Разработка методики определения альфа-токоферола ацетата в лекарственном препарате методом капиллярной газовой хроматографии

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Газовая хроматография (ГХ) - группа хроматографических методов, в которых подвижная фаза газообразна (находится в состоянии газа или пара). Большой выбор жидких фаз, позволяющий работать в широком температурном диапазоне (20-400°С), делает газо-жидкостную хроматографию (ГЖХ) наиболее селективным хроматографическим методом разделения. Используя высокоэффективные капиллярные колонки, можно достичь эффективности разделения в сотни тысяч теоретических тарелок и чувствительности на пикограммовом уровне. Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией стала мощным рутинным средством разделения и идентификации. Нашла она свое применение и в фармацевтической промышленности.

Газохроматографический метод дает возможность проводить качественный и количественный анализы лекарственных средств, изучать их физико-химические свойства, осуществлять контроль и автоматическое регулирование технологических процессов. Однако основное приложение газовой хроматографии в фармацевтике - это анализ летучих органических примесей в лекарственных препаратах, промежуточных соединениях и сырье.

Витамины представляют собой незаменимые низкомолекулярные органические вещества, поступающие в организм с пищей извне и участвующие в регуляции биохимических процессов на уровне ферментов. Нарушения регуляции процессов обмена и развитие патологии часто связаны с недостаточным поступлением витаминов в организм, полным отсутствием их в потребляемой пище либо нарушениями их всасывания, транспорта или, наконец, изменениями синтеза коферментов с участием витаминов. Важную роль в лечении гипо- и авитаминоза играют витаминные препараты, выпускаемые фармацевтической промышленностью. Они удобны во многих отношениях, однако, следует учитывать возможность гипервитаминоза - отравления препаратами витаминов (особенно жирорастворимых). Поэтому количественный анализ лекарственных средств, обладающих витаминной активностью, очень актуален в связи с необходимостью оперативного достоверного контроля качества.

Газохроматографическим методом могут быть проанализированы газообразные, жидкие и твердые вещества с молекулярной массой меньше 400, удовлетворяющие определенным требованиям, главные из которых - летучесть, термостабильность, инертность и легкость получения. Перечисленным условиям отвечает лекарственный препарат витамина Е (б-токоферола ацетат), выбранный в качестве объекта исследования данной работы.

В последние годы собран обширный экспериментальный материал как in vivo, так и in vitro, подтверждающий высокую активность витамина Е (антистерильный витамин) как природного липидного антиоксиданта, который предотвращает окисление ненасыщенных липидов, предохраняет от разрушения клеточные мембраны и вследствие этого широко применяется для профилактики и лечения ряда заболеваний. б-Токоферола ацетат является синтетическим аналогом витамина Е и используется как индивидуальная или комбинированная витаминная добавка в фармацевтической и пищевой промышленности.

Из анализа литературных источников видно, что для определения токоферолов в последнее время все больше отдается предпочтение физико-химическим методам, как наиболее экспрессным, чувствительным и информативным. Метод газожидкостной хроматографии успешно используется для определения витамина E и часто рекомендуется авторами для этих целей.

Все вышеприведенные обстоятельства обусловливают актуальность тематики данной работы, целью которой является систематизация различных аналитических подходов для решения проблемы определения витамина Е, оценка роли физико-химических, а особенно хроматографических методов в анализе токоферолов, разработка методики идентификации и количественного определения б-токоферола ацетата в лекарственном препарате методом высокоэффективной (капиллярной) газовой хроматографии.

1. Литературный обзор

Под общим названием «витамин Е» объединены несколько соединений, в основе строения которых лежит бициклическое ядро хромана, состоящего из бензольного и пиранового циклов, связанное с остатком спирта фитола. б-Токоферол, у которого бензольное кольцо является полностью замещенным - наиболее распространенный и биологически наиболее активный из всех встречающихся в природе форм витамина Е. В качестве лекарственного средства применяют б-токоферола ацетат (рисунок 1).

Рисунок 1 -- Структурная формула б-токоферола ацетата

Определению содержания витамина Е в различных объектах посвящено немало научных статей, однако, распределение числа опубликованных работ по годам весьма неравномерно (рисунок 2).

Рисунок 2 -- Распределение числа публикаций по годам согласно данным реферативных журналов «Химия»

Работы 80-х годов в основном связаны с развитием колориметрических методов анализа витамина Е. Развитие хроматографических методов обусловило появление огромного числа работ по определению жирорастворимых витаминов. Таким образом, актуальность определения токоферола неуклонно растет.

Ведущее положение в анализе витамина Е занимают хроматографические методы (около 80 %), а особенно высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, 65 %). Методы ГХ, ГЖХ и тонкослойной хроматографии (ТСХ) применяли для анализа витамина Е в 15 % опубликованных работ; оптические методы - в 9 %; электрохимические - в 6 %; другими методами (метод протонного магнитного резонанса, метод активного кислорода и т.д.) определяли токоферол в 5 % публикаций.

1.1 Химические методы

Титриметрические методики в большинстве своем основаны на способности токоферолов легко окислятся с образованием хиноидных структур. Реакция с хлоридом золота является количественной и экспрессной. Применяют водный или водноспиртовый раствор хлорида золота, однако, данный реактив является труднодоступным и дорогостоящим. Метод не может быть использован для определения различных изомеров токоферола, но применим для установления их суммарного количества.

Государственная фармакопея (ГФ) X издания рекомендует проводить количественное определение токоферола ацетата цериметрическим методом, используя выраженные восстановительные свойства лекарственного вещества.



После предварительного гидролиза токоферилацетата (нагревание с раствором серной кислоты) образовавшийся токоферол титруют сульфатом церия (IV) в присутствии индикатора - дифениламина до появления сине-фиолетового окрашивания. Определение выполняют, защищая титруемый раствор от действия прямого солнечного света. ГФ XII издания предлагает цериметрический метод для определения примеси свободного б-токоферола в б-токоферола ацетате.

