Люмінесцентне визначення деяких біологічно активних речовин за допомогою комплексів лантанідів з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ФІЗИКО-ХІМІЧНИЙ ІНСТИТУТ ім. О.В. БОГАТСЬКОГО

УДК 543.426: 541.49: 546.66: 547.831.9

ЛЮМІНЕСЦЕНТНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ДЕЯКИХ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН ЗА ДОПОМОГОЮ КОМПЛЕКСІВ ЛАНТАНІДІВ З ПОХІДНИМИ ОКСОХІНОЛІН-3-КАРБОНОВОЇ КИСЛОТИ

02.00.02 - Аналітична хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Скрипинець Юлія Володимирівна

Одеса-2007



Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі фармацевтичної хімії Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова та у відділі аналітичної хімії та фізико-хімії координаційних сполук Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України

Науковий керівник: кандидат хімічних наук, доцент Єгорова Алла Володимирівна, Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, старший науковий співробітник

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор Єфрюшина Нінель Петрівна, Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, завідувач відділу хімії лантанідів

кандидат хімічних наук, доцент Кормош Жолт Олександрович, Волинський державний університет ім. Лесі Українки, завідувач кафедри аналітичної хімії

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра аналітичної хімії.

Захист відбудеться “ 31 “ травня 2007 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 41.219.01 Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України за адресою: 65080, м. Одеса, Люстдорфська дорога, 86.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України (м. Одеса, Люстдорфська дорога, 86).

Автореферат розісланий “ 18 “ квітня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, к.х.н. Безлуцька І. В.



АНОТАЦІЯ

Скрипинець Ю.В. Люмінесцентне визначення деяких біологічно активних речовин за допомогою комплексів лантанідів з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.02. - аналітична хімія. - Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, Одеса, 2007.

Дисертація присвячена пошуку нових аналітичних форм на основі комплексних сполук іонів Ln(ІІІ) з новим класом реагентів - похідних 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти та використанню їх для люмінесцентного визначення біологічно активних речовин.

Встановлено, що іони Ln(ІІІ) утворюють з вивченими реагентами при рН 3.5-11.0 комплекси зі співвідношенням компонентів Ln(ІІІ):L = 1:1 при надлишку метала та 1:2 при надлишку реагенту. Визначені спектрофотометричні та кислотно-основні характеристики реагентів, квантові виходи та час життя їх лантанідних комплексів. Встановлено незначний вплив на сенсибілізовану люмінесценцію лантанідів у вивчених комплексах органічних розчинників, поверхнево - активних та донорно - активних речовин, а максимальна інтенсивність люмінесценції спостерігається в водних розчинах.

Комплекси Tb(III) з хіноксикаїном (L₁) та новими протитуберкульозними біологічно активними речовинами (L_15-17) застосовані для їх люмінесцентного визначення у плазмі крові у діапазонах 2.5-250.0 мкг/мл (L₁) та 0.5-500.0 мкг/мл (L_15-17). Встановлено, що люмінесценція комплексів Tb(III) та Eu(III) з новими реагентами суттєво зменшується у присутності фосфат-іонів, пероксиду водня та іонів Cu(II). Обговорені механізми гасіння люмінесценції Ln(ІІІ) у системах Eu(III)-L₁₀-Н₂О_2, Tb(III)-L₁₅-Н₂РО₄^- (Cu²⁺). Запропоновані чутливі методики люмінесцентного визначення пероксиду водню та лужної фосфатази, котра ферментативно розщеплює фенілфосфат натрію до фосфат - іонів.

Здатність L₁₅ до одночасного утворення комплексів Tb(III), Eu(III), Dy(III) та Sm(III) з високими люмінесцентними характеристиками використано для створення нового ефективного проявляючого розчину для цілей багатократного мічення в імунофлуоресцентному аналізі.

Встановлено, що люмінесценція комплексів Tb(III) з новими реагентами суттєво збільшується у присутності молекул ДНК. Розроблені високочутливі люмінесцентні зонди Tb(III) з L₁, L₁₀, норфлоксацином та діфлоксацином для визначення ДНК. Обговорені механізми взаємодії цих зондів з молекулами ДНК - електростатичний, інтеркаляційний та взаємодія бокових протонованих фрагментів лігандів комплексу з жолобом ДНК. Показано, що дані люмінесцентні зонди можна застосовувати для вивчення взаємодії ДНК з “малими молекулами” - лікарськими засобами.

Ключові слова: похідні 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти, тербій, європій, біологічно активні речовини, сенсибілізована люмінесценція, аналіз біооб'єктів. карбоновий кислота реагент люмінесцентний



АННОТАЦИЯ

Скрипинец Ю.В. Люминесцентное определение некоторых биологически активных веществ с помощью комплексов лантанидов с производными оксохинолин-3-карбоновой кислоты. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.02. - аналитическая химия. - Физико-химический институт им. А.В. Богатского НАН Украины, Одесса, 2007.

Диссертация посвящена поиску новых аналитических форм на основе комплексных соединений ионов Ln(ІІІ) с новым классом реагентов - производных 2-оксо-4-гидроксихинолин-3-карбоновой кислоты для люминесцентного определения биологически активных веществ.

