що за умов освітлення буферна ємність строми в інтактних хлоропластах значно зростає (табл.1).

Таблиця 1 Буферна ємність хлоропластів класів A - D та їх стромального вмісту

В таблиці 1 наведені значення буферної ємності різних препаратів хлоропластів і строми, розраховані на підставі результатів кислотного та лужного титрування.Буферна ємність (в) строми в темряві розрахована за даними кислотного титрування, відрізнялося від значення в, що було знайдено при лужному титруванні, становлячи 0,5 мкмоль/мг хл.·од. рН і 0,7 мкмоль/мг хл.·од. рН, відповідно.

Внесок білкових комплексів тилакоїдної мембрани в буферну ємність. Для Механізм з'ясування природи світлозалежного зростання буферної ємності тилакоїдних мембран в роботі був вивчений внесок крупних білкових комплексів у криві титрування тилакоїдів.

Поліпептидний склад фотосинтезуючих мембран і, зокрема, вміст пігмент-білкових комплексів змінюється при вирощуванні рослин в залежності від інтенсивності світла, причому найбільшою мірою варіює кількість світлозбиральних комплексів фотосистеми ІІ (СЗКII) (Anderson, Andersson, 1988). Оскільки практично увесь хлорофіл b є зв'язаним з поліпептидами СЗКII, цей параметр може застосовуватися як індикатор змін пігмент-протеїнового складу, дозволяючи оцінювати відносний вміст СЗКІІ зі співвідношення хлорофілів a/b (Chow et al., 1990).

Рослини, які ростуть за умов нестачі світла, містять значно більш хлорофілу в СЗКІI, тому хлоропласти цих рослин характеризуються більш низьким співвідношенням хлорофілів a/b. В роботі вивчалися рослини з різним вмістом пігментованих білків, які були вирощені при варіюванні світлових умов. У рослин, що зростали за інтенсивності діючого світла 120 /м2с («тіньові» рослини) питома кількість СЗКІІ була вищою (співвідношення хл a/b складало у середньому 2,72 0,08). У «світлових» рослин, що зростали при високому світлі (1200 мкмоль/м2с) вміст СЗКІІ був нижчим (хл a/b 3,87 0,05).

З листків «світлових» і «тіньових» рослин гороху були ізольовані тилакоїдні мембрани і проведено їх кислотно-лужне титрування. Розрахунки за методом Чоу та Андерсена (Chow, Anderson, 1990) показали, що за умов нашого експерименту відносна кількість СЗКІІ у «тіньових» хлоропластах була в ~ 1,3 рази вищою, ніж у «світлових». Проте значної різниці у кількості іоногенних груп в перерахунку на 1 мг хлорофілу в обох препаратах не виявлено, незважаючи на значно більший вміст СЗКII в хлоропластах «тіньових» рослин. протонний буферний хлоропласт бікарбонат

Результати титрування в перерахунку на 1 мг сухої речовини показали (рис.3), що концентрація вільних іоногенних груп у хлоропластах «тіньових» рослин є вищою, ніж у «світлових». Оскільки відомо, що загальний вміст білку в хлоропластах листків, які росли на світлі, значно перевищує його вміст у «тіньових» препаратах, тоді як вміст СЗК, навпаки, є вищим у хлоропластах «світлових» рослин (Anderson, Andersson, 1988), отримані нами дані дозволяють припустити, що іоногенні групи СЗКІІ беруть участь у формуванні буферної ємності «тіньових» тилакоїдів у діапазоні рН 4-9.

