Импринтинг цефтриаксона в присутствии ионов меди как способ повышения качества его молекулярных отпечатков
Методы определения антибиотиков. Выбор оптимальных условий получения молекулярно-импринтированных мембран (МИМ). Изучение свойств МИМ с отпечатками цефтриаксона в присутствии солей меди. Оценка селективности разделения антибиотиков на полученных МИМах.
Рубрика | Химия |
Вид | курсовая работа |
Язык | русский |
Дата добавления | 11.10.2016 |
Размер файла | 473,4 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Московский государственный университет
им. М.В.Ломоносова
Химический факультет
Кафедра аналитической химии
Лаборатория кинетических методов анализа
Курсовая работа
Импринтинг цефтриаксона в присутствии ионов меди как способ повышения качества его молекулярных отпечатков
студентки 207 группы
И.Ю. Кряжевой
Научный руководитель
к.х.н. Т.О. Самарина
Преподаватель
к.х.н., доцент И.А. Веселова
Москва - 2013
Оглавление
- Введение
- 1. Обзор литературы
- 1.1 Физико-химические свойства цефалоспоринов
- 1.2 Методы определения антибиотиков
- 1.3 Молекулярный импринтинг
- 2. Экспериментальная часть
- 2.1 Исходные вещества
- 2.2 Аппаратура
- 2.3 Методика эксперимента
- 3. Результаты и их обсуждение
- 3.1 Выбор оптимальных условий получения молекулярно-импринтированных мембран
- 3.2 Получение молекулярно-импринтированных мембран с отпечатками цефтриаксона в присутствии солей меди
- 3.3 Изучение проницаемости молекулярно-ипринтированных мембран
- 3.4 Оценка селективности модифицированных мембран
- Вывод
- Список литературы
Введение
Определение в-лактамных антибиотиков, как одной из групп лекарственных соединений, получивших широкое распространение, но в то же время, обладающих потенциальной опасностью для здоровья человека, является одной из актуальных проблем современной аналитической химии. Объекты, в которых необходимо определять и контролировать содержание антибиотиков, весьма разнообразны: фармацевтические препараты, биологические жидкости организма человека и животных, продукты питания, сточные воды фармацевтических предприятий. Постоянно возрастающее число применяемых в медицине антибиотиков делает актуальным изучение их взаимодействия с катионами металлов, прежде всего входящих в состав химических веществ живых организмов.
Извлечение антибиотиков возможно с помощью молекулярно-импринтированных полимеров (МИП). Синтез МИПов заключается в проведении реакции полимеризации в присутствии специально введенных молекул - темплатов (от английского template - шаблон, лекало), с которых предполагают «снять отпечатки». Синтез МИПов прост, они имеют термическую, химическую стабильность и высокую способность к селективному распознаванию.
Особый интерес вызывают молекулярно импринтированные мембраны (МИМ), или мембраны с молекулярными отпечатками. При использовании трековых мембран не требуется измельчать и фракционировать полимер.
Целью данной работы является получение молекулярно-импринтированных мембран с отпечатками цефтриаксона в присутствии солей меди.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- Выбор оптимальных условий получения молекулярно-импринтированных мембран (МИМ);
- Изучение свойств МИМ с отпечатками цефтриаксона в присутствии и отсутствии солей меди;
- Оценка селективности разделения антибиотиков на полученных МИМах.
1. Обзор литературы
1.1 Физико-химические свойства цефалоспоринов
Цефалоспорин - антибиотик, образуемый грибами из рода Cephalosporium.
По химическому строению антибиотик принадлежит к группе в-лактамных соединений, близких к пенициллинам (рис. 1). Основу молекул цефалоспоринов составляет цефем-группа, состоящая из соединенных циклов - в-лактамного и дигидротиазинового. Цефем-группа определяет антимикробную активность цефалоспоринов, разрыв циклов приводит к полной потере антимикробных свойств.
Рис. 1. Структурные формулы пенициллинов и цефалоспоринов.
Пенам-группа пенициллинов имеет неплоское строение, и углы связей атома N бета-лактамной группы искажены относительно sp2-гибридизации. Цефем-группа, имеет почти плоское строение, атом N, как и в обычной амидной группе находится в состоянии sp2-гибридизации, к тому же его негибридная p-орбиталь сопряжена с двойной связью C=C дигидротиазинового цикла. Радикалы R, R1 , R2 (боковые цепи) могут иметь различную химическую природу. От их структуры в значительной степени зависят кислотно-основные свойства, растворимость, химическая устойчивость и спектр антимикробного действия антибиотика [1].
В отличие от пенициллина, цефалоспорин подавляет развитие не только грамположительных бактерий, но и грамотрицательных, также цефалоспорин устойчив к действию в-лактамаз.
В последнее время методом смешанного (биологического и химического) синтеза было получено большое число (около 25 тысяч) аналогов цефалоспорина. Спектры биологического действия этих аналогов весьма разнообразны. Многие из этих соединений имеют важное практическое (клиническое) значение [2]. Один из них - цефтриаксон - высокоэффективный и широко используемый в современной медицине антибиотик третьего поколения. В отличие от антибиотиков первого и второго поколений цефалоспорины третьего поколения обладают высокой устойчивостью к в-лактамазам.
Рис. 2. Структурная формула цефтриаксона.
Молекула цефтриаксона содержит одну карбоксильную группу, однако при этом цефтриаксон ведет себя как двухосновная кислота и образует динатриевую соль Na2Cftr (рис. 2). Именно в виде Na2Cftr цефтриаксон используется в медицине.
