Фотохимические превращения ДНК. Люминесцентные метки и зонды и их применение в медицине

Размещено на http://www.allbest.ru/

АО Медицинский университет Астана

Кафедра информатики с курсом медбиофизики

СРС

На тему: Фотохимические превращения ДНК. Люминесцентные метки и зонды и их применение в медицине

Подготовил: Бельгебаев Ж.К. ОМ 136

Проверила: Масликова Е.И.

Астана 2013

Введение

В современной фотохимии выделяют следующие разделы: фотохимию малых молекул, позволяющую выяснить динамику элементарного акта в возбужденных электронных состояниях молекул; орг. и неорг. фотохимии, изучающие фотопревращения соответствующих хим. соединений и методы фотохимического синтеза; механистич. (физ.) фотохимию, изучающую механизмы и кинетические закономерности фотохимических реакций и тесно связанная с фотофизикой, химической кинетикой, квантовой химией, теорией строения молекул и др. разделами физ. химии.

Важные практические применения фотохимии связаны с фотографией, фотолитографией и др. процессами записи и обработки информации, пром. и лаб. синтезом орг. и неорг. в-в (фото-нитрозирование циклогексана с целью получения капролак-тама, синтез витаминов группы D, напряженных полициклич. структур и др.), синтезом и модификацией полимерных материалов (фотополимеризация, фотомодификация и фотодеструкцияполимеров), квантовой электроникой (фотохим. лазеры, затворы, модуляторы), микроэлектроникой (фоторезисты), преобразованием солнечной энергии в химическую.

Фотохим. процессы играют очень важную роль в природе. Биол. фотосинтез обеспечивает существование жизни на Земле. Подавляющую часть информации об окружающем мире человек и большинство животных получают посредством зрения, основанного на фотоизомеризации родопсина, к-рая запускает цепь ферментативных процессов усиления сигнала и тем самым обеспечивает чрезвычайно высокую чувствительность вплоть до регистрации отдельных фотонов. Озон образуется в верх. слоях атмосферы из кислорода под действием коротковолнового (<180 нм) излучения Солнца по р-ции:

Фотохимические реакции

ФОТОХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ - химические превращения, протекающие под действием света в видимой и ультрафиолетовой области спектра.

Еще в античные временя мастера красильного производства знали, что некоторые краски на прямом солнечном свету обесцвечиваются - выцветают. В средние века алхимики знали, что соли серебра чернеют со временем, но это связывали с действием воздуха. Лишь в 1727 Иоганн Генрих Шульце установил, что почернение хлорида серебра происходит под действием света. В 1802 немецкий физик Иоганн Риттер исследовал химическое действие различных участков светового спектра. Используя призму, он установил, что почернение хлорида серебра возрастает при переходе от красного к фиолетовому концу спектра и становится максимальным за его пределами. Таким образом в солнечном спектре было обнаружено новое излучение, которое получило название ультрафиолетового. Эти исследования были особенно важны для разработки фотографических процессов.

В 1818 прибалтийский физик и химик Теодор Гротгус сформулировал один из основных законов фотохимии: химическое действие может произвести только свет, который поглощается реагирующими молекулами. Например, водород не поглощает видимый свет, а хлор поглощает только фиолетовые и синие лучи. Поэтому красный свет не может вызвать реакцию в смеси водорода с хлором. К такому же выводу пришел независимо американский ученый Джон Уильям Дрепер. Этот первый фотохимический закон получил название закона Гротгуса - Дрепера.

Первичный фотохимический акт

После поглощения кванта света в молекуле могут происходить разнообразные процессы. В начале 20 в. Альбертом Эйнштейном и немецким физиком Иоганном Штарком был сформулирован второй закон фотохимии. В соответствии с этим законом, первичный фотохимический акт происходит под действием одного кванта света - фотона. Поэтому этот закон называют также законом квантовой эквивалентности. (После открытия лазеров было обнаружено, что у этого закона есть исключения: в случае очень мощного лазерного излучения возможно одновременное поглощение двух фотонов.)

Второй закон фотохимии служит основой для расчета квантового выхода фотохимической реакции, который равен числу прореагировавших (или вновь образовавшихся) молекул, деленному на число поглощенных квантов. Квантовый выход, определяемый экспериментально, позволяет судить о механизме фотохимической реакции.

