Методы получения аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами

Размещено на http://www.allbest.ru/

МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ, МЕЧЕНЫХ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ.

к.х.н. О.В. Мосин (Россия) Доктор наук, проф. И. Игнатов (Болгария)

Аннотация

Статья посвящена рассмотрению современных биотехнологических и химико-ферментативных методов по получению аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами 2Н, 13С, 15N, 18О. Рассмотрены потенциальные возможности этих методов для направленного синтеза изотопномеченых аминокислот и белков. Представлены собственные и имеющиеся в литературе данные по получению и использованию синтезированных меченых соединений в разнопрофильных биохимических исследованиях с применением методов спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной (ИК) и лазерной спектроскопии, а также масс-спектрометрии.

ВВЕДЕНИЕ

Метод обогащения молекул стабильными изотопами (2Н, 13C, 15N, 18О и другие) является в настоящее время важным направлением в биохимических и структурно-функциональных исследованиях разнообразных природных соединений и, в частности, аминокислот и белков [1-7]. Эти изотопномеченые биологически активные соединения (БАС), полученные данным методом с различными уровнями изотопного обогащения, от селективно до униформно меченых, являются удобными инструментами для разнопрофильных метаболических и биохимических исследований [8, 9], медицинской диагностики различных заболеваний [10-13], химических синтезов разнообразных изотопномеченых соединений на их основе. Например, [2H]- и [13C]фенилаланин и [2H]- и [13C]тирозин использованы в синтезах меченых аналогов пептидных гормонов и нейропептидов [14, 15].

Тенденции к предпочтительному применению стабильных изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ЯМР [16-19], ИК- [20, 21] и лазерной спектроскопией [22, 23], масс-спектрометрией [24, 25]. Развитие этих методов детекции стабильных изотопов за последние годы позволило повысить эффективность проведения многочисленных биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия многих клеточных БАС на молекулярном уровне.

Именно поэтому разработка путей получения аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами, является актуальной задачей для современной биотехнологии. Однако, разные методы, используемые для введения стабильных изотопов в молекулы БАС, обычно приводят к получению препаратов, представляющих собой смеси молекул, различающихся количеством атомов, замещённых на стабильные изотопы. Поэтому необходимо разрабатывать и применять новые подходы по получению изотопномеченых БАС, основанные на использовании генно-инженерных методов, комбинации биотехнологических и химико-ферментативных подходов и т. п. В зависимости от цели исследования при реализации того или иного подхода по получению изотопномеченых аминокислот и белков должны учитываться их стоимость, выходы, возможности более полного выделения и очистки, а также изотопная чистота синтезированных продуктов. При получении изотопномеченых аминокислот и белков основные затраты связаны с закупкой сырья (субстрата), расходом электроэнергии (на перемешивание, аэрацию и процессы массопереноса) и охлаждением (теплообменом).

При использовании природных сырьевых источников (пептонов, белково-витаминных концентратов и т. п.) в качестве субстратов для производства изотопно-меченых БАС необходимо также учитывать расход электроэнергии, пара и топлива на предварительную глубокую обработку сырья, чтобы превратить его в поддающиеся микробиологическому воздействию соединения.

Сравнительная оценка различных способов производства изотопно-меченых аминокислот и белков показывает, что основные расходы здесь связаны со стоимостью сырья, составляющей 70-80% всех затрат.

Использование аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами, в значительной мере определяется ограниченной доступностью и дороговизной самих высокоочищенных изотопов, выделяемых из различных природных источников.

Природная распространенность стабильных изотопов варьирует от 0,015% (относительно общего количества элемента) для дейтерия, до 1,11% для изотопа углерода 13С, однако, несмотря на низкое содержание изотопов в пробах, разработанные в последние годы методы обогащения и очистки стабильных изотопов позволяют получать меченые субстраты высокой степени изотопной чистоты.

Несмотря на всё возрастающий мировой интерес к изотопномеченым БАС, в отечественной литературе имеются лишь немногочисленные сведения, касающиеся методов получения этих важных соединений [26-28]. Целью настоящего обзора было более полное освещение методов получения аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами 2Н, 13С, 15N, 18О.

ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОТОПНОМЕЧЕНЫХ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ

Химические синтезы изотопно-меченных аминокислот

Общая стратегия получения изотопно-меченых аминокислот и белков показана на рис. 1. Синтетические методы получения изотопно-меченых аминокислот представляют собой, как правило, модифицированный классический синтез аминокислот, в котором стадии карбоксилирования, аминирования, восстановления, гидрирования или гидролиза проводят с использованием меченых реагентов, содержащих стабильные изотопы 2Н, 13С, 15N, 18О с соответствующим уровнем изотопной чистоты. В частности, для синтеза [2Н]-, [15N]- и [18О]аминокислот используют 2Н2О; 2H2; 2HCl; LiAl2H4; B22H6; 15NH3; Na15NH2; 15NH2Cl, 18H2O и др. (более подробно о методах получения [2H]-и [15N]аминокислот см. обзоры [29, 30]).

Особую ценность для многих исследований имеют [13C]аминокислоты, которые можно получать за счёт карбоксилирования соответствующих органических соединений с помощью 13CO2 и Ni(13CO)4 по связи углерод-водород или углерод-металл с последующим гидролизом. Перспективные синтетические подходы по получению [13C]аминокислот, меченных изотопом углерода 13С по различным положениям молекул, включая карбоксильные СООН- и Сa- положения, продемонстрированы в работах [31-36], а также описан стереоселективный синтез [13С]аминокислот [37-39]. Несмотря на это, химические синтезы всё же часто многостадийны, требуют больших расходов ценных реагентов и меченых субстратов и приводят в результате к продукту, представляющему собой рацемическую смесь D- и L-форм аминокислот, для разделения которых требуются специальные методы [40]. Значительным недостатком метода является то, что он приводит к синтезу [13С]аминокислот, у которых атомы углерода 13С локализуются по карбоксильным СООН-положениям молекул. Последнее существенно ограничивает использование данных [13C]аминокислот для биологических исследований вследствие возможной потери изотопной метки 13С за счёт функционирования многочисленных реакций ферментативного декарбоксилирования, происходящих в организме [41]. Кроме этого, до настоящего времени практически не существует подходящего метода для введения изотопа 13C в положения углеродных атомов боковых радикалов молекул аминокислот, так чтобы каждая стадия химического синтеза была бы развита детально. Разработанные за последние годы синтетические методы введения 13C-метки в аминокислоты затрагивают, как правило, такие положения углеродных атомов в молекулах аминокислот, как метильная СН3- группа метионина [42], С2- положение в имидазольном кольце молекулы гистидина [43], а также атомы углерода при карбоксильных СООН- группах аспарагиновой [44], и глутаминовой кислот [45].