В литературе имеются сведения, что помимо карбоксильной группы кислотные свойства проявляет также гидроксильная группа гидрокситриазинонового цикла боковой цепи молекулы [3]. При этом аминотиазольная группа другой боковой цепи проявляет слабые основные свойства и способна к протонированию в кислой среде [5].
В нейтральной и слабощелочной средах (рН 7.3 - 9.1) цефтриаксон практически не разрушается, что может быть использовано для его определения в свежеприготовленных препаратах спектрофотометрическим методом [4].
При рН 5 - 9 оптическая плотность остается практически постоянной, а при рН >10 резко увеличивается, что может быть связано с отрывом протона от амидной группы и разрушением цефемного ядра (рис. 3).
Рис. 3. Зависимость оптической плотности цефтриаксона (л=271 нм) от времени при рН: 7.3 (1), 8.2 (2), 9.1 (3), 10.2 (4), 11.2 (5)
Анализируя совокупность литературных данных по константам кислотно-основных равновесий в растворах цефалоспоринов, можно заметить значительный разброс литературных значений pKa, том числе и определенных при сходных условиях (температура, ионная сила). В ряде случаев наблюдается явная несогласованность изменения условий эксперимента и изменений значений констант, например, рост значений pKa (COOH) с увеличением температуры и ионной силы раствора, что маловероятно. Можно предположить, что причинами отклонений являются: 1) недостаточная степень чистоты использованных антибиотиков; 2) изменение состава раствора в процессе подготовки и проведения эксперимента вследствие склонности цефалоспоринов к гидролизу в кислой и сильнощелочной средах.
Кислотно-основные равновесия в водном растворе цефтриаксона исследованы методом рН-метрического титрования при 25°С на фоне 0.1 М KNO3. Показано, что анион цефтриаксона Cftr2-может присоединять в кислой среде до трех протонов. С использованием программы NewDALSFEK рассчитаны константы протонирования аниона цефтриаксона: lgK1 = 4.35 ± 0.03 (аминотиазольная группа), lgK2 = 3.19 ± 0.06 (окситриазиноновая группа), lgK3 = 2.34 ± 0.13 (карбоксилатная группа). Анион Cftr2- преобладает в растворе при рН более 5, форма HCftr- при рН от 3.5 до 4.5, формы H2Cftr и H3Cftr+ - при рН менее 3.5. Полуэмпирическим квантовохимическим методом PM6 с использованием программы MOPAC 2009 созданы модели изомерных протонированных форм цефтриаксона и рассчитаны их энтальпии образования. На основании значений энтальпий образования проведено отнесение найденных констант равновесий к процессу протонирования той или иной функциональной группы [5].
При этом можно предполагать, что K1 соответствует протонированию тиазольного цикла (1), K2 - окситриазиноновой группы (2), K3 - карбоксилатной группы (3) (рис. 4).
Рис. 4. Протонирование групп цефтриаксона.
Комплексообразование цефтриаксона с ионами металлов.
На сегодняшний день круг антибиотиков естественного происхождения ограничен темпами обнаружения их продуцентов в природе, поэтому большое значение получили работы по созданию синтетических и полусинтетических антибиотических препаратов. Выбор металлов в качестве компонента соединения обусловлен имеющимися наблюдениями антибактериальных свойств отдельных представителей этой группы элементов (серебро, медь), и недостаточной изученностью действия прочих.
Было проведено исследование воздействия экспериментальных соединений аминокислот и металлов с антибиотиком цефтриаксоном на микроорганизмы, in vitro. Объектами исследования являлись грамположительные - Staphylococcus aureus 25923 - и грамотрицательные - Escherichia coli 25922 и Klebsiella pneumoniae 13883 - виды микроорганизмов. В рамках данного исследования синтезированы и применены соединения на основе тр?х металлов: цинка, свинца и олова: [Zn(CeftrNa)]Cl*2H2O, Pb(Ceftr)*3H2O, Sn(Ceftr)*H2O. Также установлено, что цефтриаксон образует комплексы с аминокислотами: цистеином и аланином: [CeftrNa2*HCysc]*2H2O, [CeftrNa2Ala]*2H2O. Методика синтеза заключается в соединении растворенной в воде двунатриевой соли цефтриаксона с солями металлов и аминокислотами при добавлении этилового спирта (за исключением соединения с хлоридом цинка, где используется только вода) с получением порошкового осадка, который затем отфильтровывается, промывается спиртом и высушивается. Также, в случае с солями олова и цинка, синтез проводился в атмосфере N2 [6].
Способность цефалоспоринов к образованию комплексов с катионами металлов в значительной степени связана с их кислотно-основными свойствами, поскольку и в кислотно-основных реакциях и в реакциях комплексообразования участвуют, прежде всего, карбоксильные и аминные группы антибиотиков.
В литературных данных имеются сведения о том, что при pH 8.1 - 9.5 цефтриаксон образует комплексы с серебром состава Ag2L22-, где L - цефтриаксон, а в слабокислой среде (рН 4.2 - 5.8 образует комплексы стехиометрического состава 1:1) [4].
импринтированный мембрана цефтриаксон антибиотик
1.2 Методы определения антибиотиков
Для определения антибиотиков применяют большое количество самых разнообразных биологических, химических, физических методов идентификации антибиотиков. Выбор того или иного метода обусловлен целесообразностью его использования в каждом конкретном случае.
