Деструкция углеводородов различными морфотипами нефтеокисляющих актинобактерий

Размещено на http://www.allbest.ru/

УДК 579.66

Деструкция углеводородов различными морфотипами нефтеокисляющих актинобактерий

Худокормов Александр Александрович, к.б.н.

Карасева Эмма Викторовна, к.б.н., профессор

Самков Андрей Александрович, к.б.н.

Волченко Никита Николаевич, к.б.н., ст. преподаватель

Козицын Александр Евгеньевич, аспирант

Кубанский государственный университет, Краснодар, Россия

Аннотации

В работе проводили сравнительное изучение углеводородокисляющей активности S- и R-морфотипов нефтеокисляющих актинобактерий из коллекции Кубанского госуниверситета. Были отмечены достоверные различия в параметрах роста между S и R-формами нефтеокисляющих актинобактерий. У S-форм выше максимальная удельная скорость роста, для них характерен широкий спектр деградации углеводородов и высокая степень деструкции поллютантов. В опытах с использованием в качестве субстрата нефти и мазута S-формы актинобактерий быстрее адаптировались к условиям среды

Ключевые слова: АКТИНОБАКТЕРИИ, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, БИОДЕГРАДАЦИЯ, БИОРЕМЕДИАЦИЯ, МОРФОТИП

UDC 579.66

DESTRUCTION OF HYDROCARBONS WITH VARIOUS MORPHOTYPES OF OIL OXIDIZING ACTINOBACTERIA

Khudokormov Alexander Alexandrovich

Dr.Sci.Biol.

Karaseva Emma Viktorovna

Cand.Biol.Sci., professor

Samkov Andrey Alexandrovich

Cand.Biol.Sci.

Volchenko Nikita Nikolaevich

Cand.Biol.Sci., senior lecturer

Kozitsin Alexander Evgenyevich

postgraduate student

Kuban State University, Krasnodar, Russia

In this article we have carried out a comparative study of hydro-carbon-oxidizing activity of S-and R-morphological types of oil oxidizing Actinobacteria from the collection of Kuban State University. Significant differences observed in parameters of growth between S- and R-forms of oil oxidizing Actinobacteria. In S-forms it is higher than the maximum specific growth rate, which is typical for a wide range of hydrocarbon degradation and a high degree of degradation of pollutants. In experiments with the use of oil as a substrate and heavy oil S-forms, Actinobacteria quickly adapted to the environmental conditions

Keywords: ACTINOBACTERIA, CULTIVATION, BIODEGRADATION, BIOREMEDIATION, MORPHOTYPE

Введение

Крупнейшей проблемой, стоящей перед человечеством, является разрушение естественных экосистем под действием антропогенной нагрузки. Одним из основных фактором давления общепризнанно считается накопление в биосфере всевозможных поллютантов, в том числе сырой нефти и продуктов её переработки. Мощное негативное влияние нефтепродуктов на атмосферу, гидросферу, почвенный покров Земли обусловлен рядом факторов: активным и всё более возрастающим применением углеводородного сырья во всех отраслях хозяйственной деятельности человека; широким распространением нефтедобывающих, транспортирующих, перерабатывающих и потребляющих предприятий; характерными физико-химическими и токсическими свойствами углеводородов, обусловливающими их низкую биодеградабельность в естественных экосистемах. Микроорганизмы, способные потреблять углеводороды, являются обычными представителями биоценозов почв и водных экосистем. Основными компонентами углеводородокисляющих бактериоценозов являются актинобактерии, такие, как родококки, нокардии, гордонии, артробактерии [1,2]. В хронически загрязненных нефтью почвах родококки составляют 90. В почвах с низкой степенью нефтяного загрязнения количество родококков снижается и составляет 60-80 [3]. Даже в незагрязненных почвах концентрация углеводородокисляющих актинобактерий 0,01--0,05% [4]. Rhodococcus - постоянный и доминирующий компонент микробиоценозов нефтезагрязненных почв. Не меньшим нефтеокисляющим потенциалом характеризуются Gordonia, Nocardia [3]. Основной экологической ролью родококков является ассимиляция природных и антропогенных газообразных, жидких н-алканов, ароматических углеводородов [5]. Все родококки, выделяемые из углеводородзагрязнённых экосистем, при культивировании на средах с нефтепродуктами максимальную биомассу накапливают при росте на алканах C₁₅ и C₁₆ [6]. Актинобактерии способны усваивать широкий спектр углеводородов, включая и ароматические, имеют высокую скорость роста [7]. Активность актинобактерий в 70 раз превосходит активность других нефтеокисляющих микроорганизмов. Это связано с более крупными размерами клеток и их способностью окислять большие количества н-алканов, чем это необходимо для удовлетворения своих энергетических и конструктивных потребностей. Избыток окисленного н-алкана родококки и артробактерии переводят в нейтральные липиды, тогда как другие нефтеокисляющие микроорганизмы (например, псевдомонады) внутреннего пула углеводородов не имеют и резервных липидов не образуют. Нефтеокисляющая активность родококков может коррелировать с морфотипом колоний. Так, ранее была показана зависимость способности родококков утилизировать ароматическую фракцию арабской сырой нефти от морфотипа колоний [8,9].

