Методика выделения плазмидной ДНК
Выделения плазмидной ДНК. Методика внедрения плазмидной ДНК в клетки E. Coli. Порядок стерилизации глюкозы и лактозы. Сбор белка из раствора осаждением. Электрофарез в полиамидакрильном геле. Очистка и разделения белков методом аффинной хроматографии.
| Рубрика | Химия |
| Вид | отчет по практике |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 18.11.2015 |
| Размер файла | 25,4 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Министерство образования и науки Российской Федерации
Московский государственный университет тонких химических технологий имени М. В. Ломоносова
Кафедра химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А.Преображенского
Отчет по лабораторной практике
Выполнил: студент гр. БТ-32
А.С. Серегин
Руководитель: доц Н.В. Гроза
Москва 2015
Оглавление
Введение
Методика выделения плазмидной ДНК
Методика внедрения плазмидной ДНК в клетки E. Coli
Сбор белка из раствора
Электрофарез в полиамидакрильном геле
Аффинная хроматография
Введение
плазмидный стерилизация хроматография
В данном семестре мы изучали технику выделение и очистки белка PASS. На основе полученного опыта и знаний я составил отчёт, который включает в себя описание методов, применяемых на практике.
Информация, известная о PASS:
Расчетная молекулярная масса 12,8 кДа
Расчетная изоэлектрическая точка 4,68.
Вся информация, касающаяся пасса, сводится к информации о протеализине.
Методика выделения плазмидной ДНК
Приготовления:
1) Добавить и взболтать RNaseA к ресуспендирующему раствору.
2) Добавить этанол (96-100%) к промывочному раствору
|
#K0502 |
#K0503 |
||
|
Промывочный раствор |
20 мл |
100 мл |
|
|
Этанол 96% |
35 мл |
170мл |
|
|
Всего |
55 мл |
270 мл |
3) Проверить лизат и нейтрализующий раствор на содержание солей перед использованием.
4) Растворить можно путём нагревания до 37ОС и последующем охлаждении до 25ОС, при этом нельзя взбалтывать интенсивно
5) Работать только в перчатках.
Рост бактериальных культур:
1) Отобрать одиночную колонию из свежевыращенной посевной тарелки вместе с 1-5 мл LB (питательная среда с антибиотиком), пробу инкубировать в течении 12-16 часов при температуре 37ОС при вращении 200-250 об м/мин, использовать колбы с объёмом в 4 раза больше объёма пробы
2) Осадить бактериальную культуру с помощью центрифугирования 8000 об/мин в течении 2 мин при комнатной температуре и затем отделить жидкость
Весь процесс выделения плазмид проходит при комнатной температуре.
Все дальнейшие центрифугирования проходят при 10000 - 14000 об/мин
Для высококопийной плазмиды использовать 1-5 мл E. Coli в среде
Для низкокопийной плазмиды использовать 10 мл E. Coli в среде.
Методика:
1) Растворить клетки в 250 мкл ресуспендирующего раствора и перенести их в микроцентрифугаторы. Полностью растворить их пипеткой.
2) Добавить 250 мкл лизата и осторожно переворачивать пока суспензия не станет однородной. Срок хранения - 5 мин.
3) Быстро добавить 350 мкл нейтрализующего раствора и аккуратно попереварачивать до появления белых седиментов.
4) Центрифугировать 5 мин, осадить клетки и хромосомную ДНК
5) Перенести супернатант в GeneTET вращательную колонку и пипеткой перемешать. Не переносить белый седимент.
6) Центрифугировать 1 мин, слить жидкость и поместить колонку обратно в тару. Жидкость перемешивать нельзя.
7) Добавить 500 мкл промывающего раствора в GeneTET колонку, центрифугировать 30-60 сек. Слить жидкость, а остаток в тару.
8) Повторить п. 7
9) Слить жидкость и центрифугировать 1 мин, чтобы удалить остаток промывки
10) Перенести GeneTET колонку в новую 1,5 мл тару для центрифугирования. Добавить 50 мкл элиоатного буфера в центр GeneTET колонки через её мембрану, чтобы элюировать плазмидную ДНК. Нельзя касаться пипеткой мембрану. Затем центрифугировать в это таре 2 мин при комнатной температуре. Для увеличения выхода на 10-20% можно снять остаток ДНК с помощью повторного добавления элюата.