В медицине количественный анализ содержания антибиотиков в крови необходим для правильного выбора дозы препарата с целью предотвращения его токсичности и обеспечения эффективности. Наиболее подходящие в этом случае - методы иммуноферментного анализа, которые характеризуются высокой точностью и специфичностью. Определение остаточных количеств антибиотиков в продуктах питания животного происхождения проводят чаще с помощью микробиологических методов. Их выбор обусловлен простотой и дешевизной тестов. Высокая чувствительность микроорганизмов к самым различным антибиотикам позволяет проводить определение в широком диапазоне. Метод ВЭЖХ обеспечивает специфичность и чувствительность, необходимые для фармокинетики и других исследований, кроме того позволяет определять продукты метаболизма антибиотиков и содержание в них примесей. Наиболее эффективен метод в сочетании с масс-спектроскопией. Тем не менее, по-прежнему актуальной является задача разработки новых методов определения антибиотиков, оптимально сочетающих в себе следующие требования: высокая чувствительность, малая ошибка измерений, простота и экспрессность тестов, низкая себестоимость и высокая специфичность анализа.
Химические и физико-химические методы.
Чисто химические методы определения количества антибиотиков применяются довольно редко. Описано несколько способов количественного определения пенициллинов, в основу которых положено поглощение йода продуктами гидролиза этого вещества, а также методики определения антибиотиков, которые описаны ниже.
Соли бензилпенициллина растворяют в воде, а феноксиметилпенициллин -- в фосфатном буфере с рН 7.0. Затем добавляют раствор гидроксида натрия и оставляют на 20 мин. После щелочного гидролиза к смеси прибавляют соляную кислоту, раствор ацетатного буфера (рН 4.5) и избыток 0.01 н. раствора йода. Оставляют на 20 мин в темном месте и титруют избыток 0.01 н. раствора йода 0.01 и. раствором тиосульфата натрия. Параллельно проводят контрольный опыт с таким же количеством препарата, но без щелочного гидролиза. Количественное определение цефтриаксона проводят по данной методике с применением ацетатного буфера рН 4.7 [7].
При щелочном гидролизе пенициллина происходит раскрытие в-лактамного кольца с образованием пенициллоиновой кислоты в открытой тиольной форме. Пенициллоиновая кислота при рН 4.5 гидролизуетея в присутствии окислителя (йод) до пенальдиновой кислоты и пеницилламина, которые окисляются раствором йода соответственно до дегидроиенальдиновой и пеницилламиновой кислоты [7].
Пенициллины с реактивом Марки (раствор формалина в концентрированной серной кислоте) образуют окрашенные продукты. Наиболее характерной эта реакция является для феноксиметилпенициллина (красное окрашивание при комнатной температуре и углубление окраски при нагревании). Реакция протекает за счет феноксиуксусной кислоты, которая образуется из феноксиметилпенициллина при действии концентрированной серной кислоты.
Фенол с реактивом Марки образует ауриновый краситель красного цвета. Ампициллин и амоксициллин за счет остатка аминокислоты в ацильной части молекулы дают реакцию с нингидрином и солями меди (II) (с реактивом Фединга или раствором меди сульфата) [7].
Цефалексин (как и ампициллин, амоксициллин) содержит в ацильной части молекулы остаток б-фениламиноуксусной кислоты и поэтому дает реакцию с нингидрином (вишневое окрашивание) и сульфатом меди после нейтрализации раствором гидроксида натрия (оливково-зеленое окрашивание).
Преимущество химических и физико-химических методов по сравнению с биологическими методами заключается в экспрессности методов. К этим методам относят ВЭЖХ, колориметрические и спектрофотометрические методы, основанные на образовании различных соединений или использовании определенных свойств антибиотиков: цветные реакции, исчезновение характерных полос в УФ или ИК частях спектра под действием различных веществ (кислот, щелочей).
Рис. 5. ИК спектр цефтриаксона [14].
Спектрофотометрические методы основаны на свойстве многих антибиотиков давать характерный спектр поглощения в видимом свете или в УФ области, а в основу колориметрических методов положен принцип превращения препарата или его отдельных группировок в окрашенные соединения.
Определение цефалоспоринов колориметрическим методом и методом атомно-адсорбционной спектроскопии (ААС) с применением соли Рейнике NH4[Cr(NH3)2(SCN)4]. Разработаны две методики определения восьми цефалоспоринов, основанные на образовании ион-парных комплексов между аналитом и солью Рейнике. Образующийся осадок количественно определяют либо колориметрически, либо методом ААС. Реакцию проводят в кислой среде при 25±2єС. Колориметрическая методика включает растворение образовавшегося осадка в ацетоне и измерение поглощения при 525 нм относительно чистого растворителя. При использовании ААС проводят прямое или косвенное определение осажденного хромом осадка или измерении непрореагировавшего хрома при 958,6 нм. Градуировочный график линеен в диапазоне концентраций 5-35 мкг/мл с коэффициентом корреляция <0,9989 [9].
Также разработана методика спектрофотометрического определения цефтриаксона. Предварительно исследуемый препарат растворяют в фосфатном буфере с рН=6,5, измеряют оптические плотности растворов в диапазоне длин волн 220-450 нм, используя кварцевые кюветы с толщиной поглощающего слоя (l) 1 см, раствором сравнения служит фосфатный буфер. В электронных спектрах поглощения растворов цефтриаксона имеются две полосы с максимумами при 240 нм (е=30594) и 270 нм (е=27825) [10].
Разработана чувствительная проточно-инжекционная хемилюминесцентная (ХЛ) методика определения цефалоспориновых антибиотиков, основанная на усилении аналитом хемилюминесцентной реакции глиоксаль и KMnO4 в среде H2SO4. Пределы определения равны 10 нг/мл для цефалексина, 2 нг/мл для цефадроксила и 2 нг/мл для цефазолина натрия [11].
