Удосконалення методів аналізу білків в субстанціях та лікарських формах лаферону та ронколейкіну

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика

УДК 577.11:542.951.1:615.281:615.277.3

Удосконалення методів аналізу білків в субстанціях та лікарських формах лаферону та ронколейкіну

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

Ясна Наталія Степанівна

Київ 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії імунореабілітології Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук,

старший науковий співробітник

Мартинов Артур Вікторович,

Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова

АМН України,

вчений секретар

Офіційні опоненти:

доктор фармацевтичних наук, професор

Ветютнева Наталія Олександрівна,

Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України,

завідуюча кафедрою фармацевтичної

хімії і фармакогнозії

доктор фармацевтичних наук, професор

Комісаренко Андрій Миколайович,

Національний фармацевтичний університет МОЗ України,

професор кафедри хімії природних сполук

Захист відбудеться „__21___”__грудня___2007 р. о ______годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.04 при Національній медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика (04112, м.Київ, вул. Дорогожицька, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л.Шупика (04112, м.Київ, вул. Дорогожицька, 9).

Автореферат розісланий „ __19_ ”__листопада___2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Л. Б. Пилипчук

інтерферон інтерлейкін хроматографія

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В номенклатурі лікарських засобів в останні роки значно збільшилася кількість інноваційних препаратів на основі високомолекулярних речовин. Міжнародною асоціацією фармацевтичних працівників (FIP) було визначено пріоритетним напрямком наукових досліджень - розробка високомолекулярних ліків. Ці ліки, у більшості випадків, містять рекомбінантні біотехнологічні білки, концентрація яких в лікарській формі незначна, або знаходиться не активний білок, а його відновлена денатурована форма (Ронколейкін). В останні роки за рубежем здійснюється створення стабільних ліофілізованих лікарських форм високомолекулярних речовин, здатних зберігатися протягом 2-3 років фактично без втрати активності за рахунок введення до складу лікарського засобу антиоксидантів та формоутворювачів, донорів окислення.

Здійснення контролю якості високомолекулярних ліків з використанням традиційних підходів фармацевтичного аналізу практично неможливо. Використання біологічних методів аналізу, які не є специфічними в умовах сучасних аналітичних лабораторій, обмежене у зв'язку з необхідністю забезпечення лабораторій культурами клітин, вірусами, ферментами, тваринами та створення спеціальних умов для проведення аналізу.

Тому розробка і удосконалення високочутливих, специфічних методів контролю якості високомолекулярних активних інгредієнтів у сучасних ефективних лікарських засобах є вельми актуальною.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності до плану науково-дослідних робіт АМН України та Інституту мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова “Забезпечити підвищення ефективності щеплень населення шляхом використання технології ацилювання білкових та полісахаридних мікробних антигенів” (шифр теми АМН 71/2006, номер державної реєстрації 0106U003264, НДР є частиною Державної програми імунопрофілактики населення на 2002-2006 роки, затвердженою постановою Кабінету Міністрів України від 24.10.2002 р. № 1566); НДР “Ацильовані похідні білків та полісахаридів антигену синьогнійної палички, розробка на їх основі вакцин” (шифр теми АМН 70/2006, номер державної реєстрації 0106U003265). Автор виконувала фрагмент експериментальних досліджень з використанням високоефективної рідинної хроматографії (гель-фільтрації, іонообмінної та зворотньофазової хроматографії), пульс-гель-електрофорезу, імуноферментного аналізу, систематизувала отримані дані та здійснювала підготовку відповідних розділів звітів та публікацій.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження є наукове обґрунтування шляхів удосконалення методів ідентифікації, кількісного аналізу, визначення супровідних домішок в субстанціях та лікарських формах альфа-інтерферону (Лаферону) та інтерлейкіну-2 (Ронколейкіну).

Для досягнення поставленої мети вирішувалися такі завдання:

- провести науковий аналіз існуючих методів контролю якості високомолекулярних ліків та пошук сучасних інструментальних методів аналізу речовин білкової природи, придатних для аналізу лікарських форм;

- встановити кореляційний взаємозв'язок між біологічними методами визначення активності Лаферону та методами високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ), пульс-гель-електрофорезу;

- встановити кореляційний взаємозв'язок між біологічними методами визначення активності Ронколейкіну та методами ВЕРХ, пульс-гель-електрофорезу;

- оптимізувати методологічні підходи щодо використання високоефективної рідинної хроматографії для ідентифікації, кількісного аналізу Лаферону і Ронколейкіну у субстанціях та лікарських формах, визначення в них супровідних домішок;

- оптимізувати методологічні підходи щодо використання пульс-гель-електрофорезу для ідентифікації, кількісного аналізу Лаферону і Ронколейкіну у субстанціях та лікарських формах, визначення в них супровідних домішок;

- оптимізувати методологічні підходи щодо використання імуноферментного аналізу для ідентифікації, кількісного аналізу, Лаферону і Ронколейкіну у субстанціях та лікарських формах, визначення в них супровідних домішок;

- розробити проекти аналітичної нормативної документації на Лаферон та Ронколейкін, які базуються на інструментальних методах аналізу.

Об'єкти дослідження: білкові субстанції Лаферон (Лаферобіон) - б -2-інтерферон, Ронколейкін - інтерлейкін-2 відновлений (ІЛ-2), їх лікарські форми - ліофілізований стерильний порошок для приготування ін'єкційних розчинів.

Предмет дослідження: фізико-хімічні, біологічні властивості Лаферону та Ронколейкіну, кореляція між біологічними методами визначення активності та методами ідентифікації, кількісним вмістом діючих речовин з використанянм високоефективної рідинної хроматографії, пульс-гель-електрофорезу та імуноферментного аналізу.

Методи дослідження: стандартизація Лаферону та Ронколейкіну здійснювалася шляхом підтвердження їх структури, визначення молекулярної маси та заряду методами пуль-гель-електрофорезу, гель-фільтрації, йонообмінної хроматографії, високоефективної рідинної хроматографії, імуноферментного аналізу для встановлення залежності біологічної активності від концентрації білків задля заміни біологічних методів стандартизації на інструментальні фізико-хімічні методи в аналітичній нормативній документації.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено порівняльне дослідження біологічного та інструментальних методів визначення активності й концентрації основних діючих речовин в лікарських формах Лаферону (Лаферобіону) та Ронколейкіну.

Вперше підібрані оптимальні умови пептидного картування суміші олігопептидів після трипсинолізу основної діючої речовини з лікарських форм Лаферону (Лаферобіону) та Ронколейкіну з використанням пульс-гель-електрофорезу.

