Хроматография. Классификация. Использование в анализе лекарственных средств

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра фармацевтической химии

Курсовая работа

по теме: «Хроматография. Классификация. Использование в анализе лекарственных средств»

Руководитель: Сергиенко Е.М.

Исполнитель:

Студентка 4 курса СНГ-1 группы

Суркова Алина Андреевна

Оглавление

хроматография лекарственный тонкослойный

• Введение
• 1. История развития хроматографии
• 2. Основные виды хроматографии
• 3. Работа хроматографа
• 4. Использование в анализе лекарственных средств
• 5. Техника проведения анализа

6. Тонкослойная хроматография

• Заключение
• Список литературы


Введение

Одна из важных задач современной химии - надежный и точный анализ органических веществ, часто близких по строению и свойствам. Без этого невозможно проведение химических, биохимических и медицинских исследований, на этом в значительной степени базируются экологические методы анализа окружающей среды, криминалистическая экспертиза, а также химическая, нефтяная, газовая, пищевая, медицинская отрасли промышленности и многие другие отрасли народного хозяйства.

Один из наиболее чувствительных методов - хроматографический анализ, впервые предложенный российским ученым М.С.Цветом в начале XX в. и к концу века превратившийся в мощнейший инструмент, без которого уже не могут обходиться как синтетики, так и химики, работающие в других областях. Наибольшее значение приобрели тонкослойная, газожидкостная и высокоэффективная жидкостная и ионная хроматография. Будучи несложной по технике выполнения, тонкослойная хроматография хороша при определении пестицидов и других органических соединений-загрязнителей. Газожидкостная хроматография эффективна при анализе многокомпонентных смесей летучих органических веществ

1. История развития хроматографии

Впервые термин "хроматография" был использован российским биологом Михаилом Семеновичем Цветом для описания разработанного им метода разделения компонентов хлорофилла на бумаге. Это произошло 21 марта 1903 г, когда Михаил Семенович Цвет, в то время работавший в должности ассистента (официально - в должности внештатного лаборанта) кафедры анатомии и физиологии растений Варшавского университета, прочитал свой знаменательный доклад "О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биологическому анализу". Эксперименты в области адсорбции, приведшие в итоге к открытию хроматографии, ученый начал двумя годами раньше - в возрасте 28 лет. Подробное изложение принципов и возможностей своего хроматографического метода он дал в 1906 г . в двух статьях на немецком языке и в книге 1910 г . "Хромофиллы в растительном и животном мире".

По экспертным оценкам, хроматография относится к 20 выдающимся открытиям прошедшего столетия, которые в наибольшей степени преобразовали науку, а через нее определили уровень развития техники и промышленности, цивилизации в целом. Хотя по образованию и роду занятий Цвет был ботаником, результаты его открытия столь значимы для всех естественных наук, что Федерация европейских химических обществ, например, приводит имя Цвета, наряду с четырьмя другими русскими именами - Ломоносова, Менделеева, Бутлерова и Семенова, - в числе ста выдающихся химиков прошлого.

В конце своего 100-летия хроматография представляет собой:

1. самый распространенный и совершенный метод разделения смесей атомов, изотопов, молекул, всех типов изомерных молекул, включая и оптические изомеры, макромолекул (синтетических полимеров и биополимеров), ионов, устойчивых свободных радикалов, комплексов, ассоциатов, микрочастиц;

2. уникальный метод качественного и количественного анализа сложных многокомпонентных смесей:

3. самостоятельное научное направление и важный физико-химический метод исследования и измерения;

4. препаративный и промышленный метод выделения веществ в чистом виде;

5. мощную отрасль научного приборостроения.