Установлено, что ионы Ln(ІІІ) образуют с изученными реагентами при рН 3.5-11.0 комплексы с соотношением компонентов Ln(ІІІ):L = 1:1 при избытке металла и 1:2 при избытке реагента. Определены спектрофотометрические и кислотно-основные характеристики реагентов, квантовые выходы и времена жизни их лантанидных комплексов. Обнаружено незначительное влияние на сенсибилизированную люминесценцию лантанидов в изученных комплексах органических растворителей, поверхностно - активных и донорно - активных веществ, а максимальная интенсивность люминесценции наблюдается в водных растворах.

Комплексы Tb(III) с хиноксикаином (L₁) и новыми противотуберкулезными биологически активными веществами L_15-17, применены для их люминесцентного определения в плазме крови в диапазонах 2.5-250.0 мкг/мл (L₁) и 0.5-500.0 мкг/мл (L_15-17). Установлено, что люминесценция комплексов Tb(III) и Eu(III) с новыми реагентами существенно уменьшается в присутствии фосфат-ионов, пероксида водорода и ионов Cu(II). Обсуждены механизмы тушения люминесценции Ln(ІІІ) в системах Eu(III)-L₁₀-Н₂О_2, Tb(III)-L₁₅-Н₂РО₄^- (Cu²⁺). Предложены чувствительные методики люминесцентного определения пероксида водорода и щелочной фосфатазы, которая ферментативно расщепляет фенилфосфат натрия до фосфат - ионов.

Способность L₁₅ к одновременному образованию комплексов Tb(III), Eu(III), Dy(III) и Sm(III) с высокими люминесцентными характеристиками использована для разработки нового эффективного проявляющего раствора для целей многократного мечения в иммунофлуоресцентном анализе.

Установлено, что люминесценция комплексов Tb(III) с новыми реагентами существенно увеличивается в присутствии молекул ДНК. Разработаны высокочувствительные люминесцентные зонды Tb(III) с L₁, L₁₀, норфлоксацином и дифлоксацином для определения ДНК. Обсуждены механизмы взаимодействия этих зондов с молекулами ДНК - электростатический, интеркаляционный и взаимодействие боковых протонированных фрагментов лигандов комплексов с желобом ДНК. Показано, что данные люминесцентные зонды могут использоваться для изучения взаимодействия ДНК с “малыми молекулами” - лекарственными препаратами.

Ключевые слова: производные 2-оксо-4-гидроксихинолин-3-карбоновой кислоты, тербий, европий, биологически активные вещества, сенсибилизировання люминесценция, анализ биообъектов.



SUMMARY

Scripinets Y.V. The luminescent determination of some biologically active substances by means of lanthanide complexes with derivatives of 2-oxo-4-hydroxy-quinoline-3-carboxylic acid. - The manuscript.

The thesis for a candidate degree by speciality 02.00.02. - analytical chemistry - А.V. Bogatsky Physico-Chemical Institute of the National Academy of Sciences of Ukraine, Odessa, 2007.

The thesis is devoted to search of new analytical forms based on lanthanide complexes with a new class of reagents - derivatives of 2-oxo-4-hydroxy-quinoline-3-carboxylic acid for luminescent determination of biologically active substances.

It has been established, that ions Ln(ІІІ) form with the studied reagents at рН 3.5-11.0 complexes with the components ratio Ln(ІІІ):L = 1:1 in excess of metal and 1:2 in excess of a reagent. Spectrophotometric and the acid- base characteristics of reagents, quantum yields and lifetimes of complexes were determined.

Insignificant influence on the lanthanide sensitized luminescence in complexes of organic solvents is established, surfactants, synergetic agents has been established and the maximal intensity of the luminescence is observed in water solutions.

Complexes of Tb(III) ions with hinoxycaine (L₁) and new antituberculosis biologically active substances (L_15-17), have been applied for luminescent determination of these biologically active substances in blood plasma within concentration ranges 2.5-250.0 µg/ml (L₁) и 0.5-500.0 µg/ml (L_15-17). It has been established that the luminescence of Tb(III) and Eu(III) complexes with new reagents significantly decreases at presence of phosphate-ions, hydrogen peroxide and Cu (II) ions. Mechanisms of quenching of Ln(ІІІ) luminescence in systems Eu(III)-L₁₀-Н₂О_2, Tb(III)-L₁₅-Н₂РО₄^- (Cu²⁺) have been discussed.

The new effective enhancement solution for multiplex labeling in immunofluorescence assay has been offered. This solution allows to carry out simultaneous determination of Tb(III), Eu(III), Dy(III), Sm(III) ions with L₁₅ as an organic sensitizer.

It has been established that the luminescence of Tb(III) complexes significantly increases at presence of DNA molecules. The high-sensitive luminescent probes of Tb(III) with L₁, L₁₀, norfloxacin and difloxacin for determination of DNA have been developed. Mechanisms of interaction of these probes with DNA have been discussed. It has been shown that these luminescent probes can be used for studying interaction of DNA with “small molecules” - drugs.

Key words: derivatives of 2-oxo-4-hydroxy-quinoline-3-carboxylic acid, terbium, europium, biologically active substances, sensibilized luminescence, analysis of bioobjects.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останні роки для визначення низьких концентрацій лікарських препаратів та їх метаболітів, білків, ферментів, ДНК запропоновано застосування різноманітних варіантів флуоресцентного методу, у тому числі заснованого на характеристичній 4f - люмінесценції іонів лантанідів (Ln).