Вперше застосовано метод ферментативного відновлення забруднених пептидами та смолами хроматографічних колонок для ВЕРХ.

Вперше підібрані умови йонообмінного хроматографування Лаферону на ВЕРХ - системах, що добре відтворюються та дозволяють чітко встановити як концентрацію діючих речовин так і домішки.

Вперше вивчені можливості застосування імуноферментного методу для ідентифікації та кількісного аналізу субстанцій Ронколейкіну та Лаферону в лікарських формах.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані дані дають змогу замінити високовартісні біологічні методи аналізу Лаферону та Ронколейкіну на швидкі і зручні інструментальні методи аналізу: ВЕРХ, пульс-гель-електрофорез та імуноферментний метод аналізу. Підготовлені проекти аналітичної нормативної документації на Ронколейкін і Лаферон (Лаферобіон), які будуть впроваджуватися в умовах ЗАТ “Біофарма” згідно з договором про співпрацю.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота являє собою самостійну завершену наукову працю. Дисертанту належить вирішальна роль у визначенні мети дослідження, шляхів її реалізації, плануванні експерименту, обробці, інтерпретації та узагальненні одержаних результатів, формуванні основних положень та висновків, що захищаються. Крім того, проведений аналіз літературних даних щодо сучасного стану застосування методів фармацевтичного аналізу білкових лікарських засобів та про особливості встановлення структури і властивостей білків в нанокількостях у лікарських формах. Особисто дисертантом досліджено понад 50 зразків різних серій лікарських форм Лаферону (Лаферобіону) та Ронколейкіну, розроблено методики визначення супровідних домішок, ідентифікації та кількісного аналізу цих засобів з використанням ВЕРХ на іонообмінних колонках, розроблені зміни до аналітичної нормативної документації на Ронколейкін та Лаферобіон, що передбачають виключення з аналізу дорогих біологічних методів.

Приносимо глибоку подяку д.фарм.н., професору Кисличенко В.С., к.мед.н., с.н.с. Смілянській М.В., д.х.н., професору Михальській Л.Л., директору “Фармадем” д.ф.н., професору Демченку А.М. за надання реактивів, обладнання і можливість проведення досліджень, директору ТОВ “Чергова аптека” Маничу Д.О. за люб'язно надані для дослідження зразки препаратів “Пролейкін” (Кайрон, Нідерланди); “Інтрон” (Шерінг-Плау, США) та “ПЕГ-інтрон” (Шерінг-Плау, США).

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися та обговорювалися на міжнародних науково-практичних конференціях „Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями” (Харків, 2005), „Пошук та розробка нових профілактичних і лікувальних протимікробних засобів, антисептиків, дезінфектантів та пробіотиків” (Харків, 2006), наукових семінарах в Інституті мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України (2005, 2006, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, серед яких 5 статей (4 статті у наукових фахових виданнях), 2 тези доповідей, 1 методичні рекомендації та 2 звіти про виконання НДР.

Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 125 сторінках машинопису, ілюстрована 33 рисунками, 8 таблицями, включає 1 додаток і складається із вступу, огляду літератури, 4 розділів власних досліджень, загальних висновків та списку використаних джерел, що містить 107 найменувань, з них 96 іноземних. Обсяг основного тексту дисертації 110 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Розділ 1. Сучані модифікації ВЕРХ, імуноферментного та імунофлюоресцентного методів в аналізі білкових ліків (огляд літератури)

Серед сучасних методів розділення, ідентифікації та дослідження білків одне з найважливіших місць займає високоефективна рідинна хроматографія. Слід зазначити, що методи аналізу чистоти, ідентичності нових активних, в т.ч. високомолекулярних речовин потребують постійного удосконалення. В останні роки метод ВЕРХ все частіше почали модифікувати шляхом комбінації з капілярним електрофорезом та мас-спектрометрією. Отримання та розділення біологічно активних білків - лікарських засобів - стало рутинною процедурою завдяки успіхам в області ВЕРХ. Фракціонування антигенів гістосумісності з використанням ВЕРХ було описано В.Л. Альваресом. Одними з перших розділення стандартних білків з використанням ВЕРХ провели Ф. Реньє та П. Ноель на носіях для ексклюзивної хроматографії, а В. ^Менч і В. ^Денен - на носіях для зворотньофазової ВЕРХ. Після того, як М. ^{Рубінштейн} та ін. вперше виділили 21 мкг активного інтерферону з лейкоцитів людини з використанням чотирьох послідовних етапів ВЕРХ, малу кількість біологічно активних білків з успіхом стали хроматографувати на доступних у продажі ВЕРХ-носіях. З 1979 року носії для колонок були в значній мірі удосконалені, про що детально описано в огляді Ф.^Реньє. В останні роки з'явилися публікації про розділення та встановлення автентичності напівсинтетичних похідних білків: важких ланцюгів токсину ботулізму (який використовується в косметологічній хірургії) та пегильованих білків.

ВЕРХ забезпечує більшу швидкість розділення, відтворюваність, чутливість та є найбільш універсальним методом, ніж традиційні хроматографічні методи, з використанням ВЕРХ можна проводити мікроаналітичні розділення на рівні пікомолей, аналітичні розділення на рівні наномолей, а також напівпрепаративне фракціонування на рівні 1-10 мкмоль речовин з молекулярними масами від 100 до 1000000 Да. Розробляються також препаративні варіанти ВЕРХ для розділення більше ніж 10 мкмоль білку в умовах експериментальних та серійних виробництв лікарських засобів.

В огляді літературних джерел здійснено порівняння способів виділення та стандартизації пікомольних кількостей біологічно активних білків з використанням ВЕРХ, на колонках для мікроаналізу, аналіз переваг та недоліків аналітичних та напівпрепаративних варіантів ВЕРХ, які використовуються для очищення речовин, оцінка методів кількісного аналізу білків за допомогою ВЕРХ з використанням прямих вимірювань оптичної густини та інших стандартних методів, акцентована увага на чутливості ВЕРХ, спеціальних прийомах для приготування розчинників та зразків, мірах для збереження біологічної активності білків після хроматографування.