Ни один аналитический метод не может конкурировать с хроматографией по универсальности применения и эффективности разделения самых сложных многокомпонентных смесей. На современных газохроматографических капиллярных колонках в одном эксперименте могут быть разделены, количественно и качественно определены более 1000 индивидуальных компонентов, например, в бензиновых фракциях нефти; двумерный электрофорез позволяет увидеть до 2000 белков в биологических объектах или пептидов в гидролизатах белков. Только благодаря сочетанию разнообразных методов хроматографии и капиллярного электрофореза стала возможной расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК и завершение работ по программе "Геном человека". Используя хроматографию, можно определить содержание супертоксикантов, в частности, полихлорированных диоксинов в объектах окружающей среды при крайне низких концентрациях этих веществ (10-10%).

2. Основные виды хроматографии

Хроматография [гр. сhrцmatos ? цвет graphц ? пишу] -- метод разделения, анализа и физико-химических исследований веществ, основанный на перемещении зоны вещества вдоль слоя сорбента в потоке подвижной фазы с многократным повторением сорбционных и десорбционных актов. При этом разделяемые вещества распределяются между двумя несмешивающимися фазами (в зависимости от их относительной растворимости в каждой фазе): подвижной и неподвижной.

К основным видам хроматографии относят адсорбционную, ионообменную, жидкостную, бумажную, тонкослойную, гель-фильтрационную и афинную хроматографию.

Адсорбционная хроматография . В этом случае разделение веществ осуществляется за счет выборочной (селективной) адсорбции веществ на неподвижной фазе. Такая селективная адсорбция обусловлена сродством того или иного соединения к твердому адсорбенту (неподвижной фазе), а оно, в свою очередь, определяется полярными взаимодействиями их молекул. Поэтому часто хроматографию такого типа используют при анализе соединений, свойства которых определяются числом и типом полярных групп. К адсорбционной хроматографии причисляют ионообменную, жидкостную, бумажную, тонкослойную и газо-адсорбционную хроматографию.

Рис. 4. Изображение структуры частицы ионообменной смолы: - заряженные функциональные группы, ковалентно связанные с нитями решетки; - свободно перемещающиеся противоположно заряженные протовоионы, электростатически связанные с частицей смолы, способные претерпевать обмен с другими ионами.

Ионообменная хроматография. В качестве неподвижной фазы используют ионообменные смолы (рис. 4) как в колонках, так и в виде тонкого слоя на пластинке или бумаге. Разделение обычно проводят в водных средах, поэтому этот метод используется главным образом в неорганической химии, хотя применяются и смешанные растворители. Движущей силой разделения в этом случае является различное сродство разделяемых ионов раствора к ионообменным центрам противоположной полярности в неподвижной фазе.

Жидкостная хроматография . В этом случае неподвижной фазой служит жидкость. Наиболее распространенным случаем является адсорбционный вариант жидкостной колоночной хроматографии. Пример разделения природных пигментов представлен на рис. 5.

Рис. 5. Хроматографическое разделение природных пигментов (флавонов и изофлавонов)

Бумажная хроматография. В качестве неподвижной фазы используют полосы или листы бумаги (рис. 6). Разделение происходит по адсорбционному механизму, причем иногда его проводят в двух перпендикулярных направлениях.

Тонкослойная хроматография - это любая система, в которой неподвижной фазой является тонкий слой, в частности слой оксида алюминия (толщина 2 мм) в виде пасты, нанесенной на стеклянную пластинку. Пример такой системы и результаты разделения показаны на рис. 7.

Рис. 6. Схема разделения методом бумажной хроматографии: А, Б и В - положения компонентов смеси по окончании хроматографического разделения. Подвижная фаза впитывается в бумагу (неподвижная фаза) под действием капиллярных сил и переносит индивидуальные компоненты смеси с различными скоростями, зависящими от отношений растворимости этих компонентов в обеих фазах. Отношение а/б = R_f (фактор запаздывания) характеризует данное разделяемое вещество

Рис. 7. Камера для тонкослойной хроматографии:а - общий вид; б - схематический разрез; 1 - подложка со слоем сорбента; 2 - край камеры; 3 - емкость для растворителя

Гель-фильтрационная, или молекулярно-ситовая, хроматография. Принцип разделения в таких системах несколько иной, чем в предыдущих случаях. Неподвижной фазой являются материалы, обычно гели, со строго контролируемой пористостью, в результате чего одни компоненты смеси в соответствии с размером и формой молекул могут проникать между частицами геля, а другие не могут. Наиболее часто этот вид хроматографии используется для разделения высокомолекулярных соединений. Один из вариантов применения этого метода - определение молекулярных масс разделяемых веществ, часто необходимых для химических исследований (рис. 8).

