Особенности применения методов аналитической химии в биомедицинских исследованиях

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Химия всегда была связана с медициной, а в XVI-XVII в.в. практически целиком «работала» на нее (период ятрохимии). Многие химики тех времен были по образованию, а иногда и по роду занятий, врачами - Парацельс, Я.Б. Ван Гельмонт, Г.Э. Шталь, К.Л. Бертолле, А.П. Бородин и прочие. В первую очередь химию использовали для получения лекарств, но химические подходы со временем все больше применяли и в целях диагностики, а это уже ближе к химическому анализу.

Постепенно сложились следующие направления анализа медицинских объектов:

- клинический анализ - исследование состава крови, мочи и др.;

- фармацевтический анализ - анализ лекарственных объектов.

К менее распространенным медицинским исследованиям можно отнести поиск и определение новых маркеров заболеваний, фармакокинетику (изучение миграции и изменений лекарственных веществ в организме), допинг-контроль спортсменов, ДНК-анализы и др.

Целью является обобщение имеющихся данных об анализе биологических тканей и жидкостей, применяемом в медицине, а также выявление основных направлений развития этой области аналитической химии.

Аналитическая химия довольно длительное время не уделяла внимания медицинским и биологическим объектам. Методический уровень медико-биологических исследований, которыми занимались врачи или биологи, с точки зрения профессионала-аналитика был (а иногда и остается) довольно низким. В конце XX века в исследования медицинского назначения включается все больше и больше аналитических лабораторий. Этот процесс особенно характерен для США, где на биомедицинские исследования выделяются огромные средства. За это время были разработаны новые методы, прежде всего, метод иммуноанализа. В журналах по аналитической химии постоянно растет число публикаций, посвященных исследованию медицинских объектов.

В медико-биологических исследованиях методы локального анализа не менее важны, чем определение валовых показателей химического состава.

Отдельное направление клинического анализа - токсикологические исследования. В области обнаружения ядов эти исследования смыкаются с криминалистическими. Необходимость обнаружения ядов (например, соединений мышьяка и ртути) с древних времен способствовало развитию аналитических методов. Крупными достижениями стали, например, методики обнаружения следов мышьяка, связанные с образованием и разложением арсина (реакция Марша). В руководствах по токсикологии и судебной химии всегда приводились (обычно без теоретического обоснования) методики обнаружения ядовитых веществ.

1. Распределение ядов в организме

После поступления в кровь вещество распределяется по всем органам и тканям. Распределение - динамический процесс, в начальной стадии которого основное значение для накопления вещества имеет кровоснабжение ткани или органа: чем оно лучше, тем выше содержание вещества. С течением времени все большую роль в распределении начинают играть процессы взаимодействия ядов с клетками, отдельными молекулами и т.п.

Распределение токсичных веществ в организме зависит от трех основных факторов: пространственного, временного и концентрационного.

Пространственный фактор определяет пути наружного поступления и распространения яда. Это распределение связано с кровоснабжением органов и тканей, поскольку количество яда, поступающее к определенному органу, зависит от его объемного кровотока, отнесенного к единице массы тканей. Наибольшее количество яда в единицу времени поступает обычно в легкие, почки, печень, сердце, мозг. При ингаляционных отравлениях основная часть яда поступает в почки, а при пероральных - в печень, так как соотношение удельного кровотока печень/почки составляет примерно 1:2. Кроме того, токсический процесс определяется степенью чувствительности к яду рецепторов токсичности. Особенно опасны в этом отношении токсичные вещества, вызывающие необратимые поражения клеточных структур (например, при химических ожогах тканей кислотами или щелочами). Менее опасны обратимые поражения (например, при наркозе), вызывающие только функциональные расстройства.

Под временным фактором подразумевается скорость поступления яда в организм и скорость его выведения из организма или его нейтрализации. Этот фактор отражает связь между временем действия яда и его токсическим эффектом.

