Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я

Національний фармацевтичний університет

УДК: 615.322:582.998.16

АВТОРЕФЕРАТ

дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

Фармакогностичне дослідження трави арніки гірської та трави арніки листяної

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

Демидяк Ольга Лютославівна

Харків 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі фармакогнозії з медичною ботанікою Тернопільського державного медичного університету ім. І. Я. Горбачевського Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор Марчишин Світлана Михайлівна Тернопільський державний медичний університет ім. І.Я. Горбачевського професор кафедри фармакогнозії з медичною ботанікою

Офіційні опоненти:

доктор фармацевтичних наук, професор Ковальов Володимир Миколайович Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри фармакогнозії

доктор фармацевтичних наук, професор Доля Віктор Семенович Запорізький державний медичний університет, завідувач кафедри фармакогнозії з курсом ботаніки

Захист відбудеться 05.06. 2009 р. о 12⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.605.01. при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4)

Автореферат розісланий 30.04.2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук, професор Л.М. Малоштан

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Одним із джерел отримання лікувальних і профілактичних засобів сучасної медицини є лікарська рослинна сировина, яка використовується як безпосередньо, так і для отримання багатьох цінних лікарських засобів (Ковальов В.М. і спів., 1999).

За останні роки у всьому світі спостерігається тенденція до збільшення використання препаратів з рослин. Частка ліків рослинного походження на фармацевтичних ринках розвинених країн сьогодні досягає 50 % (Brubn J.G., 1989; Сур С., Гриценко О., 2002).

У сучасній медицині України використовують близько 40 % препаратів, які виготовляють із рослинної сировини, і майже 50 % - за їх участю, причому більшість рослин є дикорослими з обмеженими природними ресурсами. Потреби медицини та хіміко-фармацевтичної промисловості у сировині багатьох видів лікарських рослин задовольняються завдяки вирощуванню їх у культурі (Біленко В.Г. і спів., 2007).

Перевага використання лікарських рослин у медичній практиці полягає у їхній низькій токсичності та можливості застосування впродовж тривалого часу. У них достатньо широкий діапазон між терапевтичною і токсичною дозами; у більшості, вони не викликають алергічних реакцій.

З вищенаведеного випливає важливе науково-практичне значення представників родини Айстрових (Asteraceae), зокрема, роду Арніка (Arnica L.), види якого використовуються у багатьох країнах світу при різноманітних захворюваннях (Гарник Г.П. і спів., 1998; Палов М. , 1998; Balch Ph. A., 2002; Корсун В.Ф. і спів., 2003).

Сьогодні арніка - у переліку найперспективніших лікарських рослин (Гарник Г.П. і спів., 1998). Але заготівля дикорослого виду арніки гірської (Аrnica montana L.) дуже обмежена, у зв'язку із занесенням її до Червоної книги України (Нестерук Ю., 2003). У 80-их роках минулого століття в Україні введена у культуру й культивується на території Західного Поділля арніка листяна (Arnica foliosa Nutt.) (Марчишин С.М., 1992; 1997).

Таким чином, всебічне морфолого-анатомічне та фітохімічне вивчення трави дикорослого і культивованого видів рослин роду Арніка з метою створення субстанцій, які виявляють різні види фармакологічної активності, є актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом комплексної науково-дослідної теми кафедри фармакогнозії з медичною ботанікою фармацевтичного факультету Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського „Фармакогностичний аналіз та вивчення фармакологічної дії біологічно активних речовин лікарських рослин в експерименті” (номер Державної реєстрації 0108U001695).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи було провести фармакогностичне дослідження трави арніки гірської та арніки листяної, вивчити основні групи біологічно активних речовин досліджуваних рослин та розробити технологію одержання субстанції з протизапальною активністю із нової рослинної сировини.

Для досягнення поставленої мети необхідно вирішити наступні завдання:

- здійснити фітохімічні та хроматографічні дослідження трави арніки листяної та трави арніки гірської;

- виділити та ідентифікувати індивідуальні БАР трави арніки листяної та арніки гірської;

- вивчити кількісний склад біологічно активних речовин досліджуваної сировини;

- встановити морфолого-анатомічні ознаки трави досліджуваних видів арніки;

- розробити технологію одержання активної субстанції з трави арніки листяної та арніки гірської та стандартизувати одержані екстракти за вмістом біологічно активних речовин;

- вивчити протизапальну активність і дослідити антимікробну дію оптимальної субстанції з трави арніки листяної та арніки гірської;

- розробити проект АНД на нову лікарську рослинну сировину.

Об'єкти дослідження - рослини роду Арніка, а саме трава арніки гірської та арніки листяної, виділені біологічно активні речовини та субстанції.

Предмет дослідження - порівняльне фітохімічне та морфолого-анатомічне вивчення трави арніки гірської та арніки листяної.

Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи були використані фармакопейні методи якісного і кількісного визначення біологічно активних речовин. Використовували тонкошарову (ТШХ) і паперову (ПХ) хроматографію, газорідинну (ГРХ) хроматографію з використанням приладу Agilent Technology 6890N з мас-спектрометричним детектором 5973N. Для виділення БАР з рослинної сировини використовували колонкову хроматографію на поліаміді. Хімічну будову виділених сполук встановлювали на основі їх хімічних перетворень, методами УФ- та ІЧ-спектрального аналізу. Амінокислотний склад визначали методом рідинної іонообмінної хроматографії. Дослідження компонентного складу ефірної олії проводили на хроматографі Agilent Technology 6890N з мас-спектрометричним детектором 5973N. Вміст макро- і мікроелементів визначали методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії. Тримірні спектри флюоресценції ліпофільних сполук записували на спектрофлуориметрі Hitachi F4010. Для анатомічних досліджень використовували мікроскоп МБУ-6 та люмінісцентний мікроскоп. Мікрофотознімки зроблені фотокамерою D-580 ZOOM /C-460 ZOOM/ X-400. Фармакологічні дослідження проводили in vivo та in vitro.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено порівняльне фармакогностичне дослідження цінних лікарських рослин роду Арніка: дикорослого виду - арніки гірської та культивованого - арніки листяної. Проведено якісне і кількісне вивчення основних груп біологічно активних речовин трави досліджуваних видів. Виявлено наявність у них полісахаридів, фенольних сполук (флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, дубильних речовин), аскорбінової та органічних кислот, амінокислот, макро- і мікроелементів. Вперше вивчено жирнокислотний склад ліпофільної фракції трави арніки гірської та арніки листяної і встановлено якісний склад і кількісне співвідношення насичених і поліненасичених жирних кислот, а також вмісту важливих пігментів - каротиноїдів і хлорофілів у ліпофільному екстракті. Вивчено якісний склад і кількісний вміст ефірних олій, що містяться у траві арніки гірської та арніки листяної.