Розділ 2. Об'єкти і методи досліджень

Як об'єкти досілдження використовували ліофілізований ІЛ-2 (Ронколейкін виробництва ЗАТ „Біофарма”, м. Київ) в дозі 1 млн. МО 14-ти різних серій. Враховуючи те, що активність в одиницях (1 млн. МО) фактично є результатом біологічного тестування, тому було використано дані лабораторії заводу виробника препарату за результатами біологічного тестування. Фракційну активність встановлювали через визначення здатності до активації бластної трансформації донорських лімфоцитів. Також використовували б-інтерферон (Лаферон, порошок ліофілізований 1 млн. МО, виробництва ЗАТ „Біофарма”, м. Київ).

В дослідженні також було використано дві основні модифікації високоефективної рідинної хроматографії: гель-хроматографія на сольових градієнтах та зворотньофазова хроматографія на силікагелевих колонках. Ідентифікацію фракцій проводили на УФ-детекторах при поглинанні в області 280 нм та 210 нм.

Молекулярні маси дослідних білків встановлювали за допомогою методу імпульсного гель-електрофорезу у поліакриламідному гелі (ПААГ). Цей метод дозволяє розділити та встановити масу білків, які відрізняються лише на одну амінокислоту.

Для ідентифікації, кількісного аналізу використовували також імуноферментні тест-системи ProConIF24 - для виявлення б-інтерферону та К-100 (ТОВ “Протеїновий контур”, С.-Петербург, Росія) - для виявлення інтерлейкіну-2 на імуноферментному рідері Stat-Fax 303.

Пептидне картування білків проводили за допомогою методу пептидного картування білків - білки стандартизували за продуктами їх ферментативного гідролізу.

Розділ 3. Обгрунтування використання високоефективної рідинної хроматографії білків в лікарських формах б-2-b-інтерферону (лаферону) та інтерлейкіну-2 (ронколейкіну)

Перший етап досліджень був пов'язаний з підбором оптимальних умов розділення суміші Ронколейкіну та Лаферобіону на різних градієнтах та буферних розчинах (табл.1).

На рис. 1 наведена хроматограма розділення суміші Ронколейкіну та Лаферобіону з використанням апротеніну як внутрішнього стандарту в умовах 1 Варіанту розділення (табл.1).

Рис. 1 Хроматограма розділення суміші Ронколейкіну (3 смуга) та Лаферобіону (5 смуга) із внутрішнім стандартом апротеніном (1 смуга)

Як видно з рис. 1, суміш двох білків та стандарту розділяється на 5 смуг поглинання. Перша смуга за масою відповідає смузі апротеніна (внутрішній стандарт), друга та четверта смуги - фрагменти білків, а третя та п'ята - відповідно інтерлейкін-2 та Лаферобіон. Показником якості розділення суміші білків є чітке відокремлення однієї смуги від іншої.

Таблиця 1

Ефективність розділення суми дослідних білків в залежності від використаного буферного розчину - елюенту

Варіанти градієнтів елюювання	Кількість смуг (n=3)	Наявність зон перекриття	Відхилення від маси внутрішнього стандарту, %
1	2	3	4
Варіант 1 (градієнт від 0,5% ТРИС до 5% ТРИС)	5	відсутні	±7,5
Варіант 2 (градієнт від 0,5% натрію фосфату до 5% натрію фосфату)	2 (3)	присутня	±15,0
Варіант 3 (градієнт від 0,5% амонію дигідрофосфату до 5% амонію дигідрофосфату)	7	відсутня	±7,5
Варіант 4 (Лінійний градієнт амонію гідрофосфату від 0 до 30%)	7	відсутня	± 5

Як видно з табл. 1, найбільш відтворюваними та точними, при найменшій похибці (відхиленні смуги внутрішнього стандарту), є результати розділення при використанні лінійного градієнту до 30% включно амонію гідрофосфату. Схожі результати спостерігаються при використанні амонію дигідрофосфату у варіанті 3 з градієнтом до 5%. Найгірші результати отримані при використанні варіанту 2 з градієнтом елюенту натрію фосфату: спостерігалося лише дві злиті смуги, які накладалися одна на одну (рис. 2). Цей факт свідчить про денатурацію та кон'югацію білків один з одним.

Подальше дослідження стосувалося отримання пептидної карти кожного з дослідних білків. На рис. 2 представлена пептидна карта альфа-інтерферону.

Рис. 2 Пептидна карта трипсинізованого альфа - інтерферону

Як видно з рис. 2 інтерферон гідролізується до 12 пептидів, де смуги № 10, 11 та 12 є характерними для дипептидів. Всі смуги поглинання вельми чітко відокремлені одна від одної.

Однією з важливих проблем в аналізі лікарських засобів з використанням сучасних інструментальних методів є зменшення собівартості аналізу. Це ж відноситься й до найсучаснішого фармакопейного методу аналізу лікарських засобів - високоефективної рідинної хроматографії. Недоліками цього методу є обмежена область застосування колонок та невеликий термін їх придатності. Ці колонки часто виходять з ладу при використанні забруднених зразків лікарських засобів. Середня кількість циклів для однієї колонки на прикладі Нуклеосил-18 складає 180-200 циклів. Після цього тиск значно збільшується та колонка забивається білковими та іншими високомолекулярними речовинами. В останніх найсучасніших хроматографах та відповідних колонках передбачена можливість промивання колонки шляхом пуску розчинника у зворотному напрямку. Такі колонки здатні витримувати тиск до 20 МПа в обох напрямках, але й коштують вони значно більше. В звичайних хроматографах класу “Міліхром” не передбачена можливість зворотного току рідини для промивки колонки, але є можливість поміняти місцями вхід та вихід колонки. Відновлена (промита) колонка здатна працювати ще 50-70 циклів, але після цього зворотне промивання вже не здатне відновлювати її властивостей. Відновленню заважають високомолекулярні речовини, сорбовані на носії (білки, полісахариди, полінуклеотиди та продукти їх окислення).

Метою дослідження було удосконалення методу регенерації колонки “Нуклеосил-18” та аналогічних за класом для подовження терміну їх служби без втрати якості розділення шляхом використання для регенерації 0,1% розчину ферментів трипсину, папаїну, амілази та нуклеази.

На рис. 3 приведена залежність між кількістю циклів експлуатації колонки Нуклеосил-18 та типом розділених речовин.

Рис. 3 Залежність між типом речовин, що розділялися, та кількістю циклів колонки до забруднення

Як видно з рис. 3, найшвидше колонка забруднювалася при розділенні високомолекулярного білку - ІЛ-2. Суміші пептидів гідролізату овальбуміну (ГО) та бичачого сироваткового альбуміну (БСА) менше забивали колонку, хоч до 100 циклу більшість смуг зливалася.