Рис. 8. Схема разделения методом гель-хроматографии: а - начало разделения б - разделение в - конец разделения; большие кружки - частицы геля, большие точки - молекулы соединений с большой молекулярной массой, маленькие точки - молекулы соединений с меньшей молекулярной массой

Афинная хроматография . Этот вид хроматографии основан на взаимодействии между веществом, с одной стороны, способным реагировать с выделяемым соединением, а с другой - связанным с твердым носителем неподвижной фазы. Такое вещество обладает сродством к выделяемому соединению и называется афинным лигандом.

Наиболее часто этот метод находит применение в биохимическом анализе. Например, при пропускании через целлюлозу, активированную бромцианом, биологических объектов-антигенов, содержащих белки, происходит их специфическое удерживание, как показано на схеме 1.

По другому способу для присоединения белков к гидроксильной группе целлюлозы последнюю сначала обрабатывают 2-амино-4,6-дихлор-сим-триазином, а затем продукт их взаимодействия вступает в реакцию с аминогруппой белка по схеме 2:

Конечно, число способов хроматографирования не ограничивается перечисленными выше. Часто хроматографию сочетают с другими физико-химическими методами, например с масс-спектрометрией, но в данной статье стоит задача познакомить читателя лишь с общими принципами хроматографии. Поэтому далее рассмотрим обработку результатов хроматографирования.

3. Работа хроматографа

Схема установки наиболее простого газового хроматографа приведена на рис. 12. Она состоит из газового баллона, содержащего подвижную инертную фазу (газ-носитель), чаще всего гелий, азот, аргон и др. С помощью редуктора, уменьшающего давление газа до необходимого, газ-носитель поступает в колонку, представляющую собой трубку, заполненную сорбентом или другим хроматографическим материалом, играющим роль неподвижной фазы.

Рис. 10. Схема работы газового хроматографа: 1 - баллон высокого давления с газом-носителем; 2 - стабилизатор потока; 3 и 3 ' - манометры; 4 - хроматографическая колонка; 5 - устройство для ввода пробы; 6 - термостат; 7 - детектор; 8 - самописец; 9 - расходомер

Хроматографическая колонка - это «сердце» хроматографа, поскольку именно в ней происходит разделение смесей. Колонки чаще всего изготавливают из стекла; бывают стальные, тефлоновые, а также капиллярные колонки. Вблизи от ввода газа в колонку устанавливают устройство для ввода пробы. Чаще всего вводят пробу с помощью шприца, протыкая резиновую мембрану. Анализируемая смесь разделяется в колонке и поступает в детектор - прибор, преобразующий результаты разделения в форму, удобную для регистрации.

Одним из наиболее используемых детекторов является катарометр, принцип действия которого основан на измерении теплоемкости разных тел.

На рис. 11 показана схема катарометра. В цилиндрическую полость помещена металлическая спираль (нить сопротивления), нагревающаяся в результате прохождения через нее постоянного электрического тока. При протекании через нее газа-носителя c постоянной скоростью температура спирали остается постоянной. Однако если состав газа меняется при появлении элюируемого вещества, то температура спирали меняется, что и регистрируется прибором.

Рис. 11. Схема катарометра: 1 - ввод газа из хроматографической колонки; 2 - вывод продуктов в атмосферу; 3 - нить сопротивления; 4 - изолятор; 5 - металлический блок катарометра

Другой распространенный детектор - пламенно-ионизационный, схема которого представлена на рис. 12. Он гораздо более чувствителен, чем катарометр, но требует подачи не только газа-носителя, но и водорода. Выходящий из колонки газ-носитель, содержащий элюент, смешивается с водородом и проходит в форсунку горелки детектора. Пламя ионизирует молекулы элюента, в результате чего электрическое сопротивление между электродами уменьшается, а ток увеличивается.