Вперше проведено морфолого-анатомічне вивчення трави арніки гірської та арніки листяної, встановлено їх основні діагностичні ознаки, які використані для розробки проекту АНД.

Розроблена технологія одержання рідкого екстракту трави арніки гірської та арніки листяної, вивчено хімічний склад одержаних субстанцій. Отримано патент України за № 34254 від 11. 08. 2008 р. на „Спосіб отримання рослинної субстанції з протизапальною активністю”, що підтверджує новизну наукового напрямку досліджень.

Досліджено фармакологічну активність рідких екстрактів арніки і доведено їх протизапальну та антимікробну активність.

Практичне значення одержаних результатів. Дані фармакогностичних досліджень впроваджено у навчальний процес кафедри фармації Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, кафедри фармакогнозії та кафедри медичної ботаніки Національного фармацевтичного університету, кафедри фармакогнозії з медичною ботанікою Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, кафедри фармакогнозії Запорізького державного медичного університету, кафедри фармакогнозії і ботаніки Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького.

За результатами досліджень розроблено проекти аналітично-нормативної документації на траву арніки гірської та арніки листяної.

Встановлено діагностичні морфолого-анатомічні ознаки двох видів роду Арніка - арніки гірської та арніки листяної, які використані при складанні інформаційного листа “Відмінні морфолого-анатомічні ознаки дикорослої арніки гірської та культивованої арніки листяної”, який вводиться у практику Державної інспекції з контролю якості лікарських засобів обласних (місцевих) ВО “Фармація”.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною завершеною науковою працею.

Автором самостійно проведено патентний пошук, аналіз літератури стосовно розповсюдження, хімічного складу та використання рослин роду Арніка у народній, науковій медицині та гомеопатії. Дисертанту належить вирішальна роль у постановці мети та завдань дослідження. Разом з науковим керівником розроблена програма наукових досліджень, здійснено відпрацювання відповідних методик, сформульовані висновки та практичні рекомендації. Автором проведено вивчення хімічного складу трави арніки гірської та арніки листяної та порівняльне морфолого-анатомічне дослідження двох видів роду Арніка, визначено діагностичні макро- та мікроскопічні характеристики нової лікарської рослинної сировини - трави арніки гірської та арніки листяної. Розроблено технологію одержання рідких екстрактів арніки, визначено числові показники досліджуваної трави та розроблено проект аналітично-нормативної документації на траву арніки гірської та арніки листяної. Виконання фармакологічних досліджень здійснювались за консультативної допомоги мол. н. співробітника ЦНДЛ НФаУ О.Ю. Кошової.

У наукових працях, опублікованих у співавторстві, дисертанту належить фактичний матеріал і основний творчий доробок.

Апробація результатів дисертації. Результати наукових досліджень, що увійшли до дисертації, оприлюднені на ІХ, Х, ХІІ Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих учених (Тернопіль, 2005, 2006, 2008), ХІ Ювілейному міжнародному медичному конгресі студентів і молодих учених (Тернопіль, 2007), 76-ій міжвузівській науковій конференції студентів та молодих вчених з міжнародною участю „Працюємо, творимо, презентуємо” (Івано-Франківськ, 2007), Всеукраїнській науково-методичній конференції „Хімія природних сполук” (Тернопіль, 2008), Всеукраїнській науково-практичній конференції „Довкілля і здоров'я” (Тернопіль, 2008), Всеукраїнському конгресі „Сьогодення та майбутнє фармації” (Харків, 2008), Науково-практичній конференції з міжнародною участю „Фармакогнозія ХХІ століття. Досягнення та перспективи” (Харків, 2009) .

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 17 наукових праць, серед яких 7 статей у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 8 тез - у матеріалах і тезах наукових конференцій та конгресів, 1 патент, 1 інформаційний лист.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, чотирьох розділів власних досліджень, загальних висновків, списку використаних джерел літератури. Загальний обсяг дисертації складає 169 сторінок друкованого тексту. Робота ілюстрована 20 таблицями і 46 рисунками. Перелік використаних джерел містить 281 найменування, з яких кирилицею 218, латиницею - 63.

Основний зміст роботи

Ботанічна характеристика, хімічний склад і фармакотерапевтичні властивості рослин роду Арніка

В огляді літератури наведено ботанічну характеристику, дані про хімічний склад, застосування у народній, науковій медицині та гомеопатії арніки гірської та арніки листяної. Аналіз доступних джерел літератури показав, що арніка гірська, особливо її суцвіття, серед рослин роду є найбільш вивченою і широко використовується у народній та науковій медицині. Інші види, зокрема арніка листяна, яка культивується, в тому числі, на теренах України, у хімічному та фармакологічному аспектах практично не вивчалася. Таким чином, у результаті проведеного аналізу джерел літератури, ми зробили висновок, що дослідження культивованої арніки листяної з метою розширення сировинної бази і створення на її основі нових лікарських засобів, є перспективним.