Контроль - папаверин - фактично не забруднював колонки та термін служби колонки не відрізнявся від паспортних даних. На рис. 4 показана залежність між типом речовин, що розділялися, та кількістю циклів колонки до забруднення при використанні ферментативної регенерації (один раз на 20 циклів).

Рис. 4 Залежність між типом речовин, що розділялися, та кількістю циклів колонки до забруднення при використанні ферментативної регенерації

Як видно з рис. 4, терміни придатності колонок при використанні ферментативної регенерації збільшилися майже до максимуму (до 124 циклів для біопроб). Використання колонки для зворотньофазової хроматографії відносно високомолекулярного білку - інтерлейкіну-2 - зменшувало час експлуатації колонки до 120 циклів, що на 8 циклів менше контролю.

Особливості лікарської форми Лаферону, використання йонообмінної хроматографії для його очистки та аналізу. Класична біотехнологія базується на роботі одного гена в клітині, і вихід цільового продукту в кількості 2 - 5 % від сумарних білків вважається задовільним. В генноінженерних продуцентах працюють десятки копій цільового гена в одній клітині, що дозволяє отримувати 10 - 15% цільового продукту від сумарних клітинних білків. Генноінженерна техніка дозволила створити штами мікроорганізмів, здатні синтезувати продукти як бактерійних генів, так і генів вищих організмів. Завдяки цьому медицина дістала можливість використовувати як ліки гормони, імуномодулятори, лімфокіни та багато ін. Система суперсинтезу людського рекомбінантного б-2-b-інтерферону - Лаферону - розроблена в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України під керівництвом чл.-кор. НАН України і АМН України В.А. Кордюма. Лаферон є аналогом Intron A (Roferon), Реаферона та інших генноінженерних рекомбінантних б-2-b-інтерферонів, що синтезуються в бактеріях.

Принципова особливість Лаферону полягає в технології його отримання. Перераховані аналоги, як і більшість інших генноінженерних продуктів, отримують за технологією, де ампліфікатором цільового гену є плазміди. Плазмідозалежні технології - високопродуктивні, але мають серйозний недолік: цільовий продукт, як правило, утворює в клітині водонерозчинні кристалоподібні форми, так звані "тільця включення". Технологія отримання Лаферону заснована на використанні як ампліфікатора цільового гену (гену інтерферону) бактеріофагу, в геном якого генноінженерним методом вбудований ген інтерферону. Бактеріофаг, заражаючи бактерійну клітину, розмножується в ній, копіюючи багато разів свою ДНК і вбудований в неї ген інтерферону, синтезує свої білки, у тому числі і інтерферон. На певній стадії розвитку бактеріофаг лізує бактерійну клітину. Інтерферон виходить в культуральну рідину, причому у водорозчинному стані, не утворюючи нерозчинних форм.

У зв'язку з тим, що компоненти клуьтуральної рідини також можуть потрапляти до лікарської форми, нами було проведене хроматографування Лаферону на йонообмінній смолі - диетиламіноетилцелюлозі (ДЕАЕ) з метою виявлення високомолекулярних фракцій. На рис. 5 представлені результати хроматографування лікарської форми Лаферону на ДЕАЕ-целюлозі з градієнтом калію фосфату.

а)

б)

Рис. 5 Хроматограма Лаферону - а) рН 4,5, гель ДЕАЕ-целюлози, колонка 10 см х 0,3 см², градієнт елюювання з калію фосфатом (від 0,01 до 0,5 М, рН 5-8), об'єм суміші для аналізу 50 мл; б) градієнт калію фосфату

Як видно з рис. 5 (а), на хроматограмі Лаферону спостерігається дві смуги поглинання - в області елюату 8 мл та 42 мл. Перша смуга відповідає компонентам клітинної стінки мікроорганізму-продуценту, а друга - інтерферону. Ця модифікація йонообмінного хроматографування Лаферону може бути використана для ідентифікації, встановлення концентрації основної діючої речовини та наявності високомолекулярних домішок у розчині з лікарської форми.

На рис. 6 представлена хроматограма розділення інтерлейкіну відновленого на колонці Synchropak RP-P. Ця колонка широко використовується для розділення білків та встановлення молекулярної маси окремих білків у порівнянні з контрольною сумішшю білків.

Рис. 6 Зворотньофазова хроматограма відновленого ІЛ-2 (колонка 0,41 см на 25 см Synchropak RP-P C₁₈)

Для хроматографування Ронколейкіну (рис. 6) використовували градієнт елюентів: розчин А - 0,1% трифторацетат; розчин Б - 65% ацетонітрил в 0,1% трифторацетаті, в такій послідовності: від 0 до 82% розчину Б, 10 хв; 82% розчину Б, 10 хв; від 82 до 100 % розчину Б, 24 хв; швидкість елюювання - 0,5 мл/хв. На хроматограмі ІЛ-2 спостерігалося дві смуги, які відповідали окисленій формі ІЛ-2 (смуга Х) та відновленій формі (смуга Y). Окислена форма елюювалася 56,5% ацетонітрилом, а відновлена - 59,5% ацетонітрилом, відповідно. Смуги поглинання обох ізоформ інтерлейкіну-2 досить чіткі та симетричні, незважаючи на наявність високомолекулярних домішок в області 10-30 хвилин. Ця модифікація високоефективної рідинної хроматографії є оптимальною для якісного та кількісного аналізу низькомолекулярних білків, таких як інтерлейкін, тому, що дозволяє чітко відокремлювати одну лізоформу від іншої.

Розділ 4. Ідентифікація лаферону та ронколейкіну з використанням пульс-гель-електрофорезу

До протеїнового складу Лаферону (Лаферобіону) входить б-2-b-інтерферон, його фрагменти, бівалентні кон'югати, денатуровані форми інтерферону. До складу лікарської форми часто входять такі допоміжні речовини: додецилсульфат натрію, меркаптоетанол, диметилсульфат, диметикон. Бромфеноловим блакитним та солями срібла забарвлюються виключно білки. Мурамілпептиди та полісахариди забарвлюються тільки бромфеноловим блакитним. Технологія очистки запобігає потраплянню до лікарських форм полінуклеотидів та полісахаридів, які є недопустимими домішками, у зв'язку з притаманними їм алергенними властивостями. Саме ці речовини повинні бути відсутні у складі лікарських форм.