11) Извлечь из колонки очищенные плазмидные ДНК, хранить при -20ОС.
Методика внедрения плазмидной ДНК в клетки E. Coli
После 3го раунда ПЦР амплификат пересадить в 9/10 объёма изопропанола и 1/10 объёма ацетата калия на 30 мин. Центрифугировать в течении 15 мин при 11000 об/мин.
После рестрикции порезанную плазмиду выделить из геля.
Для получения препарата Pln-клетки Bl21 с плазмидой hPln-6Hisкультивировать в автоиндуцирующей (BoostBroth) среде с помощью лактозного оперона.
Состав BoostBroth (на 1 литр):
HNa2PO4 - 7,098 г
KH2PO4 - 6,805 г
(NH4)2SO4 - 3,304 г
MgCl2 - 0,19 г
MgCl2*6H2O - 4,07 г
Глицерол - 5,000 мл
Пентон - 10 г
Дрожжи - 2 г
Глюкоза 0,5 г
Лактоза - 2 г
Глюкоза и лактоза стирилизуются отдельно через мембрану.
Остальное в автоклаве при отсутствии осадка
BoostBroth - среда для экспресси генов в клетках E. Coli с Т7 - регулируемой системой экспрессии без слежения за оптической плотностью системы и без добавления индуктора. Биомасса бактериальных масс в 3-18 раз болше по сравнению и LB-IPTG
ОП600нм=7-15 за 15-20 часов
Культивировать BoostBroth при 37ОС и 250 об/мин в течении 16-20 часов
Переносить в среду единичную колонию со свежей амплификацией.
Рестрикция амплификата:
|
I |
II |
III |
||
|
Pass_6His/S |
7мкл |
2 мкл |
2 мкл |
|
|
XBa |
1 мкл |
1 мкл |
- |
|
|
XHo |
1 мкл |
- |
1 мкл |
|
|
Буфер |
2 мкл |
1 мкл |
1 мкл |
|
|
МФ |
9 мкл |
6 мкл |
6 мкл |
|
|
Всего |
20 мкл |
10 мкл |
10 мкл |
Сбор белка из раствора
1) Осаждение белка из раствора с помощью ТХУ
2) Очистка от ТХУ ацетоном(повторяется 3-4 раза):
- разбавление раствора ацетоном
- центрифугирование
- слив супернатанта
3) выпарка ацетона
4) добавление 10 мкл красителя
5) термостатирование
6) электрофарез
Электрофарез в полиамидакрильном геле:
1) Дезинфексия стёкл для фареза спиртом, затеем фильтровальной бумагой и закрепление их на заливочном столике
2) Приготовление геля:
Используется 2 типа геля: нижний ( разделяющий, отличается повышенной концентрацией) и верхний (концентрирующий).
Раствор для полиакриламидного геля (ПААГ):
А* - 0,5 М трис-HCl 0,4% SDS, pH 6,8
A - 1,5 M трис-HCl, 0,4% SDS, pH8,8
B - 29,2% акриламид, 0,8% бисакриламид
С - 10% персульфат аммония
D - 50% глицерин
Е - 0,5 М ЭДТА-Na2? pH=7,0
F - 100% TEMED
Нижний гель:
А - 1,5 мл
В - 2,49мл
Е - 24 мкл
H2O - 1,42 мл
Затем
С - 40 мкл
F - 15 мкл
Верхний гель:
А* - 0,625 мл
В - 0,375 мл
Е - 16,5 мкл
H2O - 1,4535 мл
Затем
С - 20 мкл
D - 10 мкл
После добавления C и D гели сразу взболтать и залить в стёкла. Сначала залить 3 мл нижнего геля и дождаться его затвердения, затем залить 1 мл верхнего геля и вставить в него гребёнку для образования кармашков.
Затем залить буфер.
Состав (на 500 мл буфера):
- 7,2 г Gly
- 1,5 г трис-ОН
- 0,5 г SDS
- H2O до 500 мл
В каждую пробу добавить растворитель и краску по 3 мкл.