У випадку лантанідного імунофлуоресцентного аналізу одним з основних напрямків є розробка нових проявляючих розчинів, які дозволяють проводити високочутливе визначення декількох іонів лантанідів, що відкриває можливість визначення мічених ними різних антитіл.

Тільки в деяких роботах показані можливості люмінесцентного визначення сполук, виступаючих у якості “других” лігандів різнолігандних комплексів Ln(III), які чинять вплив (підсилюючий або гасящий) на спектрально - люмінесцентні властивості таких комплексів. В плані розвитку цього перспективного та актуального напрямку, що пов'язаний з використанням сенсибілізованної люмінесценції комплексів іонів лантанідів в біоаналітичній хімії, здійснена дана робота.

Зв'язок роботи з науковими темами, програмами, планами. Робота виконана на кафедрі фармацевтичної хімії Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова та у відділі аналітичної хімії та фізико-хімії координаційних сполук Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України відповідно до науково-дослідної тематики відділу та держбюджетних тем № 0103U001124 (шифр 2.16.267) “Використання сенсибілізованої люмінесценції лантанідів для визначення біологічно активних речовин” (2002-2004 рр.) та № 0102U001630 (шифр III -12.02.260) “Нові люмінесцентні сполуки лантанідів” (2002-2006 рр.).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є пошук нових аналітичних форм на основі комплексних сполук іонів лантанідів (ІІІ) з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти (L) для визначення деяких біологічно активних речовин.

Для досягнення цієї мети потрібно було вирішити такі задачі:

Встановити кислотно - основні властивості та деякі оптичні характеристики похідних 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти;

Вивчити взаємодію іонів Ln(III) з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти у подвійних (Ln-L) та потрійних (Ln-L-ДНК, Ln-L-фосфат-іонів, Ln-L-Сu(II), Ln-L-Н₂О₂) системах;

Показати можливість застосування досліджених систем у якості аналітичних форм для люмінесцентного визначення біологічно активних лігандів (L), ДНК, пероксиду водню та лужної фосфатази.

Об'єкт дослідження - комплекси Ln (ІІІ) з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти.

Предмет дослідження - комплекси Ln (ІІІ) з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти у якості аналітичних форм для люмінесцентного визначення деяких біологічно активних речовин.

Методи дослідження - спектрофотометрія, люмінесцентна спектроскопія.

Наукова новизна одержаних результатів.

Показана можливість утворення комплексів похідних оксохінолін-3-карбонової кислоти з іонами лантанідів як церієвої (Eu³⁺, Sm³⁺) так і ітрієвої (Tb³⁺, Dy³⁺) підгруп, які інтенсивно люмінесцирують, що дало можливість запропонувати новий проявляючий розчин для багатократного мічення в імунофлуоресцентному аналізі.

Показано, що максимальні значення квантових виходів (Ф) та часу життя збудженого стану (?) вивчених комплексів можуть бути отримані у водному середовищі без застосування органічних розчинників та поверхнево-активних речовин (ПАР), шо спрощує застосування цих аналітичних форм в біоаналізі.

Встановлено, що для люмінесцентного визначення компонентів, не утворюючих різнолігандних комплексів в системах іон Tb(Eu) -L - ДНК (фосфат - іони, Cu (II), H₂O₂), але які викликають збільшення (ДНК) або гасіння (фосфат - іони, Cu (II), H₂O₂) люмінесценції Ln(ІІІ), необхідно застосовувати співвідношення концентрацій Ln(ІІІ) : сенсибілізатор (L) = 1 : 1 або 2 : 1. Для визначення гасіїв найбільш ефективні подвійні комплекси Ln(ІІІ) : (L) з високим квантовим виходом (Ф>0.4 для іонів Tb та Ф>0.1 для іонів Eu), а для визначення ДНК - слабо люмінесцентні комплекси.

Запропоновані нові аналітичні форми на основі комплексів Tb(ІІІ) з діфлоксацином і норфлоксацином для високочутливого люмінесцентного визначення ДНК, а також для вивчення інтеркаляційної взаємодії противірусних лікарських сполук з молекулами ДНК.

Практичне значення одержаних результатів. На основі нових аналітичних форм - комплексних сполук Ln (ІІІ) з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти розроблені методики люмінесцентного визначення хіноксикаїну (анестетік) та протитуберкульозних біологічно активних сполук у плазмі крові з межами визначення 1.0 мкг/мл та 0.25 мкг/мл, відповідно; ДНК у модельних розчинах з межами визначення 0.5-10.0 нг/мл, пероксиду водню у воді з межею визначення 0.06 мкг/мл; лужної фосфатази у модельних розчинах з межею визначення 0.05 мU/мл. Показана можливість сумісного визначення іонів Tb (III), Eu (III), Dy (III), Sm (III) із застосуванням у якості органічного сенсибілізатора похідного 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти з метою багатократного мічення в імунофлуоресцентному аналізі.

Методика визначення пероксиду водню випробувана та впроваджена в практику роботи ЦЗЛ фармацевтичного підприємства ВАТ “ІнтерХім”.