Нами вивчені можливості модифікації методики розділення компонентів лікарської форми Лаферону. За результатами дослідження були сформульовані методологічні підходи щодо забезпечення оптимальних умов розділення компонентів лікарської форми, а саме: до складу поліакриламідного гелю нами внесено 0,0001% етідію броміду. Ця речовина специфічно зв'язується з полінуклеотидами, завдяки чому їх емісія в ультрафіолетовому світлі збільшується на два порядки, причому з'являється можливість встановлення в одному досліді наявності білків, полінуклеотидів та полісахаридів. Для ідентифікації останніх нами використовувався бромфеноловий блакитний. У зв'язку з тим, що бактеріальні полісахариди мають ряд особливостей (наявність у своєму складі залишків карбонових кислот - мурамової кислоти та її похідних), вони зв'язуються з барвником. На електрофореграмах при постійній напрузі полісахариди дають розмиті нечіткі смуги, характерні для розгалужених полімерів, які не забарвлюються солями срібла. Запропонована нами модифікація методики дозволяє більш чітко відокремити смуги окремих білків, навіть схожих за молекулярними масами, але різних за структурою та конформацією. На відміну від електрофорезу при постійній напрузі пульс-гель-електрофорез обумовлює чіткі та прямі смуги окремих речовин на електрофореграмах. Ці смуги не перекриваються та відокремлюються одна від одної. Окрім того, додавання етідію броміду дозволяє встановити наявність недопустимих домішок ДНК чи РНК, а також складних полімерів клітинної стінки - глікопротеїдів та фосфогліколіпідів.

Нами було проведено дослідження різних серій Лаферону та інтерферонів інших виробників з метою порівняння чистоти та відтворюваності методу пульс-гель-електрофорезу.

На електрофореграмі (рис. 7) представлені смуги після розділення різних зразків інтерферонів (Лаферону серії 2000 року, Реаферону, Інтрону) при імпульсі 3:1 на 10% ПААГ-гелі. Як електрофоретичний буфер використовували ТРИС-боратний буфер при рН=6,8, напруга 300 В.

Рис. 7 Електрофореграма розділення білків лікарських форм інтерферону : смуга 1- контроль суміші білків; смуга 2 - Лаферобіон серії 2007 року; смуга 3- контроль буферного розчину без білків; смуга 4 - Лаферобіон 2003 року; смуга 5 - Інтрон; смуга 6 - ПЕГ- інтрон; смуга 7 - Лаферон 2004 року; смуга 8 - Реаферон; смуги 9-11 - Лаферобіон 2007 року у двократних розведеннях

Як видно з рис. 7, Лаферобіону випуску 2007 року відповідає чітка пряма смуга 2, що свідчить про відсутність білкових домішок, полінуклеотидів та полісахаридів. Буферний розчин (носій) також є чистим та не містить білкових чи інших біополімерних домішок (смуга 3). Інтрон випуску 2000 року має більш розпливчату смугу (5), що свідчить про наявність кон'югатів більших за масою ніж сам інтерферон. ПЕГ- інтрон (смуга 6) має більшу молекулярну масу ніж нативний інтерферон. Найменш очищеним, таким, що містить полісахариди та полінуклеотиди, є Реаферон: смуга 8 займає область молекулярних мас як мономерів, так і бівалентних кон'югатів, а також пегильованого інтерферону (50-55 кДа). При двократному розведенні Лаферобіону (смуги 9-11) електрофореграми принципово не відрізняються від електрофореграм Лаферобіону (смуги 2,4,7).

Особливості розділення Ронколейкіну (інтерлейкін-2). Лікарська форма Ронколейкіну - інтерлейкіну-2 рекомбінантного (рІЛ-2) представляє собою сухий ліофілізований порошок для подальшого розведення, який містить сам рекомбінантний білок, солюбілізатор - додецилсульфат натрію, стабілізатор D-манніт, відновлювач - ренатуратор дитіотреїтол і амоній-гідрокарбонатний буфер.

Інформація про властивості і структуру молекули ІЛ-2 отримана з використанням методу електрофорезу в ПААГ за наявності додецилсульфату натрію, оцінки імунологічної ідентичності, аналізу амінокислотної послідовності молекули і визна-ченням специфічної біологічної активності в тесті з ІЛ-2-залежною лінією клітин CTLL-2.

За результатами дослідження концентрованого розчину ІЛ-2 було встановлено, що розмір основної смуги після проведення елек-трофорезу в ПААГ, відповідає 15 300 Да, його вміст у препараті коли-вається від 75 до 80 %. Виділений білок імунологічно повністю іден-тичний у тесті з моноклональними антитілами з ІЛ-2 людини і має специфічну біологічну активність в тесті з ІЛ-2-залежною лінією клітин CTLL-2. Аналіз амінокислотної послідовності N-кінцевого фрагмента цього білку і пептидної сполуки триптичного гідролізату, що одержа-ли після переварювання білка 15 300 Да трипсином, також підтверд-жує його ідентичність з ендогенним ІЛ-2. При електрофорезі, крім основної смуги, присутня додаткова сму-га, що відповідає низькомолекулярному білку 13 000 Да, вміст якого в препараті складає 15--20%. Визначення амінокислотної послідов-ності N-кінцевого фрагменту білка 13 000 Да показало, що він є уко-роченим варіантом білка 15 300 Да, що починається з 23-ї амінокис-лоти. "Інтерлейкінова природа" білка 13 000 Да підтверджується тим, що він специфічно взаємодіє з тими ж моноклональними антитілами, які були отримані до ІЛ-2 з молекулярною масою 15 300 Да, і має спе-цифічну біологічну активність в тесті з ІЛ-2-залежною лінією лімфо-цитів CTLL-2.

Обидва білки виділяються тільки з дріжджового екстракту шта-му, трансформованого плазмідою з геном ІЛ-2 людини; у дріжджовому екстракті контрольного штаму-реципієнта обидва білки відсутні. У препараті припустимий також незначний вміст димерів зазначе-них вище двох білків (не більше 2%). Чистоту препарату Ронколейкін визначають за сумарним вмістом піків "інтерлейкінової природи", що повинні складати не менше 93%. Крім білків "інтерлейкінової природи" у препараті припустима наяв-ність домішкових (дріжджових) білків, що в сумі не повинна переви-щувати 5%. Нами було проведено розділення різних зразків інтерлейкіну, в тому числі в динаміці при окисленні відновленої форми з використанням гель-електрофорезу. На рис. 8 представлені результати розділення Ронколейкіну за різних умов відновлення.