Состав краски:
MeOH 50 мл
H2O 50 мл
AcOH 10 мл
Coomasine 0,25 г
Состав растворителя для проб:
D - 200 мкл
Е - 20 мкл
А* - 0,5 мл
Меркаптоэтанол - 100 мкл
SDS - 40 мг
H2O - 1,280 мл
Бромфеноловый синий на кончике шпателя
В кармашки в геле залить по 8 мкл проб (пропипетированных с растворителем и краской) и маркер.
Затем залить 2 л буфера в основную камеру установки.
Электрофарез проводится при силе тока 25 мА и напряжении 200 В
Затем осадить белок в геле раствором ТХУ в течении 15 мин, после чего добавить краску и очистить раствором (7% AcOH и 5% EtOH)
Определить массу белка путём сравнения с маркером.
Аффинная хроматография
Аффинная хроматография - (от лат. affinis - родственный) (биоспецифическая хроматография, хроматография по сродству), метод очистки и разделения белков, основанный на их избирательном взаимодействии с лигандом ковалентно связанным с инертным носителем. В качестве лигандов используют соединения, взаимодействие которых с разделяемыми веществами основано на биологической функции последних.
Для выделения нашего белка из смеси мы использовали его модифицированную структуру, добавив в неё: гистидиновых остатков. Гистидин имеет высокое сродство к никелю, который мы использовали как лиганд. В качестве инертного носителя мы использовали амилазную смолу.
Методика выделения белка из раствора для растворимого белка:
1) Засыпать амилазную смолу в колонну и промыть её пятью объёмами буфера
При этом перегонять буфер не быстрее чем 25 мл/час
2) Поместить экстракт (белок) в колонку
3) Залить 12 объёмов колонки буфером для перегонки буфером для прогонки и перегонять со скоростью не более 10 мл/час для колонки 2,5 см
4) Добавить буфер с мальтозой, собрать 20 фракций по 0,2 объёма колонки
Белок обычно выходит с 5той фракции и различим при длине волны 280 нм.
5) Слить остаток и промыть колонку:
- 3 объёма воды
- 3 объёма SDS
- 1 объём воды
- 3 объёма колоночного буфера
Все действия хроматографии проводятся при температуре 40С
Смолу рекомендуется хранить в 20% этиловом спирте.
Состав колоночного буфера:
20 мМоль Трис-HCl
200 мМоль NaCl
1 мМоль ETDA
Опционально добавляется:
1 м Моль азида натрия
10 мМоль меркаптоэтанола
Или 1 мМоль DTT
Концентрация мальтозы: 10 мМоль
Затем мы определяем содержимое наших проб, для этого используем методику электрофареза в полиамидакрильном геле.
Вывод: на основе данных методик можно получать, проводить выделение и очистку различных белков в лабораторных условиях.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Аминокислоты, входящие в состав пептидов и белков. Моноаминодикарбоновые кислоты и их амиды. Энантиомерия аминокислот, образование солей. Мезомерия и строение пептидной связи. Методы выделения и анализа белков. Электрофорез в полиакриламидном геле.
презентация [351,2 K], добавлен 16.12.2013Характеристика химических свойств актинидов. Количественное определение трансплутониевых элементов. Отделение осаждением неорганическими и органическими реагентами. Методы выделения и разделения трансплутониевых элементов. Получение металлического урана.
реферат [75,3 K], добавлен 03.10.2010Способы выделения, очистки и анализа органических веществ. Получение предельных, непредельных и ароматических углеводородов, спиртов, карбоновых кислот. Получение и разложение фенолята натрия. Методы выделения белков. Химические свойства жиров, ферментов.
лабораторная работа [201,8 K], добавлен 24.06.2015Роль в живой природе. Состав и свойства белков. Классификация белков. Определение строения белков. Определение наличия белка. Идентификация белков и полипептидов. Синтез пептидов. Искусственное получение белка. Аминокислоты.
реферат [16,2 K], добавлен 01.12.2006Основные требования к растворителям. Элюирующая сила растворителя и элюотропные ряды. Элюотропные серии для адсорбционной хроматографии на силикагеле. Вопрос о чистоте растворителя, адсорбционная очистка методом классической колоночной хроматографии.