При зростанні освітленості листків в хлоропластах пришвидшується синтез мембранних комплексів, які безпосередньо беруть участь в енергетичному забезпеченні процесу фіксації СО2, зокрема АТФ-синтази. Цей інтегральний поліпептидний комплекс складається з двох частин - мембранної, (фактор CFо) і поверхневої (фактор CF1) (Nelson, 2005). В своїх дослідах ми порівнювали протонування ізольованих тилакоїдних мембран до і після видалення з них каталітичної частини АТФ-синтазного комплексу - фактора CF1. Повне видалення CF1 з мембран досягалося при обробці тилакоїдів високими концентраціями хаотропного агенту NaBr (Kamienietzky and Nelson, 1975). Після видалення поверхневої частини АТФ-синтази за допомогою NaBr протон-провідний канал CF0 залишається відкритим, через що мембрани стають повністю проникними для протонів і характеризуються високими швидкостями електронного транспорту. Результати титрування суспензії контрольних і NaBr-оброблених тилакоїдів в діапазоні рН 9-4 розведеним розчином HCI в темряві наведені у табл. 2. Крива титрування тилакоїдів, які не містили CF1 після обробки мембран 2 М NaBr, практично не відрізнялася від кривої титрування контрольного зразка.

Це дає підставу вважати, що іоногенні групи CF1 не дають помітного внеску в буферну ємність тилакоїдних мембран у темряві. Криві титрування NaBr-тилакоїдів на світлі також близька до темнового контролю: повністю відсутнє світлоіндуковане зростання протонного зв'язування при рН 9-7 (табл. 2).

Таблиця 2 Зв'язування протонів з мембранами тилакоїдів при зниженні рН від 9,0 до 4,0; мкмольН+/мг хл

Таким чином, результати цих дослідів підтвердили припущення (Walz et al., 1974; Ewy, Dilley, 2000) щодо участі іоногенних груп інтегральних білкових комплексів, зокрема вільних амінокислотних груп СЗКІІ, у буферній ємності тилакоїдних мембран. У той же час, нами встановлено, що буферні групи одного з найбільших білкових компонентів тилакоїдів, а саме розчинної частини АТФ-синтази (фактор CF1) у фізіологічному діапазоні рН не вносять суттєвого внеску в буферність тилакоїдів (табл. 2).

Визначення вмісту бікарбонату в тилакоїдах. Тилакоїди хлоропластів містять аніони бікарбонату, які неоднаково міцно зв'язані з мембранами, причому вміст слабко зв'язаного бікарбонату і його функціональна роль залишалися невідомими. Визначення вмісту бікарбонату в тилакоїдах проводили методом інфрачервоного газового аналізу (ІЧГА). Для цього мембрани після урівноваження з газовою фазою відомого складу в ізольованій від атмосфери комірці порушували, додаючи концентровану НСl до рН 1. Вивільнений СО2 реєстрували в ІЧГА-аналізаторі. Результати наведені у табл. 3. Загальна кількість зв'язаного бікарбонату складала біля 0,63-0,85 мкмоль/мг хл, що добре узгоджується з літературними даними (Stemler, 2002), але його розподіл між мембранної фракцією і супернатантом значно змінювався в залежності від наявності у середовищі інгібіторів карбоангідрази. Кількість мембранозв'язаного бікарбонату розраховували як різницю між кількістю НСО3- в супернатанті і в осаді після центрифугування суспензії. Видно, що в контрольних хлоропластах кількість бікарбонату, зв'язаного з мембранами, складала 0,3 мкмоль /мг хл, тоді як після інкубації в присутності ацетозоламіду (АА) або етоксізоламіду (ЕА) знижувалася практично до нуля. Дані прецезійного кислотно-лужного титрування (не показано) довели, що мембрано зв'язаний бікарбонат бере участь у формуванні буферної ємності тилакоїдів, яка значно знижується після інкубування мембран в присутності інгібіторів карбоангідрази - ліпофільного ЕА або гідрофільного АА. Рівень буферної ємності мембран, таким чином, залежить від активності тилакоїдної карбоангідрази (табл. 3).

Таблиця 3 Вплив інгібіторів карбоангідрази на вміст зв'язаного бікарбонату в тилакоїдних мембранах

Вплив інгібіторів КА визначали після інкубації хлоропластів за їх присутності в комірці лабораторного пристрою при постійній продувці нітрогеном. Після врівноваження суспензії з газовою фазою вмикали магнітну мішалку і реєстрували вивільнення слабко зв'язаного CO2; по закінченні цього процесу до суспензії додавали порцію 10 М HCl і фіксували вивільнення CO2 внаслідок деструкції мембран. Концентрація хлоропластів складала 1 мг хл/мл.