Фітохімічний аналіз біологічно активних речовин трави арніки гірської та арніки листяної

Об'єктом дослідження було обрано траву арніки гірської, яку заготовляли у червні - серпні в Українських Карпатах у районі м. Ворохта, та траву арніки листяної, яку збирали на дослідних ділянках Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського.

У результаті попереднього дослідження трави арніки гірської та арніки листяної за допомогою якісних реакцій, хроматографії на папері та у тонкому шарі сорбенту виявлено наявність дубильних речовин, флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, амінокислот, гетерополісахаридів, каротиноїдів та аскорбінової кислоти.

У спиртово-водних витягах трави арніки гірської та арніки листяної було ідентифіковано 5 флавоноїдів: кверцетин, рутин, морин, кверцитрин та гесперидин; 4 гідроксикоричні кислоти: кофейна (3,4-дигідроксикорична, С₉Н₈О₄), ферулова (3-гідрокси-4-метоксикорична, С₁₀Н₁₀О₄), хлорогенова (5-О-кофеїл-П-хінна, С₁₆Н₁₈О₉), неохлорогенова (3-О-кофеїл-П-хінна, С₁₆Н₁₈О₉ ). У хлороформному витязі арніки виявлено 6 речовин каротиноїдної природи. Встановлено, що до полісахаридів і пектинових речовин арніки гірської входить D-глюкоза, L-арабіноза та глюкуронова кислота; до полісахаридного комплексу арніки листяної - L-арабіноза, D-ксилоза і D-глюкоза; пектинові речовини арніки листяної представлені 4-а моноцукрами: D-глюкозою, L-арабінозою, D-ксилозою та глюкуроновою кислотою.

На підставі фізико-хімічних властивостей, хімічних перетворень, даних хроматографічного аналізу, УФ- та ІЧ-спектроскопії, якісних реакцій та порівняння з достовірними зразками у траві арніки гірської і арніки листяної ідентифіковано речовини фенольної структури: похідні коричної кислоти (ферулова, хлорогенова, неохлорогенова і кофейна) та 2-фенілбензо-г-пірону (кверцетин, кверцитрин, морин і рутин) (табл. 1).

Таблиця 1. Основні фізико-хімічні властивості речовин, виділених з трави арніки гірської та арніки листяної

Речовина, її структурна характеристика	Джерело отримання сполук	Загальна формула	Тпл., 0С	[]20D, град	Значення Rf у системах розчинників
					А	Б	В
Похідні коричної кислоти
Кофейна кислота (3,4-дигідроксикорична кислота)	тАГ тАЛ	С9Н8О4	194-196	-	0,80	0,50	0,30
Ферулова кислота (3-гідрокси-4-метоксикорична кислота)	тАГ тАЛ	С10Н10О4	168-170	-	0,88	0,55	0,44
Хлорогенова кислота (5-О-кофеїл-П-хінна кислота)	тАГ тАЛ	С16Н18О9	202-204	-32,1	0,62	0,70	0,65
Неохлорогенова кислота (3-О-кофеїл-П-хінна кислота)	тАГ тАЛ	С16Н18О9	аморфн.	+2,6	0,54	0,75	0,70
Кверцетин (3,5,7,3`,4`-пентагідроксифлавон)	тАГ тАЛ	С15Н10О7	310-312	-	0,67	0,07	-
Кверцитрин (кверцетин-3-О--D-рамнопі-ранозид)	тАГ тАЛ	С21Н20О11	182-185	-	0,62	-	0,39
Морин (3,5,7, 2`,4`-пентагідроксифлавон)	тАГ тАЛ	С15Н10О7	288-290	-	0,76	0,27	0,68
Рутин (кверцетин-3-О-в-D-рутинозид)	тАГ тАЛ	С27Н30О16	189-192	-32,3 (етанол)	0,46	0,54	-

Примітка. Системи розчинників:

А - н-бутанол-оцтова кислота-вода (4:1:2);

Б - 15 % оцтова кислота;

В - 3 % оцтова кислота.

Кількісне визначення біологічно активних речовин у траві арніки гірської та арніки листяної

У даній частині роботи проведено порівняльний фармакогностичний аналіз двох представників рослин роду Арніка: дикорослої арніки гірської та культивованої арніки листяної. Визначено кількісний вміст основних біологічно активних речовин досліджуваних видів. Отримані результати використані для розробки проектів АНД на нову лікарську рослинну сировину.

Кількісне визначення загального вмісту полісахаридів проводили гравіметричним методом; вміст пектинових речовин - спектрофотометричним.

Сполуки фенольного комплексу визначали: дубильні речовини - методом перманганатометрії, флавоноїди - спектрофотометричним методом у перерахунку на рутин, гідроксикоричні кислоти - спектрофотометричним методом у перерахунку на хлорогенову кислоту.

Кількісний вміст вільних органічних кислот проводили титриметричним методом у перерахунку на яблучну кислоту; вміст аскорбінової кислоти - за реакцією з натрієвою сіллю 2,6-дихлорфеноліндофенолу, що ґрунтується на здатності аскорбінової кислоти окиснюватися до дегідроформи і відновлювати натрієву сіль 2,6-дихлорфеноліндофенолу до лейкоформи. Результати досліджень представлені у таблиці 2.

Таблиця 2. Кількісний вміст біологічно активних речовин у траві арніки гірської та арніки листяної

БАР	Вміст, % (n=5)
	Трава арніки гірської	Трава арніки листяної
Дубильні речовини	15,58 ± 0,17	16,95 ± 0,50
Флавоноїди	1,14 ± 0,003	1,59 ± 0,003
Гідроксикоричні кислоти	3,78 ± 0,01	6,08 ± 0,01
Водорозчинні полісахариди	4,61 ± 0,10	7,49 ± 0,01
Аскорбінова кислота	0,02 ± 0,004	0,05 ± 0,004
Вільні органічні кислоти	1,05 ± 0,17	1,35 ± 0,10

У результаті порівняльного аналізу встановлено, що вміст БАР у траві арніки листяної (культивованого виду) більший, ніж у траві дикорослої арніки гірської.