Концентрационный фактор, т.е. концентрация яда в биологических средах, в частности в крови, считается основным в клинической токсикологии. Определение этого фактора позволяет различать токсикогенную и соматогенную фазы отравления и оценивать эффективность дезинтоксикационной терапии. Исследование динамики концентрационного фактора помогает обнаружить в токсикогенной фазе отравления два основных периода: период резорбции, продолжающийся до момента достижения максимальной концентрации токсического вещества в крови, и период элиминации от этого момента до полного очищения крови от яда.

Одним из основных токсикологических показателей является объем распределения, т.е. характеристика пространства, в котором распределяется данное токсичное вещество. Существует три главных сектора распределения токсичных веществ в организме: внеклеточная жидкость (примерно 14 л для человека, имеющего массу тела 70 кг), внутриклеточная жидкость (28 л) и жировая ткань, объем которой значительно варьирует.

На практике чаще приходится определять концентрацию токсичного вещества в плазме и общую его дозу, циркулирующую в организме. Для этого необходимо знать объем распределения этого яда. При отравлении веществом, распределяющимся только во внеклеточной жидкости, можно быстрее очистить этот сектор организма от яда, чем в случае отравления веществом, находящимся во всем объеме распределения. Только знание объема распределения позволяет сопоставить скорость выведения яда из организма со скоростью снижения его концентрации в плазме и ответить на вопрос, поступают ли новые порции яда в организм из ЖКТ. На распределение яда в организме кроме концентрации ЯВ и силы его связи с белками влияют и другие факторы: физиологическое состояние организма, пол, биоритмы и др.

Проникновение ксенобиотиков внутрь клетки сопровождается их межфазовым распределением в соответствии с коэффициентом распределения вода - неполярная фаза. Химические вещества по мере поступления в кровь и лимфу распределяются между жидкой частью этих сред, а также в межклеточной и внутриклеточной жидкостях. Различные лекарственные и ядовитые вещества способны избирательно накапливаться в отдельных органах: адреналин-преимущественно в сердце, йод-в щитовидной железе, трихлорэтилен-в мозге, хлороформ-в надпочечниках, тиофос-в слюнных железах, печени. Многие тяжелые металлы, достигая клетки, фиксируются часто на клеточной мембране, нарушая тем самым жизнедеятельность клетки. Металлы, поступающие в организм в виде растворимых соединений, накапливаются преимущественно в костной ткани.

2. Пробоподготовка при исследовании биожидкостей

Наиболее сложным объектом в ХТА является биологический материал и, главным образом, материал животного происхождения: внутренние органы, ткани трупа человека, кровь, пищевые продукты.

Современные методы анализа позволяют идентифицировать вещество с высокой скоростью и точностью. Однако инструментальному методу анализа предшествует проботодготовка - отделение мешающих проведению анализа компонентов и концентрирование определяемых веществ. Именно этот этап является наиболее трудоемким и содержит главные источники ошибок анализа. Пробоподготовку следует выполнять очень аккуратно и последовательно с учетом дальнейшего метода идентификации и количественного определения яда.

Химико-токсикологический анализ с использованием высокочувствильных методов на современных, часто очень дорогостоящих приборах: ВЭЖХ, ГЖХ, атомно - адсорбционном и плазменном спектрофотометрах, ионном хроматографе и т.д. - требует очень тщательной пробоподготовки. Плохо подготовленные образцы приводят не только к искажению истинного значения яда, но могут вывести из строя сам прибор. Выбор оптимального способа подготовки пробы в каждом конкретном случае определяется методом анализа и характером анализируемых веществ. Современные методы пробоподготовки учитывают эти подходы.