Світлозалежне поглинання СО2 ізольованими тилакоїдними мембранами. Світлоіндуковане поглинання CO2 визначали в суспензії ізольованих тилакоїдів в закритій комірці при постійній продувці повітрям, вміст CO2 в якому складав 600 ppm. У табл. 4 наведені дані про вплив акцепторів електронного транспорту, роз'єднувачів та інгібіторів КА на процес світлозалежного поглинання СО2 і протонів (ДН+) суспензією ізольованих хлоропластів. Виявилося, що обидва процеси реагують на внесення ефекторів якісно подібним чином. Роз'єднувачі знижували трансмембранний протонний градієнт, що викликало як зменшення поглинання СО2 тилакоїдами, так і величини ДН+. Інгібітори КА при внесенні до суспензії тилакоїдів призводять до інгібування поглинання СО2 (табл.4). Ефект інгібіторів КА залежав від концентрації та тривалості обробки. АА і ЕА (1 мМ) одразу після внесення до реакційного середовища викликали лише часткове інгібування світлозалежного поглинання СО2, тоді як інкубування суспензії хлоропластів за їх присутності протягом 3 год призводила до повного пригнічення цього процесу. Світлоіндуковане поглинання протонів залежало від рівня рН у середовищі, причому максимальні величини ДН+ реєстрували при значеннях рН, близьких до рК (І) вугілекислоти. На відміну від цього, поглинання СО2, практично не залежало від рН у діапазоні рН 6-8.

Таблиця 4 Вплив ефекторів на величину світлозалежного поглинання протонів і CO2 в суспензії хлоропластів гороху

Отримані результати доводять, що енергізація тилакоїдних мембран супроводжується поглинанням вуглекислого газу з оточуючого середовища, який за участю карбоангідрази трансформується у бікарбонат, що призводить до підвищення буферної ємності мембран і стабілізації трансмембранного протонного градієнту.

Вплив іонів важких металів на карбоангідразну активність і буферну ємність тилакоїдних мембран. Відомо, що, іони важких металів, зокрема іони ртуті, цинку та міді, інгібують активність КА (Stemler, 1997; Tu et al.,1981). Дослідження впливу іонів Hg2+, Cu2+ і Zn2+ на каталітичну активність карбоангідрази ізольованих хлоропластів шпинату показало, що в їх присутності швидкості реакцій дегідратації та гідратації бікарбонату знижувалися (табл. 5). Іони ртуті є найбільш ефективними інгібіторами тилакоїдної карбоангідрази. В присутності іонів цинку і міді активність ферменту знижувалася в меншій мірі. Крім того, іони важких металів пригнічували світлозалежне поглинання СО2 тилакоїдами (табл. 5) та значно зменшували кількість буферних груп, які титруються в діапазоні рН 4,5-8,5.

Таблиця 5 Вплив важких металів на швидкість реакцій, які каталізуються КА в ізольованих хлоропластах шпинату

Отриманні результати вказують на зв'язок між активністю КА і кількістю буферних груп тилакоїдів і дозволяють вважати, що бікарбонат, зв'язаний з тилакоїдними мембранами, бере участь у формуванні енергізованого стану тилакоїдних мембран.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що при формуванні енергізованного стану хлоропластів відбувається світлозалежне підвищення буферної ємності тилакоїдів, яке забезпечено за рахунок світлоіндукованого поглинання вуглекислого газу і зростання вмісту бікарбонату в тилакоїдних мембранах.

2. Визначено протонну буферну ємність хлоропластів різного функціонального стану і різного ступеня їх цілісності. Показано, що у інтактних хлоропластах буферна ємність стромальної фази значно збільшується при освітленні шляхом фотовідновлення розчинних буферних сполук;

3. Встановлено, що іммобілізовані іоногенні групи світлозбірального комплексу фотосистеми ІІ, які розташовані на поверхні тилакоїдних мембран, певною мірою відповідають за буферну ємність за умов темряви, тоді як групи АТФсинтази суттєво не впливають на буферність хлоропластів у фізіологічному діапазоні рН.