Следует отметить, что титриметрические методики, отличающиеся высокой точностью, но низкой избирательностью, применяются главным образом в анализе лекарственных субстанций и малопригодны для анализа многокомпонентных лекарственных форм, содержащих близкие по свойствам соединения (группа изомеров токоферолов). Несомненно, что данные методики анализа жирорастворимых витаминов ушли в прошлое.

Анализ литературных источников показал, что в последнее время для контроля качества токоферолов предпочтение отдается физико-химическим методам, как наиболее экспрессным, чувствительным и информативным.

1.2 Электрохимические методы

Публикации по определению витамина Е электрохимическими методами немногочисленны. Потенциометрическое и амперометрическое титрование раствором хлорида золота (III) находит ограниченное применение из-за малой специфичности. Для определения суммы токоферолов предложен метод амперометрического титрования в среде 1 н серной кислоты раствором сульфата церия (IV) с использованием платинового электрода. Кулонометрическим методом проводили анализ токоферолов в этаноле и хлороформе с использованием ферроцианид-иона в качестве медиатора.

Одним из перспективных методов анализа жирорастворимых витаминов является метод дифференциальной вольтамперометрии, позволяющий существенно увеличить чувствительность и экспрессность определения витамина Е. Методика определения б-токоферола ацетата в фармацевтических препаратах основана на извлечении витамина из пробы путем экстракции его хлороформом в аппарате Сокслета с последующим вольтамперометрическим определением массовой концентрации витамина Е методом дифференциальной анодной вольтамперометрии. В качестве анализируемых объектов использовали поливитаминные препараты: «Эвитол» (KRKA, d.d. Novo mesto, Slovenia), «Дуовит» (d.d. Novo mesto, Slovenia) и «Аэровит» (АО «Ай си эн Октябрь», Санкт-Петербург). Время анализа с учетом пробоподготовки составляет 30 - 40 мин.

Электролитическое окисление является основой полярографического определения хроманов. Этот метод имеет ограниченное применение для природных масел, но дает прекрасные результаты для б-токоферола. Известен способ определения токоферилацетата, основанный на получении в области положительных потенциалов одноэлектронной волны его анодного окисления (Е1/2 = 1,33 В относительно насыщенного каломельного электрода) в растворе ацетонитрила на фоне перхлората лития. о-Токоферол в этих условиях образует анодную волну при Е1/2 = 0,68 В, поэтому смесь б- и о-токоферолов можно анализировать без предварительного разделения. Определение витамина Е полярографированием на катоде возможно в виде его окисленной формы - токоферилхинона. Восстановление проводят в 75 %-ном этаноле на фоне ацетатного буферного раствора (рН 6-7).

Электрохимические методы в настоящее время ограниченно используются в фармацевтическом анализе, по-видимому, из-за проблем, возникающих при контроле качества многокомпонентных поливитаминных препаратов, сложности автоматизации анализа, а также токсичности больших количеств ртути, используемой в полярографах. Методики анализа, в основе которых лежит электрофорез, в публикациях не обнаружены.

1.3 Оптические методы

В ГФ XII издания для оценки подлинности витамина Е в субстанции рекомендован метод прямой спектрофотометрии. Инфракрасный спектр жидкой пленки субстанции в области средних частот 4000 - 400 см-1 по положению полос поглощения должен соответствовать рисунку спектра альфа-токоферола ацетата (рисунок 3).

Рисунок 3 -- ИК-спектр б-токоферола ацетата

Ультрафиолетовый спектр поглощения 0,01 % раствора б-токоферилацетата в 96 % этаноле в области 230 - 350 нм должен имеет максимумы поглощения при 278 нм, 284 нм и минимум при 254 нм. Определение витамина Е в готовых лекарственных формах проводят также спектрофотометрически при л=450 нм после его окисления комплексом меди (II) с неокупроином.

Для качественного и количественного колориметрического определения б-токоферола используется возможность его окисления с образованием окрашенных продуктов, химическая структура которых и их окраска разнообразны и зависят от характера окисления. Большое практическое применение в аналитической практике нашел метод Эммери-Энгеля, который основан на окислении токоферола хлоридом железа (III) в присутствии -дипиридила или о-фенантролина и фотометрическом измерении окраски образовавшегося комплексного соединения при длине волны 520 нм. Однако хлорид железа (III) окисляет только свободные токоферолы, но не их эфиры, поэтому для определения последних по реакции Эммери - Энгеля необходимо проводить предварительное омыление.

Окисление витамина Е концентрированной азотной кислотой при нагревании приводит к образованию окрашенных в красно-оранжевый цвет о-токоферилхинонов, что служит основой для количественного фотоколориметрического определения при л=470 нм по методу Фуртера-Мейера с использованием стандартного образца.

Основным недостатком колориметрических методов определения витамина Е является их неспецифичность. С целью повышения селективности определения, посторонние мешающие вещества удаляют, применяя щелочное омыление спиртовым раствором гидроксида калия с добавкой антиоксидантов и последующей экстракцией токоферола из неомыленной части сернокислым эфиром, что значительно удлиняет и усложняет анализ. Кроме того, щелочное омыление небезразлично для б-токоферола, который нестоек в щелочной среде, тем более что мешающие вещества часто остаются в неомыляемой фракции.

Перечисленных недостатков лишен флуориметрический метод, основанный на образовании флуоресцирующего красителя феназина при конденсации окисленной формы б-токоферола - о-токоферилхинона - с о-фенилендиамином. Токоферолы обладают интенсивной флюоресценцией с максимумом возбуждения при 295 нм и излучения при 340 нм. Данный метод используют при количественном определении б- и г-токоферола в моно- и поливитаминных препаратах.