Цефалоспорины по данным Британской и Европейской фармакопей рекомендуют определять методом высокоэффективной жидкостной хроматографии методом. В качестве неподвижной фазы используют гидрофобизированный силикагель с привитыми радикалами С10, а подвижной - смесь катионных ПАВ в буферных растворах различной кислотности (градиентное элюирование) бромидов тетрадециламмония, с УФ-детекторованием (л = 254 нм) [8].
Биологические методы.
Биологические методы основаны на непосредственном биологическом действии антибиотика на используемый тест-организм, чувствительный к данному препарату, а поэтому считается наиболее объективным. Однако биологические методы определения антибиотиков имеют и недостатки: длительность проведения анализов, зависимость точности результатов от многих внешних факторов. Наиболее широкое распространение среди биологических методов получили метод последовательных разведений, диффузионный и турбидиметрический методы.
Метод последовательных разведений используется для определения количества антибиотика в культуральных жидкостях, растворах или экстрактах. Количественное определение антибиотиков диффузионными методами основано на способности антибиотических веществ диффундировать в агаровых средах и образовывать зоны, где не развиваются используемые тест-организмы. На практике применяются турбидиметрические методы количественного определения антибиотиков, в основу которых положена логарифмическая зависимость степени угнетения роста тест-организма от концентрации антибиотика [2].
1.3 Молекулярный импринтинг
Полимеры с молекулярными отпечатками представляют собой новое поколение полимерных сорбентов, которые получают с помощью метода молекулярных отпечатков (импринтинга). Общая стратегия синтеза заключается в создании предполимеризационного комплекса между молекулами темплата и функционального мономера в определенном растворителе, сополимеризации этого раствора в присутствии сшиваюшего агента и инициатора, и последующем удалении темплата из полимера, в результате чего в МИПе остаются специфические центры связывания (сайты молекулярного распознавания), комплементарные по размеру, форме, структуре и физико-химическим свойствам молекуле-темплату. Одним из параметров варьирования способности МИПа к молекулярному распознаванию является выбор соотношения пар темплат-функциональный мономер. При выборе этих пар предпочтение отдают таким комбинациям, для которых реализуется максимальное число комплементарных взаимодействий, обеспечивающих высокую устойчивость ассоциата мономер-темплат до начала и в течение процесса полимеризации [12].
Процесс взаимодействия функционального мономера и темплата основан на ковалентном или нековалентном взаимодействии функциональных групп.
Рис. 6. Схема ковалентного и нековалентного импринтинга [13].
Существует два способа инициации полимеризации: нагревание реакционной смеси до 50-60єС и ультрафиолетовое облучение смеси. В нековалентном импринтинге реакция полимеризации обычно инициируется ультрафиолетовым облучением, так как сила водородных и ионных взаимодействий мономера с молекулами шаблона с ростом температуры снижается [13].
Способ удаления темплата зависит от природы его связи с мономером. При ковалентном импринтинге проводится химическое разрушение связей, при нековалентном - многократная экстракция смесью органических растворителей (как правило, последовательно метанол : уксусная кислота, метанол).
Довольно часто МИПы используются в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Показательный пример высокой селективности МИП-хроматографии - разделение структурно близких в-лактамных антибиотиков. Молекулярный импринтинг позволил получить неподвижные фазы, специфичные для разных в-лактамов, в отличие от традиционных сорбентов, отделяющих в-лактамные антибиотики только от соединении другой природы.
Помимо ВЭЖХ полимеры с молекулярными отпечатками применяются в капиллярной электрохроматографии, тонкослойной хроматографии, твердофазной экстракции, в катализе, в органическом синтезе.
2. Экспериментальная часть
2.1 Исходные вещества
В работе использовали трековые мембраны (ТМ), изготовленные в Объединенном Институте Ядерных Исследований (г. Дубна). Трековые мембраны изготовлены из пленки полиэтилентерефталата толщиной 12 мкм, облученной ускоренными ионами криптона и далее обработанной 0.2М NaOH при 80°С. Диаметр пор мембраны 0.4 мкм (рис. 7). Диффузию проводили на дисках из ТМ диаметром 2.5 см.
Рис. 7. Поверхность трековой мембраны под микроскопом.
Для проведения экспериментов в качестве темлата использовали динатриевую соль цефтриаксона (Цеф) фирмы «Sigma», модельными антибиотиками были тетрациклин(Тет) и эритромицин(Эр), «Sigma». Растворы антибиотиков 0.1 М готовили по точным навескам (Цеф - на воде, Тет - на 0.1М НСl, Эр - в 50% этаноле) В качестве солей меди вводили хлорид меди (I) фирмы «Sigma-aldrich» (97%); карбонат меди (CuCO3), пентагидрат сульфата меди (CuSO4*5H2O) фирмы “ХИММЕД» марок «х.ч.». Дифенилфосфиноксид (ФО) (97%) и метакриловую кислоту (МАК) (99%) фирмы «Sigma», этиленгликольдиметакрилат (ЭГДМА), растворители ДМФА, ДМСО, ТГФ фирмы «ХИММЕД» марок «х.ч.».
Для отмывки мембран использовали уксусную кислоту (ледяную), метанол (MeOH), этанол (EtOH), медицинский, 96%, «ЗАО Брынцалов», раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), приготовленный из навески соли марки «х.ч.». Для приготовления боратного буфера использовали натрий тетраборнокислый 10-водный «Баум-Люкс». При приготовлении фосфатного буфера (KH2PO4) использовали дигидрофосфат калия «Veb Laborchemie Apolda». Остальные реактивы имели маркировку не ниже «х.ч.».