4. За допомогою інфрачервоного газового аналізу одержано кількісні оцінки рівня мембранозв'язаного бікарбонату у тилакоїдах. Уперше показано, що суспензії ізольованих тилакоїдних мембран, відмитих від розчинних компонентів строми, за умов освітлення поглинають значну кількість СО2 з газової фази, що призводить до підвищення буферної ємності тилакоїдних мембран;

5. Доведено кореляцію між рівнями світлоіндукованого поглинання протонів і СО2 ізольованими тилакоїдними мембранами;

6. Розроблено метод визначення гідратазної і дегідратазної активності карбоангідрази тилакоїдів, за допомогою інфрачервоного газового аналізатора. Показано, що рівень світлозалежного поглинання протонів і СО2 ізольованими тилакоїдами залежить від активності цього ферменту.

7. Встановлено, що іони важких металів, які пригнічують активність карбоангідрази, знижують кількість буферних груп в діапазоні рН 4,5-8,5 і рівень світлозалежного поглинання CO2 в суспензії ізольованих тилакоїдних мембран.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Подорванов В. В. Сравнительное исследование буферной ёмкости хлоропластов различной степени целостности / Подорванов В. В., Золотарева Е. К. // Физиол. биохим. культ. раст. Ї 2004. Ї Т. 36, № 4. Ї С. 342Ї348. (Особистий внесок здобувача - створення установки, проведення експериментів, обробка даних титрування, написання статті).

2. Подорванов В. В. Роль бикарбоната в светозависимом поглощении протонов изолированными хлоропластами / Подорванов В. В., Черноштан A. А., Золотарева Е. К. // Физиол. биохим. культ. раст. - 2005. - Т. 37, № 4. - С. 326-332. (Особистий внесок здобувача - виготовлення та характеристика препаратів, проведення експериментів, написання статті).

3. Подорванов В. В. Буферная ёмкость изолированных тилакоидов хлоропластов гороха / Подорванов В. В., Чорноштан А. А., Коновалюк В. Д. // Доп. НАН України. Ї 2006 Ї № 9. Ї С. 186Ї192. (Особистий внесок здобувача - запропонована ідея дослідження, оброблені дані, написана стаття).

4. Подорванов В. В. Карбоангідраза тилакоїдів / Подорванов В. В., Семеніхін А. В., Поліщук О. В. / «Фізіологія рослин: проблеми та перспективи розвитку» [головн. ред. В. В. Моггун]. Ї К. Ї Видав. Логос. Ї 2009. Ї Т.1. Ї С.150Ї158. (Особистий внесок здобувача - збір та обробка даних, написання статті).

5. Подорванов В. В. Вплив іонів цинку на протонний перенос в ізольованих хлоропластах шпинату / Поліщук О. В., Подорванов В. В., Ситник С. К. // Доп. НАН України. Ї 2007. Ї № 8. Ї С. 174Ї178. (Особистий внесок здобувача - запропонована ідея дослідження, отримані та оброблені експериментальні дані, написана стаття).

6. Подорванов В. В. Активний транспорт неорганічного вуглецю і функціональна роль карбоангідрази у синьозелених водоростей. Фізіологія рослин в Україні на межі тисячоліть / Терещенко А. Ф., Подорванов В. В., Довбиш К. П., Золотарьова О. К. Ї Видав. Укр. Фізіол. Центру. Ї Київ, 2001. Ї Т. 2. Ї С. 324Ї328. (Особистий внесок здобувача - збір та обробка даних, написання статті).

7. Podorvanov V. V. Active transport of inorganic carbon into cells of blue-green algae (Cyanophyta) / Tereshchenko A. F., Podorvanov V. V., Zolotareva E. K. // Int. J. Algae. Ї 2002. Ї Vol. 4, № 4. Ї P. 29Ї40. (Особистий внесок здобувача - збір та обробка даних, написання статті).