При диагностике отравлений в судебно - химических исследованиях преимущественно анализируют кровь, мочу, ткани различных органов. В крови и моче содержание определяемых токсических веществ и их метаболитов может быть ниже предела обнаружения. В этих биожидкостях присутствуют фоновые эндогенные соединения: белки, жиры, пептиды, аминокислоты, углеводы, стероиды, пигменты. Яд должен быть отделен от белков и липидов, с которыми он может быть прочно связан по лигандорецепторному механизму. Изолирование токсиканта обычно приводит к увеличению его концентрации в пробе. Следовательно, под термином «изолирование» следует понимать процесс выделения токсиканта из биоматериала, его очистку от эндогенных веществ и концентрирование в анализируемой пробе.

При поступлении биоматериала на анализ его подвергают визуальному осмотру.

Визуальный осмотр. При исследовании внутренних органов трупа важно установить, какие именно органы доставлены на анализ.

Необходимо установить факт консервирования и природу консерванта. При транспортировке объекта на большие расстояния допускается консервирование только чистым этиловым спиртом. Если консервация проведена этанолом то перед минерализацией пробы серной или азотной кислотой необходимо его удалить. Чаще всего о консервации сообщают в акте судебно- медицинского исследования или других сопроводительных документах. При этом проба консерванта прилагается. Консервация формалином, глицерином, фенолом и другими веществами рассматривается как «преступная» халатность. Такое вещество, как формалин, само является ядом и входит в круг химического исследования. Кроме того, он затрудняет обнаружение метилового спирта, аналитические реакции которого основаны на превращение его в формальдегид, способствует уничтожению ряда химических веществ.

В ходе визуального осмотра отмечают цвет содержимого желудка. Пурпурный или розовый цвет содержимиго может быть связан с отравлением перманганата калия. В случае отравления солями меди наблюдается окрашивание содержимого желудка пострадавшего в зеленый или голубой цвет. При отравлении солями никеля - в зеленый, а солями кобальта - в розовый цвет. Окрашивание содержимого желудка в желтый цвет позволяет предположить отравление азотной или пикриновой кислотой.

При отравлении может наблюдаться изменение окрашивания или запаха мочи. Красно-коричневый цвет моча имеет при отравлении производными пиразола, фенотиазина. Фенол и метиленовая синь меняют цвет мочи на зелено-синий, а фенацетин, рибофлавин - на желтый.

Пробоподготовка мочи. После визуального осмотра мочи проводят предварительные испытания с отдельными порциями пробы. В случае отрицательного результата исследование на невыявленные группы токсикантов не проводят.

Часть анализируемой мочи смешивают с органическими растворителями при разных значениях pH среды.

Еще одну порцию мочи нагревают в течение 30 минут с концентрированной соляной кислотой для гидролиза химических веществ, вызвавших отравление. Затем пробу охлаждают, подщелачивают и проводят экстракцию соответствующими органическими растворителями.

Полученные экстракты раздельно испаряют на часовых стеклах, затем сухие остатки рассматривают визуально и под микроскопом. Каждый из остатков исследуют методом тонкослойной хроматографии, в том числе в системах.

К точно фиксированному объему биожидкости (обычно около 500 мкл) добавляют отмеренное (около 10% по объему) количество раствора образца сравнения в D2O известной концентрации. Чаще всего в качестве такого образца используют 3-триметил-[2,2,3,3-2Н4]-пропионат натрия.

На основе интенсивностей по стандартной методике рассчитываются концентрации всех соединений. Положение сигналов основных компонентов сильно зависит от pH образца и температуры регистрации Поэтому, чтоб такие измерения можно было сравнивать между собой, оба эти параметра должны быть строго стандартизированы. В вязи с этим перед регистрацией к образцу добавляют стандартное количество фосфатного буферного раствора.

3. Способы проведения экстракции

В зависимости от глубины извлечения из исходного раствора растворенного в нем вещества, требований, предъявляемых к рафинату и экстракту, и других условий возможны различные варианты проведения процесса жидкостной экстракции. Однако любое экстрагирование обязательно включает в себя две основные стадии: смешение растворителя с исходной смесью для создания между ними тесного контакта и разделение образовавшейся смеси на экстракт и рафинад. Очень часто процесс экстрагирования сопровождается регенерацией экстрагента, т.е. удалением его из экстракта и рафинада. Эту стадию процесса обычно проводят в специальном регенерационном аппарате.