Более тонкие синтезы изотопномеченых аминокислот были связаны с использованием комбинации химических и ферментативных подходов. Например, L-[4-13C]валин, L-[3-13C]триптофан и другие L-[13C]аминокислоты, были синтезированы с использованием препаратов ферментов [46] (более подробно о химико-ферментативных подходах по синтезу изотопно-меченых аминокислот см ниже).

Изотопный (1Н-2Н)- и (16О-18О)-обмен в молекулах аминокислот и белков

Весьма эффективным подходом для препаративного получения [2H]аминокислот является селективное замещение определённых легко обмениваемых на дейтерий ароматических протонов в бензольном кольце фенилаланина и тирозина, в индольном кольце триптофана и в имидазольном кольце гистидина, как в виде индивидуальных аминокислот, так и в составе аминокислотных остатков в белках [47, 48]. Реакция изотопного (1Н-2Н)-обмена протекает по механизму электрофильного замещения и затрагивает лишь определённые, наиболее чувствительные к замещению протоны в ароматических аминокислотах. Этим методом могут быть получены в граммовых количествах L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланин в 85% 2H2SO4 при 500 C, L-[3,5-2H]тирозин в 6 н. 2H2SO4 при слабом кипячении раствора, L-[2,4,5,6,7-2H]триптофан в 75% [2H]трифторуксусной кислоте при 250 С и L-[2-2H]гистидин в 6 н. NaO2H при 800 С.

Вследствие того, что замещаемые на дейтерий протоны в молекулах белков прочно связаны с атомами углерода и трудно обмениваются на дейтерий в мягких условиях, метод несколько лимитируется из-за нестабильности белков в жестких условиях (85-90% НCl/H2SO4, 80-1000 C), необходимых для проведения реакции изотопного обмена [49]. Кроме того, проведение изотопного обмена в более жёстких условиях сопровождается рацемизацией аминокислот. Избежать этого позволяет непосредственное введение полученных за счёт (1Н-2Н)-обмена дейтерированных аналогов аминокислот - L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланина, L-[3,5-2H]тирозина и L-[2,4,5,6,7-2H]триптофана в молекулы индивидуальных белков, например, в бактериородопсин, синтезируемый бактерией Halobacterium halobium [50].

Недавно разработан новый метод получения равномерно меченых a -[2H]аминокислот (глицин, аланин, валин, изолейцин, серин, треонин, пролин, гистидин) реакцией высокотемпературного твёрдофазного каталитического изотопного обмена [51, 52]. В соответствии с этим методом L-аминокислота в протонированой форме реагирует с газообразным дейтерием при 200-2500 С в присутствии высокодисперстного катализатора группы платины (Pt, Pd, Rh), и неорганического носителя (BaSO4, CaCO3, Al2O3).

С помощью изотопного обмена можно также получать и [18O]аминокислоты. Для этого используют реакцию изотопного (16О-18О)-обмена по атомам кислорода карбоксильных СООН- групп в молекулах аминокислот в присутствии Н218О в качестве источника метки [53]. Использование этого метода лимитируется высокой стоимостью полученных таким способом [18О]аминокислот. Однако, он полностью оправдывает себя при проведении многочисленных биомедицинских исследований с применением синтезированных [18O]аминокислот, так как они, в отличие от их дейтерированных аналогов, стабильны по отношению к обратному изотопному обмену. Например, [18О]аминокислоты стабильно существовали в плазме крови в течении нескольких дней после инъекции: обратный изотопный (18О-16О)-обмен по карбоксильным положениям в молекуле [18О]тирозина и других [18O]аминокислот проявлялся лишь при длительной инкубации клеток крови с питательной средой [54].

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОТОПНО-МЕЧЕНЫХ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ

Выращивание микроорганизмов на средах, содержащих стабильные изотопы

Для многих целей, и прежде всего для структурных исследований белков, биотехнология предлагает альтернативный химическому синтезу путь получения изотопно-меченых аминокислот и белков, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению изотопов в молекулы соединений, и, самое главное, к сохранению природной конфигурации (стереоселективности) конечных продуктов [55, 56]. Метод заключается в выращивании штаммов-продуцентов необходимых БАС на ростовых средах, содержащих различные субстраты, представляющие собой органические соединения и неорганические соли, содержащие стабильные изотопы 2Н, 13С, 15N и 18О [57-61].

Решающее значение для биотехнологического получения изотопно-меченых аминокислот и белков имеет правильный выбор микроорганизмов, способных к устойчивому росту на средах, содержащих стабильные изотопы и к продукции нужных БАС. Наиболее доступными объектами для получения многих изотопно-меченых белков признаны микроводоросли, большое разнообразие которых в природе позволяет выбирать среди них отдельные виды, способные к эндогенному накоплению белков [62]. В то же время комплексное использование компонентов меченой биомассы микроводорослей позволяет выделять, например, [2H]аминокислоты, в том числе и гетеромеченые, из гидролизатов суммарных белков биомассы, выращенной на 2Н2O-среде [63]. Другие традиционные штаммы микроорганизмов также могут эффективно применяться для получения изотопно-меченых аминокислот и белков. При этом основными требованиями к микроорганизмам, используемым для получения изотопно-меченых соединений являются устойчивый рост на средах, содержащих стабильные изотопы и высокий уровень продукции нужных БАС, который можно повысить за счёт применения генно-инженерных методов, а также мутагенеза и селекции. Это создаёт предпосылки для конструирования новых бактериальных штаммов-продуцентов с заданными свойствами и для дальнейшего изучения их характеристик. Биотехнологический подход экономически целесообразен и особенно незаменим, когда необходимы высокая стереоселективность и максимальные уровни изотопного обогащения синтезируемых соединений.