реферат [41,5 K], добавлен 12.01.2010Основные методы разделения и выделения веществ при биохимических исследованиях. Количественное определение белка в сыворотке крови. Химическая природа нуклеопротеидов. Применение единиц СИ для выражения результатов клинико-биохимических исследований.
учебное пособие [4,2 M], добавлен 11.03.2013Строение и свойства белков. Различия в строении аминокислот. Пространственная организация белковой молекулы. Типы связей между аминокислотами в молекуле белка. Основные факторы, вызывающие денатурацию белков. Методы определения первичной структуры белка.
реферат [354,6 K], добавлен 15.05.2010Общие принципы препаративной химии белков, особенности их выделения. Удаление небелковых примесей, разделение между собой собственно белковых компонентов. Характерные свойства белков, на которых основано разделение, гель-хроматография (гель-фильтрация).
научная работа [1,8 M], добавлен 17.12.2009Исследования свойств белков для изучения их химического состава и строения. Аминокислота - основная структурная единица белка. Белковые резервы. Этапы синтеза белка. Регуляция биосинтеза аминокислот. Переваривание белков. Патология белкового обмена.
реферат [21,7 K], добавлен 17.01.2009Особенности производства хлопковой целлюлозы по бисульфитно-аммиачному методу. Способы получения сернистого ангидрида и варочного раствора. Исследование правил выделения химических реагентов из аммиачного варочного раствора повторного использования.
контрольная работа [307,9 K], добавлен 11.10.2010Понятие и основатели химии белка. Состав, уровень организации, структура белка. Денатурация, биуретовая реакция, гидролиз белков. Полноценные и неполноценные белки. Белки, жиры и углеводы - основа питания, их необходимое количество для человека.
презентация [7,4 M], добавлен 26.01.2011Сущность метода хроматографии, история его разработки и виды. Сферы применения хроматографии, приборы или установки для хроматографического разделения и анализа смесей веществ. Схема газового хроматографа, его основные системы и принцип действия.
реферат [130,2 K], добавлен 25.09.2010Основные химические элементы, входящие в состав белков. Белки - полимеры, мономерами которых являются аминокислоты. Строение аминокислот, уровни организации белковых молекул. Структуры белка, основные свойства белков. Денатурация белка и ее виды.
презентация [1,7 M], добавлен 15.01.2011Назначение лигандообменной хроматографии, принцип и этапы ее реализации, задействованные элементы. Определение микропримесей в жидкостной хроматографии, рекомендации по его проведению. Методика анализа сложных примесей и инструментарий для него.
реферат [27,1 K], добавлен 07.01.2010Токсикологическая характеристика N-метилформамида. Расчет равновесной концентрации абсорбата при использовании чистой и артезианской воды. Ректификация раствора N-метилформамида в воде. Кинетика биологической очистки растворов от органических веществ.
курсовая работа [788,0 K], добавлен 18.09.2014Разработка урока по расширению знаний об углеводах, изучению строения и свойств глюкозы. Проведение химического эксперимента по взаимодействию раствора глюкозы с гидроксидом меди и аммиачным раствором оксида серебра. Тестовые упражнения, задание на дом.
презентация [440,8 K], добавлен 31.10.2009Общие пути обмена аминокислот. Значение и функции белков в организме. Нормы белка и его биологическая ценность. Источники и пути использования аминокислот. Азотистый баланс. Панкреатический сок. Переваривание сложных белков. Понятие трансаминирования.
презентация [6,6 M], добавлен 05.10.2011Общая характеристика кумаринов - природных кислородсодержащих гетероциклических соединений. Классификация и фармакологические свойства производных кумарина. Способы выделения и синтеза кумаринов из растений в лекарственное сырье, методы их анализа.
курсовая работа [519,5 K], добавлен 21.11.2010Сущность высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) как метода анализа и разделения сложных примесей. Сорбенты, координационно-насыщенные хелаты; закономерности влияния строения лиганда на поведение хелатов в условиях обращенофазной хроматографии.
реферат [109,8 K], добавлен 11.10.2011Состав и физико-химические свойства техногенного карбонатсодержащего отхода Ростовской ТЭЦ-2. Возможности применения КСО для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов (Fe3+, Cr3+, Zn2+, Cu2+ и Ni2+), определение условий их выделения с использованием.
статья [13,3 K], добавлен 22.07.2013