Метод поляриметрии дает важную информацию при анализе субстанции оптически активных веществ (б-токоферол), но не пригоден для анализа суммы изомеров оптически активных веществ без их предварительного разделения. Ведущие зарубежные фармакопеи (европейская и Фармакопея США) рекомендует проводить определение величины удельного вращения для 10 % раствора рацемической смеси б-токоферола и его ацетата в этаноле [б]D20 = -0,01° до +0,01°. Величину удельного вращения для RRR-б-токоферола по ЕФ определяют для 20 % раствора в диэтиловом эфире после его окисления гексацианоферратом калия до хинона - [б]D20 не менее +24°. Информация по применению данного метода для количественного определения токоферолов в научной литературе не обнаружена.

Предложен рефрактометрический способ определения б-токоферилацетата в препаратах витамина Е (концентрированные растворы в масле), ошибка которого не превышает 1 % в диапазоне концентраций 20 - 50 % масс. По сравнению с обращено-фазовой (ОФ) ВЭЖХ метод снижает затраты времени с 2-3 ч. до нескольких минут, поэтому он может быть рекомендован для выполнения серийных определений. Однако, ограничением данного метода является минимально определяемый уровень содержания б-токоферилацетата в соевом масле приблизительно 15 - 20 % масс.

Измерены спектры ЯМР 1Н токоферола ацетата в дейтерированном хлороформе. Проведено отнесение характерных сигналов спектров, что позволяет надежно идентифицировать его данным методом. Для спектра токоферола ацетата характерно наличие триплетов протонов в положении 4 и 3 с химическими сдвигами д = 2,59 и 1,77 м.д. (J3,4 = 6,9 Гц) соответственно, синглетов протонов метильных групп в положениях 5, 7 и 8 (д = 2,09; 2,02; 1,97 м.д.) и в положении 2 (д = 1,23 м.д.). Метильные протоны боковой цепи регистрируются в виде дублета при д = 0,86 м.д. (J = 6,3 Гц), а ацетатной группы - в виде синглета при д = 2,32 м.д. Метиленовые и метиновые протоны боковой цепи наблюдаются в области д = 1,0 - 1,6 м.д. Данный метод с успехом может использоваться для установления или подтверждения структуры отдельных изомеров токоферолов после их разделения.

1.4 Хроматографические методы

Анализ литературных источников показал, что в начале второго десятилетия XXI века ведущее положение при определении жирорастворимых витаминов (в т.ч. витамина Е) занимают исключительно хроматографические методы. В мировой научной литературе около 95 % работ посвящено современным хроматографическим методам для контроля качества и стандартизации различных лекарственных средств. Наибольшее применение получили методы ВЭЖХ и ТСХ.

Метод ВЭЖХ с использованием различных детекторов (спектрофотометрических, флуоресцентных, ИК-фурье, масс-спектрометрических) в последние годы получил более широкое признание в фармацевтическом анализе для количественного определения токоферолов. В зарубежных государственных фармакопеях данный метод применяют в качестве основного для определения витамина Е в лекарственных формах. В USP 24 издания описаны три метода определения б-токоферола (таблица 1), различающиеся предподготовкой пробы, а также качественным и количественным составом подвижной фазы. Детектирование осуществляют с помощью УФ-детектора при длине волны 285 нм.

Таблица 1 -- Примеры методик USP 24 анализа витамина Е в лекарственных формах

№ п/п	Подвижная фаза	Подготовка пробы
1	Метанол и 1 % водный раствор фосфорной кислоты (95:5)	Пятикратная экстракция гексаном из пробы, диспергированной в диметилсульфоксиде
2	24 % метанол, 1 % воды, 0,05 % фосфорной кислоты в 50 % ацетонитриле	1 кратная экстракция изооктаном из Н2O - диметилсульфоксидометанольной пробы с постепенным добавлением компонентов
3	Метанол : ацетонитрил : гексан (46,5 : 46,5 : 7,0)	Щелочной гидролиз с последующей 1 кратной экстракцией гексаном

Описан способ определения жирорастворимых витаминов, исключающий стадию омыления [21]. При этом исследовались гетерогенные системы: этанол (96 %) - растительное масло с добавками витаминов. Детектирование токоферола проводили при 292 нм (рисунок 4).

Рисунок 4 -- Хроматограмма этанольной фазы гетерогенной системы этанол-растительное масло, содержащее ретинол и б-токоферол: 1 - ретинол; 2 - б-токоферол

Хроматографическое определение жирорастворимых витаминов (A, D3, E) методом ОФ ВЭЖХ перспективно для решения аналитических задач в производственных условиях. В качестве объектов исследования применяют фармакопейные препараты жирорастворимых витаминов. Идентифицируют пики по временам удерживания витаминов. Для разделения смеси жирорастворимых витаминов наилучшей является подвижная фаза состава вода - изопропиловый спирт в соотношении 30 : 70 (рисунок 5). Объем вводимой пробы 1 мкл. Определение проводят по градуировочной зависимости высоты пика h (см) от содержания витамина Е (мг/мл).

Рисунок 5 -- Хроматограмма смеси жирорастворимых витаминов: подвижная фаза - смесь воды и изопропанола (30:70): 1 - витамин К3 (0,24 мкг); 2 - витамин А (2,0 мкг); 3 - витамин D3 (27 мкг); 4 - витамин Е (64 мкг)

Изучено поведение витаминов Е и D3 при совместном присутствии в условиях ОФ ВЭЖХ с использованием немодифицированных и модифицированных подвижных фаз. Для косвенного спектрофотометрического детектирования витаминов выбран ацетонитрил, модифицированный хлорофиллом (а+в) и тетрафенилпорфирином. При этом пределы обнаружения веществ с данным способом детектирования (нг) превосходят чувствительность УФ-детектора (мкг) и сравнимы с флуориметрическим (нг) детектированием.

ВЭЖХ, в соответствии с современным уровнем развития фармацевтической науки, вытесняет спектральные методы анализа водо- и жирорастворимых витаминов. Так, в последнюю ГФ XIII издания [23] включена общая фармакопейная статья «Количественное определение витаминов», в которой определение витамина Е после омыления пробы рекомендуется проводить методом ОФ ВЭЖХ с детектированием при 292 нм. Возможно также одновременно определять витамины А и Е, проводя детектирование при длине волны 300 нм.