При биотехнологическом получении изотопно-меченых соединений используют несколько подходов, один из которых заключается в униформном обогащении стабильными изотопами клеточных БАС по всему углеродному скелету молекул. Это достигается за счёт выращивания микроорганизмов на средах, содержащих меченые субстраты высокого уровня изотопной чистоты и с последующим фракционированием компонентов биомассы на различные классы природных соединений [64]. Так, аминокислоты с униформным характером включения изотопной метки 13С по скелету молекулы получают, в основном, при выращивании автотрофных микроорганизмов на ростовых средах, содержащих вместо обычных углеродных субстратов исключительно их низкомолекулярные [13С]аналоги, например 13СО2 [65]. Таким способом были получены многие [13C]белки, синтезируемые микроводорослями: ферридоксин из Anabaena [66], цитохром C-553 [67], цитохром C2 из Rhodospirillum [68], и флаводоксин из Anabaena 7120 [69] и использованы для дальнейших ЯМР исследований. Для структурных исследований белков методом спектроскопии ЯМР, для которого необходимо, чтобы как можно больше атомов в молекуле были замещены на их стабильные изотопы, биосинтетические подходы по получению униформно меченых [13C]аминокислот могут обеспечить сравнительно недорогое получение нужного количества меченых [13C]продуктов [70]. [15N]аминокислоты получают аналогичным путём за счёт выращивания микроорганизмов на водных средах, содержащих К15NO3 или другие 15N-содержащие соли [71], в то время как высокообогащённые дейтерием аминокислоты можно получать с использованием ростовых сред, содержащих вместо обычной воды 99,9% 2H2O [72]. Однако, при этом необходимо учитывать эффекты, связанные с клеточной адаптацией к 2Н2O. Известно, что2Н2О действует токсически на клетки, ингибируя жизненно-важные функции роста и развития многих микроорганизмов.

Однако, несмотря на негативный биостатический эффект 2Н2O, разные таксономические роды бактерий могут быть достаточно легко адаптированы к росту и биосинтезу на средах содержащих максимальные концентрации тяжелой воды [73], в то время как клетки высших растений способны выдерживать не более 60% 2Н2О [74], а животные клетки не более 30% [75]. С точки зрения физиологии и генетики адаптация клетки к 2Н2О является комплексным феноменом и может привести к изменениям активностей ферментативных реакций, что сказывается косвенно на структуре и функциях синтезируемых БАС, процессах биосинтеза и метаболизма и даже морфологии клетки. В связи с этим, разработка методов физиологической адаптации клетки к 2Н2О для получения высокообогащённых дейтерием БАС является весьма актуальной [76-78]. Следует также подчеркнуть, что исследования по адаптации биологических объектов к 2Н2О также должны учитывать химические изотопные эффекты, которые для изотопных пар протий/дейтерий могут быть аномально высокими [79]. При этом различают первичные и вторичные изотопные эффекты. К первичным изотопным эффектам следует отнести изменение констант скоростей химических реакций, протекающих в 2Н2О по отношению к таковым в обычной воде, измеренных как соотношение kH/k2H. Это соотношение меняется для различных связей, образованных с участием дейтерия и может варьировать в пределах от 7 до 10 единиц. К вторичным изотопным эффектам относятся изменения в константах скоростей химических реакций, обусловленных действием 2Н2О как растворителя (большая струрированность и вязкость, плотность, коэффициент диффузии и т. п.). Кроме того, следует помнить, что 2H2O является гидроскопическим соединением, активно поглощающем пары влаги из воздуха, неорганических солей среды, при стерилизации и т. п., и, следовательно, этапы, связанные с выращиванием бактерий на 2H2O-средах необходимо проводить в герметических условиях с использованием безводных реагентов, предварительно перекристаллизованных в 2Н2O неорганических солей и т. п. [18O]аминокислоты можно получать за счёт выращивания микроорганизмов на средах, содержащих другой изотопный аналог воды - H218O. Адаптация клеток к H218O в данном случае не является лимитирующим этапом. Однако, H218O используется в качестве источника изотопной метки в редких случаях, главным образом, вследствие высокой стоимости изотопных соединений кислорода [80].

Селективного включения стабильных изотопов в определённые положения молекул аминокислот и белков можно достичь за счёт применения комбинации меченых и немеченых субстратов в ростовых средах [81], меченых предшественников аминокислот [82], или при использовании ауксотрофных по определённым аминокислотам штаммов микроорганизмов [83]. Для этих целей очень хорошо подходит такая распространённая бактерия как E. coli, биосинтез аминокислот в которой к настоящему времени изучен наиболее детально и для которой получен многочисленный набор мутантных форм [84].

Очень часто, разветвлённые пути метаболизма меченых аминокислот в клетке приводят к специфическому мечению других биосинтетически родственных аминокислот за счёт использования клеткой многочисленных минорных путей биосинтеза и сопряжённых реакций метаболизма. В некоторых случаях этот фактор может существенно облегчить процесс получения селективно меченых белков и аминокислот. Таким способом был получен [15N]Т4-лизоцим, с селективным характером включения метки 15N лишь по остаткам глутамата, глутамина и аргинина [85]. В работах [86, 87] сообщается о получении других индивидуальных [15N]белков, селективно меченных изотопом 15N по остаткам гистидина и лизина.