Нами вперше в Україні методом рідинної іонообмінної хроматографії вивчено якісний склад та кількісний вміст амінокислот у траві арніки гірської та арніки листяної. Результати представлені у таблиці 3.

Таблиця 3. Вміст амінокислот у траві арніки гірської та арніки листяної

Назва амінокислоти	Загальна формула	Кількісний вміст, мг/100 г
		Трава арніки листяної	Трава арніки гірської
Аргінін	С6Н14О2N4	2551,80	2470,98
Лізин	С6Н14О2N2	538,66	478,08
Аланін	С3Н7О2N	335,28	283,94
Треонін	С4Н9О3N	385,14	347,55
Гліцин	С2Н5О2N	286,51	226,95
Валін	С5Н11О2N	407,06	346,01
Серин	С3Н7О3N	443,96	394,02
Пролін	С5Н9О2N	619,83	698,55
Ізолейцин	С6Н13О2N	387,39	411,40
Лейцин	С6Н13О2N	548,03	530,18
Гістидин	С6Н9О2N3	405,49	385,62
Фенілаланін	С6Н11О2N	642,79	504,12
Глутамінова кислота	С5Н9О4N	1075,72	1028,17
Аспарагінова кислота	С4Н7О4N	1011,67	783,18
Тирозин	С9Н11О3N	487,72	435,35

У досліджуваних зразках виявлено 15 амінокислот, з яких 6 (лізин, треонін, валін, ізолейцин, лейцин, фенілаланін) належать до незамінних амінокислот, 9 (аргінін, аланін, гліцин, серин, пролін, гістидин, глутамінова та аспарагінова кислоти, тирозин) - до замінних. У рослинах виявлено значний вміст аргініну, глутамінової та аспарагінової кислот, фенілаланіну, проліну, лейцину та лізину.

Дослідження компонентного складу ефірної олії досліджуваної сировини проводили на хроматографі Agilent Technology 6890N з мас-спектрометричним детектором 5973N. Встановлено, що в ефірній олії арніки гірської міститься 32 речовини, що становить 75,44 %. У досліджуваній сировині у найбільшій кількості виявлено тимогідрохінон, що становить 23,73 %, каріофіленоксид - 14,29 %, 2-аліл-1,4-диметокси-3-метилбензол - 12,81 %, карвакрол - 4,13 %, метилтимол - 3,24 %, каріофілен - 2,89 %. У результаті досліджень трави арніки листяної встановлено, що в ефірній олії даної рослини міститься 86 різних речовин, серед яких ідентифіковано 37, що становить 50,83 %. Основними компонентами ефірної олії арніки листяної є гермакрен Д (6,57 %), оксид каріофілену (6,29 %), каріофілен (4,9 %), 2,3,5,6-тетраметилфенол (2,5 %), карвакрол (2,43 %), геранілізобутират (2,16 %). Спільними компонентами ефірної олії трави арніки гірської та арніки листяної є: б-терпінеол, тимол, карвакрол, каріофілен, гумулен та гермакрен D. арніка біологічний протизапальний антимікробний

Методом атомно-абсорбційної спектроскопії у траві досліджуваних видів арніки виявлено 16 макро- і мікроелементів. Відмічено високий вміст калію і магнію у траві арніки гірської та калію, кальцію і магнію у траві арніки листяної (табл. 4).

Таблиця 4. Елементний склад трави арніки гірської та арніки листяної

Елемент	Кількісний вміст елементів, мг/кг
	Трава арніки гірської	Трава арніки листяної
Натрій (Na)	157	306
Калій (K)	13200	17200
Магній (Mg)	6638	8325
Кальцій (Ca)	322	9392
Ферум (Fe)	80	850
Цинк (Zn)	-	22
Манган (Mn)	-	-
Купрум (Cu)	0,8	3,5
Нікол (Ni)	0,9	4,5
Кобальт (Co)	-	2,1
Плюмбум (Pb)	-	6,5
Барій (Ва)	40	35
Титан (Ті)	20,5	143,5
Ванадій (V)	2,0	2,6
Кадмій (Cd)	-	0,3
Стронцій (Sr)	28	38
Аурум (Аu)	0,96	2,23

У ліпофільній фракції трави арніки гірської ідентифіковано 11 жирних кислот, у арніки листяної - 10. В обох видах переважають поліненасичені жирні кислоти. Найбільший вміст у траві арніки листяної (42,59 %) та у траві арніки гірської (26,32 %) припадає на б-ліноленову кислоту. Лінолевої кислоти у траві арніки гірської міститься 24,54 %, у траві арніки листяної - 20,48 %. З насичених жирних кислот у обох видах арніки переважає пальмітинова кислота. ЇЇ вміст у траві арніки гірської становить 32,07 %, у траві арніки листяної - 23,45 % (рис. 1).

Рис. 1. Вміст жирних кислот у ліпофільній фракції трави арніки гірської та арніки листяної

У ліпофільній фракції трави обох видів арніки методом тривимірної флуоресцентної спектроскопії визначено кількісний вміст суми каротиноїдів і хлорофілів. Більший вміст даних пігментів спостерігається у траві арніки листяної: каротиноїдів - 43,66 мг/г, хлорофілів - 25,53 мг/г. Вміст хлорофілів в екстракті арніки гірської складає 9,61 мг/г, каротиноїдів - 2,21 мг/г.

Дослідження хімічного складу трави арніки гірської та арніки листяної показало її перспективність для використання у якості лікарської рослинної сировини.

Морфолого-анатомічний аналіз досліджуваних рослин роду Арніка

У даному розділі представлено результати порівняльного морфолого-анатомічного аналізу досліджуваної лікарської рослинної сировини, які були використані для розробки проекту АНД на нову сировину - траву арніки гірської та арніки листяної. Анатомічне дослідження трави арніки гірської та арніки листяної проведено вперше. Визначено діагностичні ознаки, що є характерними для двох досліджуваних видів рослин роду Арніка.