Як видно з рис. 8, лікарська форма Ронколейкіну містить виключно відновлену форму ронколейкіну (5 Е), тоді як активною діючою речовиною є окислена форма рІЛ-2 (3С, 4D, 6G,8M). При розчиненні лікарської форми у дистильованій воді (10 мл) спостерігається картина розділення смуг 6,7,8. Але недостатнє розведення не дає можливості перевести всю відновлену форму ІЛ-2 в активну окислену форму. Для кращого окислення невеликих об'ємів ІЛ-2 нами рекомендується використовувати 0,01% розчин пероксиду водню. Така модифікація методики аналізу дозволяє у невеликому об'ємі лікарської форми перевести протягом 10 хвилин всю відновлену форму інтерлейкіну в окислену.

Рис. 8 Хроматограма розділення різних зразків інтерлейкіну-2 (Ронколейкіну) за різних умов відновлення: 1(А), 2(B) - бичачий сироватковий альбумін в концентраціях 1 та 10 мкг/мл відповідно; 3(С), 4(D) - Ронколейкін окислений; 5(E) - Ронколейкін відновлений; 6(G) та 6(F) - суміш окисленої та відновленої форми рІЛ-2 відповідно; 7(J) та 7(H) - Ронколейкін в присутності у розчині додецилсульфата натрію та меркаптоетанолу; 8(K) - відновлений Ронколейкін, 8(М) - окислений інтерлейкін (у процесі окислення лікарської форми), 8L - невідома домішка пептидної природи

Розділ 5. Практичне використання удосконалених методик аналізу у контролі якості Лаферону та Ронколейкіну

Відібрані в попередніх дослідженнях умови для контролю якості Лаферону та Ронколейкіну дозволяють з використанням сучасних інструментальних методів аналізу встановити автентичність білку навіть без референт-зразків по фотографії гель-електрофореграми трипсиногідролізатів чи хроматограми ВЕРХ. Концентрація основної діючої речовини та форма білку (відновлена чи окислена) також можуть бути легко встановлені, але в аналізі кожного з дослідних препаратів є відмінності, пов'язані з особливостями лікарських форм, допоміжними речовинами, зарядами молекул, формою білків в ліофілізованих порошках. Результати досліджень дозволили нам сформулювати конкретні методичні вказівки щодо використання уніфікованих прилад-незалежних методів для подальшого удосконалення аналітичної нормативної документації на Лаферобіон та Ронколейкін.

Для ідентифікації Лаферону запропоновано використовувати пульс-гель-електрофорез двох зразків Лаферону - нативного та трипсинізованого. Як хроматограму для порівняння запропоновано використовувати еталон розділення, представлений в проекті АНД.

На рис. 9 наведено еталон хроматограми розділення лікарської форми Лаферону з використанням зворотньофазової ВЕРХ.

Рис. 9 Хроматограма Лаферону з використанням зворотньофазової системи на колонці Нуклеосил-18

Для кількісного визначення Лаферону запропоновано використовувати зворотньофазову ВЕРХ на градієнті ацетонітрилу (до 65%) за площею піку поглинання у порівнянні з внутрішнім стандартом чи зовнішнім білком-порівняння. Для ідентифікації недопустимих високомолекулярних домішок (фрагментів мікроорганізму-продуценту та компонентів поживних середовищ) також запропоновано використовувати зворотньофазову ВЕРХ в попередньо описаних умовах.

Для Ронколейкіну запропоновано проводити ідентифікацію з використанням пульс-гель-електрофорезу із введенням білків порівняння - бичачого сироваткового альбуміну в двох розведеннях у зв'язку з тим, що трипсиноліз призводить до появи дуже низькомолекулярних пептидів, які неможливо ідентифікувати в гелі (утворюється розпливчаста смуга).

Для кількісного визначення Ронколейкіну також пропонується використовувати зворотньофазову ВЕРХ на градієнті ацетонітрилу до 60%. Для зовнішнього стандарту можливе використання ліофілізованих білків-стандартів Bio-Rad чи Farmacia.

ВИСНОВКИ

1. Науково обґрунтовані шляхи удосконалення методів ідентифікації, кількісного аналізу та визначення супровідних домішок в субстанціях та лікарських формах альфа-інтерферону (Лаферону) та ІЛ-2 (Ронколейкіну); доведена перспективність включення методів високоефективної рідинної хроматографії, пульс-гель-електрофорезу до аналітичної нормативної документації на білкові ліки та встановлено їх кореляційний взаємозв'язок з біологічними методами вивчення активності Ронколейкіну і Лаферону; оптимізовано методологічні підходи до методів контролю якості Лаферону та Ронколейкіну на основі імуноферментного методу аналізу.

2. Вперше встановлено, що лінійний градієнт елюенту амонію гідрофосфату від 0 до 30% дозволив при мінімальній похибці розділити суміш білків та триптичних гідролізатів Лаферону при трикратному повторенні та найменшому часі проведення процедури розділення - до 10 хвилин включно.

3. Вперше встановлено, що трипсин не повністю гідролізує відновлену форму ІЛ-2; перед проведенням триптичного гідролізу його необхідно переводити в окислену форму.

4. Вперше встановлено, що при використанні ферментативної регенерації колонок для ВЕРХ, незважаючи на збільшення терміну їх експлуатації, розділення білків достовірно зменшує терміни служби колонок, що свідчить про наявність фракцій високомолекулярних речовин, стійких до використаних ферментів.

5. Вперше, завдяки регенерації зворотньофазових силікагелевих колонок за допомогою суміші ферментів обґрунтовано трикратне збільшення терміну їх експлуатації без зміни якості розділення.

6. Обгрунтовано оптимальний режим використання звротньофазової ВЕРХ з градієнтом ацетонітрилу від 0 до 60% для контролю якості Ронколейкіну.

7. Встановлено, що для аналізу Лаферону найбільш доступним та відтворюваним є метод розділення на йонообмінній диетиламіноетил-целюлозній ВЕРХ-колонці. Використання градієнту калію фосфату дає можливість чітко відокремити супровідні домішки від основної діючої речовини. Результати розділення Лаферону на ВЕРХ-колонці корелюють з результатами біологічних тестів.

8. Вперше обґрунтовано, що метод зворотньофазової ВЕРХ з градієнтом ацетонітрилу є оптимальним методом для інструментального підтвердження аутентичності білку за триптичним гідролізатом (пептидне картування) інтерлейкіну-2. Метод добре відтворюється, а колонки є доступними та недорогими.