Рис. 12. Схема пламенно-ионизационного детектора: 1 - ввод водорода; 2 - ввод газа из хроматографической колонки; 3 - ввод воздуха; 4 - катод; 5 - горелка; 6 - собирающий электрод; 7 - вывод продуктов горения в атмосферу.

В жидкостной хроматографии применяются спектрофотометрические детекторы (в видимой, УФ - и ИК-областях), а также рефрактометрические детекторы, основанные на измерении показателей преломления растворов.

4. Использование в анализе лекарственных средств

Одним из наиболее распространенных методов адсорбционной хроматографии является тонкослойная хроматография (ТСХ) - разновидность плоскостной хроматографии, при которой адсорбент используют в виде тонкого слоя на пластинке.

На чистую плоскую поверхность (пластинку из стекла, металла, пластмассы) тем или иным способом наносят тонкий слой сорбента, который чаще всего закрепляется на поверхности пластинки. Размеры пластинки могут быть различными (длина и ширина - от 5 до 50 см, хотя это и необязательно). На поверхности пластинки осторожно, чтобы не повредить слой сорбента, намечают (например, карандашом) линию старта (на расстоянии 2-3 см от нижнего края пластинки) и линию финиша растворителя (рис. 3-2).

На линию старта пластинки наносят (микрошприцем, капилляром) пробу - небольшое количество жидкости, содержащей смесь разделяемых веществ, например двух веществ А и В в подходящем растворителе (см. рис. 3-2). Дают возможность испариться растворителю, после чего

пластинку погружают в хроматографической камере в жидкую фазу ПФ, представляющую собой специально подобранный для данного случая растворитель или смесь растворителей. Под действием капиллярных сил ПФ самопроизвольно перемещается вдоль НФ от стартовой линии до линии финиша растворителя, увлекая с собой компоненты А и В пробы, которые перемещаются с различной скоростью. В рассматриваемом случае сродство компонента А к НФ меньше сродства к той же фазе компонента В, поэтому компонент А перемещается быстрее компонента В. После достижения за времяподвижной фазой (растворителем) линии финиша растворителя хроматографирование прерывают, пластинку извлекают из хроматографической камеры, высушивают на воздухе и определяют положение пятен веществ А и В на поверхности пластинки. Пятна (зоны) обычно имеют овальную или круглую форму. В рассматриваемом случае пятно компонента А переместилось от линии старта на расстояниепятно компонента В - на расстояниеа растворитель прошел расстояние.

Рис. 3-2. Схема разделения компонентов А и В методом тонкослойной хроматографии

5. Техника проведения анализа

Нанесение пробы. Анализируемую жидкую пробу наносят на линию старта с помощью капилляра, микрошприца, микропипетки, осторожно касаясь слоя сорбента (диаметр пятна на линии старта - обычно от одного до нескольких миллиметров). Если на линию старта наносят несколько проб, то расстояние между пятнами образцов на линии старта не должно быть меньше 2 см. По возможности используют концентрированные растворы. Пятна сушат на воздухе, после чего проводят хроматографирование.

Развитие хроматограмы (хроматографирование). Процесс проводят в закрытых хроматографических камерах, насыщенных парами растворителя, используемого в качестве ПФ, например, в стеклянном сосуде, покрытом сверху крышкой. В зависимости от направления движения ПФ различают восходящую, нисходящую и горизонтальную хроматографию.

- В варианте восходящей хроматографии ПФ наливают на дно камеры (в качестве последней можно использовать стеклянный химический стакан подходящего размера со стеклянной крышкой), хроматографическую пластинку помещают вертикально или наклонно в камеру так, чтобы слой ПФ на дне камеры смачивал нижнюю часть пластинки (ниже линии старта на ~1,5- 2 см). ПФ перемещается за счет действия капиллярных сил снизу вверх (против силы тяжести) сравнительно медленно.