До спільних віднесено наступні ознаки:

· ізолатеральна анатомічна будова листкової пластинки; продиховий апарат аномоцитного типу. Верхня сторона листків у меншій мірі, нижня у значній - опушені, особливо над жилками і по краю листкової пластинки;

· характерні прості і залозисті трихоми;

· епідерма має вигляд тонкої, горбкуватої, темно-коричневої смужки. Базисні клітини епідерми прозенхімні, вузькі, з тонкими оболонками;

· основні і додаткові судинно-волокнисті провідні пучки - колатерального типу, відкриті, розміщені щільно, сполучені між собою міжпучковою склеренхімою;

· продихи орієнтовані уздовж осі стебла, овальні, аномоцитного типу, з 5-6 побічними клітинами.

Видоспецифічні ознаки трави арніки гірської:

· тип анатомічної будови стебла змінюється від пучкового на верхівці пагона до перехідного у середній зоні і майже безпучкового у нижній;

· на поперечних зрізах квітконосні верхівкові зони стебел округло-хвилясті;

· прості волоски 2-4-клітинні, загострені, найчастіше мертві, зустрічаються рідко, багато залозистих трихом;

· первинна кора квітконосів вузька, утворена 3-4 рядами спалої хлоренхіми і великими клітинами ендодерми;

· судини вузькі, переважно спіральні, кільчасто-спіральні та драбинчасті;

Видоспецифічні ознаки трави арніки листяної:

· анатомічна будова стебла пучково-перехідна;

· на поперечних зрізах квітконосні верхівкові зони стебел округлі;

· прості волоски 4-7-клітинні, донизу розширені, до верхівки загострені, найчастіше мертві, іноді зі спалими нижніми клітинами;

· первинна кора представлена 1-4 рядами пластинчастої коленхіми, 10 рядами пухкої хлоренхіми і крупноклітинною ендодермою;

· ксилема пучків променисто-судинна, переважають драбинчасті та пористі судини;

Визначені морфолого-анатомічні ознаки використано при складанні інформаційного листа “Відмінні морфолого-анатомічні ознаки дикорослої арніки гірської та культивованої арніки листяної”, який вводиться у практику Державної інспекції з контролю якості лікарських засобів обласних (місцевих) ВО “Фармація.

Отримання фармакологічно активних субстанцій з трави арніки гірської та арніки листяної та вивчення їх протизапальної та антимікробної активності

Визначено оптимальні умови отримання фармакологічно активних субстанцій з трави арніки гірської та арніки листяної, при яких екстрагується максимальна кількість БАР. Вивчався процес екстрагування суми фенольних сполук, а саме, флавоноїдів, гідроксикоричних кислот і дубильних речовин; полісахаридів, вільних органічних кислот та вільних цукрів. Як екстрагент використовували спирт 40 %, 70 % і гарячу дистильовану воду. Ефект екстрагування оцінювали при роздільній і ступеневій екстракції (спочатку екстрагування проводили спиртом , а потім гарячою водою).

Встановлено, що для трави обох видів арніки доцільно використовувати як екстрагент гарячу дистильовану воду, яка вилучає з досліджуваних зразків максимальну кількість БАР: з трави арніки гірської 27,84 %, з трави арніки листяної - 29,52 %.

На підставі отриманих результатів запропоновано технологію отримання екстракту з трави арніки гірської та арніки листяної (патент України за № 34254 від 11. 08. 2008 р. на „Спосіб отримання рослинної субстанції з протизапальною активністю”).

Вивчення протизапальної активності екстрактів арніки проводили на базі ЦНДЛ Національного фармацевтичного університету під керівництвом професора Л.В. Яковлєвої.

На моделі карагенінового та зимозанового набряку встановлено однакові за динамікою та вираженістю антиексудативні властивості водних екстрактів арніки листяної та арніки гірської. Відмічалось, що на моделі карагенінового набряку найбільшу протизапальну дію досліджувані об'єкти виявляють у дозі 75 мг/кг у період максимального розвитку запалення. Середня протизапальна активність екстракту арніки гірської та арніки листяної у дозі 75 мл/кг склала 36-40 %.

На моделі зимозанового набряку середня протизапальна активність екстракту арніки гірської дорівнювала 21 % у дозі 50 мг/кг і 18 % у дозі 75 мг/кг, а екстракту арніки листяної у аналогічних дозах - 32 % і 23 % (середня протизапальна активність препарату порівняння - гранул кверцетину була на рівні 16 %). Вищенаведене вказує на перспективність подальшого фармакологічного вивчення екстрактів арніки з метою створення ефективного протизапального засобу рослинного походження.

Антимікробну активність екстрактів арніки гірської та арніки листяної проводили на базі лабораторії мікробіологічних досліджень Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачовського під керівництвом доц. Покришко О.В. за методами серійних розведень.

Дослідження антимікробної активності екстрактів арніки гірської та арніки листяної показали, що нативні екстракти досліджуваної сировини проявляють виражену бактерицидну дію по відношенню до культури Pseudomonas aeruginosa та бактеріостатичну дію по відношенню до культури Escherichia coli, Staphylococcus aureus та Bacillus subtilis. Це свідчить про те, що екстракти обох досліджуваних видів арніки можна використовувати для профілактики і лікування гнійно-асептичних захворювань, які викликають вищеназвані бактерії.

Висновки

У дисертаційній роботі наведено результати порівняльного фармакогностичного дослідження нової лікарської рослинної сировини - трави двох видів рослин роду Арніка - дикорослої арніки гірської та культивованої арніки листяної. Визначено якісний склад та кількісний вміст біологічно активних речовин, проведено порівняльний морфолого-анатомічний аналіз трави досліджуваних видів, розроблена технологія одержання екстрактів арніки гірської та арніки листяної та проведено вивчення їх протизапальної та антимікробної активності.