9. Вперше доведено, що використання пульс-гель-електрофорезу дозволяє не тільки ідентифікувати низькомолекулярні білки та встановлювати наявність білкових домішок, але й встановити форму білку - денатуровану, окислену чи гібридизовану. Вперше встановлено, що застосування пульс-гель-електрофорезу на 10% поліакриламідному гелі при використанні ТРИС-буферного розчину чи трис-борат-буферу при рН=6,8 дозволяє досить точно та швидко відокремити один білок від іншого як у суміші трипсиногідролізату так і при використанні нативного білку.

10. Результати досліджень покладені в основу розробки змін до аналітичної нормативної документації, де біологічні методи контролю якості Лаферону та Ронколейкіну замінено на високоефективну рідинну хроматографію та пульс-гель-електрофорез.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ ВИКЛАДЕНО У ПУБЛІКАЦІЯХ

Статті у наукових фахових виданнях:

1. Ясна Н.С., Мартинов А.В. Порівняння ефективності фармакопейного біологічного методу встановлення активності (концентрації) ронколейкіну з імуноферментним і ВЕРХ - методами // Фармац. журн. - 2006. - № 1. - С. 70-73. (Дисертант особисто приймала участь у проведенні досліджень, написанні статті, узагальненні матеріалу).

2. Ясна Н.С., Шевцов І.М., Мартинов А.В., Костіна Т.А., Кисличенко В.С. Методологічні особливості використання імунологічних серологічних методів для якісного та кількісного аналізу наднизької кількості високомолекулярних лікарських засобів в лікарських формах // Фармац. журн. - 2005. - № 6. - С.54-59. (Дисертант особисто приймала участь у проведенні досліджень, написанні статті, узагальненні матеріалу).

3. Ясна Н.С. Удосконалення методів регенерації колонок для високоефективної рідинної хроматографії, які використовуються для розділення високомолекулярних речовин // Фармац. журн. - 2007 . - № 2. - С. 81-84.

4. Ясна Н.С., Мартинов А.В., Костіна Т.А., Кисличенко В.С. Високоефективна рідинна хроматографія лікарських засобів білкової природи в пікомольних кількостях // Фармац. журн. - 2006. - № 2. - С. 38-47. (Дисертант особисто приймала участь у проведенні досліджень, написанні статті, узагальненні матеріалу).

5. Городницька Н.І., Ясна Н.С., Мартинов А.В., Чернявський В.І., Козубова Г.М., Смілянська М.В., Осолодченко Т.П., Перемот С.Д., Романова О.А., Ігумнова Н.І., Сидоренко Т.А. Сучасний стан розробки хімічних вакцин для профілактики синьогнійної інфекції // Анн. Мечн. Інст-ту. - 2006. - № 3. - С. 4-17. (Дисертант особисто готувала розділ огляду, повязвний з хроматографічним виділенням, очищенням та стандартизацією білків синьогнійної палички з використанням ВЕРХ).

Тези доповідей:

6. Эпидемиологические и биологические особенности возбудителей сальмонеллеза людей и животных / С.А. Рыженко, Л.М. Сладкова, Н.М. Школьная, А.Г. Дьяченко, И.А. Воронкина, В.Ф. Шаповал, Л.М. Руденко, Н.С. Ясная, Н.П. Донец, Ю.В. Шатилло // Поиск и разработка новых иммунобиологических препаратов, профилактических и лечебных противомикробных средств, антисептиков, дезинфектантов и пробиотиков: Материалы международной научно-практической конференции (20-21 ноября 2006 года. - Харьков, 2006. - С. 22 (Дисертант особисто досліджувала кон'югати інтерферону з адгезинами сальмонели та готувала тези).

7. Ясная Н.С., Волянский Д.Л., Балута И.М., Дубинина Н.В., Волков А.А., Вальчук С.И., Лебедева И.Ю. Современные методические подходы к изучению адгезивных свойств клинически значимых условно-патогенных микроорганизмов // Поиск и разработка новых иммунобиологических препаратов, профилактических и лечебных противомикробных средств, антисептиков, дезинфектантов и пробиотиков: Материалы международной научно-практической конференции (20-21 ноября 2006 года. - Харьков, 2006. - С. 28. (Дисертант особисто досліджувала кон'югати інтерферону з адгезинами мікроорганізмів та готувала тези).

Методичні рекомендації:

8. Лабораторна діагностика та діагностичні критерії змішаних гострих кишкових інфекцій / Ю.Л. Волянський, С.І. Похил, С.В. Бірюкова, С.А. Деркач, Н.Ф. Дзюбан, А.І. Носатенко, Н.С. Ясна, О.І. Клімов, І.Ю. Кучма, О.В. Стольнікова, В.М. Козько, І.А. Крилова, Е.О. Чулей, Н.П. Волянська, М.І. Краснов, О.О. Тарасов, В.Б. Стороженко, В.І. Лучик, М.Г. Божко, І.А. Вороніна, О.Я. Строга, С.А. Черняєв, В.Ф. Шаповал, Б.І. Панамарь // Методичні рекомендації МОЗ України. - Харків, 2005. - 53 с. (Дисертант особисто підготувала розділ із описом та методичними підходами щодо сучасних методів ідентифікації інфекційних білків з використанням ІФА, ВЕРХ).

Звіти про виконання НДР:

9. Забезпечити підвищення ефективності щеплень населення шляхом використання технології ацилювання білкових та полісахаридних мікробних антигенів: Звіт про НДР (заключний)/ Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України. - АМН 71/2006, номер державної реєстрації 0106U003264. - 82 с. (Дисертантом розроблена методика кількісного визначення інтерлейкіну-2 з використанням ВЕРХ як ад'юванта вакцин, підготовлений відповідний розділ звіту).

10. Ацильовані похідні білків та полісахаридів антигену синьогнійної палички, розробка на їх основі вакцин: Звіт про НДР (проміжний)/ Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова АМН України.- шифр теми АМН 70/2006, номер державної реєстрації 0106U003265 ). - 46 с. (Дисертантом особисто розроблена методика кількісного визначення інтерлейкіну-2 як ад'юванта вакцин методик пульс-гель-електрофорезу, підготовлений відповідний розділ звіту).

АНОТАЦІЇ

Ясна Н.С. Удосконалення методів аналізу білків в субстанціях та лікарських формах лаферону та ронколейкіну. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія.- Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л.Шупика, Київ, 2007.