Была разработана унифицированная упрощенная методика, основанная на применении ВЭЖХ для качественного и количественного анализа жирорастворимых витаминов А, D и Е при их совместном присутствии в многокомпонентных витаминных препаратах, исключающая большинство вспомогательных операций при подготовке образцов к анализу. Извлечение жирорастворимых витаминов проводилось в одну операцию - сначала проба обрабатывалась 0,05 М раствором хлористоводородной кислоты, затем смесью эфира и этанола.

Разработаны методики определения изомеров токоферола в капсулах витамина Е (рисунок 6) с применением нормально-фазового варианта ВЭЖХ и флуоресцентного способа детектирования (лex 295 нм, леm 340 нм).

Рисунок 6 -- Определение изомеров токоферола в капсуле витамина Е

Несмотря на вышеперечисленные достоинства метода ВЭЖХ, высокая стоимость оборудования существенно ограничивает его применение в аналитических лабораториях.

Метод ТСХ в настоящее время в фармацевтическом анализе токоферолов применяют для оценки подлинности и чистоты субстанций и лекарственных форм. Группу токоферолов определяют по величинам Rf после хроматографирования в условиях, представленных в таблице 2.

Таблица 2 -- Характеристика условий хроматографического определения б-токоферола методом ТСХ

№ п/п	Растворитель	Соотношения растворителей (мл)	Rf б-токоферола	Р системы
1 2 3 4 5	Гексан - этилацетат Бензол - гексан Хлороформ - этанол Хлороформ - этанол Хлороформ - этанол	37 : 3 95 : 5 3 : 1 2 : 1 1 : 1	0,29 0,42 0,94 0,95 0,97	0,320 2,850 4,600 4,660 4,800

В качестве реагентов-детекторов могут использоваться: реактив Эммера-Энгели - токоферолы окрашиваются в розовый или красный цвет на белом фоне; растворы фосфорно-молибденовой кислоты - на желто-зеленом фоне наблюдается окрашивание в сине-голубой цвет; водный раствор нитрата серебра - на белом фоне токоферолы окрашиваются в красный цвет и водный раствор гексацианоферрата калия (III) - на синем фоне имеет место окрашивание в желто-оранжевый цвет.

В последнее время стали появляться публикации, свидетельствующие о возможностях ТСХ для количественного анализа с применением специализированного программного обеспечения, не требующих наличия дорогостоящих аналитических приборов и позволяющих объективно количественно оценить содержание вещества при минимальных затратах времени. Разработаны методики идентификации и количественного определения б-токоферола методом хроматографии в тонком слое сорбента с применением обработки сканированных хроматограмм компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer».

Методы ТСХ часто объединяют с ГЖХ, поскольку последняя отличается большей чувствительностью и более пригодна для количественных определений. В этом случае пластинки опрыскивают раствором родамина G или 2,7-дихлрфлуоресцеина (либо хроматографию проводят на пластинках, содержащих указанные флуоресцентные индикаторы), соединения группы витамина Е обнаруживают по тушению индуцированной УФ-облучением флуоресценции, соответствующие зоны сорбента соскабливают, вещества экстрагируют и анализируют с помощью ГЖХ. Высокой разрешающей способностью обладают открытые капиллярные колонки с непористым слоем, внутренняя поверхность которых дезактивирована силаноксом и покрыта полярной фазой - сульфоном полифенилового эфира. На таких колонках разделяют токоферолы в виде их триметилсилильных производных.

Газовая хроматография.

ГЖХ - экспрессный и точный метод анализа, но его основным недостатком является тот факт, что в нативном виде токоферолы не определяются. Необходима длительная предподготовка пробы, заключающаяся в предварительном переведении витамина Е в метиловый или пропиловый эфир, гептафторбутирильные или триметилсилилпроизводные, что увеличивает ошибку анализа. Однако метод газовой хроматографии успешно используется для определения б-токоферилацетата и часто рекомендуется для анализа субстанции и масляных растворов витамина Е.

В соответствии с ГФ XII б-токоферола ацетат определяют методом ГЖХ с применением внутреннего стандарта дотриокантана и пламенно-ионизационного детектора. В Фармакопее США USP 30 описана методика определения б-токоферола, его ацетата и сукцината, а также смеси изомеров (в-, б-, д- и г-), полученной из растительных масел, методом ГЖХ с применением пламенно-ионизационного детектора. В качестве внутреннего стандарта в анализируемую пробу вводят гексадецилгексадеканоат. Следует отметить, что в предлагаемых условиях не наблюдается разделения пиков в- и г-токоферолов.

Была изучена возможность определения витамина Е в масляных растворах фармацевтических препаратов как методом прямой капиллярной хроматографии, так и с предварительным выделением его из масляных растворов экстракцией этанолом. Результаты по оценке выхода б-токоферилацетата из масляных растворов и правильности результатов анализа, представленные в таблице 3, показали возможность использования прямой капиллярной хроматографии.

Таблица 3 -- Результаты определения выхода б-токоферилацетата (ТФА) из масляных растворов и проверка правильности методики (n=5; Р=0,95)

№ модельной смеси	Методика	Введено ТФА, % масс. W% (ТФА)	Найдено ТФА, % масс. W% (ТФА) ± у	S	Выход ТФА отн. %
1 2	Эктракция этанолом + ГЖХ	28,17 36,07	16,28 ± 0,76 23,47 ± 1,08	0,61 0,87	57,79 65,07
3 4	Прямая ГЖХ	29,44 47,13	28,93 ± 0,92 47,52 ± 1,07	0,74 0,86	98,27 101,44

Разработанная методика применена к анализу трех фармпрепаратов: 50%-ного масляного раствора витамина Е в капсулах, 30%-ного масляного раствора для инъекций, препарата «Левит». Компоненты масляной основы не хроматографировались и не мешали определению витамина Е.