При приготовлении растворов использовали дистиллированную воду, дополнительно очищенную на установке «Millipore».
2.2 Аппаратура
В работе использовали: весы «Voyager OHAUS», спектрофотометр СФ-102, «Аквилон», Россия; ультразвуковую ванну «Сапфир» V=1.3 л (мощность генератора: 50 Вт, мощность нагревателя: 130 Вт, рабочая частота: 35 кГц), ультрафиолетовую лампу «Mercury» 15W (Diac, Россия). Растворы перемешивали на шейкере «Sky Line» (ELMI).
В качестве диффузионной ячейки (рис. 8) использовали полипропиленовую шприцевую насадку «Swinnex», компании Millipore, диаметром 2.5 см с дополнительно просверленными отверстиями.
Рис. 8. Ячейка для изучения диффузии.
2.3 Методика эксперимента
Методика I. Приготовление полимеризационной смеси.
Навеску меди (I) массой 1.5 мг вносили в пластиковую пробирку (2.0 мл) и растворяли в ДМФА (125 или 250 мкл), оставляли смесь в закртытой пробирке на 10 мин в УЗ бане. Далее вносили навеску цефтриаксона массой 5 мг и в первом случае вводили 125 мкл ДМСО, во втором случае 125 мкл метанола и 125 мкл ТГФ, смесь перемешивали до растворения. Для приготовления контрольных мембран без темплата в смесь не вводили цефтриаксон. Затем добавляли 250 мкл ЭГДМА, 25 мкл МАК и 10 мг ФО. Полимеризационную смесь 20 мкл помещали на мембрану, закрепляли между двумя стеклянными пластинками и помещали под ультрафиолетовую лампу на 10 мин. По истечении этого времени мембраны аккуратно отделяли от стекла и помещали в емкости для отмывания темплата и непрореагировавших компонентов полимеризационной смеси.
Методика II. Отмывка темплата из принтованной мембраны.
Важной стадией получения молекулярных отпечатков является удаление темплата из полимерной матрицы. Для удаления компонентов полимеризационной смеси и темплата использовали смеси спиртов с кислотами, ацетон, буру. Для удаления остаточного содержания меди использовали 1*10-3 М раствор ЭДТА. Объем растворов 2 мл.
Методика III. Изучение диффузии цефтриаксона.
Мембрану (немодифицированную, контрольную и принтованную) помещали в диффузионную ячейку (рис. 6).В качестве питающего раствора использовали 1*10-3 М раствор цефтриаксона в 0.07 М KH2PO4 (2 мл), в качестве принимающего - 0.07 М KH2PO4 (1.4 мл). Время диффузии 10 минут.
Расчет степени переноса цефтриаксона R проводили по формуле.
R,
где Сисх - концентрация исходного раствора, Сприн - концентрация принимающего раствора, n - коэффициент, учитывающий разность в объемах принимающей (1.4 мл) и питающей (2.0 мл) фаз.
Все расчеты величины R проводили на основе расчета концентраций цефтриаксона по заранее построенной градуировочной зависимости (l = 1 см, =276 нм, раствор сравнения KH2PO4): A = 17449C + 0,016 (R2=0.999).
Концентрацию Тет и Эр рассчитывали по заранее построенным градуировочным зависимостям (l = 1 см, ТЕТ=360 нм, ЭР=286 нм ): AТЕТ = 14851C (R2=0.997), AЭР = 6850С (R2=0.997).
Методика IV. Проверка селективности разделения антибиотиков с помощью модифицированных мембран.
Для проверки селективности разделения антибиотиков разных классов с помощью полученных мембран изучили диффузию эритромицина и тетрациклина. Фактор разделения рассчитали по формуле:
;
где Ra -- степень переноса цефтриаксона, Rb -- степень переноса тетрациклина (или эритромицина).
3. Результаты и их обсуждение
3.1 Выбор оптимальных условий получения молекулярно-импринтированных мембран
Большинство работ по молекулярному импринтингу посвящено получению МИП в массе. Отрицательная сторона такого подхода заключается в длительности, трудоемкости получения этих сорбентов, как то необходимость дегазирования полимеризационной смеси, удаление ингибирующего полимеризацию кислорода, среднее время полимеризации от 12 ч до 36 ч. Получение тонких полимеризационных пленок на подложках из ТМ между силикатными стеклами позволяет избежать стадии удаления кислорода из полимеризационной смеси и сократить время полимеризации до 1 ч [15].
В качестве фотоинициатора выбран ФО. Установлено, что минимальное количество ФО необходимое для получения качественных полимерных пленок равно 0,057 ммоль. Выбрав оптимальное количество ФО, подбирали минимальное время полимеризации (tопт = 10 мин).
Оптимальное количество порогена (ДМФА) необходимое для получения качественных МИМов выбирали, варьируя его соотношение к сшивающему полимеру (ЭГДМА). Качество полученных молекулярных отпечатков оценивали по степени десорбции темплата из массы образовавшегося полимера. Следует отметить, что при соотношении ДМФА:ЭГДМА = 1:1 наблюдается увеличение времени полимеризации пленки на поверхности ТМ, визуально полученные пленки покрывают подложку не полностью, не ровные, и для дальнейших диффузионных исследований эти пленки не пригодны.
Удаление темплата из полимеризационной смеси является важной стадией для получения МИП. Поэтому были исследованы различные способы экстракции молекулы - шаблона из пленки полимера, нанесенной на подложку. В качестве экстрагентов использовали : спирты, смесь спиртов с кислотами (этанол с 0.1 М HCl, метанол с ускусной кислотой), ацетон, водные буферные растовры (фосфатный и боратный).