Дисертацію присвячено питанням розробки методів аналізу біотехнологічних рекомбінантних білкових ліків Лаферобіону та Ронколейкіну. Відібрано оптимальні умови хроматографування лікарських форм вище означених білків. Показано, що зворотньофазова ВЕРХ з використанням градієнту ацетонітрила на колонках класу Нуклеосил-18 є оптимальним методом як кількісного, так і якісного аналізу лікарських форм. Окрім того, цей же метод можна успішно застосовувати для пептидного картування триптичних гідролізатів Лаферобіону та Ронколейкіну з метою підтвердження їх автентичності. Розроблений новий метод ферментативної регенерації колонок для ВЕРХ, який дозволяє від 10 до 100 разів підвищити терміни використання колонок для ВЕРХ. Експериментально відпрацьовані методики аналізу з використанням різних умов розділення для уніфікації інструментальних методів ВЕРХ, пульс-гель-електрофорезу, імуноферментного аналізу з метою їх включення до аналітичної нормативної документації.

Ключові слова: білки, Лаферобіон, Ронколейкін, інтерлейкін-2, альфа-інтерферон, ВЕРХ, електрофорез, імуноферментний аналіз, аналіз якості, фармацевтичний аналіз.



Ясная Н.С. Усовершенствование методов анализа белков в субстанциях и лекарственных формах лаферона и ронколейкина. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия. - Национальная медицинская академия последипломного образования имени П.Л.Шупика, Киев, 2007.

Диссертация посвящена вопросам разработки методов анализа биотехнологических рекомбинантных белковых препаратов Лаферобиона и Ронколейкина. В связи с тем, что в задачи входила унификация методик, нами были использованы несколько жидкостных хроматографов - Милихром А02, Милихром-4, Hewlett Pachard 1050, а также спектрофотометрический стриповый ридер (в видимой области) для иммуноферментного анализа StatFax 303 и электронное устройство для пульс-гель-электрофореза ВМ-4. В некоторых случаях дублирование исследований на хроматографах приводило к определенным трудностям. Например, Милихром-4 давал большое количество шумовых пиков поглощения, которые отсутствовали при использовании Милихрома А02 и НР 1050. Наиболее повторяемые методы были использованы нами для усовершенствования методов анализа компонентов лекарственных форм Лаферона и Ронколейкина. Экспериментально выбраны оптимальные условия хроматографирования лекарственных форм выше отмеченных белков. Признаком качественной хроматографической системы является незначительное отклонение полученной массы стандарта от реальной и отсутствие перекрывания полос поглощения. В данном случае наилучшей системой с 5% ошибкой был вариант с линейным градиентом гидрофосфата аммония от 0 до 30%.

Показано, что обратнофазовая ВЭЖХ с использованием градиента ацетонитрила на колонках класса Нуклеосил-18 является оптимальным методом как количественного, так и качественного анализа лекарственных форм. Кроме того, этот же метод можно успешно применять для пептидного картирования триптических гидролизатов Лаферобиона и Ронколейкина с целью подтверждения их подлинности. Разработан уникальный метод ферментативной регенерации колонок для ВЭЖХ, который позволяет от 10 до 100 раз продлить сроки использования колонок для ВЭЖХ. Бычий сывороточный альбумин и гидролизат овальбумина засоряют колонку в среднем после 90 циклов. Низкомолекулярный контроль папаверин засоряет колонку только при 130 циклах, что близко к реальному ресурсу колонки. Невзирая на то, что интерлейкин-2 является низкомолекулярным белком, он быстрее всего засоряет колонку и уже через 40 циклов колонка выходит из строя. Скорее всего, это связано с наличием в лекарственной форме лаферона додецилсульфата натрия, образующего мицеллы с силикагелем. Срок эксплуатации восстановленных колонок Нуклеосил-18 в среднем возрастает до 120 циклов, хотя для интерлейкина-2 он и остается самым низким. Следующий использованный нами метод анализа белков - ионообменная хроматография на диэтиламиноэтилцеллюлозе позволяет очистить белок, установить для него необходимый разброс ионной силы элюента и выделить его в чистом виде.

Экспериментально отработаны методики анализа с использованием разных условий разделения для унификации инструментальных методов ВЭЖХ, пульс-гель-электрофореза, иммуноферментного анализа с целью их включения в аналитическую нормативную документацию. Методики, результаты которых лучше всего воспроизводятся на разных хроматографах либо в повторениях были унифицированы и внесены в проекты ФС. Например, характерной для интерферонов в методе обратнофазовой жидкостной хроматографии высокого давления является раздвоенная полоса поглощения, которая характерна для двух физиологических изоформ интерферона: тетрамера и димера. Обе формы биологически активны и находятся в человеческом организме. Таким образом, вполне возможно полностью заменить биологические методы определения активности интерферона и интерлейкина жидкостной хроматографией, особенно, если использовать детекцию фракций в области 210 нм - по пептидным связям. В данном случае наблюдается линейная зависимость между экстинкцией и концентрацией белка.

Ключевые слова: белки, Лаферобион, Ронколейкин, интерлейкин-2, альфа-интерферон, ВЭЖХ, электрофорез, иммуноферментный анализ, анализ качества, фармацевтический анализ.

Yasnaya N.S. Improvement of an analysis method's of proteins in medical forms of laferon and ronkoleukin. - A manuscript. Dissertation on Ph.D in pharmacy 15.00.02 - pharmaceutical chemistry and pharmacognosy. - The National Medical Academy of Postgraduate Education named after P.L.Shupic, Ministry of Healthcare of Ukraine, Kiev, 2007.

Dissertation is devoted the questions of analysis methods development for biotechnological recombinant proteinous preparations Laferobion (Laferon) and Ronkoleukin. The optimal terms for medicinal forms of these drugs chromatographying are experimentally chosen. It is rotined that reversefase HPLC with the use of acetonitrile gradient on the Nukleosil-18 columns is the optimum method of both quantitative and high-quality analysis of medicinal forms. In addition, the same method can be successfully applied for peptid carted of triptic hydrolysates of Laferobiona and Ronkoleukin with the purpose of confirmation of their authenticity. The unique method of fermental regeneration of columns is developed for HPLC, which allows from 10 to 100 times to prolong the terms of the use of columns for HPLC . Analytical methods are experimentally confirmed with the use of different terms of division for standardization of such instrumental methods, as HPLC, pulse-gelelectrophoresis, ELISA- analysis with the purpose of their including in technical documentation (Pharmacopea article for medico-biological drugs).

Keywords: proteins, Laferobion, Ronkoleykin, interleukin-2, alpha-interferone, HPLC, electrophoresis, ELISA analysis, analysis of quality, pharmaceutical analysis.

Размещено на Allbest.ru

...