Использование ауксотрофных мутантов бактерий для получения изотопномеченных аминокислот и белков

Использование ауксотрофных по определённым аминокислотам форм микроорганизмов для биосинтеза изотопно-меченых аминокислот и белков стало настолько популярным в биотехнологии, что сегодня его следует рассматривать как отдельное направление. Селективность мечения белков достигается в результате добавления в ростовую среду меченого аналога соответствующей аминокислоты или её предшественника, по которым штамм ауксотрофен и которые, вследствие этого, непосредственно или через de novo биосинтетический цикл предшественников заменяют в белке нативную аминокислоту. Аналогичный принцип может применяться и при получении изотопномеченых аналогов аминокислот. При этом ауксотрофные штаммы могут относиться к различным таксономическим группам микроорганизмов, включая метаногенные и метилотрофные бактерии, биотехнологический потенциал которых для получения изотопно-меченых аминокислот в настоящее время общепризнан. Так, метаногенные бактерии, относящиеся к группе облигатных анаэробов, которые получают энергию за счет ассимиляции газовой смеси (H2-CO2) [88, 89], чаще всего используют для получения [13C]аминокислот. Причём эффективности мечения аминокислот 13С добиваются за счёт получения и использования ацетатзависимых мутантов метаногенных бактерий, неспособных синтезировать ацетил-СоА из СО2 и вследствие этого для роста которых необходим экзогенный ацетат [90]. Поэтому выращивание этих бактерий проводят на ростовых средах, содержащих наряду с (H2-CO2) добавки ацетата, которые могут заменяться их [13С]аналогами. Как правило, при росте этих метанотрофов на средах с (H2-13CO2) и [13C]ацетатом удаётся достичь униформного характера включения 13С по углеродным скелетам в молекулах аминокислот, а также резкого уменьшения уровня включения экзогенного 13СО2 в конечный продукт ассимиляции углерода - метан [91]. В данном случае удается почти полностью избежать процесса разбавления метки в молекулах синтезируемых [13C]аминокислот. Селективного замещения молекул аминокислот изотопом 13С можно достичь за счёт использования ростовых сред, содержащих немеченую смесь (Н2-СО2) и [13C]ацетат либо 13СО2 в составе смеси (Н2-13СО2) и немеченый ацетат [92]. При этом вследствие высокой стоимости 13СО2 и неудобств, связанных с её компрессией, получение [13C]аминокислот чаще всего осуществляют по первому варианту, т. е. с использованием (Н2-СО2) и [13C]ацетата. Однако, как было отмечено в работах [93, 94], этим ацетатассимилирующим метаногенам, например, Methanospirillum hungatei GP1 требуются значительные концентрации ацетата для оптимального роста. Вследствие этого основным недостатком использования этих бактерий является значительный расход изотопной метки. При биотехнологическом получении изотопномеченых аминокислот необходимо учитывать пути их биосинтеза в клетке, которые для метаногенных бактерий хотя и являются характеристичными, но несколько отличаются от известных для E. coli. Данные по биосинтезу [13C]аминокислот, полученных при выращивании ауксотрофной по ацетату бактерии M. hungatei GP1 в среде, содержащей (H2-CO2) и [1,2- 13C]ацетат в качестве источников углерода и энергии, приведены ниже.

Рис. 1. Аминокислоты, необходимые для синтеза белков, образующиеся в клетке из предшественников (по Г. Шлегелю)

[13C]Аланин. Включение углерода 13С в молекулу аланина происходило за счет реакции карбоксилирования ацетил-СоА до пирувата. Такой путь биосинтеза был продемонстрирован для других таксономических родов и видов метаногенных бактерий [95].

[13C]Серин и [13C]глицин. Характер распределения изотопа 13C в молекулах серина и глицина был объяснён частичным фосфорилированинем пирувата до фосфопирувата и образованием 3-фосфоенолпирувата по гликогенному пути ассимиляции углерода. Подтверждением этому служат значительные уровни активности ферментов - фосфоенолпируватсинтетазы, енолазы и 2-фосфоглицератмутазы, которые были обнаружены в клеточных экстрактах других метаногенов, например, Methanobacterium thermoautotrophicum [96]. [13C]Аспарагиновая кислота, [13C]треонин и [13C]метионин. Присоединение 13C-метки по атому углерода a -карбоксильной группы аспартата, происходящего из C1-ацетата и по b -углеродному атому С2-ацетата и включение изотопа 13С в карбоксильные группы аминокислот из СО2, свидетельствовало о том, что биосинтез аспартата в этой бактерии происходил через цикл трикарбоновых кислот в результате ферментативного карбоксилирования пирувата до оксалоацетата. Распределение метки в треонине и метионине происходило в соответствии с путем биосинтеза этих аминокислот из аспартата. Атом углерода в метильной группе молекулы метионина происходил из СО2.

[13C]Лизин. Распределение метки 13С в молекуле лизина свидетельствовало о том, что лизин синтезировался из пирувата и аспартата по типичному для бактерий диаминопимелиновому пути [97].

[13C]Глутаминовая кислота, [13C]аргинин и [13C]пролин. В молекуле глутаминовой кислоты изотопная метка детектировалась в Сb и Cg положениях углеродного скелета молекулы. Атомы углерода при карбоксильной СООН- группе молекулы глутаминовой кислоты и в a -положении происходили из СО2. Этот результат свидетельствовал о том, что цикл трикарбоновых кислот приводил к образованию a -кетоглутарата. Распределение 13C-метки в молекулах аргинина и пролина аналогично таковому в глутаминовой кислоте.

[13C]Лейцин, [13C]валин и [13C]изолейцин. Характер изотопного включения 13С в молекулы лейцина и валина свидетельствовал об их образовании из a -ацетолактата, в то время как биосинтез изолейцина отличался от ожидаемого пути биосинтеза этой аминокислоты из треонина. В клетках M. hungatei изолейцин образовывался из ацетата. Аналогичный путь биосинтеза изолейцина был обнаружен у спирохеты [98], у лейцинассимилирующего мутанта Serratia marcescens [99], и у мутанта Saccharomyces cerevisiae, у которого дефектен ген треониндезаминазы [100]. [13C]Фенилаланин и [13C]тирозин. Меченые позиции углерода в молекулах фенилаланина и тирозина полностью совпадали с типичным для бактерий путем биосинтеза этих аминокислот из шикимовой и хоризмовой кислот [101].

[13C]Гистидин. Атом углерода в положении Cg имидазольного кольца гистидина происходил из СО2. Углеродный атом в положении Сe имидазольного кольца гистидина был замещён на изотоп 13С с участием С2- ацетата.