В химической технологии используются в основном следующие способы проведения экстракции:

· однократная экстракция,

· многократная экстракция с перекрестным и противоточным движением растворителя,

· непрерывная противоточная экстракция.

Наибольшее распространение в промышленности получила экстракция одним растворителем, хотя находит применение и экстракция двумя экстрагентами.

Жидкость - жидкостная экстракция

4. Способы пробоподготовки

Для изолирования определяемого вещества используют жидкостную экстракцию, твердофазную экстракцию, перегонку с водяным паром, сублимацию в вакууме, минерализацию.

Жидкостная экстракция органическими растворителями применяется для изолирования хлорорганических пестицидов, фосфорорганических соединений, пиретроидов, производных карбаминовой кислоты, четвертных аммониевых оснований, металлоорганических пестицидов.

Экстракционное разделение - процесс извлечения одного или нескольких компонентов из растворов или твердых пористых материалов избирательно действующими растворителями (экстрагентами).

Различают:

- жидкофазная экстракция- экстрагирование в системе Ж-Ж.

- твердофазное экстрагирование - экстрагирование в системе ТВ-Ж.

Экстракция в системах «жидкость-жидкость» - диффузионный процесс, который протекающий при участии двух взаимно нерастворимых или ограниченно растворимых жидких фаз, между которыми распределяется экстрагируемое вещество. Этот метод известен с середины XIX в.. И получил широкое распространение через 100 лет - в 50-60-е гг. XX в.. В течение нескольких десятилетий он был одним из самых важных аналитических методов разделения и концентрирования органических соединений и микроэлементов.

Жидкостная экстракция состоит из двух технологических операций:

1) контактирование исходной смеси с растворителем, в ходе которого осуществляется массообменный процесс, переход компонента через границу раздела из одной фазы в другую;

2) отделение полученного раствора от оставшейся жидкой смеси.

При жидкостной экстракции происходит неполная взаимная растворимость исходной смеси и растворителя - в противном случае вторая операция неосуществима. Контактирование фаз проводится путём распределения (дробления) одной фазы в виде капель в объёме другой.

В результате взаимодействия жидких фаз получают экстракт - раствор извлеченных веществ в экстрагенте и рафинад - остаточный исходный раствор, из которого удалены экстрагируемые компоненты.

Полученные жидкие фазы (экстракт и рафинад) отделяются друг от друга отстаиванием, центрифугированием или другими механическими способами. После этого происходит извлечение целевых продуктов из экстракта и регенерация экстрагента из рафинада. Целевой продукт выделяют из экстракта ректификацией, упариванием, или реэкстракцией.

Главное преимущество процесса экстракции в системе «жидкость-жидкость» по сравнению с другими процессами разделения жидких смесей - низкая рабочая температура процесса. Процесс часто проводится при нормальной температуре. Отпадает необходимость в затратах тепла на испарение раствора. При экстракции из многочисленных растворителей можно подобрать высокоизбирательный экстрагент, отличающийся по химическим свойствам от компонента исходной смеси. При этом достигается более полное разделение, чем с помощью других массообменных процессов.

Твердо - жидкостная экстракция.

Твердофазная экстракция на химически модифицированных сорбентах с неполярными гидрофобными группами и на силикагелях может применяться при определении пестицидов в природных водах, почвах, моче.