Молекула, поглотившая в первичном процессе квант света, приобретает избыточную энергию, поэтому такую молекулу называют возбужденной. В отличие от теплового воздействия, когда возбуждаются колебательные движения молекулы и возрастает ее кинетическая энергия, при поглощении фотона энергия передается электронам. С электронно возбужденной молекулой могут происходить самые разнообразные процессы. Некоторые из них не связаны с химическими превращениями и называются фотофизическими процессами. Так, возбужденное состояние может за очень короткое время (порядка 10-⁹ с) вернуться в основное состояние, отдавая избыточную энергию в виде кванта света (как правило, с меньшей энергией). Этот процесс называется флуоресценцией. Если же в результате столкновения возбужденной молекулы с другими молекулами происходит передача избыточной энергии, то интенсивность флуоресценции снижается - частично или полностью. Такие процессы с потерей энергии называются тушением флуоресценции. Возбужденное состояние может также перейти в более долгоживущее (от 0,001 с до нескольких минут) триплетное состояние, энергия которого ниже. Испускание света из этого состояния называется фосфоресценцией.

Возбужденная светом молекула может также вступать в различные химические реакции. Свойства электронно возбужденного состояния могут сильно отличаться от свойств основного состояния молекулы. Так как у каждой молекулы существует лишь одно основное, но несколько возбужденных состояний, фотохимия данного соединения может быть существенно богаче его химии в основном состоянии. В результате появляется возможность осуществлять необычные химические превращения, не свойственные веществам в основном состоянии.

Если после поглощения фотона преобладают фотофизические процессы, число химически прореагировавших молекул, приходящихся на один поглощенный квант, то есть квантовый выход реакции, будет меньше единицы. Например, при облучении красным светом водного раствора ферриоксалата калия (комплекса трехвалентного железа с анионом щавелевой кислоты - оксалатом состава К₃[Fe(C₂O₄)₃]) квантовый выход фотохимической реакции 2Fe(C₂O₄)₃^3- ? 2Fe²⁺ + 5C₂O₄^2- + 2CO₂ равен всего 0,01, но возрастает с увеличением энергии кванта света. Еще меньшие квантовые выходы наблюдаются при фотохимическом разложении (фотолизе) твердых тел. Например, даже на ярком солнечном свету полимерные пленки разрушаются довольно медленно, в течение многих недель, месяцев и даже лет.

В большинстве фотохимических реакций получаемая молекулой энергия превышает типичные энергии активации темновых (термических) реакций и может даже превосходить энергию разрыва химических связей. Тем не менее многие фотохимические реакции отличаются высокой избирательностью, что связано с особенностями электронного строения возбужденного состояния.

Реакция фотодимеризации

Эта реакция впервые была обнаружена при Уф облучении замороженных растворов тимина. Она состоит в соединении двух оснований по 5,6-двойной углеродной связи с образованием кольца циклобутанового типа:

Характерная черта реакции димеризации ее обратимость. Пиримидиновые основания поглощают свет в области 200-300 нм, их димеры примерно в том же диапазоне УФ-спектра (200-285 нм). Поэтому при Уф облучении оснований или ДНК для каждой длины волны возбуждающего света между димерами и основаниями устанавливается динамическое равновесие, определяемое соотношением поперечных сечений димеризации оснований и мономеризации димеров. Так, в случае облучения тимина при 200 нм димеризуется около 65% оснований, а при 280-15%.

Вследствие бимолекулярного характера реакций фотодимеризации ее квантовый выход существенно зависит от степени взаимоориентации мономеров при возбуждении одного из них. Например, квантовый выход димеризации тимина в водном растворе при комнатной температуре - 4,710^-4, а в замороженном - 1. Квантовый выход димеризации тимина в ДНК - 210^-2. В соответствии с проведенными расчетами условия для димеризации тимина в ДНК являются оптимальными, если соседние мономеры ориентированы друг к другу под углом в 36.

Некоторые красители акридинового ряда могут эффективно уменьшать выход УФ- индуцированных димеров в ДНК. Защитное свойство акридинов основано на их способности интеркалировать между парами оснований в молекуле ДНК. Характерная черта взаимодействия акридинов (например акридиновый оранжевый) с ДНК заключается в том, что при образовании комплекса резко увеличивается интенсивность флуоресценции красителя в максимуме спектра при 530 нм. По мнению некоторых авторов, это может быть обусловлено синглет-синглетной миграцией энергии возбуждения с оснований на краситель. Расчеты показывают, что максимальный квантовый выход такой миграции энергии достигается при соотношении 1 молекула красителя / 5 оснований и составляет 32%. Помимо увеличения интенсивности флуоресценции тестом на связывание акридинов с ДНК может служить так же изменение степени поляризации люминесценции, зависящей от подвижности молекул красителей. С помощью этого метода показано, в частности, что плоскость кольца акридинового оранжевого перпендикулярна длинной оси спирали ДНК и параллельна плоскостям оснований.