Особистий внесок здобувача. Аналіз даних літератури, основний об'єм експериментальних досліджень та обробка експериментальних даних виконані безпосередньо автором. Постановка мети та задач дослідження, а також аналіз отриманих результатів проведено разом з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертаційної роботи доповідалися на Міжнародній конференції студентів та аспірантів „Сучасні напрямки розвитку хімії” (Одеса, 19-23 квітня 2004р.), V та VI Всеукраїнських наукових конференціях студентів та аспірантів "Сучасні проблеми хімії" (Київ, 20-21 травня 2004 р. та 16-18 травня 2005 р.), XVI Українській конференції з неорганічної хімії (Ужгород, 20-24 вересня 2004 р.), Всеросійській конференції "Аналитика Росии 2004" (Москва, 27 вересня - 1 жовтня 2004 р.), IX international conference on methods and applications of fluorescence (Lisbon - Portugal, September 4-7, 2005), Міжнародній конференції “Analytical chemistry and chemical analysis” (AC& CA - 05) (Kyiv, September 12-18, 2005), VIII і IХ конференції молодих учених та студентів -хіміків південного регіону України (Одеса, 22-23 листопада 2005 р і 16-17 жовтня 2006 р.), Euroоpt(R)ode VIII (Tubingen, April 2-5, 2006), сесії наукової ради НАН України з проблеми "Аналітична хімія" (Одеса, 22-26 травня 2006 р.), International congress on analytical sciences (Moscow, Russia, June 25-30, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 статей, 13 тез доповідей на наукових конференціях. Отримано 3 деклараційних патента України на корисні моделі.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, 5 розділів, висновків, списку цитованої літератури, що нараховує 264 найменування, містить 72 рисунка та 22 таблиці. Загальний обсяг дисертації складає 175 сторінок машинописного тексту.

Автор висловлює щиру подяку професору І.В. Українцю (Харківський національний фармацевтичний університет) за синтез похідних оксохінолін-3-карбонової кислоти, які були використані у дисертаційній роботі.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми, сформульовано мету та задачі дослідження, зазначено наукову новизну та практичне значення отриманих результатів.

У першому розділі (огляд літератури) систематизовані дані стосовно використання сенсибілізованої люмінесценції іонів лантанідів у біоаналізі, обговорені можливості та обмеження цих аналітичних форм. Показано широке застосування цього методу для визначення лікарських препаратів, які можуть хелатирувати іони Ln(III). Аналіз літературних даних свідчить про перспективи використання комплексних сполук Ln(III) для підвищення чутливості визначення ДНК та багатократного мічення в імунофлуоресцентному аналізі.

У другому розділі описані вихідні речовини та методики приготування їх розчинів, охарактеризовано використане обладнання та апаратура.

Усі використані у роботі реактиви були за кваліфікацією не нижче ч.д.а. Застосовані реагенти, похідні 2-оксо-4-гідроксихінолін-3 карбонової кислоти, були синтезовані, ідентифіковані та очищені у Національному фармацевтичному університеті (м. Харків). Спектри люмінесценції, збудження та час життя реєстрували за допомогою спектрофлуориметрів: ИСП-51 з ртутно-кварцевою лампою СВД-120А, Aminco-Bowman Series 2 (SLM - Aminco, Rochester, NY) з ксеноновою лампою 150-W, СМ2203 “SOLAR” (Беларусь) з ксеноновою лампою 150-W. Спектри люмінесценції іонів європію (III) реєстрували в області 560 - 650 нм; самарію (III) - 520 - 650 нм; тербію (III) - 480 - 620 нм; диспрозію (III) - 460 - 595 нм.

Вимірювання інтенсивності люмінесценції з часовим розрішенням проводили в чорних плоскодонних 96 - луночних мікропланшетах з полістирола (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany) на спектрофлуориметрі - Genios Plus (Tecan, Grцdig, Austria) з імпульсною ксеноновою лампою.

Спектри поглинання реєстрували на спектрометрах UV-2401 PC (Shimadzu) і Lаmbda-9 UV/VIS/NIR (Perkin Elmer).

ІЧ-спектри зразків у вигляді таблеток з КBr записані в області 400-4000 см^-1 на спектрофотометрі FTIR - 8400 S (Shimadzu).

Значення рН розчинів вимірювали за допомогою рН-метру ОР-211/1 зі скляним електродом.

У третьому розділі викладені результати вивчення спектральних властивостей 17 нових реагентів - похідних амідів 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти. В авторефераті більш докладно наведені результати дослідження реагентів L₁, L₁₀, L₁₅, L₁₆, L₁₇, лантанідні комплекси яких використані у роботі у якості аналітичних форм (табл.1).

Встановлено, що для цих сполук характерна наявність смуг поглинання в УФ - області спектра з високими молярними коефіцієнтами поглинання (е), а значення енергій триплетних рівней лігандів (Т) дозволяють припустити, що в комплексах іонів лантанідів з ними можливий перенос енергії збудження від органічної частини молекули комплексу до іону лантаніду.

Для даного класу вивчених органічних сполук стандартним спектрофотометричним методом були визначені константи іонізації. З отриманих даних можливо констатувати, що усі досліджені реагенти є слабкими органічними кислотами (рК от 5.83 до 7.85).

На прикладі L₂ показано, що константа іонізації в збудженому стані (рК = 6.89) (одержана по зміні власної люмінесценції реагенту) практично співпадає з такою, що отримана за результатами спектрофотометричних вимірювань, і підтверджує її правильність та дозволяє проводити співставлення люмінесцентних характеристик комплексів (?, Ф), отриманих у збудженому стані, з рК лігандів.