Установлено, что при отмывке мембраны с нанесенным на нее полимером, смесью этанола-соляная кислота происходит разрушение полимера. При отмывке фосфатным или боратным буферным раствором темплат не извлекается. По результатам исследований лучшим составом для извлечения молекулы темплата является смесь метанола с уксусной кислотой (лед.), также получены хорошие результаты для смеси этанол-уксусная кислота.
3.2 Получение молекулярно-импринтированных мембран с отпечатками цефтриаксона в присутствии солей меди
Для повышения качества отпечатков эффективен ввод солей переходных металлов (медь, никель, цинка) [15]. Так как соединения меди обычно гидротированы, а полимеры в предполимиризационной смеси гидрофобны и присутствие воды сказывается отрицательно на качестве молекулярных отпечатков, то для получения МИП в присутствии солей меди исследовались следующие составы полимеризационных смесей: разные соли меди (CuSO4*5H2O, CuCO3 и CuCl (I)) и разные смеси растворителей.
Таблица 1. Выбор состава растворителя для приготовления полимеризационной смеси в присутствии солей меди (mн (CuCl) = 5 мг)
Растворитель Система |
ДМСО, мкл |
ДМФА, мкл |
ТГФ, мкл |
МеОН, мкл |
МАК, мкл |
Результат |
|
I |
250 |
500 |
- |
250 |
25 |
- |
|
II |
250 |
500 |
- |
- |
25 |
+ |
|
III* |
- |
500 |
250 |
250 |
25 |
+ |
*- Раствор имеет интенсивную голубую окраску
Установлено, что CuSO4*5H2O не растворим в полимеризационной смеси.
Для полного растворения навески CuCO3 в смеси ДМФА и МАК потребовалось 15 ч. Предложено использовать соли одновалентной меди, плохо растворимые в водных растворах, но растворимые в ДМФА. Однако для растворения навески CuCl массой 5 мг в необходимом количестве ДМФА также требуется значительное время, поэтому для уменьшения времени растворения соли меди использовали смеси растворителей (табл. 1).
Установлено, что в смеси ДМФА-ТГФ-МеОН растворение хлорида меди (I) происходит за 10 минут, при этом раствор при добавлении МАК приобретает интенсивную окраску. Это может быть связано с образованием координационных соединений меди с функциональным мономером (МАК). Также положительного результата достигли, используя смесь ДМФА-ДМСО, но в данном случае при введении МАК интенсивной окраски раствора не наблюдали. В связи с этим интересно было получить мембраны, приготовленные на различных смесях растворителей (системы II и III).
Далее для извлечения темплата и непрореагировавших компонентов полимеризационной смеси мембраны помещали в пластиковые стаканчики и отмывали следующим образом:
Первая отмывка: 10 минут в 1 мл смеси метанол : уксусная кислота (лед.) в соотношении 9:1.
Вторая отмывка: 10 минут в 1 мл ЭДТА 1Ч10-3 М.
Третья отмывка: 10 минут в 1 мл смеси этанол : уксусная кислота (лед.) в соотношении 9:1.
Раствор ЭДТА использовали для удаления остаточного содержания меди из модицифицированных мембран, а отмывка на третьей стадии этанолом (вместо метанола) призвана уменьшить токсичность и стоимость применяемых реагентов.
Подготовленные таким образом мембраны использовали для проведения дальнейших исследований.
3.3 Изучение проницаемости молекулярно-ипринтированных мембран
Для оценки МИП в литературе используют такой параметр как импринтинг-фактор (IF). Импринтинг-факторы для всех исследованных систем рассчитывали на основе обработки данных, полученных из кинетических кривых диффузии. Минимальное необходимое время для расчета степени переноса (R, %) модельного соединения через модифицированную полимером мембрану 10 мин (рис. 9). Это же время приняли при изучении диффузии других антибиотиков через исследованные мембраны.
Важно отметить, что для системы II диффузию модельного соединения возможно проводить из водных растворов (фосфатный буферный раствор). В то время как для системы III диффузия модельного соединения через мембрану из водных растворов не наблюдается. Поэтому принимающая и питающая фазы диффузионной ячейки были заменены на этанол. Установлено, что замена водной фазы на органическую позволяет проводить диффузию цефтриаксона.
Рис. 9. Зависимость степени переноса цефтриаксона от времени диффузии через молекулярно-импринтированную мембрану, полученную в присутствии меди (ДМФА-ДМСО, принимающая и питающая фаза - фосфатный буферный раствор)
Сравнивая импринтинг-факторы системы II и III можно отметить, что системы, полученные на смеси растворителей ДМСО-ДМФА имеют несколько большие значения IF (рис. 10). Кроме того, несомненным преимуществом является возможность работать с такими системами в водных средах и с водорастворимыми антибиотиками.
Рис. 10. Импринтинг-факторы молекулярно-импринтированных мембран, полученных в присутствии/отсутствие меди (система II - ДМФА-ДМСО, диффузия в фосфатных растворах; система III - ДМФА-МеОН-ТГФ, диффузия в этанольных растворах).
3.4 Оценка селективности модифицированных мембран
Для целей разделения и концентрирования в аналитической химии важно было установить селективность разделения на полученных модифицированных мембранах к антибиотикам других классов.
В качестве модельных антибиотиков выбраны тетрациклин и эритромицин, спектры поглощения которых представлены на рис. 11. Первый представляет собой антибиотик тетрациклинового ряда первого поколения, широко используемый в медицинской практике при лечении ЛОР заболеваний. Второй антибиотик (эритромицин) относится к классу макролидов. Он назначается при непереносимости или неэффективности тетрациклинов.