Реакция фотогидратации

Этот процесс - вторая важная фотохимическая реакция пиримидиновых оснований ДНК, которая заключается в присоединении воды к пиримиддиновым основаниям ДНК, которая заключается в присоединении воды к пиримидиновому кольцу у С ₅(Н) и С₆(ОН) углеродных атомов с разрывом двойной связи между ними и образованием 6-окси-5-гидропроизводных оснований.

В отличие от димеризации реакция гидратации не является фотообратимой. Однако гидраты могут разрушаться при повышении температуры (>30 50 0С) и ионной силы раствора, а так же при сдвигах рН. Скорость фотогидратации уменьшается при замене Н₂О на Д₂О. Предшественниками гидратов пиримидинов являются видимо, их синглетные возбужденные состояния. В пользу этого свидетельствуют следующие данные: триплетные тушители не влияют на фотогидратацию, квантовый выход реакции не зависит от длины Уф света, хотя вероятность конверсии в триплетное состояние зависит от нее, избирательное фотосенсибилизированное заселение триплетных уровней оснований не приводит к их гидратации. Особенность реакции фотогидратации заключается в том, что она протекает только в одно-цепочной ДНК. Поэтому гидраты пиримидинов могут вносить вклад в летальный или мутагенный эффект лишь у клеток с активным процессом репликации и транскрипции, в ходе которых появляются короткие одно-цепочные участки ДНК.

Образование (6-4) пиримидиновых аддуктов

фотохимия квантовый реакция аддукт

Эти фотопродукты, характеризующиеся абсорбцией при 315-320 нм и флуоресценцией в области 405-440 нм, были выделены из кислотного гидролизата УФ-облученной ДНК. Структура аддуктов была установлена с помощью УФ-, ИК-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии, Квантовый выход (6-4)-аддуктов порядка 10~³, т. е. в ~ 10 раз меньше, чем цикло-бутановых димеров, и следовательно, в летальный эффект УФ-излучения (254 нм) они вносят незначительный вклад. Однако в УФ-мутагенезе они могут играть важную роль. В отличие от летальных повреждений ДНК, мутационные дефекты возникают намного реже, и поэтому для них требование максимального квантового выхода не имеет принципиального значения. Полагают, что реакция образования (6-4) пиримидиновых аддуктов идет по схеме:

Сшивки с белком

Это пример межмолекулярных взаимодействий, относящихся к третьему типу фотохимических реакций, в которые вступают Пиримидиновые основания ДНК. Акцепторами Уф света являются оба компонента, поскольку облучение как белка, так и ДНК перед сшиванием сопровождается образованием сшивок. Механизм данного процесса, вероятно, заключается в прикреплении аминокислотных остатков белка через SН- или ОН- группы к С₅ или С₆ цитозина или тимина ДНК. В модельной системе наблюдали образование по такому механизму 5-S-цистеин-6-гидроурацила.

Рассмотренные выше фотохимические реакции ДНК протекают с участием низших возбужденных (синглетных и триплетных) состояний пиримидиновых оснований, которые возникают в результате поглощения одного кванта Уф света.

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия -- оптическое исследование микрообъектов, окрашенных специальными красителями (флюорохромами), испускающими свечение при воздействии ультрафиолетовыми лучами. Для люминесцентной микроскопии применяются специальные оптические устройства и микроскопы, основной частью которых является источник ультрафиолетовых лучей и система фильтров к нему.

Флюорохромы, как правило, флюоресцируют по-разному в зависимости от химического состава структур, с которыми они взаимодействуют. Некоторые из них обладают сродством к определенным клеточным структурам. Например, акридиновый оранжевый краситель окрашивает нуклеопротеиды клетки, аурамин -- воскоподобное вещество, содержащееся в микобактериях. Некоторые микрообъекты не требуют предварительной окраски флюорохромами и изучаются с помощью люминесцентной микроскопии без окраски. См. также Люминесцентный анализ, Люминесценция.

Люминесцентная микроскопия (флюоресцентная микроскопия) -- специальный вид микроскопирования, основанный на использовании собственной (первичной) или наведенной (вторичной) фотолюминесценции микроскопических объектов. Видимая люминесценция (см.) препарата возбуждается либо сине-фиолетовым светом, либо ультрафиолетовыми лучами.