Комплексоутворення похідних хінолонкарбонової кислоти з іонами Ln(III) спостерігається в широкому інтервалі значень рН від 3.0 до 11.0 з максимумами люмінесценції при рН 8.0 - 9.0. При більш низьких значеннях рН ступінь утворення комплексів мала, а в лужних розчинах (при рН?9) хелатоутворенню пререшкоджає гідроліз іонів Ln (III). Показано, що іони лантанідів у недостачі ліганду або при еквімолярних концентраціях Ln:L₁-₁₇ утворюють комплекси зі співвідношенням компонентів Ln:L = 1:1, а у надлишку лігандів утворюють комплекси зі співвідношенням компонентів Ln:L = 1:2. За даними ІЧ - спектроскопії встановлено, що в координації приймає участь карбонільна група ліганду. Максимальна I_люм вивчених комплексів спостерігається в водних розчинах. Органічні розчинники, ПАР та донорно-активні речовини (ДАР) практично не підвищують I_люм хелатів, що свідчить про мінімальні втрати енергії збудження в подвійних комплексах.

Збільшення кислотних властивостей лігандів сприяє підсиленню люмінесцентних характеристик відповідних комплексів Eu(III) та Tb(III).

Встановлено збільшення I_люм комплексів: Tb(III) - L₁ (в 10 разів); Tb(III) - L₁₀ (в 25 разів); Tb(III) - норфлоксацин (Нор) (в 95 разів); Tb(III) - діфлоксацин (ДФ) (в 85 разів) у присутності ДНК, що свідчить про можливість застосовування цих комплексів у якості люмінесцентних зондів для високочутливого визначення ДНК. На прикладі комплексу Tb(III) - діфлоксацин у присутності різних кількостей ДНК наведені зміни у спектрах люмінесценції; спектрах збудження (спостерігається батохромний зсув на 3 - 10 нм); часу життя.

Встановлено, що при концентрації NaCl 2Ч10^-3 моль/л спостерігається зменшення інтенсивності люмінесценції системи Tb(III)-ДФ-ДНК на 50%. Це можливо пояснити електростатичною взаємодією комплексів з фосфатними групами ДНК, яка зменшується при збільшенні іонної сили середовища, що проявляється в зниженні I_люм.

У спектрах поглинання комплексів у присутності ДНК спостерігаються гіпо- та батохромні зсуви у порівнянні зі спектрами поглинання подвійних комплексів, що свідчить про інтеркаляційний механізм взаємодії. Для підтвердження механізму інтеркаляції комплексів з молекулами ДНК застосовували метод витиснення ними етідію броміду (ЕБ) з його сполуки з ДНК, та розраховували константи зв'язування запропонованих зондів з ДНК: lgK_Tb-L1=6.1±0.4; lgK_Tb-L10= 5.5±0.4; lg K_Tb-Нор = 4.56±0.11; lgK_Tb-ДФ = 4.69±0.12, які характерні для моноінтеркаляторів ДНК.

Висловлено припущення про можливі механізми взаємодії вивчених комплексів з молекулами ДНК:

електростатичний (взаємодія з фосфатними групами ДНК);

інтеркаляційний (фіксація комплексу між парами основ в молекулах ДНК);

можливість взаємодії бокових протонованих фрагментів лігандів комплексу з жолобом ДНК за рахунок утворення водневих зв'язків.

Для підтвердження можливості застосування запропонованих зондів для вивчення взаємодії ДНК з “малими молекулами” - лікарськими засобами було розглянуто витиснення ЕБ (за люмінесценцією ЕБ) та зонду Tb(III) - ДФ (за люмінесценцією тербію) з ДНК молекулами відомого противірусного лікарського препарату - аміксину.

Значення С₅₀, отримані за допомогою ЕБ та Tb(III)-ДФ, задовільно узгоджуються. Так як величина С₅₀ характеризує ступінь взаємодії лікарських препаратів з молекулами ДНК, то у рядах біологічно активних речовин, які близькі за структурою, можна використовувати запропоновані зонди - комплекси тербію (III) з L₁, L₁₀, Нор, ДФ.

Виявлено ефект гасіння люмінесценції комплексів тербію з досліджуваними реагентами фосфат-іонами. Із застосуванням цього ефекту на прикладі комплексу Tb (III) - L₁₅ показана принципова можливість посереднього високочутливого визначення лужної фосфатази (ЛФ), заснована на реакції ферментативного гідролізу фенілфосфату (ФФ):

Встановлено, що при збільшенні концентрації ЛФ спостерігається зменшення інтенсивності в спектрах люмінесценції комплексу Tb (III) - L₁₅, що обумовлено збільшенням концентрації фосфат - іонів у результаті ферментативного гідролізу ФФ. Встановлено, що не відбувається зміна часу життя збудженого стану ⁵D₄ іонів Tb(III) у присутності різних концентрацій ЛФ. Це свідчить про незмінність хімічної форми флуорофору (комплексу Tb (III) - L₁₅), а лише про зменшення його кількості за рахунок конкурентного комплексоутворення Tb (III) з фосфат - іонами. Даний вид гасіння може бути віднесений до статичного типу.