Табл. 1. Параметры роста некоторых используемых в биотехнологии штаммов метилотрофных бактерий

Другими перспективными источниками изотопномеченых аминокислот и белков признаны метилотрофные микроорганизмы, которые в таксономическом аспекте представлены грамположительными, грамотрицательными бактериями и дрожжами, интерес к которым в настоящее время все возрастает благодаря разработке новых технологий химического синтеза метанола [102]. Эти бактерии привлекают внимание исследователей прежде всего как дешевые источники микробного белка и аминокислот [103, 104]. Знание путей бактериального метаболизма позволяет осуществлять направленное введение изотопной метки в молекулы аминокислот. Как известно, метилотрофные бактерии окисляют метанол с использованием фермента - метанолдегидрогеназы, последующие окислительные реакции катализируют формальдегид- и формиатдегидрогеназа [105-108]. Лишь затем продукт окисления метанола в виде формальдегида фиксируется клеткой одним из двух путей ассимиляции углерода: рибулозо-5-монофосфатным и сериновым [109, 110]. Основные параметры роста некоторых используемых в биотехнологии штаммов метилотрофных бактерий представлены в таблице 1.

Ауксотрофные штаммы метилотрофных бактерий начали эффективно использовать для получения [2H]- и [13C]аминокислот. Для этих целей перспективно осуществлять биологическую конверсию дешёвых низкомолекулярных меченых субстратов - (13С)метанола, (2Н)метанола и 2Н2O в дорогостоящие меченые БАС в клетках метилотрофов [111-113]. Традиционным подходом при этом остаётся выращивание соответствующих штаммов-продуцентов аминокислот, устойчивых к росту на средах, содержащих стабильные изотопы водорода, углерода, азота и др. В работах [114, 115] сообщается о получении [13C]аминокислот (уровни включения стабильных изотопов в молекулах варьируют от 30% для L-[13C]лейцина до 90% для L-[13C]фенилаланина) за счёт использования ауксотрофных по L-изолейцину бактерийMethylobacillus flagellatum.

Заслуживает упоминания то, что (13С)метанол в отличие от 2Н2О не оказывает существенного биостатического эффекта на ростовые и биосинтетические характеристики метилотрофов [116], поэтому данный подход можно эффективно использовать для введения в молекулы синтезируемых БАС двойной изотопной метки (например, введение изотопа 13С в молекулы на фоне максимальных концентраций 2Н2О в ростовых средах). В работе [117] были получены [2H]- и [13С]аминокислоты с разными уровнями изотопной обогащённости при росте ауксотрофного по L-лейцину штамма факультативных метилотрофных бактерийBrevibacterium methylicum и ауксотрофного по L-изолейцину штамма облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum на минимальных средах с (13С)метанолом, (2Н)метанолом и 2Н2О. [13C]- и [2Н]аминокислоты разного уровня изотопной замещённости выделяли как из культуральных жидкостей, полученных после выращивания бактерий на средах с соответствующими изотопномечеными субстратами, так из гидролизатов белков биомассы. Биосинтетически полученные [2H]- и [13С]аминокислоты представляли собой смеси, в которых присутствовали изотопнозамещённые формы молекул, различающиеся количеством атомов водорода и углерода, замещённых на 2Н и 13С.

При этом распределение зависело как от общего включения изотопа в молекулу, так и от способа их получения. Данные по суммарным уровням включения стабильных изотопов в молекулы секретируемых аминокислот и аминокислотные остатки суммарных белков биомассы B. methylicum и M. flagellatum представлены в таблице 2.

Эти исследования показали, что в условиях ауксотрофности по лейцину уровень изотопного обогащения лейцина, а также метаболически связанных с ним аминокислот немного ниже, чем для других аминокислот, вероятно, за счёт сохранения минорных путей метаболизма, связанных с биосинтезом данных аминокислот de novo.

Так, при выращивании B. methylicum на среде, содержащей 98% 2Н2О и немеченый L-лейцин, уровни включения дейтерия в индивидуальные аминокислоты культуральной жидкости составили 51% для лейцина/изолейцина, 58,8% для валина, в то время как уровни изотопного включения для аланина составили 77,5%, для фенилаланина -75% (табл. 2).

Табл. 2. Суммарные уровни включения стабильных изотопов в молекулы секретируемых аминокислот и аминокислотные остатки суммарных белков биомассы B. methylicum* и M. flagellatum**.

*Данные по включению дейтерия в молекулы аминокислот приведены для B. methylicum при росте на средах, содержащих 2% CH3OH и 24,5; 49,0; 73,5; 98,0% 2Н2О

**Данные по включению 13С приведены для M. flagellatum при росте на среде, содержащей обычную воду и 1% 13СН3ОН.

Термином КЖ обозначены культуральные жидкости, полученные после отделения клеток из ростовых сред

Аналогичная корреляция наблюдалась и в аминокислотах белковых гидролизатов. Уровни включения 2Н и 13С в метаболически связанных аминокислотах в пределах одинаковых концентраций меченых субстратов, обнаружили определённую коррелляцию: уровни изотопного включения для валина и лейцина (семейство пирувата), фенилаланина и тирозина (семейство ароматических аминокислот) коррелировали (табл. 2). Уровни изотопного включения для глицина и серина (семейство серина), аспарагиновой кислоты и лизина (семейство аспарагина) также имели близкие величины. Важным результатом являются высокие уровни включения стабильных изотопов 2Н и 13С в молекулы полученных аминокислот. В настоящее время исследования по изучению биотехнологического потенциала метилотрофных бактерий для направленного синтеза изотопномеченых аминокислот и других БАС продолжаются.