Люминесцентный микроскоп в принципе -- обычный биологический микроскоп, снабженный двумя светофильтрами: один пропускает только возбуждающие сине- или ультрафиолетовые лучи (его помещают перед источником света), другой поглощает эти лучи и пропускает только более длинноволновый свет люминесценции препарата (его устанавливают в тубусе или на окуляре микроскопа). Источниками света служат ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления (типа ДРП1) или лампы накаливания точечного типа. Яркое цветное свечение объектов на темном фоне обеспечивает высокий контраст. Оптико-механическая промышленность выпускает специальные люминесцентные микроскопы и отдельные осветители.

Лишь немногие биологически значимые вещества имеют выраженную собственную люминесценцию в видимой области спектра. К ним относятся некоторые пигменты (хлорофилл, порфирины, липохромы), витамины А и В2, алкалоиды (берберин, хинин и др.), антибиотики (тетрациклины и др.), химиотерапевтические и токсические вещества. Проникновение этих веществ в органы и клетки, их распределение и превращения могут быть прослежены при помощи прижизненной люминесцентной микроскопии. Чаще в люминесцентной микроскопии используют люминесцентную «окраску» специальными веществами (флюорохромами), избирательно придающими тонким структурам клетки и тканей способность люминесцировать (люминесцентная цитохимия). Так, например, флюорохром акридиновый оранжевый применяют для контрастирования ядерных структур, выявления нуклеиновых кислот, мукополисахаридов, для обнаружения микробов и крупных вирусов, для цитодиагностики, в том числе распознавания в мазках раковых клеток; аурамин 00 служит для выявления кислотоустойчивых бактерий (туберкулеза, проказы), риккетсий и некоторых вирусов; примулин -- для флюорохромирования элементарных телец вирусов и различения живых и мертвых клеток; фосфин ЗК, нильский голубой и бензпирен -- для локализации липидов в клетках.

Особое значение в люминесцентной микроскопии придается люминесцентно-иммунологическим методам [Куне (A. Coons) с сотр., 1942, 1950], основанным на применении люминесцентно меченных специфических сывороток (антител). Метчиком чаще служит флюорохром изотиоцианат флюоресцеина. Получаемый комплекс «антитело-флюорохром» позволяет быстро обнаруживать, идентифицировать и локализовать даже ничтожные количества соответствующих антигенов, в том числе вирусов, риккетсий, бактерий на фоне посторонней микрофлоры, а также выявлять специфические белки, ферменты, полисахариды в клетках и тканях. Наряду с визуальными наблюдениями и фотографированием в Л.м. все шире применяется объективная регистрация интенсивности, спектров и выхода люминесценции.

В СССР развивается новый вид Л. м.-- так называемая ультрафиолетовая Л.м., при помощи которой исследуется собственная ультрафиолетовая невидимая в обычных условиях люминесценция объектов (Е. М. Брумберг), тонко отражающая особенности их физиологического состояния.

Люминесцентная микроскопия клеток и тканей

При люминесцентной микроскопии можно изучать первичную (ткани и органы человека и животных имеют нерезкую белесую, голубую или синюю люминесценцию) и вторичную люминесценцию клеток и тканей. Изучение вторичной люминесценции живых и фиксированных клеток и тканей (после их «окраски» флюорохромами) получило широкое распространение. При изучении живых клеток флюоресцирующие вещества применяют в очень малых количествах, не вызывающих токсического действия. В цитологических исследованиях Л. м. применяют при диагностике злокачественных новообразований в соскобах, пунктатах, мокроте, промывных водах. Этот метод позволяет быстро получить ярко окрашенный препарат, в котором атипичные клетки выделяются ярким свечением, оттенками цвета и структурой. Л. м. применяется и в гистохимии. Использование акридинового оранжевого позволяет выявить нуклеиновые кислоты, при этом ДНК дает зеленую, а РНК -- красную флюоресценцию. Тот же флюорохром в нефиксированных срезах помогает выявить мукополисахариды, а при модификации этого метода -- муцины. Фосфин 3R, родамин В, бензпирен и др. выявляют в срезах липиды.