Методика проста по технике выполнения, не требует предварительной пробоподготовки, характеризуется малым временем анализа и имеет хорошую воспроизводимость (относительное стандартное отклонение среднего определения 0,03-0,05). Кроме того, методика позволяет сочетать количественный анализ с оценкой качества фармпрепарата.

1.5 Задачи для исследования

Цель исследовательской работы состоит в разработке методики определения б-токоферола ацетата в лекарственном препарате методом капиллярной газовой хроматографии.

Для достижения этой цели были поставленны следующие задачи:

- приобрести навыки работы на газовом хроматографе «Кристалл-люкс 4000М»;

- изучить влияние различных факторов на эффективность газохроматографического анализа б-токоферилацетата;

- выбрать оптимальные условия хроматографирования;

- определить содержание б-токоферола ацетата в масляном растворе витамина Е;

- провести анализ полученных данных, сделать необходимые выводы.

2. Экспериментальная часть

2.1 Газовый хроматограф «Кристалл-люкс 4000М». Технические характеристики прибора

«Кристалл-люкс 4000М» - двухканальный газовый хроматограф с полностью автоматическим программным управлением всеми функциями инструмента (рисунок 7).

Рисунок 7 -- Газовый хроматограф «Кристалл-люкс 4000М»

Параметры хроматографических колонок:

1. капиллярная марки ZB - 1, длиной 30 м, внутренним диаметром 0,53 мм;

- максимальная температура термостата колонки 360 єС;

- неподвижная жидкая фаза - полидиметилсилоксан, толщина - 0,5 мm.

2. насадочная (для углеводородов) марки Haye SepR длиной 3 м, внутренним диаметром 3 мм; дисперсность сорбента 60/80 mesh.

При использовании капиллярной колонки пробу необходимо вводить во второй испаритель.

Подвижная фаза - азот.

Давление газа-носителя (для капиллярной колонки) - 6 атм, на вход - 4 атм.

Используются детекторы двух типов:

1. пламенно-ионизационный детектор (ПИД);

2. детектор по теплопроводности (ДТП).

2.2 Порядок работы на газовом хроматографе «Кристалл-люкс 4000М»

Порядок включения и выключения: вначале подать газ (давление 6 атм), затем включить электричество и запустить компьютер, запустить программу NetChrom. Выключение производить в обратном порядке.

Работа с программой NetChrom. Создание метода

Рабочий метод позволяет осуществлять полное управление хроматографом и подключаемым к нему периферийным устройствам.

Создать метод можно одним из следующих способов:

o Выберите в меню Файл команду Открыть > Метод.

o Нажмите на кнопку инструментальной панели и из выпадающего списка выберите команду «Метод».

o Нажмите на кнопку инструментальной панели.

В появившемся окне «Список методов» введите имя нового метода, нажмите на кнопку «Открыть». В появившемся окне «Метод» при создании метода необходимо задать:

1) Паспорт метода.

Проверьте правильность указанного в конфигурации хроматографа типа модуля.

2) Параметры управления.

· Вкладка «Детектора» (рисунок 8).

Задайте время анализа и рабочие детектора. При работе с ДТП задайте значение тока моста, при работе с ПИД значения токов убрать.



Рисунок 8 -- Параметры управления. Вкладка «Детектора»

· Вкладка «Температуры» (рисунок 9).

Задайте температуру колонки для работы в изотермическом режиме. Задайте температуры детектора и испарителя.

· Вкладка «Газы» (рисунок 10).

При работе с капиллярной колонкой задайте значения расходов газов носителей (значения расходов газа-1 и газа-3 задают при работе с ДТП, газа-2 - при работе с ПИД).

При работе с ПИД задайте значения расходов воздуха и водорода.

Рекомендуемое значение расхода воздуха 250 мл/мин, водорода 30 мл/мин.

Рисунок 9 -- Параметры управления. Вкладка «Температуры»



Рисунок 10 -- Параметры управления. Вкладка «Газы»

Задайте давление на входе в капиллярную колонку. Для этого воспользуйтесь газовым калькулятором, нажав на кнопку «Калькулятор». Во вкладке «Исходные данные» введите исходные значения параметров.

Для расчета расхода газа через капиллярную колонку укажите известное давление (в атм.) на входе в колонку. Нажмите на кнопку «Расчет». Для просмотра результатов расчета перейдите во вкладку «Расход».

Для расчета давления на входе в капиллярную колонку укажите известный расход (в см3/мин) газа через колонку. Нажмите на кнопку «Расчет». Для просмотра результатов расчета перейдите во вкладку «Давление».

Закройте вкладку «Газовый калькулятор» (рисунок 11). Введите рассчитанное значение давления.

Рисунок 11 -- Газовый калькулятор

Запуск метода.

Для ручного запуска метода выполните одно из следующих действий:

o Выберите в меню «Хроматограф» команду «Запуск метода».

o Нажмите на кнопку инструментальной панели.

В появившемся окне «Запуск метода» (рисунок 12) откройте метод, который требуется запустить, выполнив следующие действия:

o Нажмите на кнопку.

o В появившемся Окне «Список методов» выберите метод и нажмите на кнопку «ОК».

В результате этих действий в строке Метод появится имя метода для запуска.

Введите номер хроматограммы.

Нажмите кнопку «Запуск». После того как запустили метод, программа не разрешает подавать пламя до того как детектор достигнет заданной температуры, потом подается воздух, потом водород, затем происходит поджог пламени (хлопок). После установления заданного метода на хроматографе загорается лампа «Ввод пробы».

Рисунок 12 -- Окно «Запуск метода»

Окно «Хроматограф» (рисунок 13) предназначено для контроля соответствия заданных и измеренных параметров прибора, для отображения различной диагностической информации. Пока значения заданных параметров не достигнут измеренных, они будут выделяться красным и фиксироваться в поле «Параметры вне нормы».

Данное окно можно вызвать одним из следующих способов:

o Выберите в меню «Хроматограф» команду «Состояние» или «Диагностика».

o Нажмите на кнопку инструментальной панели .