В варианте нисходящей хроматографии ПФ подается сверху и перемещается вниз вдоль слоя сорбента пластинки. Сила тяжести ускоряет движение ПФ. Такой вариант реализуют при анализе смесей, содержащих компоненты, медленно перемещающиеся с ПФ.

В варианте горизонтальной хроматографии пластинку помещают горизонтально. Можно использовать прямоугольные или круглые пластинки. При применении круглых пластинок (круговой вариант горизонтальной хроматографии) стартовую линию обозначают в виде окружности подходящего радиуса (~1,5-2 см), на которую наносят пробы. В центре круглой пластинки вырезают отверстие, в которое вставляют фитиль для подачи ПФ. Последняя перемещается вдоль слоя сорбента от центра круга к его периферии. Хроматографирование проводят в закрытой камере - эксикаторе или в чашке Петри. При круговом варианте можно одновременно анализировать до нескольких десятков проб.

Расшифровка хроматограмм. Если пятна на хроматограмме окрашены, после высушивания пластинок определяют расстояние от линии старта до центра каждого пятна и вычисляют коэффициенты подвижности. Если же в состав анализируемой пробы входят бесцветные вещества, дающие неокрашенные, т.е. визуально не идентифицируемые пятна на хроматограмме, необходимо провести детектирование этих пятен, для чего хроматограммы проявляют. Рассмотрим некоторые наиболее распространенные методы детектирования.

Облучение ультрафиолетовым светом. Используется для обнаружения флуоресцирующих соединений (пятна светятся при облучении пластинки УФ-светом) или нефлуоресцирующих веществ, но с применением сорбента с флуоресцирующим индикатором (сорбент светится, пятна не светятся). Таким образом детектируют, например, алкалоиды, антибиотики, витамины и другие лекарственные вещества.

Термическая обработка. Высушенную после хроматографирования пластинку осторожно нагревают (до ~200 °C), избегая потемнения слоя самого сорбента (например, тогда, когда тонкий слой сорбента содержит крахмал). При этом пятна проявляются обычно в виде коричневых зон (за счет частичного термолиза органических компонентов).

Химическая обработка. Хроматограммы проявляют, обрабатывая их реагентами, которые образуют окрашенные соединения с разделяемыми компонентами смесей. Для этих целей применяют различные реагенты: пары йода, аммиака, брома, диоксида серы, сероводород, специально приготовленные растворы, которыми обрабатывают пластинки. Применяют как универсальные, так и селективные реагенты (понятие «универсальные» достаточно условно).

Универсальными реагентами могут служить, например, концентрированная серная кислота (при нагревании наблюдается потемнение пятен органических соединений), кислый водный раствор перманганата калия (зоны наблюдаются в виде коричневых пятен на фиолетовом фоне сорбента), раствор фосфорно-молибденовой кислоты при нагревании (появляются синие пятна на желтом фоне) и т.д.

Селективные реагенты:

- реактив Драгендорфа; -реактив Циммермана;

- водный аммиачный раствор сульфата меди (10% по , 2% - по аммиаку);

- смесь нингидрина с этанолом и уксусной кислотой.

Реактив Драгендорфа представляет собой раствор основного нитрата висмута, иодида калия и уксусной кислоты в воде. Используется для определения аминов, алкалоидов, стероидов.

Реактив Циммермана готовят, обрабатывая раствором щелочи 2% этанольный раствор динитробензола с последующим нагреванием смеси при ~70-100 °C. Применяют для обнаружения стероидов.

С помощью нингидрина детектируют пятна аминов, аминокислот, белков и других соединений.

Применяют и некоторые другие способы детектирования пятен. Например, измеряют их радиоактивность, если некоторые из разделяемых компонентов радиоактивны, либо вводят специально добавки радиоактивных изотопов элементов, входящих в состав разделяемых составляющих смеси.