Для оценки эффективности разделения антибиотиков рассчитаны факторы разделения (SF) мембран с молекулярными отпечатками цефтриаксона, полученными в присутствии и отсутствие солей меди.
Рис. 11. Спектры поглощения цефтриаксона (1),тетрациклина (2) и эритромицина (3). Сант=1Ч10-5М
Рис. 12. Импринтинг-фактор и факторы разделения антибиотиков на модифицированных мембранах, полученных в присутствии/отсутствие меди.
Как видно из рисунка 12, IF мембраны, полученной в присутствии меди, в 2 раза выше, чем у мембраны при приготовлении которой соли меди не вводили. Факторы разделения тетрациклина и эритромицина значительно выше для модифицированных мембран, полученных в присутствии меди.
Таким образом, введение солей меди в предполимеризационную смесь при модифицировании мембран тонкими слоями полимеров, оказывает положительное влияние на импринтинг цефтриаксона, позволяя получать более качественные молекулярные отпечатки. Это можно связать с образованием молекулярных комплексов этого антибиотика и ионов меди, что, видимо, способствует увеличению числа сайтов связывания антибиотика и полимера.
Вывод
• Получены трековые мембраны с молекулярными отпечатками цефтриаксона. Установлено, что импринтинг фактор для мембран, модифицированных в присутствии соли меди в 2 раза выше, чем в ее отсутствии.
• Найдены оптимальные условия получения МИМ в присутствии/отсутствие соли меди. Время получения - 10 мин, С(ФО) = 0,057 ммоль, соотношение МАК:ЭГДМА=1:100, МАК:Цеф=20:1.
• Разработаны две системы с разными смесями растворителей. Установлено, что для системы ДМФА-ТГФ-МеОН перенос цефтриаксона происходит только из этанольных растворов. Для системы ДМФА-ДМСО диффузию возможно проводить в водных растворах.
• Показана селективность полученных МИМ к различным классам антибиотиков (тетрациклин, эритромицин). Фактор разделения для МИМ полученных в присутствии меди (ДМФА-ДМСО) по отношению к тетрациклину равен 8, эритромицину - 3.
Список литературы
1. Алексеев В.Г. Ионные равновесия в растворах пенициллинов, цефалоспоринов и их металлокомплексов / автореф. дис. канд. хим. наук. Тверь, 2007. C. 31.
2. Егоров Н.С. Основные учения об антибиотиках. М.: Высшая школа, 1986. С. 448.
3. Солдатенков А.Т., Колядина Н.М., Шендрик И.В. Основы органической химии лекарственных веществ. М.: Мир, 2003. С. 192.
4. Снесарев С.В. Потенциометрические сенсоры на основе комплексов серебра (I) с некоторыми в-лактамными антибиотиками и катионами тетраалкиламмония // автореф. дис. канд. хим. наук. Саратов. 2012. С. 24.
5. Голубева М.В., Алексеев В.Г. Ионные равновесия в водном растворе цефтриаксона // Chemical Science. 2012. №6. P.494-496.
6. Мохов Д.С., Барабанова С.С. Воздействие экспериментальных соединений цефтриаксона с аминокислотами и металлами на микроорганизмы / Конф. «Молодёжь и наука» [Электронный ресурс]. Красноярск: Сибирский федеральный ун-т, 2012.
7. Арзамасцев А.П. Фармацевтическая химия. М.: 1 Э0ТАР-МЕД. 2004. С. 640
8. British Pharmacopoeia 2009. V. I & II. Monographs: Medicinal and Pharmaceutical Substances: Ceftriaxone Sodium (article). P. 1-5.
9. Salem Hesham, Askal Hassan Colourimetric and AAS determination of cephalosporins using Reineck's salt. // J.Pharm. and Biomed. Anal. 2002. 29, №1-2. P. 347 - 354.
10. Новикова Г.В., Сталоверова Н.А. «Спектрофотометрическое определение цефтриаксона в соединениях с металлами». / Конф. «Аналитика Сибири и Дальнего Востока». Красноярск: Сибирский федеральный ун-т, 2012. С. 54.
11. Sun Yuanyuan, Tang Yuhai, Yao Hong, Zheng Xiaohui Potassium permanganate - glyoxal chemiluminescence system for flow injections analysis of cephalosporin antibiotics: cefalexin, cefadroxil,and cefazolin sodium in pharmaceutical preparations //Talanta. 2004. 64, № 1. P. 156-159.
12. Дмитриенко С.Г., Ирха В.В. Влияние соотношения функциональный мономер-темплат в предполимеризационной смеси на сорбционные свойства полимеров с молекулярными отпечатками органических соединений // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2006. Т.47. №3. С. 210.
13. Гендриксон О.Д., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Молекулярно импринтированные полимеры и их применение в биохимическом анализе // Успех. Биолог. Хим. 2006. Т. 46. С. 149-192.
14. British Pharmacopoeia 2009. Volume IV. Infrared Reference Spectra Cefoxitin Sodium. Р. 1.
15. Kryvshenko G.A., Apel P.Y., Abramchuk S.S., Beklemishev M.K. A Highly Permeable membrane for separation of quercetin obtained by Nickel(II) Ion-Mediated Molecular Imprinting // Separation Science and Technology. №47. 2012. Р. 1715-1724.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Физико-химическая характеристика алюминия. Методика определения меди (II) йодометрическим методом и алюминия (III) комплексонометрическим методом. Оборудование и реактивы, используемые при этом. Аналитическое определение ионов алюминия (III) и меди (II).