Рисунок 13 -- Хроматограф. Вкладка «Состояние»

При выходе хроматографа на режим на этапе ПОДГОТОВКА и в последующем, в т.ч. при проведении анализа, полезно наблюдать изменение сигнала детектора во времени, что позволяет осуществить окно «Видеосамописец».

Окно «Видеосамописец» можно вызвать одним из следующих способов:

o Выберите в меню Хроматограф команду «Видеосамописец».

o Нажмите на кнопку инструментальной панели.

o Нажмите на кнопку инструментальной панели и из выпадающего списка выберите команду «Видеосамописец».

Во время приема данных по умолчанию сигнал детектора в видеосамописце отображается в режиме автомасштабирования. Данный режим обеспечивает автоматическое изменение масштаба по оси сигнала детектора. Масштабирование сигнала по оси времен происходит автоматически при достижении сигналом правого края области отображения сигнала.

После выхода прибора на рабочий режим в строке состояния появится надпись этапа ВВОД ПРОБЫ.

Получение хроматограммы.

Для получения хроматограммы выполните следующие действия:

o Введите пробу и нажмите кнопку СТАРТ на хроматографе. Хроматограф перейдет на этап АНАЛИЗ.

o Заполните окно «Паспорт хроматограммы», которое появляется сразу после перехода хроматографа на режим ввод пробы.

o Дождитесь выхода всех компонентов или окончания анализа по времени.

Открыть хроматограмму можно одним из следующих способов:

· Выберите в меню «Файл» команду «Открыть > Хроматограмму».

· Нажмите на кнопку инструментальной панели и из выпадающего списка выберите команду «Хроматограмма».

· Нажмите на кнопку инструментальной панели.

В появившемся окне «Список хроматограмм» выберите имя хроматограммы, которую необходимо открыть, и нажмите на кнопку «Открыть».

Метод хроматограммы содержит в себе следующую информацию (части рабочего метода):

· условия проведения анализа (режим хроматографа);

· анализируемые компоненты и их характеристики (название, время удерживания, канал детектирования, функция отклика детектора и т.д.);

· настройки расчета хроматограммы и отчетов;

· отдельные операции обработки хроматограммы.

Для открытия метода хроматограммы выполните одно из следующих действий:

o В меню «Хроматограмма» выберите команду «Метод».

o Нажмите на кнопку инструментальной панели.

Создание списка компонентов.

Список компонентов можно создать одним из следующих способов:

1) Открыть метод хроматограммы и в разделе «Компоненты» во вкладке «Список» создать список компонентов, выполнив одно из следующих действий:

o В меню «Правка» выберите команду «Добавить запись».

o Нажмите на кнопку инструментальной панели.

o Щелкните правой клавишей мыши по таблице и из выпадающего меню выберите команду «Добавить запись».

В результате в таблице появится новая строка с порядковым номером компонента. Вместо номера введите название компонента. Повторите вышеописанные действия для добавления всех компонентов в список. Во вкладке «Компонент» укажите время удерживания созданного компонента и окно времени для поиска компонента.

2) Выделить пик и в любом месте таблицы пиков нажать правой клавишей мыши. Затем из выпадающего меню выбрать команду «Создать компонент». В результате чего откроется окно «Метод хроматограммы/Компоненты/Список». В списке компонентов появится порядковый номер создаваемого компонента, который необходимо заменить на название. В данном случае время удерживания компонента проставится автоматически.

Настройка событий интегрирования.

Для тонкой настройки разметки пиков на хроматограмме могут быть использованы события интегрирования. По умолчанию в программе список событий интегрирования пуст, для их настройки выполните в окне «Метод хроматограммы» необходимо выбрать команду «Обработка > ПИД» и открыть вкладку «События интегрирования» (рисунок 14).

Для внесения нового события в список необходимо выполнить одно из следующих действий:

o В меню «Сервис» выберите команду «Добавить запись».

o В инструментальной панели нажмите на кнопку.

o Щелкните правой клавишей мыши по таблице и из выпадающего меню выберите команду «Добавить запись».

Введите время активации события (в мин.). Введите значение события интегрирования, если данное событие требует этого (например, для задержки обработки - время, мин). Выберите из выпадающего списка тип события интегрирования, предварительно активировав доступ к списку нажатием левой клавиши мыши по строке.

Рисунок 14 -- Обработка. Вкладка «События интегрирования»

Настройка параметров внешнего вида хроматограммы.

Настройка параметров внешнего вида области отображения хроматограммы осуществляется с помощью окна «Свойства Хроматограммы», которое можно вызвать одним из следующих способов:

o Нажмите на кнопку инструментальной панели.

o Установите курсор мыши в области отображения хроматограммы и нажмите на правую клавишу мыши. В появившемся контекстном меню выберите команду Свойства.

При включенных переключателях «Ось времени» и «Ось сигнала» на вкладке «Оси» окна «Свойства Хроматограммы», можно установить границы графика, отличные от предложенных по умолчанию. Если строки неактивные, то границы графика определяются автоматически и соответствуют максимальным границам сигнала по высоте и времени.

Настроенные границы графика можно сохранить в рабочий метод, нажав на кнопку «Сохранить». Таким образом, последующие хроматограммы, записанные с помощью него будут иметь сохраненный в данной вкладке вид. При нажатие на кнопку «Восстановить» - восстанавливаются исходные значения границ графика, которые были получены при снятии хроматограммы.

Для выхода из окна «Свойства хроматограммы» с сохранением настроек нажмите кнопку «ОК». Нажатие кнопки «Отмена» приведет к закрытию данного окна без сохранения данных.

Для отфильтровывания лишних пиков нажмите на кнопку инструментальной панели. В открывшемся окне «Метод хроматограммы» выбрать команду Обработка > ПИД. В рабочем поле «Пороги» ввести минимальные высоту и площадь пиков. Нажать кнопку «ОК».

Программное обеспечение NetChrom представляет также широкие возможности по масштабированию изображения графика хроматограммы.