1. Вперше проведено порівняльне фармакогностичне дослідження трави двох видів рослин роду Арніка: дикорослого - арніки гірської (Arnica montana L.) та культивованого - арніки листяної (Arnica foliosa Nutt.).

2. Фітохімічними та хроматографічними методами дослідження встановлено, що до складу арніки гірської та арніки листяної входять конденсовані дубильні речовини, флавоноїди, гідроксикоричні кислоти, полісахариди, амінокислоти, каротиноїди, аскорбінова кислота, які забезпечують їх фармакологічну активність. На основі фізико-хімічних властивостей виділених речовин фенольного характеру та продуктів їх хімічних перетворень, даних УФ- та ІЧ-спектроскопії, порівняння з „свідками” встановлено структуру гідроксикоричних кислот (хлорогенової, неохлорогенової, кофейної та ферулової) та флавоноїдів: кверцетину, кверцитрину, морину і рутину.

3. Визначено кількісний вміст фенольних сполук: флавоноїдів (у тАГ - 1,14 %, тАЛ - 1,59 %), гідроксикоричних кислот (у тАГ - 3,78 %, тАЛ - 6,08 %), дубильних речовин (у тАГ - 15,58 %, тАЛ - 16,95 %), а також органічних кислот (у тАГ - 1,05 %, тАЛ - 1,35 %), аскорбінової кислоти (у тАГ - 0,02 %, тАЛ - 0,05 %) та полісахаридів (у тАГ - 4,61 %, тАЛ - 7,49 %) у траві дикорослого та культивованого виду рослин роду Арніка.

4. Виявлено у траві обох видів арніки 15 амінокислот та 4 макро- (Na, K, Ca, Mg) і 12 (Fe, Zn, Cu, Ni, Co, Pb, Cd, Ва, Ті, V, Sr, Аu) мікроелементів. Встановлено значне накопичення калію і магнію.

5. Досліджено якісний склад та кількісний вміст ефірних олій арніки гірської та арніки листяної. Встановлено, що в ефірній олії арніки гірської міститься 32 речовини, що становить 75,44 %. В ефірній олії арніки листяної міститься 86 різних речовин, серед яких ідентифіковано 37, що становить 50,83 %. Спільними компонентами ефірної олії трави арніки гірської та арніки листяної є: б-терпінеол, тимол, карвакрол, каріофілен, гумулен та гермакрен D.

6. Вперше проведено дослідження ліпофільної фракції трави арніки гірської та арніки листяної. У ліпофільній фракції трави арніки гірської ідентифіковано 11 жирних кислот, у ліпофільній фракції арніки листяної - 10. У фракціях обох видів арніки переважають поліненасичені жирні кислоти: лінолева і ліноленова. Також визначено кількісний вміст каротиноїдів і хлорофілів. Вміст даних пігментів у траві арніки листяної становить 25,53 мг/г та 43,66 мг/г відповідно. Вміст хлорофілів в екстракті арніки гірської складає 9,61 мг/г, каротиноїдів - 2,21 мг/г.

7. Вперше вивчено морфолого-анатомічні діагностичні ознаки трави арніки гірської та арніки листяної. Визначені спільні для роду та видоспецифічні морфологічні та анатомічні ознаки.

8. Розроблено технологію одержання екстрактів трави арніки і проведено стандартизацію одержаних екстрактів. Більше утримання біологічно активних речовин в екстракті обґрунтувало використанням як екстрагента гарячої дистильованої води.

9. У результаті фармакологічних досліджень рідких екстрактів обох видів арніки на моделі карагенінового та зимозанового набряку стопи у щурів встановлена їх протизапальна активність. Також досліджено антимікробну активність екстрактів і доведено, що екстракти арніки гірської і арніки листяної проявляють виражену бактерицидну дію по відношенню до культури Pseudomonas aeruginosa та бактеріостатичну дію по відношенню до культури Escherichia coli, Staphylococcus aureus та Bacillus subtilis.

10. Розроблено проекти аналітично-нормативної документації на лікарську рослинну сировину „Трава арніки гірської” та „Трава арніки листяної”.

Список опублікованих за темою дисертації робіт

1. Демидяк О. Л. Визначення елементного складу суцвіття рослин роду Арніка / О. Л. Демидяк, І. В. Саска, С. М. Марчишин // Медична хімія. Ї 2006. Ї Т.8, № 2. Ї С. 121Ї123. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання статті).

2. Марчишин С. М. Історія застосування рослин роду Арніка в народній та науковій медицині / С. М. Марчишин, О. Л. Демидяк // Фармацевтичний журнал. Ї 2006. Ї №2. Ї С. 47Ї53.

3. Сіра Л. М. Анатомічна будова трави арніки гірської (Arnica montana L.) / Л. М. Сіра, О. Л. Демидяк, І. В. Саска // Фармацевтичний журнал. Ї 2007. Ї № 6. Ї С. 97Ї100. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання статті).

4. Демидяк О. Л. Анатомічна будова арніки листяної (Arnica foliosa Nutt.) / О. Л. Демидяк, С. М. Марчишин, Л. М. Сіра, Г. Р. Козир // Медична хімія. Ї 2007. Ї № 4. Ї С. 96Ї98. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання статті).

5. Демидяк О. Л. Аналіз ліпофільної фракції арніки гірської та арніки листяної / О. Л. Демидяк, С. М. Марчишин, О. М. Сопель // Медична хімія. Ї 2008. Ї № 1. Ї № С. 84Ї87. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання статті).

6. Яковлєва Л. В. Протизапальна активність рідких екстрактів різних видів арніки на моделі гострого ексудативного запалення, викликаного зимозаном / Л. В. Яковлєва, С. М. Марчишин, О. Ю. Кошова, О. Л. Демидяк // Фітотерапія. Часопис. Ї 2008. Ї № 2. Ї С. 36Ї38. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання статті).