8. Podorvanov V. V. Functional role and content of bound bicarbonate in thylakoid membranes of higher plants / Podorvanov V. V., Polishchuk A. V., Sytnik S. K., Chernoshtan A. A. // «Актуальні проблеми ботаніки та екології». Ї Киев, 2005. Ї Вип. 1. Ї С. 247Ї253. (Особистий внесок здобувача - виготовлення установки, характеристика препаратів, проведення експериментів, написання статті).

9. Подорванов В. В. Вплив iонiв мiдi Cu (II) та залiза Fe (II) на фотохiмiчнi реакцiї в хлоропластах гороху / Подорванов В. В., Терещенко О. Ф., Золотарьова О. К. // I Всеукраїнська наукова конференцiя «Екологiчний стрес i адаптацiя у бiологiчних системах». Ї Тернопiль, 27-29 жовтня 1998 Ї С. 88.

10. Подорванов В. В. Влияние ионов Сu(II) на протонный транспорт в хлоропластах гороха / Подорванов В. В., Золотарева Е. К. // Мат. V съезда об-ва физиол. раст. России. Ї Пенза, 15-21 сентября 2003. Ї C.61Ї62.

11. Подорванов В. В. Влияние ингибиторов карбоангидразы на светозависимое поглощение протонов изолированными хлоропластами / Черноштан А. А., Подорванов В. В., Золотарева Е. К. // Мат. V съезда об-ва физиол. раст. России. Ї Пенза, 15-21 сентября 2003. Ї C. 84.

12. Podorvanov V. V. Functional role and content of bound bicarbonate in thylakoid membranes of higher plants Zolotareva E. K., Podorvanov V. V., Polishchuk A. V., Sytnik S. K., Chernoshtan A. A. // «Актуальні проблеми ботаніки та екології». Мат. конф. мол. уч.-бот. Ї Канів, 7-10 вересня 2004. Ї Вип. 9. Ї С. 199Ї201.

13. Подорванов В. В. Роль бікарбонату в процесах протонного транспорту в хлоропластах / Золотарьова О. К. Подорванов В. В., Чoрноштан O. А. // ІІ Міжн. конф. «Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти». Ї Львів, 18-21 серпня 2004. Ї С. 152.

14. Подорванов В. В. Вплив іонів Cu (II) на протонний транспорт в хлоропластах гороху / Подорванов В. В., Золотарьова О. К. // ІІ Міжн. конф. «Онтогенез рослин у природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти». Ї Львів, 18-21 серпня 2004. Ї C. 272.

15. Podorvanov V. V. The effect of Cu2+ ions on photosynthetic process / Polishchuk O. V., Podorvanov V. V., Zolotаreva E. K. // Aсta Physiol. Plant. Ї 2005. Ї Vol. 27, № 4. Ї P. 24.

16. Подорванов В. В. Определение скорости роста водорослей по изменению рН среды в условиях автотрофного и миксотрофного питания / Подорванов В. В., Золотарева E. К. // II Межд. конф. «Актуальные проблемы современной альгологии». Ї Харьков, 20-23 апреля 2005. Ї С. 125.

17. Podorvanov V. V. pH-dependence of exogenic acceptor by uptake by isolated class (II) chloroplasts / Polishchuk A. V., Podorvanov V. V., Zolotareva E. K.// Intern. meet. «Photosynthesis in the post-genomic era. II: Structure and function of photosystems». Ї Pushchino, 20-26 august 2006. Ї P. 260.

18. Подорванов В. В. Пригнічення карбоангідразної активності тилакоїдів гороху іонами важких металів / Подорванов В. В., Поліщук О. В. // III Міжн. конф. «Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти». Ї Львів, 4-6 жовтня 2007. Ї С. 174.

19. Подорванов В. В. Вплив важких металів на фотохімічні процеси в хлоропластах / Поліщук О. В., Подорванов В. В. // III Міжн. конф. «Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі. Фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти». Ї Львів, 4-6 жовтня 2007. Ї С. 175.