Введення в систему Eu(III) - L₁₀ = 1:1 пероксиду водню при рН 9.0 приводить до значного гасіння люмінесценції комплексу. При збільшенні концентрації Н₂О₂ спостерігається збільшення інтенсивності власної люмінесценції ліганду. Вимірювання часу життя збудженого стану ⁵D₀ іонів Eu(III) показало відсутність залежності ф від концентрації гасія (Н₂О₂). Даний вид гасіння можливо пояснити хімічною взаємодією комплексу Eu(III) - L₁₀ з Н₂О₂ у збудженому стані та відповідним зменшенням масової долі комплексу Eu(III) - L₁₀ при збільшенні концентрації Н₂О₂.

Виявлені ефекти гасіння люмінесценції комплексів Tb (III) - L₁₅ та Eu(III) - L₁₀ запропоновані для високочутливого люмінесцентного визначення лужної фосфатази та пероксиду водню.

Показана можливість високочутливого визначення іонів міді (II) по гасінню люмінесценції комплексної сполуки Tb(III) - L₁₅. Встановлено, що при додаванні Cu(II) до даного комплексу відбувається зменшення часу життя збудженного стану ⁵D₄ іонів Tb(III). Висловлено припущення, що ефект гасіння пов'язаний з конкуруючим комплексоутворенням іонів міді (II) з лігандом комплексу. Даний тип гасіння є змішаним (одночасне гасіння як по статичному, так і по динамічному механізмові). Межа визначення іонів міді (II) - 5 Ч10^-9 моль/л.

В п'ятому розділі показана можливість використання вивчених комплексів для високочутливого визначення органічних лігандів і сполук, підсилюючих (ДНК) або зменшуючих (лужної фосфатази і пероксиду водню) люмінесценцію аналітичних форм.

Для кількісного визначення нового місцевого анестетика - хіноксикаїна (L₁) і нових протитуберкульозних біологічно активних речовин (L₁₅-₁₇) у плазмі крові людини використовували метод додатків, який дозволяє елімінувати вплив біоматриці.

Для визначення пероксиду водню у воді використовували метод градуювального графіку. Методика апробована на змивних водах після дезінфекції 30% розчином Н₂О₂ обладнання водопідготовки на фармацевтичному підприємстві. Цей же метод використовували для визначення ЛФ за ефектом гасіння люмінесценції комплексу Tb (III) - L₁₅ фосфат - іонами.

Градуювальні графіки для визначення ДНК в інтервалах концентрації 1-100 нг/мл та 5-1500 нг/мл відповідно. Градуювальний графік для визначення ДНК в інтервалі більших концентрацій із затримкою у часі 40 мкс та з інтегруванням сигналу на протязі 1400 мкс

Запропанований ефективний проявляючий розчин для багатократного мічення в імунофлуоресцентому аналізі, який дозволяє проводити одночасне визначення Tb(III), Eu(III), Dy(III), Sm(III) із застосуванням у якості органічного сенсибілізатора похідного 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти (L₁₅), який дозволяє збільшити чутливість визначення іонів тербію (III) на порядок і диспрозію (III) на два порядки величин, у порівнянні з аналогічними методами, описаними в літературі.

Встановлена можливість визначення іонів Tb(III), Dy(III), Eu(III), Sm(III) при одній довжині хвилі збудження вузькополосні спектри лантанідів достатньо розділені що дозволяє вести їх визначення з однієї проби.

Для кількісного визначення іонів лантанідів використовували метод додатків. Порівняння меж визначення іонів лантанідів з використанням запропонованого проявляючого розчину та розчину порівняння на основі півалоілтрифторацетону та 1,10 - фенатроліну.

Усі розроблені методики дорівнюють або перевищують за чутливістю методики, які використовуються в аналітичній практиці, але перевершують їх за простотою та експресністю виконання.



ВИСНОВКИ

Запропоновані нові аналітичні реагенти - похідні амідів 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти, які дозволяють отримувати комплекси Tb(III), Eu(III), Dy(III), Sm(III) з високими люмінесцентними характеристиками без використання органічних розчинників, поверхнево активних речовин та додаткових донорно - активних лігандів.

Для всіх вивчених реагентів визначені їх константи іонізації та встановлено, що ліганди з найбільш сильними кислотними властивостями утворюють в більш кислій області комплексні сполуки з іонами лантанідів з найбільш високими значеннями квантових виходів та часу життя збудженого стану Ln(III).

Люмінесцентним методом вивчено утворювання подвійних комплексів європію (III) та тербію (III) з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти. Показано, що іони лантанідів утворюють з досліджуваним класом сполук комплекси у недостачі ліганду або при еквімолярних концентраціях Ln:L₁-₁₇ зі співвідношенням компонентів Ln:L = 1:1, а у надлишку лігандів утворюють комплекси зі співвідношенням компонентів Ln:L = 1:2.

Показано, що для люмінесцентного визначення компонентів, які не утворюють різнолігандні комплекси в системах іон Tb(Eu) - похідні оксохінолін-3-карбонової кислоти - ДНК (фосфат - іони, іони Cu(II), H₂O₂), але підсилють (ДНК) або гасять (фосфат - іони, іони Cu(II), H₂O₂), люмінесценцію Ln(ІІІ), потрібно застосовувати співвідношення концентрацій Ln(ІІІ):сенсибілізатор = 1:1 або 2:1. Для визначення гасіїв найбільш ефективні подвійні комплекси Ln(ІІІ) : (L) з високим квантовим виходом (Ф>0.4 для іонів Tb та Ф>0.1 для іонів Eu), а для визначення ДНК - слабо люмінесцентні комплекси.