Люминесцентные зонды и метки. В медицине используется применение специальных флуоресцирующих молекул, добавляемых к исследуемым биологическим системам извне, в которых они распределяются в соответствии со своими свойствами. Примером использования флуоресцентных зондов является метод флюоресцентной ангиографии - контрастирование сосудов флуоресцеином и их последующее фотографирование. Этот краситель вводится внутривенно пациентам. Этот краситель не токсичен, обладает очень высоким квантовым выходом флуоресценции. Он разносится с током крови по всему организму и диффундирует в дерму и эпидермис. Флуоресцеин возбуждается невидимым длинноволновым ультрафиолетовым излучением. Люминесценция его наблюдается в видимом свете. Диагностическая значимость этого метода заключается в том, что по скорости появления флуоресценции (люминесценции) в поверхностных тканях судят об участках тела с пониженным кровообращением, в них флуоресцеин появляется позже, чем в участках тела с нормальным кровообращением. [3]

Применение люминесценции для аналитических целей включает широкую область использования ее для идентификации веществ, для обнаружения малых концентраций веществ; для контроля изменений, претерпеваемых веществом; для определения степени чистоты веществ. Широко применяются измерения люминесценции при изучении кинетики обычных химических реакций. Высокая чувствительность метода позволяет фиксировать малую степень превращения, а иногда по люминесценции промежуточных соединений становится возможным установить механизм химической реакции. Люминесцентные методы используются в биологии, в частности, для исследования структуры белков методом флуоресцентных зондов и меток.

Вывод

До создания лазерных источников УФ-излучения классическая УФ - фотобиология рассматривала в основном процессы, линейно зависящие от интенсивности УФ-света или исследовались биологические эффекты одноквантовых фотохимических реакций. Лазерное излучение обладает такими замечательными свойствами, как пространственная к:огерентность, монохроматичность, высокая интенсивность и концентрация энергии в коротком импульсе наносекундной или пикосекундной длительности. Большая мощность и ультракороткое время действия делают лазерное УФ-излучение потенциально новым инструментом для исследования процессов двухквантового возбуждения электронных уровней оснований ДНК и особенностей протекающих при этом фотохимических реакций, а также их проявления на биологическом уровне.

Экспериментальные исследования, в которых водные растворы азотистых оснований облучали пикосекундными или наносекундными импульсами УФ-излученш (266 нм), показали, что при интенсивностях выше 10¹⁰ Вт/м² происходят необратимые фотохимические изменения молекул, причем образующиеся продукты качественно отличаются от фотопродуктов одноквантовых реакций, таких, как пиримидиновые димеры и гидраты. Причем степень деградации оснований квадратично зависит от интенсивности излучения, что свидетельствует о двухквантовом механизме лазер-индуцированных фотохимических превращений.

Лазер-индуцированное двухквантовое возбуждение оснований в составе ДНК приводит к таким ее фотохимическим превращениям, которые не наблюдаются (либо идут с очень низким квантовым выходом) в случае действии низкоинтенсивного УФ-света. Наряду с деградацией оснований в ДНК выявлены разрывы N-гликозидной связи с отрывом тимина от цепи ДНК (при низко интенсивном УФ-облучении такой процесс не происходит) и одноцепочечные разрывы. Показано, что квантовый выход однонитевых разрывов при переходе от низкоинтенсивного УФ-облучения (1 Вт/м²) к высокоинтенсивному пикосекундному УФ-облучению (4 * 10¹³ Вт/м²) возрастает от (12) * 10^-6 до 8 * 10^-5.

Вклад двухквантовых фотоповреждений ДНК по сравнению с одноквантовымг (пиримидиновые димеры) в лазерную УФ-инактивацию плазмид, бактериофагов и микроорганизмов значительно выше. Об этом, в частности, свидетельствуют эксперименты по изучению фотореактивации УФ-облученных биологических объектов Они показали, что с ростом интенсивности лазерного УФ-излучения (266 нм) степень фотореактивации резко уменьшается (СЛАЙД 8).

Поскольку при фотореактивации ликвидируются летальные фотопродукты только одного типа -- циклобутановые пиримидиновые димеры ДНК, то установленный факт свидетельствует ос уменьшении вклада димеров (и соответственно увеличении вклада двухквантовых фотоповреждений ДНК) в лазерную УФ-инактивацию.

Литература

1. http://www.ngpedia.ru/id43109p2.html.

2. http://www.medical-enc.ru/11/lumen_microscopy.shtml.

3. http://www.krugosvet.ru/enc/nauka_i_tehnika/himiya/FOTOHIMICHESKIE_REAKTSII.html?page=0,1.

4. http://lib.znate.ru/docs/index-202005.html.

5. http://www.himi.oglib.ru/bgl/483/6.html.

Размещено на Allbest.ru