После детектирования пятен на хроматограмме проводят их идентификацию, т.е. определяют, какому соединению соответствует то или иное пятно. Для этого чаще всего используют эталонные пятна «свидетелей». Иногда пятна идентифицируют по величине коэффициентов подвижности сравнивая их с известными для данных условий величинами . Однако такая идентификация по величине часто носит предварительный характер.

Окраску флуоресцирующих пятен также используют в целях идентификации, поскольку различные соединения флуоресцируют излучением различной длины волны (разного цвета).

При химическом детектировании пятен селективные реагенты дают окрашенные пятна с соединениями определенной природы, что также используется в целях идентификации.

С помощью ТСХ можно не только открывать, но и количественно определять содержание компонентов в смесях. Для этого либо анализируют сами пятна на хроматограмме, либо извлекают разделенные компоненты из хроматограммы тем или иным способом (экстракцией, элюированием подходящими растворителями).

При анализе пятен предполагают существование определенной связи между площадью пятна и содержанием данного вещества (например, наличие пропорциональной или линейной зависимости), которую устанавливают методом построения градуировочного графика, измеряя площади пятен «свидетелей» - эталона с известным содержанием анализируемого компонента.

Иногда сравнивают интенсивность окраски пятен, полагая, что интенсивность окраски пятна пропорциональна количеству данного окрашенного компонента. Для измерения интенсивности окраски применяют различные приемы.

При извлечении разделенных компонентов из хроматограммы получают раствор, содержащий данный компонент. Последний затем определяют тем или иным аналитическим методом.

6. Тонкослойная хроматография

Относительная ошибка количественного определения вещества методом ТСХ составляет 5-10%.

ТСХ - фармакопейный метод и широко применяется для анализа и контроля качества разнообразных лекарственных средств.

В этом современном варианте ТСХ применяют пластинки с толщиной слоя сорбента ~100 мкм и малым размером зерен сорбента - порядка 5 мкм или еще меньше. Благодаря меньшим размерам толщины слоя сорбента и зерен сорбента (по сравнению с обычным вариантом ТСХ) увеличивается эффективность разделения пятен на хроматограме и уменьшается время хроматографирования (до ~10 мин).

Заключение

Хроматография один из наиболее распространенных физико-химических методов исследования. Хроматографические методы широко используются в химии и биохимии, находят применение в химической, нефтехимической, металлургической, фармацевтической, пищевой и других отраслях промышленности. Особо широкое распространения получила газожидкостная хроматография, благодаря эффективности, быстроте и простоте эксперимента. Этот метод хорошо подходит для количественного определения летучих веществ - терпенов, обладающих значительной летучестью и входящих в состав эфирных масел. Это наиболее быстрый метод, позволяющий получить характеристические хроматограммы, называемые «отпечатками пальцев эфирных масел, с помощью специального прибора -- газожидкостного хроматографа. Таким образом, приведенные данные показывают широкие возможности применения ГЖХ, благодаря высокой разделительной способностью и чувствительности, как эффективного метода современных наук.

Список литературы

1. http://www.chromatogramma.ru «Теория и практика хроматографии»

2. Царев H.И., Царев В.И., Катраков И.Б. Практическая газовая хроматография: Учебно-методическое пособие для студентов химического факультета по спецкурсу «Газохроматографические методы анализа».-- Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2000.

3. Макодынский К.И., Киселев А.В., Иогансен А.В. и др. Физико-химическое применение газовой хроматографии. М.: Химия.

4. Введение в хроматографический анализ: методические разработки для студентов V курса фармацевтического факультета. - Нижний Новгород: Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 2005

5. http://www.chem-astu.ru/chair/study/PCMA/r3_1.htm «Физико-химические методы анализа. Хроматографические методы анализа»

6. Экспериментальные методы химической кинетики: газожидкостная хроматография. Учебн. Пособие. / Под. ред. Н. М. Эммануэля и М. Г. Кузьмина. Москва: изд-во Московского университета, 1985 г.

Размещено на Allbest.ru