7. Марчишин С. М. Амінокислотний склад арніки гірської та арніки листяної / С. М. Марчишин, О. Л. Демидяк // Фармацевтичний часопис. Ї 2008. Ї № 2 (6). Ї С. 48Ї50. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, написання статті).

8. Пат. 34254 U. Україна, МПК С11В1/10 (2008.01). Спосіб отримання рослинної субстанції з протизапальною активністю / С. М. Марчишин, О. Л. Демидяк, О. Ю. Кошова. - № u200800680; заявл. 01.11.2004; опубл. 15.06.2005, Бюл. № 6.

9. Гладиш Т. Дослідження хімічного складу арніки листяної / Т. Гладиш, І. Саска, О. Демидяк // 9-й Міжнародний медичний конгрес студентів і молодих учених, 21-22 квітня 2005 р.: матеріали конгресу . - Тернопіль, 2005. - С. 181.

10. Гладиш Т. Фенольні сполуки арніки листяної / Т. Гладиш, І. Саска, О. Демидяк // Х Міжнародний медичний конгрес студентів і молодих учених, 11-13 травня 2006 р. : матеріали конгресу. - Тернопіль, 2006. - С. 222.

11. Демидяк О. Компонентний склад ефірної олії арніки листяної (Arnica foliosa Nutt.) / О. Демидяк // Х Міжнародний медичний конгрес студентів і молодих учених, 11-13 травня 2006 р.: матеріали конгресу. - Тернопіль, 2006. - С. 223.

12. Демидяк О. Порівняльна характеристика анатомічної будови трави арніки гірської і арніки листяної / О. Демидяк, І. Саска // ХІ Ювілейний міжнародний медичний конгрес студентів і молодих вчених, присвячений 50-річчю заснування ТДМУ, 10-12 травня 2007 р.: матеріали конгресу. - Тернопіль, 2007. - С. 255.

13. Демидяк О. Дослідження фармакологічних властивостей арніки листяної / О. Демидяк // ХІІ Міжнародний медичний конгрес студентів та молодих учених. - Тернопіль, 2008. - С. 215.

14. Демидяк О. Л. Біологічно активні речовини рослин роду Арніка / О. Л. Демидяк // Сьогодення та майбутнє фармації: Всеукраїнський конгрес, 16-19 квітня 2008 р.: тези доповідей. - Х., 2008. - С. 124.

15. Марчишин С. М. Інтродукція Arnica foliosa Nutt. на території Західного Поділля / С. М. Марчишин, О. Л. Демидяк // Довкілля і здоров'я: Всеукраїнська науково-практична конференція, 24-25 квітня 2008 р.: тези доповідей. - Тернопіль, 2008. - С. 59.

16. Демидяк О. Л. Вивчення полісахаридного комплексу трави арніки гірської та арніки листяної / О. Л. Демидяк // Фармакогнозія ХХІ століття. Досягнення та перспективи: Ювілейна науково-практична конференція з міжнародною участю, 26 березня 2009 р.: тези доповідей. - Х. : Вид-во НФаУ, 2009. - с. 49.

17. Демидяк О.Л. Відмінні морфолого-анатомічні ознаки дикорослої арніки гірської та культивованої арніки листяної: інформ. лист / О.Л. Демидяк, С.М. Марчишин. - К. : Центр „Укрмедпатентінформ” МОЗ України, 2008. - № 242-2008. - 3 с. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень, підготовка до друку).

Анотація

Демидяк Ольга Лютославівна. „Фармакогностичне дослідження трави арніки гірської та трави арніки листяної”. - Рукопис. Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата фармацевтичних наук за фахом 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. Тернопільський державний медичний університет ім. І.Я. Горбачевського, Тернопіль, 2009.

Вперше проведено порівняльний фармакогностичний аналіз двох видів рослин роду Арніка: дикорослого - арніки гірської та культивованого - арніки листяної. Досліджено якісний і кількісний склад основних груп біологічно активних речовин двох видів арніки.

Встановлено, що трава арніки гірської та арніки листяної містять фенольні сполуки: дубильні речовини, флавоноїди, гідроксикоричні кислоти; полісахариди, амінокислоти, ефірні олії, органічні кислоти та аскорбінову кислоту. У ліпофільній фракції виявлено наявність жирних кислот, суми каротиноїдів і хлорофілів. У досліджуваній сировині також визначено 4 макро- і 12 мікроелементів.

З трави арніки гірської та арніки листяної виділено в індивідуальному стані 8 речовин фенольної природи.

Проведено морфолого-анатомічне вивчення двох видів арніки та розроблено проект АНД „Трава арніки гірської” та „Трава арніки листяної”.

Розроблено оптимальні технологічні умови отримання екстракту з трави арніки гірської та арніки листяної, досліджено їх протизапальну та антимікробну активність.

Ключові слова: арніка гірська, арніка листяна, фармакогностичне вивчення, біологічно активні речовини, морфолого-анатомічний аналіз, протизапальна, антимікробна активність.

Аннотация

Демидяк Ольга Лютославовна. „Фармакогностическое исследование травы арники горной и травы арники олиственной”. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия. Тернопольский государственный медицинский университет им. И.Я. Горбачевского, Тернополь, 2009.

Впервые проведено сравнительное фармакогностическое изучение двух видов растений рода Арника: дикорастущей - арники горной и культивируемой - арники олиственной. Изучен качественный и количественный состав основных групп биологически активных веществ двух видов арники.

Установлено, что трава арники горной и арники олиственной содержат фенольные соединения: дубильные вещества, флавоноиды, гидроксикоричные кислоты; полисахариды, аминокислоты, эфирные масла, органические кислоты и аскорбиновую кислоту.