Показана можливість ефективного застосування нових люмінесцентних зондів на основі комплексів Tb(III) для високочутливого визначення ДНК та вивчення інтеркаляційної взаємодії противірусних біологічно активних речовин з молекулами ДНК.

На основі нових аналітичних форм - комплексних сполук Ln(ІІІ) з похідними оксохінолін-3-карбонової кислоти розроблені методики люмінесцентного визначення L₁ (хіноксикаїна) та L_15-17 (протитуберкульозних біологічно активних речовин) у плазмі крові з межами визначення 1.0 мкг/мл та 0.25 мкг/мл, відповідно; ДНК у модельних розчинах з межами визначення 0.5-10.0 нг/мл; пероксиду водню в змивних водах при очищенні обладнання водопідготовки на фармпідприємстві з межею визначення 0.06 мкг/мл. Вперше знайдена можливість посереднього високочутливого люмінесцентного визначення лужної фосфатази в модельних розчинах за гасінням люмінесценції комплексу Tb(III) з похідним 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти з межею визначення 0.05 мU/мл. Показана можливість сумісного визначення іонів Tb(III), Eu(III), Dy(III), Sm(III) із застосуванням у якості органічного сенсибілізатора похідного 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти для цілей багатократного мічення в імунофлуоресцентному аналізі.



СПИСОК ПУБЛИКАЦІЙ

Егорова А.В., Скрипинец Ю.В., Антонович В.П., Украинец И.В., Сидоренко Л.В., Рыбаков В.Б., Чернышев В.В. Комплексные соединения лантанидов с гидрохлоридом (2 диэтиламиноэтил)-амида 1-аллил-4-гидрокси-2-оксо-1,2-дигидро-хинолин-3-карбоновой кислоты // Журн. орг. та фарм. хімії. - 2004. - Т. 2, вип. 4 (8). - С. 32 - 37.

Особистий внесок здобувача полягає в плануванні та виконанні експериментального дослідження люмінесцентних властивостей комплексу тербію (III) з похідним 2 - оксо - 4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти.

Скрипинец Ю.В., Егорова А.В., Антонович В.П., Украинец И.В. Люминесцентное определение некоторых новых противотуберкулёзных биологически активных соединений с помощью их тербиевых комплексов // Вісн. Одеськ. нац. ун-ту. Хімія. - 2005. - Т. 10, вип. 9. - С. 77-84.

Здобувачем встановлені умови утворення та люмінесцентні характеристики комплексів тербію (III) з новими протитуберкульозними біологічно активними сполуками. Проведено люмінесцентне визначення цих речовин у плазмі крові людини.

Скрипинец Ю.В., Егорова А.В., Украинец И.В., Антонович В.П. Люминесцентное определение ДНК с использованием в качестве зондов новых комплексных соединений тербия // Журн. аналит. химии. - 2006. - Т. 61, № 1. - С. 50-58.

Здобувачем виконана експериментальна робота по вивченню спектрально - люмінесцентних характеристик комплексних сполук тербію (III) з похідними амідів 2-оксо-4-гідроксіхінолін-3-карбонової кислоти та впливу на них молекул ДНК. З використанням цих комплексів розроблені люмінесцентні методики кількісного визначення ДНК.

Скрипинец Ю.В., Егорова А.В., Антонович В.П., Украинец И.В. Определение пероксида водорода в воде по тушению флуоресценции комплекса Eu (III) // Химия и технология воды. - 2006. - Т. 28, № 2. - С. 143-151.

Здобувачем вивчено люмінесцентні властивості комплексної сполуки Eu(III) з похідним 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти у присутності пероксиду водню. Розроблена методика визначення пероксиду водню у змивних водах. Проведено оцінку правильності та відтворюваності методики.

Скрипинец Ю.В., Егорова А.В., Антонович В.П., Украинец И.В. Люминесцентное определение щелочной фосфатазы с использованием комплексного соединения тербия(III) // Вісник УжНУ. - 2006. - вып. 16. - С. 100 - 106.

Здобувачем виконана експериментальна робота по вивченню люмінесцентних характеристик комплексу тербію (III) з похідним 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти у присутності лужної фосфатази, котра ферментативно розщеплює фенілфосфат натрію до фосфат - іонів. З використанням цього комплексу розроблено люмінесцентну методику кількісного визначення лужної фосфатази у модельному розчині.

Yegorova A.V., Scripinets Y.V., Duerkop A., Karasyov A.A., Antonovich V.P., Wolfbeis O.S. Sensitive luminescent determination of DNA using the terbium(III)-difloxacin complex // Anal. Chim. Acta. - 2007. - Vol. 584. - P. 260 - 267.

Особистий внесок здобувача полягає в плануванні та виконанні експериментального дослідження спектрально - люмінесцентних властивостей комплексу тербію (III) з діфлоксацином у присутності молекул ДНК. З використанням цього комплексу розроблено високочутливу люмінесцентну методику кількісного визначення ДНК.

Пат. 4837 A МПК7 G01N33/15. Спосіб кількісного визначення ДНК. / Скрипинець Ю.В., Єгорова А.В., Українець І.В., Антонович В.П. (Україна). - №20040403191; Заявл. 27.04.04; Опубл. 15.02.05, Бюл. №2. - 3 с.