В зависимости от объема пробы воды и характера анализируемого вещества, экстракция может быть проведена либо на картридже (патроне, заполненном сорбентом), либо на мембранных дисках. Широкое применение высокоэффективных картриджей привело к более полному выделению во множестве лабораторий большого числа загрязнителей. Более того, такой подход позволяет обеспечивать более высокую степень гибкости в смысле автоматизации, поскольку процедура экстракции значительно упрощается. В последнее время метод 525 ЕРА, который первоначально был рассчитан на применение жидкостно-жидкостной экстракции при анализе мало летучих веществ, был модифицирован в расчете на использование твердофазной экстракции. Значительно чаще других традиционных методов пробоподготовки ТФЭ используют в стандартных российских методиках

Концентрирование на сорбентах используют для определения неполярных и малополярных нелетучих соединений и осуществляют в три этапа: сорбция при пропускании потока воды через колонку с сорбентом; элюирование сорбированных органических соединений малым объемом растворителя (реже применяют термодесорбцию); очистка элюата и удаление растворителя из концентрата. Концентрирование на сорбентах позволяет объединить отбор проб и выделение органических соединений из воды.

Для извлечения и концентрирования органических соединений используют макропористые полимерные сорбенты (амберлиты ХАО, тенакс ОС, хромо-сорбы серии 100, порапак О, полисорбы), активный уголь и графитированные сажи, синтетические иониты, химически модифицированный силикагель, а также пенополиуретан, материалы на основе фторопласта и полипропилена. Пористые полимерные сорбенты характеризуются большой сорбционной емкостью, гидрофобностью, легкостью проведения десорбции.

Особенно широко для этих целей применяют амберлиты ХАО-2 и ХАЛ-4 (сополимеры стирола и дивинилбензола), ХАО-7 и ХАО-8 (сополимеры метакрилата и дивинилбензола). Иониты достаточно прочно удерживают сорбированные вещества, что позволяет анализировать большие объемы воды (100-- 1000 л), достигая степени концентрирования 103-106. Степень извлечения многих пестицидов, ПАУ, фенолов, фталатов и ПХБ с помощью амбер-литов типа ХАЛ может достигать 90-100%.

Однако при использовании этих сорбентов необходимо исключить возможность загрязнения проб воды продуктами их деструкции; сорбенты перед использованием тщательно очищают, но и после этого они могут загрязнять концентраты следами бензола, толуола, полизамещенных бензолов. При анализе вод, содержащих активный хлор, возможно загрязнение проб продуктами его взаимодействия с амберлитами ХАО.

Активные угли и графитированные сажи являются очень хорошими сорбентами органических соединений различных классов -- недаром активный уголь широко используют в различного рода фильтрационных (очистительных) установках для очистки питьевой воды и сточных вод различного происхождения. Однако трудности достижения полноты десорбции (особенно в случае активного угля), реакционная способность по отношению к некоторым классам органических соединений ограничивают их широкое применение в анализе вод.

Все эти особенности сорбентов следует непременно учитывать, чтобы избежать возможных артефактов (особенно при анализе загрязненных вод), приводящих к изменению состава загрязняющих веществ и искажающих результаты идентификации.

Заключение

экстракция пробоотделение химический токсичный

Развитие методов аналитической химии в биомедицинских исследованиях ускоряется с каждым годом. При этом основными задачами остаются экспрессность и точность метода, возможность проведения анализа в полевых условиях, снижение его стоимости. Кроме того, разработка новых методов невозможна без тесного сотрудничества аналитиков и медиков. К сожалению, на сегодняшний день эти две группы специалистов развиваются параллельно, не взаимодействуя. Но без сомнения можно сказать, что, объединившись, исследователи поднимут биомедицинский анализ на качественно новый уровень, на котором будут учитываться в полной мере и биологические закономерности организмов, и химические закономерности.

Список литературы

1. Токсикологическая химия: метаболизм и анализ токсикантов: учебное пособие / под ред. Н.И. Калетиной. - М., 2008. - 1016с.

2. Токсикологическая химия: учебник / под ред. Т.В. Плетеневой. - 2-ое изд. - М., 2008. - 512с.

3. Токсикологическая химия. Ситуационные задачи и упражнения: учебное пособие / под ред. Н.И. Калетиной. - М., 2007. - 352с.

Размещено на Allbest.ru