20. Podorvanov V. V. The role of membrane bound bicarbonate in stress reaction of photosynthetic apparatus of higher plants / Podorvanov V. V., Polishchuk O. V. // The VIIth intern. conf. «Eco-physiological aspects of plant responses to stress factors». Ї Poland. Ї Cracow, 19-22 September 2007. Ї P. 95.

21. Podorvanov V. V. The influence of heavy metal ions on light-dependent proton uptake by thylakoids / Polishchuk A. V., Podorvanov V. V., Zolotareva E. K. // The VIIth intern.l conf. «Eco-physiological aspects of plant responses to stress factors». - Poland. Ї Cracow, 19-22 September 2007. Ї P. 96.

АНОТАЦІЇ

Подорванов В. В. Роль іммобілізованних і мобільних буферних систем у світлозалежному зв'язуванні протонів тилакоїдними мембранами хлоропластів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - Біохімія. - Чернівецький національний університет ім. Юрія Федьковича, Чернівці - 2009.

За допомогою методу кислотно-лужного титрування проведено порівняльне дослідження буферних властивостей хлоропластів різного ступеню цілісності. Показано, що буферна ємність інтактних хлоропластів підвищується при світлозалежному відновленні розчинних компонентів строми; іоногенні групи світлозбірального комплексу ФСІІ, які розташовані на поверхні тилакоїдних мембран, незначною мірою відповідають за буферну ємність у темряві, тоді як групи АТФсинтази майже не впливають на буферність хлоропластів в фізіологічному діапазоні рН. З використанням методу інфрачервоного газового аналізу визначений вміст бікарбонату, міцно зв'язаного з мембранами тилакоїдів в темряві, і показано, що при освітленні суспензія ізольованих тилакоїдів обернено поглинає СО2. Доведено, що світлозалежне поглинання CO2 корелює з поглинання протонів і відповідає за зростання буферної ємності тилакоїдів при енергізації. В роботі розроблений метод визначення дегідратазної і гідратазної активності карброангідрази (КА). Встановлено, що КА контролює світлоіндуковане поглинання CO2 і бере участь у формуванні енергізованного стану хлоропластів, стабілізуя рівень pH через збільшення буферної ємності тилакоїдних мембран.

Ключові слова: Pisum sativum, фотосинтез, хлоропласт, бікарбонат, трансмембранний протонний градієнт, карбоангідраза, світлозбиральний комплекс, буферна ємність.

Подорванов В. В. Роль иммобилизованных и мобильных буферных систем в светозависимом связывании протонов тилакоидными мембранами хлоропластов. - Рукопись.

Podorvanov V. V. The role of immobilized and mobile buffer systems in the light dependent proton binding by thylakoid membranes of chloroplasts. - A manuscript.

Dissertation for the candidate of biological science degree in speciality 03.00.04 - Biochemistry. - Yuriy Fedkovych Chernivtsi National University, Chernivtsi - 2009.

A comparative study of buffer properties of chloroplasts with different degree of integrity was carried out by acid-base titration method. It was shown that buffer capacity of intact chloroplast increased in the light due to reduction of their soluble stromal components. Ionogenic groups of light-harvesting complex of PSII located on the thylakoid membrane surface are partly responsible for the buffer capacity in the dark, whereas groups of ATPsynthase do not contribute to the chloroplast buffer capacity in physiological pH range. A bound bicarbonate content was determined by infrared gas analysis method. It was shown that isolated thylakoid suspensions can reversibly absorbed CO2 from air under illumination. This light-dependent CO2 adsorption is correlated with proton uptake and causes a buffer capacity rise in the thylakoid membrane energization process. A new method of thylakoid carbonic anhydrase (CA) determination has been proposed. It has been shown that CA catalyzes the light-induced CO2 uptake, takes part in chloroplast energization and ДpH level stabilization through the increase of the buffer capacity of thylakoid membranes.

Key words: Pisum sativum, photosynthesis, chloroplast, bicarbonate, transmembrane proton gradient, carbonic anhydrase, light-harvesting complex, buffer capacity.