По умолчанию автоматически устанавливается масштаб, при котором видна вся хроматограмма. Для того чтобы оценить характер хроматограммы у подножия пиков, необходимо воспользоваться операциями масштабирования. Можно менять масштаб по любой оси хроматограммы, увеличивать и сдвигать любую ее часть и т.д. с помощью мыши и клавиатуры. Те же процедуры, а также другие изменения вида хроматограммы выполняются с помощью команд главного меню программы «Вид». Для масштабирования хроматограммы используйте следующие команды интерфейса, клавиши клавиатуры и мышь:

· Растягивание/сжатие хроматограммы по амплитуде - Стрелка вверх/Стрелка вниз.

· Растягивание/сжатие хроматограммы по времени - Стрелка вправо/Стрелка влево.

· Для того чтобы увеличить некоторый участок хроматограммы, нажмите левую кнопку мыши в одном из углов интересующей области и, не отпуская, переместите указатель мыши в противоположный угол. Выбранная область будет ограничена прямоугольником, цвет которого настраивается в окне «Свойства хроматограммы». После отпускания кнопки в окне появится увеличенное изображение выбранной части хроматограммы.

· Для того чтобы переместить увеличенное изображение влево/вправо, используйте полосу прокрутки в нижней части панели графиков или сочетание клавиш Shift + Стрелка влево/Shift + Стрелка вправо.

· Для возврата к отображению на экране всей хроматограммы дважды щелкните левой клавишей мыши на любом месте хроматограммы, или нажмите правую клавишу мыши на любом месте хроматограммы и из выпадающего меню выберите команду «Показать все», или нажмите на кнопку инструментальной панели.

Охлаждение прибора. Печать отчета.

Режим охлаждения прибора используется после окончания работы, перед выключением хроматографа. Для охлаждения прибора выполните следующие действия:

o Откройте окно «Запуск метода».

o Запустите режим охлаждения, выбрав в меню «Режим» команду «Охлаждение».

В результате хроматограф перейдет на этап ОХЛАЖДЕНИЕ, при котором будут поддерживаться заданные в методе расходы газов-носителей.

Для печати отчета с предварительным просмотром информации вызовите окно «Печать хроматограммы с предпросмотром», выбрав в меню «Файл» команду «Предварительный просмотр». В появившемся окне «Печать хроматограммы с предпросмотром» настройте структуру отчета. Нажать кнопку «Печатать».

2.3 Выбор оптимальных условий газохроматографического анализа б-токоферилацетата

Газохроматографический анализ б-токоферилацетата проводили на капиллярной колонке с использованием пламенно-ионизационного детектора. При создании рабочего метода установили расход газа-носителя по линии сброса 30 см3/мин и рекомендуемые значения расходов водорода и воздуха (30 см3/мин и 250 см3/мин соответственно).

Температура кипения токоферола ацетата 225-230 °С, поэтому для проведения анализа целесообразно установить температуру испарителя 270 °С, температуру детектора 250 °С.

Для выбора оптимальной температуры термостата колонок приготовили стандартный раствор б-токоферилацетата с концентрацией 7,92 мг/мл. Для этого 0,1188 г стандартного образца б-токоферилацетата растворили в гексане до 15 мл (по шкале на колориметрической трубке). Далее вводили в испаритель хроматографа по 1 мкл полученного раствора.

При температурах термостата колонки 150, 175, 200 и 225 °С пик, соответствующий б-токоферилацетату не идентифицировался (рисунок 15).



Рисунок 15 -- Хроматограмма стандартного раствора б-токоферола ацетата (температура термостата колонки 200 °С)

При температуре термостата колонки 250 °С образовался симметричный пик исследуемого компонента. Полученная хроматограмма приведена на рисунке 16.

Рисунок 16 -- Хроматограмма стандартного раствора б-токоферола ацетата (температура термостата колонки 250 °С)

Дальнейшее повышение температуры является нецелесообразным, так как при этом увеличивается вероятность улетучивания неподвижной жидкой фазы с поверхности колонки, поэтому температура термостата колонки 250 °С была выбрана в качестве оптимальной для газохроматографического определения б-токоферилацетата.

Таким образом, в результате проведенных исследований были выбраны следующие условия хроматографирования витамина Е-ацетата:

- температура термостата колонок 250 °С;

- температура испарителя 270 °С;

- температура детектора 250 °С;

- давление на капиллярной колонке 0,83 атм;

- расход газа-носителя (азота) 30 см3/мин;

- расход водорода 30 см3/мин;

- расход воздуха 250 см3/мин.

Все последующие определения проводили в описанных условиях.

2.4 Определение подлинности лекарственного препарата витамина Е

В качестве объекта исследования был выбран 10 % масляный раствор витамина Е с концентрацией б-токоферола ацетата 0,1 г/мл.

Определение подлинности лекарственного препарата проводили путем сравнения времени удерживания б-токоферола ацетата в анализируемом растворе с эталонным раствором витамина Е-ацетата. Для этого 0,5135 г стандартного образца б-токоферилацетата растворили в гексане и перенесли в мерную колбу вместимостью 25 мл, доведя объем до метки. Концентрация полученного раствора 20,54 мг/мл.

После установления выбранного режима хроматографирования при помощи микрошприца последовательно вводили в хроматограф по 1 мкл гексана и раствора стандартного образца. Время удерживания б-токоферилацетата в стандартном растворе составило 11,31 мин (рисунок 17).



Рисунок 17 -- Сравнение хроматограмм анализируемого и стандартного растворов

Для проведения анализа 1,5 мл лекарственного препарата растворили в 5 мл гексана (в колориметрической трубке). Хроматографирование полученного раствора проводили в идентичных условиях. Объем вводимой пробы 1 мкл. Время удерживания б-токоферола ацетата в анализируемом растворе составило 11,32 мин (рисунок 17).

Вывод: лекарственная форма приготовлена удовлетворительно по показателю «подлинность».

