Гель-хроматография как метод определения молекулярной массы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реферат

Гель-хроматография как метод определения молекулярной массы

Гель-проникающая хроматография представляет собой разновидность метода фракционирования на колонке, в которой разделение осуществляется по принципу молекулярного сита. Этот принцип был известен уже в начале 50-х годов, но лишь после того, как Порат и Флодин вновь открыли и широко использовали этот метод, он получил признание и широкое применение в научных исследованиях. Начиная с этого момента и до 1964 г. было опубликовано более 300 работ, посвященных этому новому методу фракционирования.

Гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография (ситовая, гель-проникающая, гель-фильтрационная хроматография) - разновидность хроматографии, в ходе которой молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бомльшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. В отличие от адсорбционной хроматографии, при гель-фильтрации стационарная фаза остается химически инертной и с разделяемыми веществами не взаимодействует. Неподвижной фазой являются поры сорбента, заполненные жидкостью. Средняя скорость передвижения этой фазы вдоль оси колонки равна нулю. Анализируемое вещество перемещается вдоль оси колонки, двигаясь вместе с подвижной фазой и время от времени делая остановки при попадании в неподвижную фазу. Молекулы делают остановки в щелевидных порах, размер которых по порядку величины соответствует размеру макромолекул.

При эксклюзионной хроматографии молекулы, имеющие в растворе большой размер, или совсем не проникают, или проникают только в часть пор сорбента (геля) и вымываются из колонки раньше, чем небольшие молекулы. Соотношение эффективных размеров макромолекул и пор сорбента определяет коэффициент распределения K_d, от которого зависит объем удерживания компонента V_R в колонке:

Эффективным размером макромолекулы при эксклюзионной хроматографии является ее гидродинамический радиус R, который вместе с молекулярной массой полимера М определяет характеристическую вязкость полимера. Универсальную калибровочную зависимость V_R от произведения / уравнение (2) впервые получил экспериментально Г. Бенуа, она имеет вид (рис. 1):

где А и В-константы. Уравнение (2) одинаково справедливо для линейных и разветвленных полимеров, блок- и привитых сополимеров, олигомеров.

Рис. 1. Рабочая калибровочная зависимость для эксклюзионной хроматографии

хроматография молекулярный эксклюзионный

В области от V₀ до V_T (объем колонки, доступный для растворителя и молекул ниже определенного размера, соответствующего М_мин) рабочая зависимость имеет линейный (квазилинейный) характер. Соответствующие объемам V₀ и V_T мол. массы представляют собой пределы исключения - М_макс (молекулы большого размера, не проникают в поры сорбента) и М_мин, (молекулы небольшие, полностью проникают в поры сорбента). Сорбенты с порами одного размера теоретически способны разделять макромолекулы в пределах коммерческие сорбенты характеризуются. Ддя разделения макромолекул в большом диапазоне М нужны сорбенты с бимодальным и тримодальным распределением пор по размерам, обеспечивающие линейную мол. массовую калибровочную зависимость в диапазоне М = 10^2,5 - 10^6,5. Максимальная селективность достигается увеличением объема перового пространства сорбента, у бимодального и тримодального сорбентов, кроме того, оптимальным распределением пор по размерам. Важно, чтобы при разделении смеси макромолекул их наибольшая и наименьшая М находились в пределах М_МИН - М_МАКС характерных для данного сорбента.

Механизм эксклюзионной хроматографии. Эксклюзионная хроматография (Size Exclusion Chromatography, SEC) или гель-проникающая хроматография (ГПХ, Gel Permeation Chromatography, GPC) реализуется, когда поведение макромолекул в порах определяется энтропийной составляющей свободной энергии, а энергетическая составляющая мала по сравнению с ней. В этом случае, коэффициент распределения будет экспоненциально зависеть от соотношения размера макромолекулы и размера пор. Макромолекулы в р-ре представляют собой статистич. ансамбль (статистич. клубок). Их распределение между пористым сорбентом и р-ром контролируется изменением энергии Гиббса при переходе макромолекулы из р-ра в поры: где- изменение энтальпиимакромолекулы вследствие взаимод. ее сегментов с пов-стью сорбента (матрицей геля); - уменьшение энтропиипри переходе макромолекулы из р-ра в поры; Т - абс. т-ра. Разделение макромолекул происходит в эксклюзионном режиме, когда, a K_d, зависящий от соотношения размеров макромолекул и пор, меньше 1. Для подавления нежелательных для эксклюзионной хроматографии явлений ионной эксклюзии и ионообменной сорбции модифицируют поверхность сорбентов (для придания ей нейтрального заряда при рН > 4), увеличивают ионную силу растворителя, ослабляя кулоновские взаимодействие, добавляют органические растворители, смещая тем самым рК полиэлектролита или изоэлектрическую точку у полиамфолитов. С другой стороны, ионообменную сорбцию и ионную эксклюзию можно использовать для разделения нейтральных макромолекул, полианионов и поликатионов одного размера. Поскольку диссоциация полиэлектролитов увеличивается с разбавлением их растворов, то при эксклюзионной хроматографии макромолекулы на краях хроматографической колонки, где их концентрация мала, диссоциируют и движутся по колонке не по законам эксклюзионной хроматографии, а по законам ионообменной сорбции и ионной эксклюзии в зависимости от заряда поверхности сорбента и макромолекулы, что приводит к искажению формы кривой зависимости V и М (рис. 2), а также позволяет диагностировать наличие того или другого процесса.