Здобувачем розроблено методику кількісного визначення ДНК із застосуванням у якості люмінесцентного зонду комплексу тербію (III) з гідрохлоридом діетиламіноетиламіду-1-пропіл-2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти гідратом.

Пат. 4952 A МПК7 G01N33/15. Спосіб кількісного визначення ДНК./ Скрипинець Ю.В., Єгорова А.В., Українець І.В., Антонович В.П. (Україна). - №20040604207; Заявл. 01.06.04; Опубл. 15.02.05. Бюл. №2.- 4 с.

Здобувачем розроблено методику кількісного визначення ДНК із застосуванням у якості люмінесцентного зонду комплексу тербію (III) з гідрохлоридом амінобутиламіду-1,8-діметилен-2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти.

Пат. 14609 МПК G01N33/53. Спосіб сумісного визначення іонів тербію, диспрозію, європію і самарію в імунофлуоресцентному аналізі./ Скрипинець Ю.В., Єгорова А.В., Українець І.В., Антонович В.П. (Україна). - № U 200511683; Заявл. 08.12.05; Опубл. 15.05.06. Бюл. №5. - 4 с. Здобувачем розроблено методику сумісного визначення іонів тербію, диспрозію, європію і самарію з метою багатократного мічення в імунофлуоресцентному аналізі із застосуванням комплексів Ln(III) з похідним 2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової кислоти.

Скрипинец Ю.В. Использование комплексных соединений тербия (III) с амидами 2-оксо-4-гидроксихинолин-3-карбоновой кислоты для люминесцентного определения ДНК // Тез. доп. міжнародної конференції студентів та аспірантів „Сучасні напрямки розвитку хімії”. - Одеса. - 2004. - С. 111.

Скрипинец Ю.В. Сенсибилизированная люминесценция тербия в комплексе с хиноксикаином и ее использование в биоанализе // Тез. доп. V Всеукраїнської наукової конференції студентів та аспирантів „Сучасні проблеми хімії”. - Київ. - 2004. - С. 156.

Скрипинец Ю.В, Егорова А.В., Украинец И.В. Комплексные соединения европия (III) и тербия (III) с амидами 2-оксо-4-гидроксихинолин-3-карбоновой кислоты // Тез. доп. XVI Української конференції з неорганічної хімії. - Ужгород. - 2004. - С. 93.

Скрипинец Ю.В., Егорова А.В., Украинец И.В., Антонович В.П. Определение ДНК с использованием комплексных соединений тербия (ІІІ) в качестве люминесцентных зондов // Тез. докл. Конференции “Аналитика России”. - Москва. - 2004. - С. 121-122.

Скрипинец Ю.В. Люминесцентное определение пероксида водорода в воде // Тез. доп. VI Всеукраїнської наукової конференції студентів та аспірантів „Сучасні проблеми хімії”. - Київ. - 2005. - С. 171.

Scripinets Y., Alexandrova D., Yegorova A., Antonovich V. Determination of DNA by its enhancement effect on the fluorescence of Tb³⁺-norfloxacin complex // Book of abstracts International conference “Analytical chemistry and chemical analysis” (AC& CA - 05). - Kyiv. - 2005. - Р. 377.

Yegorova A., Scripinets Y., Karasyov A., Duerkop A., Wolfbeis O. Extremely sensitive luminescent determination of ds-DNA using the terbium (III) - norfloxacin complex // Book of abstracts 9th. International conference on methods and applications of fluorescence. - Lisbon - Portugal. - 2005. - P. 262.

Duerkop A., Yegorova A.,Turel M., Karasyov A., Lobnik A., Scripinets Y., Ukrainets I., Wolfbeis O., Sensitive probe for phosphate based on the quenching of the luminescence of a the terbium (III) - ligand complex // Book of abstracts 9th. International conference on methods and applications of fluorescence. - Lisbon - Portugal. - 2005. - P. 99.

Скрипинец Ю.В. Люминесцентные свойства комплексных соединений лантанидов с производными 2-оксо-4-гидроксихинолин-3-карбоновой кислоты и применение их в анализе // Тез. доп. VIII конференції молодих учених та студентів-хіміків південного регіону України. - Одеса. - 2005. - С. 32.

Turel M., Duerkop A., Yegorova A., Scripinets Y., Lobnik A. Detection of copper(II) in nanomolar concentrations by luminescence quenching of a Tb-ligand probe // Book of abstracts Euroоpt(R)ode VIII. - Tubingen. - 2006. - P. 171.

Скрипинец Ю.В. Люминесцентные свойства комплексов лантанидов с производными 2-оксо-4-гидроксихинолин-3-карбоновой кислоты и применение их в биоаналитической химии // Тез. доп. Cесії наукової ради НАН України з проблеми "Аналітична хімія". - Одеса. - 2006. - С. 72.

Scripinets Y., Yegorova A., Antonovich V. Application of the luminescence of lanthanide complexes with the 2-oxo-4-hydroxy-quinoline-3-carboxylic acid derivatives in bioanalytical chemistry // Book of abstracts International сongress on аnalytical sciences. - Moscow. - 2006. - P.127.

Скрипинец Ю.В. Люминесцентные определение ДНК с использованием в качестве зонда комплексного соединения тербия с дифлоксацином // Тез. доп. IX конференції молодих учених та студентів-хіміків південного регіону України. - Одеса. -2006. - С. 69.

Размещено на Allbest.ru

...