Проведено определение количественного состава фенольных соединений в траве арники горной и арники олиственной. В траве арники горной содержится флавоноидов - (1,14±0,003) %, дубильных веществ - (15,58±0,17) %, гидроксикоричных кислот - (3,78±0,01) %; полисахаридов - (4,61±0,10) %, органических кислот - (1,05±0,17) %, аскорбиновой кислоты - (0,02±0,004) %; в траве арники олиственной - флавоноидов - (1,59±0,003) %, дубильных веществ - (16,95±0,50) %, гидроксикоричных кислот - (6,08±0,01) %; полисахаридов - (7,69±0,01) %, органических кислот - (1,35±0,10) %, аскорбиновой кислоты - (0,05±0,004) %.

Установлено, что эфирное масло арники горной содержит 32 вещества, эфирное масло арники олиственной - 86, из которых идентифицировано 37. Общими компонентами эфирных масел травы арники горной и арники олиственной являются: б-терпинеол, тимол, карвакрол, кариофиллен, гумулен, гермакрен D.

Изучен полисахаридный комплекс травы двух видов арники. Установлено, что в состав полисаридов и пектиновых веществ арники горной входит D-глюкоза, L-арабиноза и глюкуроновая кислота; в состав полисахаридного комплекса арники олиственной - L-арабиноза, D-ксилоза и D-глюкоза; пектиновые вещества арники олиственной представлены D-глюкозой, L-арабинозой, D-ксилозой и глюкуроновой кислотой.

Определен качественный состав и количественное содержание аминокислот; обнаружено 15 аминокислот - 6 незаменимых и 9 заменимых. Аспарагиновая и глукуроновая кислоты преобладают в траве исследуемых видов арники.

Методом атомно-абсорбционной спектроскопии в исследуемом сырье определено 4 макроэлементы (Na, K, Ca, Mg) и 12 микроэлементов (Fe, Zn, Cu, Ni, Co, Pb, Cd, Ва, Ті, V, Sr, Аu). В значительном количестве накапливается калий и магний.

В липофильной фракции травы арники горной установлено наличие 11 жирных кислот, в липофильной фракции арники олиственной - 10. В фракциях двух видов арники преобладают полиненасыщенные жирные кислоты: линолевая и линоленовая. С насыщенных жирных кислот преобладает пальмитиновая кислота.

Определено количественное содержание суммы каротиноидов и хлорофилла в липофильной фракции двух видов арники.

Из травы арники горной и арники олиственной выделено 8 индивидуальных веществ фенольной природы: 4 производных коричной кислоты (кофейная, феруловая, хлорогеновая, неохлорогеновая) и 4 производных 2-фенилбензо-г-пирона (кверцетин, квецитрин, морин и рутин).

Проведено морфолого-анатомическое изучение арники горной и арники олиственной, определены характерные для рода и специфические для вида морфологические и анатомические признаки.

Разработаны оптимальные технологические условия получения экстракта из травы арники горной и арники олиственной.

Фармакологические исследования, проведенные на базе ЦНИЛ Национального фармацевтического университета под руководством профессора Л.В. Яковлевой показали, что экстракты травы арники горной и арники олиственной проявляют противовоспалительную активность на моделях каррагенинового и зимозанового отека стопы у крыс.

Исследованиями, проведенными на базе лаборатории микробиологических исследований Тернопольского государственного университета им. И.Я. Горбачевского под руководством доц. Покрышко Е.В., установлена антимикробная активность экстрактов арники.

Разработан проект АНД на новое лекарственное сырье - „Трава арники горной” и „Трава арники олиственной”.

Получен патент Украины под № 34254 от 11.08.2008 г. „Способ получения растительной субстанции с противовоспалительной активностью”.

Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедр фармакогнозии и медицинской ботаники Национального фармацевтического университета, кафедры фармакогнозии и ботаники Львовского национального медицинского университета им. Данилы Галицкого, кафедры фармакогнозии с медицинской ботаникой Тернопольского государственного медицинского университета им. И.Я.Горбачевского, кафедры фармакогнозии Запорожского государственного медицинского университета, кафедры фармации Винницкого национального медицинского университета им. М.И.Пирогова.

Ключевые слова: арника горная, арника олиственная, фармакогностическое изучение, биологически активные вещества, морфолого-анатомический анализ, противовоспалительная, антимикробная активность.

Annotation

Demydyak Olga Lyutoslavivna. ”Pharmacognostik research of Arnika montana and Arnika foliosa grasses” - Manuscript. Thesis for the Degree of Candidate of Pharmaceutical Sciences, Specialty 15.00.02 - Pharmaceutical chemistry and Pharmacognosy. Ternopil State Medical University by I. Ya. Horbachevsky, Ternopil, 2009.

Pharmakognostic comparative analysis of two species of the Arnika genus: non-cultivated - Arnika montana and cultivated - Arnika foliosa has been done for the first time. The qualitative and quantitative composition of the major groups of biologically active compounds of two types of Arnika has been investigated.

It was established that grasses of Arnika montana and Arnika foliosa contain phenol compounds: tannin substances, flavonoids, hydroxycortic acids, polysaccharides, amino acids, essential oil, organic acid and ascorbic acid. The presence of fatty acids, karotynoids' and chlorophylls' general amount was indentified in the lypophylic fraction. 4 macro- and 12 micronutrients was also determined in the studied substances. From the Arnika montana and Arnika foliosa grasses in individual condition was allocated 8 phenol nature substances: 4 derivatives of coric acid (cofenic, ferulic, chlorogenic, neochlorogenic), 4 derivatives of 2-phenilbenzo-г-piron (quercetine, quecytrine, morine and rutine).

Morphological and anatomical study of two types of Arnika and project design of AND (analytic normative documentation) “The grass of Arnika montana” and "The grass of Arnika foliosa" has been made.

Optimal technological conditions to make the extract of Arnika montana and Arnika foliosa herbs was developed, their anti-inflammatory and antimicrobial activity was also studied.

Key words: аrnica montana, arnica foliosa, pharmacognostic study, biologically active substances, morphological - anatomical analysis, anti-inflammatory, antimicrobial activity.

Размещено на Allbest.ru

...