Генно-инженерные методы получения изотопно-меченных аминокислот и белков

Осуществлять направленное биосинтетическое получение индивидуальных белков, меченных стабильными изотопами удобно за счёт использования векторов экспрессии нужных генов, ответственных за биосинтез того или иного интересующего исследователей белка. Оправдано и целесообразно использование для этих целей векторов экспрессии на основе плазмидной ДНК бактерии E. coli, например, вектор экспрессии Т4 лизоцима, включающий в своем составе плазмиду pHSe5 [118]. В результате использования этого вектора экспрессии, были получены миллиграммовые количества Т4-лизоцима, селективно меченного стабильными изотопами азота 15N или углерода 13C. Включение стабильных изотопов в данном случае удалось осуществить за счет роста генного конструкта E. coli на средах, содержащих [15N]- или [13С]аминокислоты. Метод также может применяться для получения индивидуальных меченых белков, экспрессия которых происходит в системах, отличных от E. coli, например, системы экспрессии на основе клеток насекомых или млекопитающих [119].

Другие микробные системы, в которых белки экспрессируются с высокими выходами, также могут быть пригодны для получения изотопно-меченых аналогов белков. К ним относятся, прежде всего такие хорошо изученные биологические объекты, как дрожжи, бактерии и бактериофаги. Так, за счёт использования вышеперечисленных микробных объектов в качестве векторов экспрессии были получены препаративные количества индивидуальных очищенных [15N]белков: нуклеаза стафилококка [120], интерлейкин 1b [121], белок репрессор фага P22C2 [122], тиредоксин E. coli [123], гемоглобин [124], a -протеаза [125], ингибитор субтилизина [126], репрессор фага l [127], и белок человеческого фактора роста N-ras P21 [128].

В работе [129] описан метод получения индивидуальных [2H]белков с использованием вектора экспрессии на основе штамма облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum. Метод состоит в том, что в метилотрофах клонируют структурный ген исследуемого белка. Таким методом можно получать, например, [2H]b -интерфероны, хорошо экспрессируемые в клетках метилотрофов, либо другие интересующие исследователей белки. Метод также позволяет вводить в молекулы аминокислот и белков другие стабильные изотопы, например, 13С. В связи с этим следует подчеркнуть, что основным недостатком при использовании полученных данным методом [13C]аминокислот в ЯМР-исследованиях являются всё же недостаточно высокие уровни изотопного обогащения аминокислот, что обусловливает усложнение спектров ЯМР за счет 12C- 13C-спин-спинового взаимодействия между близлежащими атомами углерода в молекуле [130]. Так как мультиквантовые резонансы близлежащих атомов углерода в молекуле являются основным препятствием для интерпретации спектров ЯМР, необходимо применять усовершенствованные методы получения [13C]аминокислот, позволяющие лимитировать процесс разбавления метки. Так, в последнее время были генетически сконструированы новые штаммы бактерий, которые несут мутации по генам метаболизма определенного круга предшественников этих аминокислот [131]. Это позволяет избежать разбавления метки при росте микроорганизма на среде, содержащей те или иные меченые субстраты за счет ингибирования биосинтеза аминокислот de novo у данных мутантных штаммов бактерий.

При выборе определенных мутаций по генам метаболизма стремятся удовлетворить как миниум двум условиям для нормального функционирования подобных генетически сконструированных систем, чтобы, во-первых, по возможности снизить деградацию метки или ее разбавление в процессе внутриклеточного синтеза немеченых предшественников de novo и во-вторых, свести к минимуму процессы перестройки меченых положений углеродного скелета молекулы за счет биосинтеза одинаковых интермедиантов, образующихся по сопряжённым путям биосинтеза. Данная стратегия реализована в работе [132], где сообщается о получении двух генетически сконструированных штаммов бактерий, обозначенных как E. coli DL10 и E. coli DL11, которые несли геномные делеции, исключающие обмен атомов углерода между интермедиаторами в процессе гликолиза и в цикле трикарбоновых кислот.

За счёт использования данных штаммов удалось получить препаративные количества [13C]аминокислот с уровнями изотопного обогащения до 95%. Схема, иллюстрирующая мутации в генах метаболизма в цикле гликолиза и трикарбоновых кислот, приведена на рис. 2. Оба сконструированных штамма бактерий E. coli имели в геноме мутации, затрагивающие гены семи ферментов основных путей метаболизма (рис. 2).

Ферменты (1-5) у штамма E. coli DL10 были инактивированы за счёт мутаций, вследствие чего он ассимилировал в качестве источников углерода и энергии сукцинат и ацетат из ростовой среды, а [1-13C]лактат добавляли в ростовую среду для компенсации метаболических потребностей клетки и для введения 13C-метки в молекулы аминокислот, синтезируемых в процессе гликолиза.

аминокислота белок синтез микроорганизм

Рис. 2. Мутации в генах метаболизма цикла гликолиза и трикарбоновых кислот (по ЛеМастеру Д. М., 1982).

Обозначения ферментов: 1 - пируватдегидрогеназа; 2 - фосфоенолпируваткарбоксилаза; 3 - фосфоенолпируваткарбоксикиназа; 4 - NAD-малатдегидрогеназа; 5 - NADP-малатдегидрогеназа; 6 - триозофосфатизомераза; 7 - a -кетоглутаратдегидрогеназа.

Другой штамм бактерий E. coli DL11 мог утилизировать немеченую глюкозу в качестве источников углерода и энергии по гликолитическому пути ассимиляции углерода, в то время как [1,4-13C]cукцинат и [1-13C]ацетат добавляли в ростовую среду для того, чтобы стимулировать биосинтез [13C]аминокислот, образующихся по циклу трикарбоновых кислот. Кроме того, в этом случае было необходимо ввести в бактериальный геном дополнительную мутацию, связанную c геном a -кетоглутаратдегидрогеназы, чтобы минимизировать процесс деградации метки в цикле трикарбоновых кислот.