курсовая работа [53,8 K], добавлен 28.07.2009Распространение меди в природе. Физические и химические свойства меди. Характеристики основных физико-механических свойств. Отношение меди к галогенам и другим неметаллам. Качественные реакции на ионы меди. Двойные и многокомпонентные медные сплавы.
реферат [68,0 K], добавлен 16.12.2010История открытия меди и серебра. Применение меди в промышленности: электротехнике, машиностроении, строительстве, химическом аппаратуростроении, денежном обращении и ювелирном деле. Основные химические свойства и физическая характеристика металлов.
презентация [1,1 M], добавлен 25.03.2013Атомные, физические и химические свойства элементов подгруппы меди и их соединений. Содержание элементов подгруппы меди в земной коре. Использование пиро- и гидрометаллургическиех процессов для получения меди. Свойства соединений меди, серебра и золота.
реферат [111,9 K], добавлен 26.06.2014Прохождение луча света через истинные растворы и коллоидные системы. Окислительные свойства хлора по отношению к бромид и иодид ионам, а также по отношению к сульфид и сульфит ионам. Каталитическое разложение пероксида водорода в присутствии ионов меди.
лабораторная работа [1,8 M], добавлен 02.11.2009Медь и её содержание в живой природе и полезных ископаемых. Определение содержания ионов меди в воде реки методом фотоэлектроколориметрии. Методика определения качества природных вод в школьном кабинете химии и результаты колориметрического анализа.
лабораторная работа [68,6 K], добавлен 25.03.2013Изучение сорбируемости меди на буром угле, сапропелях и выделенных из них гуминовых кислотах и минеральном сорбенте на основе горелой породы. Методы извлечения и структура гуминовых кислот. Функции гумусовы веществ в биосфере. Методы определения меди.
курсовая работа [741,5 K], добавлен 14.12.2010Физико-химические основы процесса получения этилбензола в присутствии хлорида, технологическая схема процесса. Материальный баланс процесса производства этилбензола алкилированием в присутствии хлорида алюминия. Расчет теплового баланса алкилатора.
курсовая работа [551,4 K], добавлен 09.08.2012Положение меди в периодической системе Д.И. Менделеева. Распространение в природе. Физические и химические свойства. Комплексные соединения меди. Применение меди в электротехнической, металлургической и химической промышленности, в теплообменных системах.
реферат [62,6 K], добавлен 11.08.2014Характеристика антибиотиков, их классификация по разным признакам. Обзор антибиотиков – производных бетта-лактамидов тиазолидина и дигидротиазина (пенициллинов и цефалоспоринов). Описание их свойств, методик идентификации и количественного определения.
курсовая работа [2,2 M], добавлен 21.08.2011Свойства палладия, его поведение в хлоридных средах. Разработка оптимального метода анализа металла, с учетом доступности реагентов, селективности и высокой воспроизводимости результатов. Гравиметрические и фотометрические методы определения палладия.
дипломная работа [166,0 K], добавлен 24.02.2012Общая характеристика элементов подгруппы меди. Основные химические реакции меди и ее соединений. Изучение свойств серебра и золота. Рассмотрение особенностей подгруппы цинка. Получение цинка из руд. Исследование химических свойств цинка и ртути.
презентация [565,3 K], добавлен 19.11.2015Антибиотики как одни из наиболее эффективных средств борьбы с жизненно опасными инфекционными заболеваниями. Локальная концентрация антибиотика в патологическом очаге. Взаимодействие анионов антибиотиков с распределенным зарядом тканей организма.
автореферат [28,6 K], добавлен 23.03.2009Методика определения содержания меди в виде аммиаката в растворе, дифференциальным методом. Необходимая аппаратура и реактивы. Основные достоинства дифференциальной спектрофотометрии. Расчет массы аммиаката меди в растворах в колбах. Погрешность опыта.
лабораторная работа [60,7 K], добавлен 01.10.2015Физиологическая роль и индикаторы элементного статуса меди. Применение ее в промышленности и медицине. Физические свойства химического элемента, нахождение его в природе. Оценка содержания меди в организме человека, индикаторы ее элементного статуса.
презентация [3,5 M], добавлен 23.02.2015Общая характеристика и свойства меди. Рассмотрение основных методов получения меди из руд и минералов. Определение понятия сплавов. Изучение внешних характеристик, а также основных особенностей латуни, бронзы, медно-никелевых сплавов, мельхиора.
презентация [577,5 K], добавлен 14.04.2015Каталитическое ацилирование алкинов в присутствии соединений меди. Основные методы анализа и идентификации синтезированных соединений. Очистка исходных веществ и растворителей. Взаимодействие тетраалкинилидов олова с хлорангидридами карбоновых кислот.
дипломная работа [474,8 K], добавлен 09.10.2013Рассмотрение взаимодействия солей меди с сульфидами аммония, натрия, калия, гидроксидами, карбонатами натрия или калия, иодидами, роданидами, кислотами. Изучение методов очистки сточных вод от соединений натрия, ванадия, марганца и их изотопов.
творческая работа [22,9 K], добавлен 13.03.2010Описание технологической схемы получения фталоцианина меди. Расчёт материального и теплового балансов. Особенности схемы автоматизации установки. Расчет фильтра, необходимого для фильтрования образующегося красителя. Расчет размеров основных аппаратов.
курсовая работа [529,1 K], добавлен 15.03.2015Физические и химические свойства меди: тепло- и электропроводность, атомный радиус, степени окисления. Содержание металла в земной коре и его применение в промышленности. Изотопы и химическая активность меди. Биологическое значение меди в организме.
презентация [3,9 M], добавлен 12.11.2014