2.5 Количественное определение б-токоферола ацетата в масляном растворе витамина Е-ацетата

Количественное определение б-токоферола ацетата проводили методом абсолютной градуировки, основанным на сопоставлении параметров пика анализируемого вещества с параметрами пика на градуировочном графике. Для этого готовили пять стандартных растворов б-токоферола ацетата в гексане в мерных колбах вместимостью 25 мл согласно таблице 4.

Таблица 4 -- Стандартные растворы б-токоферола ацетата

№ раствора	1	2	3	4	5	6
Масса б-токоферилацетата m, г	0	0,1980	0,2568	0,5135	0,7702	1,2838
Концентрация раствора С, мг/мл	0	7,92	10,27	20,54	30,81	51,35

Анализ проводили при заданных условиях хроматографирования. Объем вводимой пробы 1 мкл. Полученные результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5 -- Параметры пика б-токоферола ацетата

№ раствора	1	2	3	4	5	6
Высота пика h, мВ	0	1804,430	2170,370	4052,831	5506,135	7816,236
Площадь S, мВ•мин	0	794,280	978,511	2001,130	3070,533	5106,331

Величина достоверности аппроксимации выше в последнем случае, поэтому для проведения количественного анализа предпочтительнее использовать данные о площади пика.

Далее приготовили два гексановых раствора лекарственного препарата. Для этого 1,5 мл масляного раствора б-токоферола ацетата растворили в гексане до 7 мл (по шкале на колориметрической трубке). Из каждого полученного раствора брали по три пробы объемом 1 мкл и вводили в испаритель хроматографа при идентичных условиях. Полученные результаты приведены в таблице 6.

Таблица 6 -- Результаты анализа исследуемого раствора

№ раствора	Раствор 1	Раствор 2
№ ввода	1	2	3	1	2	3
Площадь S, мВ•мин	2625,5981	2690,7164	2756,0724	2604,6734	2599,0012	2593,0030
Концентрация Сх, мг/мл	26,4691	27,1255	27,7844	26,2581	26,2009	26,1405

По градуировочному графику находим концентрацию исследуемого раствора при первом вводе раствора 1, Сx = 26,5 мг/мл.

Рассчитаем концентрацию анализируемого раствора по уравнению регрессии:

мг/мл.

При использовании регрессионного уравнения увеличивается точность расчета, поэтому в остальных случаях будем применять данный метод. Полученные результаты приведены в таблице 6.

Масса б-токоферилацетата в анализируемом растворе находится по формуле:

,

где - объем исследуемого раствора, мл.

Тогда выражение для определения концентрации витамина Е-ацетата в лекарственном препарате (С) будет иметь вид:

,

где - объем лекарственного препарата, взятого для анализа, мл.

Подставив соответствующие значения, полученные при первом вводе, имеем:

г/мл.

Результаты аналогичных расчетов и статистическая обработка полученных данных приведены в таблице 7.

Таблица 7 -- Результаты эксперимента и статистическая обработка данных (Р=0,95)

№ п/п	хi
1 2 3 4 5 6	0,1235 0,1266 0,1297 0,1225 0,1223 0,1220	-0,0009 0,0022 0,0052 -0,0019 -0,0022 -0,0024	0,8198 4,6573 27,3820 3,5715 4,6513 5,9482	0,003067		= 2,57 %

Таким образом, гарантированный результат С = (0,1244 ± 0,0032) г/мл.

Вывод: Лекарственная форма приготовлена удовлетворительно по показателю «количественное содержание» (заявленная концентрация равна 0,1 г/мл).

Заключение

токоферол ацетат газохроматографический

В ходе выполнения курсовой работы проведена систематизация различных методов определения витамина Е, выяснена роль газовой хроматографии в анализе токоферолов, приобретены навыки работы на современном газовом хроматографе «Кристалл-люкс?4000М».

В результате проведенных исследований было изучено влияние различных факторов на эффективность газохроматографического анализа витамина Е, выбраны оптимальные условия хроматографирования, проведены испытания на подлинность и количественное определение масляного раствора б-токоферола ацетата.

Выполненные исследования расширяют возможности использования высокоэффективной (капиллярной) газовой хроматографии в анализе б-токоферилацетата и могут служить основой для разработки методики газохроматографического определения витамина Е в фармацевтических препаратах.

Литература

1. Жерносек А.К., Талуть И.Е. Аналитическая химия для будущих провизоров. Часть 1. Учебное пособие / под ред. А.И. Жебентяева. - Витебск, ВГМУ, 2003. - 362.

2. Гармонов С.Ю. Контроль качества и безопасность лекарственных препаратов: учебное пособие / под ред. С.Ю. Гармонова. - Казань: Изд-во Казан. гос. технол. ун-та, 2008. - 171с.

3.. Сноу Н. Новые направления в газохроматографическом анализе фармацевтических препаратов // Российский химический журнал. Том XLVII, № 1, 2003. С. 49 - 54.

4. Пустовалова Л.М. Основы биохимии для медицинских колледжей / изд. 4-е. - Ростов н/Д: Феникс, 2010. - 440с.

5. Березов Т.Т., Коровин Б.Ф., Биологическая химия: Учебник. -3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1998. - 704с.

6. Харкевич Д.А. Фармакология. - 9 изд., перераб., доп. и испр. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 736с.

7. Голубицкий Г.Б. Одновременное количественное определение водо- и жирорастворимых витаминов и консервантов с использованием колонки нового типа Chromolith // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. Том 74, № 3, 2008. С. 10 - 14.

8. Основы аналитической химии. В 2 кн. Кн. 1. общие вопросы. Методы разделения: Учебник для вузов / Ю.А. Золотов, Е.Н. Дорохова, В.И. Фадеева и др. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Высш. Шк., 2004. - 361с.

9. Патракова Н.М., Хохлов А.В. Анализ методов определения (содержания) витамина Е в пищевых продуктах // Материалы LIII международной научно-технической конференции «Достижения науки - агропромышленному производству» / под ред. докт. техн. наук П.Г. Свечникова. - Челябинск : ЧГАА, 2014. - Ч. IV. - 200с.

Размещено на Allbest.ru

...