Выделение изотопно-меченых аминокислот из белковых гидролизатов микроорганизмов

Биомасса микроорганизмов, выращенных на средах, содержащих стабильные изотопы, является ценным источником различных изотопно-меченых БАС, в том числе аминокислот. При этом наиболее распространённым и традиционным методом препаративного выделения аминокислот из клеточной биомассы является её гидролиз с использованием ферментативных или химических методов и последующая ионообменная хроматография на катионо- и анионообменных смолах (дауэкс, амберлит, пермутит, аминекс, дуолит и др.) [133]. Большое значение при проведении гидролиза белка имеет выбор того или иного гидролизирующего агента, который определяется целью исследования. Ферментативное расщепление протеолитическими ферментами может протекать ступенчато с концов молекулы (экзопептидазами) или путём расщепления специфических отдельных пептидных связей полипептидной цепи (эндопептидазами), причём специфичность зависит от конфигурации, аминокислотной последовательности и конформации белка [134]. Для селективного химического расщепления белков разработано очень много методов [135], среди которых имеется несколько методов расщепления по a -углеродному атому (например, через остатки дегидроаланина). Щёлочи и кислоты обладают высокой гидролизующей способностью и поэтому их использование приводит к разрушению некоторых аминокислот и к изотопному обмену в триптофане, тирозине и гистидине и в некоторых других аминокислотах. В условиях щелочного гидролиза (4 н. Ba(OH)2 или NaOH, 24 ч, 1100) реакций изотопного обмена водорода на дейтерий практически не наблюдается (исключением является протон (дейтерон) у атома С2' гистидина) [136]. Существенным недостатком щелочного гидролиза, лимитирующим его использование, является значительная рацемизация аминокислот. Поэтому для препаративных целей щелочной гидролиз используется крайне редко, в то время как кислотный - очень широко. Кислотный гидролиз в стандартных условиях (6 н. НCl или 8 н. Н2SO4, 24 ч, 1100), как известно, приводит к полному разрушению триптофана и частичному разрушению серина, треонина и некоторых других аминокислот [137]. Добавление в реакционную среду фенола [138], тиогликолевой кислоты [139], b -меркаптоэтанола [140], позволяет сохранить до 80-85% триптофана. Кроме этого, в условиях кислотного гидролиза с высокой скоростью протекает изотопный обмен ароматических протонов (дейтеронов) в молекулах триптофана, тирозина и гистидина [141], а также протонов (дейтеронов) при атоме С3 аспарагиновой и С4 глутаминовой кислот [142]. Поэтому для получения реальных данных о биосинтетическом включении дейтерия в белок рекомендуется проводить кислотный гидролиз в присутствии дейтерированных реагентов. Этим способом могут быть выделены и анализированы с использованием ионообменной хроматографии большинство аминокислот в составе гидролизатов белка (рис. 3). Так, при помощи ионообменной хроматографии были препаративно выделены [2H], [13C]- и [15N]аминокислоты из белковых гидролизатов разных природных источников с выходами индивидуальных аминокислот от 77% до 95% и с уровнями изотопного включения, превышающими 95% [143]. Однако, метод выделения аминокислот из гидролизатов биомассы, будучи широко применяем на практике часто требует использования вредных буферных растворов (ацетат, формиат, пиридин и др.), нескольких колонок с последующей рехроматографией для полного выделения чистых аминокислот из гидролизатов биомассы.

Условия ионообменного выделения [2H]аминокислот из гидролизатов суммарных белков биомассы микроводоросли Scenedesmus obliquus, состав элюирующих растворителей, время проведения хроматографического анализа и др, были исследованы в работе [144]. При этом, уровни изотопного включения дейтерия в аминокислоты, выделенные из гидролизатов белков Scenedesmus obliquus составили более 98%. Вследствие протекания реакций обратного изотопного (1Н-2Н)-обмена с протонированным растворителем в ходе элюирования [2H]аминокислот с сорбента, протоны в b -положении аспарагиновой кислоты и g -положении глутаминовой кислоты были обогащены дейтерием на 90%, т. е. ниже, чем для других аминокислот. Подвижные атомы дейтерия в a -положении имидазольного кольца молекулы гистидина и атомы дейтерия при гетероатоме азота в индольном кольце триптофана также легко обменивались на протоны в составе водных растворителей при выделении аминокислот.

Рис. 3. Ионнообменная хроматография аминокислот из гидролизатов протонированных (a) и дейтерированных (б) клеток B. methylicum на максимально дейтерированной среде.

Biotronic LC-5001 (230ґ 3,2 мм) (“Eppendorf-Nethleler-Hinz”, Germany); подвижная фаза: сульфонированная стирольная смола UR-30 (“Beckman-Spinco”, USA); диаметр гранул - 25 мкм; рабочее давление - 50…60 атм; подвижная фаза - 0,2 MNa-цитратный буфер (pH = 2,5); скорость подачи элюента - 18,5 мл/ч; нингидрина - 9,25 mл/ч; детекция при л = 570 и л = 440 нм (для пролина).

[13C]аминокислоты были выделены из гидролизатов суммарных белков биомассы штамма метаногенных бактерий Methanobacterium espanolae при росте бактерий на [1-13C]- и [2-13C]ацетате с уровнями включения13С в молекулы аминокислот до 90% [145]. Согласно цитируемым там данным, менее 2% случайной метки в молекулах аминокислот были распределены между атомами углерода в позициях, происходящих из 13С карбоксильной или метильной группы ацетата и еще меньший процент включения метки детектировался в положениях углеродного скелета молекул, образованных из 13СО2.

Большой практический интерес представляет реализация преимуществ препаративной обращенно-фазовой высокоэфективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) при получении оптически чистых меченых аминокислот и их N-производных в количествах, необходимых для биоаналитических и синтетических целей [146, 147]. Так, в работе [147] описан метод препаративного выделения индивидуальных аминокислот из различных микробиологических источников с помощью ОФ ВЭЖХ в виде бензилоксикарбонильных производных (N-Cbz производных) аминокислот. Разработанный метод позволяет выделять аминокислоты с высоким выходом (от 67% до 89%) и хроматографической чистотой (96-99%) [147] и может быть использован для выделения [2H]-, [13C]-, [15N] и [18O]аминокислот из белковых гидролизатов различных источников.

ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОТОПНО-МЕЧЕНЫХ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ

Другим подходом по получению изотопно-меченых аминокислот является химико-ферментативный метод, основанный на комбинации синтетических и ферментативных реакций. Для этого перспективно и экономически оправдано использование препаратов очищенных ферментов и их экстрактов, безклеточных ферментативных систем, а также иммобилизованных ферментов. Ферментативные реакции осуществляют на иммобилизованных ферментах, например, таких как аланиндегидрогеназе (КФ 1.4.1.1) в присутствии NADH при получении [2H]аланина [148], иммобилизованной на сахарозе фенилаланинаммонийлиазе (КФ 4.3.1.5) и фенилаланингидроксилазе (КФ 1.14.16.1), при получении [2H]фенилаланина [149] и [2H]тирозина [150], триптофансинтазе (КФ 4.2.1.20), при получении [2H]триптофана [151], глутаматдегидрогеназе (КФ 1.4.1.2), при получении [2H]глутаминовой кислоты [152], аспартазы (КФ 4.3.1.1), при получении [2Н]аспарагиновой кислоты [153] и серингидроксиметилазе (КФ 2.5.1.6) при получении [2H]серина [154].

Ферментативный метод давно используется для препаративного лабораторного и промышленного получения оптически активных аминокислот, благодаря высокой субстратной специфичности ферментов и возможности селективного введения стабильных изотопов по определённым положениям молекул аминокислот. Основными аспектами использования ферментативных систем являются каталитические реакции ассиметрического образования связи на прохиральных субстратах и ферментативное разделение рацематов аминокислот.

Что касается хроматографического разделения рацематов на прохиральных сорбентах, то оно все же недостаточно эффективно для разделения и обеспечивает в лучшем случае больше половины меченого продукта в виде одного из оптических антиподов. Ферментативная стадия часто завершает химический синтез меченых аналогов аминокислот, причем использование для этих целей интактных клеток или их экстрактов так же эффективно, как использование очищенных ферментов. Однако, субстратная специфичность ферментов, их ограниченная доступность, сложность их выделения и очистки ограничивают их применение для этих целей. Несмотря на то, что ферментативные синтезы преодолевают все вышеперечисленные проблемы, низкие выхода очищенных ферментов лимитируют использование химико-ферментативных реакций. Так, разработанный ферментативный процесс для получения [15N]аланина включает комплексное использование нескольких специфичных ферментов и меченых субстратов и имеет выход по целевому продукту не более 1 г [155]. С другой стороны, методы генной инженерии открывают возможности для получения большинства ферментных препаратов в препаративных количествах.

Методы получения [15N]аминокислот связаны с использованием [15N]аммонийных или [15N]нитратных солей в качестве источников 15N-метки [156], в то время как ферментативный метод более эффективен для получения прежде всего [15N]аспарагиновой и [15N]глутаминовой кислот за счёт аминирования a -кетопроизводных аминокислот и в тех случаях, когда необходимы высокие уровни включения изотопа 15N в молекулы [157].

Осуществление различных методов включения 15N-метки в молекулы аминокислот связано с использованием методов газовой подпитки 15NН3 [158], иммобилизацией клеток с последующей активацией носителя15NН4Cl [159], или с оптимизацией концентраций [15N]предшественников аминокислот в ростовых средах [160]. C использованием вышеперечисленных подходов были получены [15N]аспарагиновая кислота и [15N]аланин с уровнями изотопного включения 15N, превышающими 95% [161]. При этом иммобилизованные клетки E. coli были использованы как источник аспартазы, которая катализирует превращение [15N]фумаровой кислоты и [15N]фумарата в [15N]аспарагиновую кислоту, в то время как для получения [15N]аланина из [15N]аспарагиновой кислоты в качестве источника аспартат-4-декарбоксилазы использовали бактерию Pseudomonas decahee. [15N]глутаминовую кислоту получали за счёт процесса ферментации бактерий Brevibacterium lactofermentum с предшественниками аминокислот в присутствии 15NН4ОН [162].

Для включения изотопа 13С в молекулы аминокислот могут применяться аналогичные ферментативные подходы с применением [13С]глюкозы, однако при проведении ферментативной реакции требуются значительные количества высокообогащённой [13C]глюкозы и поэтому даный метод является слишком дорогим для получения [13C]аминокислот. Кроме того, большая часть глюкозы (до 70%) идёт на обеспечение процесса дыхания клетки, поэтому эффективность мечения молекул БАС изотопом углерода за счёт ферментативного окисления [13С]глюкозы невысокая. Так, уровни изотопного обогащения [13C]глутамата, полученного ферментативно с участием [13C]глюкозы, были менее 50% [163].

Перспективны также подходы с использованием комбинации химико-ферментативных и биотехнологических способов получения изотопномеченых аминокислот. В работах [164, 165] сообщается о получении более десятка аналогов триптофана, специфически меченных изотопами 2Н, 13C, 15N по индольному кольцу молекулы. Моно-изотопномеченые производные индолов и их 4, 5 и 7-гидроксипроизводные были ферментативно превращены в меченые аналоги триптофана при помощи генетически сконструированного штамма бактерий E. coli, содержащего рекомбинантную плазмиду с триптофановым (Тrp) опероном, который кодировал ряд ферментов, ответственных за биосинтез этой аминокислоты.

В заключение следует отметить, что несмотря на многочисленность описанных в современной литературе подходов по получению БАС, меченных стабильными изотопами, в настоящее время практически не существует способов, которые позволяют получать аминокислоты и белки, меченные 2Н, 13С, 15N и 18O за счет того или иного универсального подхода, хотя химико-ферментативные методы позволяют использовать одну и ту же химико-биохимическую реакцию для получения меченых аминокислот за счет применения различных меченых низкомолекулярных реагентов (субстратов). Получение аминокислот и белков, высокообогащённых стабильными изотопами удобнее всего проводить с использованием биотехнологических подходов, в то время как селективности включения стабильных изотопов в молекулы БАС можно достичь за счёт применения комбинации синтетических и ферментативных реакций. Выбор метода получения БАС, несущих ту или иную изотопную метку, определяется прежде всего целью исследования.

ЛИТЕРАТУРА

1. Smith K., Barua J. M., Watt P. W. // Am. J. Physiol. - 1992. - V. 262. - N 3. - P. 1372-1376.

2. McIntosh L. P., Dahlquist F. W. // Quarterly Reviews of Biophysics. - 1990. - V. 23. - N. 1. - P. 1-38.