Рис. 2. Эксклюзионная хроматография нейтральных макромолекул (а) и полиэлектролитов: ионная эксклюзия (б), ионообменная сорбция (в)

Эффекты, аналогичные ионообменной сорбции, но только в более слабой степени, могут наблюдаться при гидрофобных взаимодействиях макромолекулярных сегментов с модифицированной гидрофобными радикалами поверхностью сорбента или при электростатическом взаимодействии поверхностных силанольных гидроксигрупп с с функциональными группами полярных макромолекул. Все эти эффекты должны подавляться при проведении эксклюзионной хроматографии.

Для анализа какого-либо полимера по молекулярным массам необходимо подобрать колонку с подходящим размером пор или серию колонок с разными порами или воспользоваться колонкой со смесью сорбентов с разными порами (колонка Linear в приведенном примере). Разумеется, чтобы использовать метод ГПХ для анализа ММР необходимо обеспечить условия реализации эксклюзионного механизма разделения, не осложненного эффектами взаимодействия как срединных, так и концевых звеньев цепи. Речь идет об адсорбционном взаимодействии из неполярного растворителя или обращено-фазном взаимодействии неполярных фрагментов цепи при хроматографии гидрофильных полимеров в водной среде. Кроме того, водорастворимые полимеры, содержашщие ионизированные группы, способны к сильным электростатическим взаимодействиям и требуют особенно тщательного подбора условий хроматографии. Подбор условий включает в себя выбор подходящих по химическому строению для конкретного анализа сорбента и растворителя (элюента).

Техника эксклюзионной хроматографии. Для разделения макромолекул в режиме эксклюзионной хроматографии используют колонки двух типов: работающие в узком = 10²) и широком (= 10⁴ - 10⁵) диапазонах. Колонки широкого диапазона M имеют широкое распределение пор сорбента по размерам (бимодальное, тримодальное). Это распределение подбирается таким образом, чтобы при заданных степени линейности калибровочной мол.-массовой зависимости и диапазона масс обеспечивалась наибольшая степень селективности. Эксклюзионная хроматография осуществляется с помощью хроматографа, детектором служит спектрофотометр или проточный рефрактометр с предельной чувствительностью 5 х 10^-8 ед. рефракции, что соответствует концентрации полимера 5-10^-5%. Обычно прибор работает при комнатной температуре, однако эксклюзионная хроматография полиолефинов требует повышенной температуры, что способствует увеличению селективности разделения, эффективности колонок и скорости анализа вследствие уменьшения вязкости подвижной фазы. Современные хроматографы комплектуются автоматическим устройством для приготовления (растворение полимера, фильтрация р-ра) и ввода пробы, компьютером для интерпретации результатов анализа ММР. Применение комбинации рефрактометрического детектора и фотометра позволяет определять ММР и индексы разветвленности без калибровки хроматографа по полимерным стандартам. При гель-фильтрации белков необходимо принимать меры для предотвращения их адсорбции на сорбенте и не допускать их денатурации. В отличие от эксклюзионной хроматографии синтетических полимеров и олигомеров, используемой главным образом в аналитических целях, гель-фильтрация белков - один из важнейших способов их выделения и очистки.

Ддя эксклюзионной хроматографии используют макропористые неорганические или полимерные сорбенты. Для эксклюзионной хроматографии полярных полимеров неорганические сорбенты (силикагели и макропористые стекла) модифицируют кремнийорганическими радикалами, а для эксклюзионной хроматографии гидрофильных полимеров - гидрофильными группами. Среди полимерных сорбентов наиболее распространены стирол-дивинил-бензольные (для эксклюзионной хроматографии высокополимеров и олигомеров). Для гель-фильтрации биополимеров, прежде всего белков, используют гидрофильные полимерные сорбенты (сефадексы - декстраны с поперечными сшивками, а также полиакриламидные гели) или модифицированные полисахаридами макропористые силикагели.

Эксклюзионную хроматографию эффективно применяют при разработке новых полимеров, технологических процессов их получения, контроле производства и стандартизации полимеров. Эксклюзионную хроматографию используют для анализа ММР полимеров, исследования, выделения и очистки полимеров, в т. ч. биополимеров.

Размещено на Allbest.ru