Материалы и методы

В качестве объектов исследования послужили штаммы нефтеокисляющих актинобактерий S- и R-морфотипов, выделенные из углеводородзагрязнённых объектов и входящие в коллекцию микроорганизмов КубГУ

Штамм Rhodococcus erythropolis B2. Грамположительные коккобактерии. Колонии кремовые округлые, точечные, непрозрачные, поверхность гладкая, край ровный, консистенция маслянистая.

Штамм Rhodococcus sp. J8. Короткие палочки с закруглёнными концами. По Граму окрашиваются положительно. Колонии округлые, точечные, непрозрачные. Поверхность колоний шероховатая, окраска красная, структура однородная.

Штамм Dietzia maris J1. Мелкие одиночные грамположительные кокки. Образуют округлые, точечные колонии оранжевого цвета. Край колоний ровный, поверхность шероховатая, выпуклая, консистенция сухая.

Штамм Gordonia sp. Z7. Грамположительные изогнутые палочки в виде скоб, дают V-образные структуры. Колонии красно-оранжевые, непрозрачные, шероховатые, край рваный, структура однородная

Штамм Nocardia sp. J2. Одиночные грамположительные палочки с обрубленными концами. Дают округлые, непрозрачные, ярко-розовые колонии с гладкой поверхностью и ровным краем.

Штамм Rhodococcus erythropolis F1. Тонкие, изящные коккобактерии. По Граму окрашиваются положительно. Образуют V-образные структуры. Колонии кремово-розовые, округлые, блестящие, с гладкой выпуклой поверхностью, край ровный, консистенция маслянистая.

При выборе штаммов руководствовались ранее проведёнными исследованиями, подтверждающими их высокую нефтеокисляющую активность [10]. Для поддержания культур, наработки биомассы клеток и количественного учета использовали плотную питательную среду - питательный агар (ПА) стандартного состава. Для наращивания биомассы клеток, а также исследования биодеструкции нефтепродуктов использовали жидкую минеральную среду следующего состава (минимальную среду): нитрат калия - 4,0 г, однозамещенный фосфат калия - 0,6 г, двузамещенный фосфат натрия (двенадцати водный) - 1,4 г, сульфат магния - 0,8 г, вода дистиллированная 1 л, раствор микроэлементов стандартный №17 - 1 мл. В качестве субстрата использовали сахарозу, гексадекан или нефтепродукты из ряда: дизельное топливо, нефть, мазут, вносимые в среду в необходимом количестве в зависимости от целей культивирования. Для качественного определения деструкции индивидуальных алканов использовали агаризованную среду того же состава. Культивирование на жидких питательных средах осуществлялось в колбах 100-500 мл на орбитальных качалках при частоте вращения 100-200 об/мин при комнатной температуре.

Остаточное содержание нефтепродуктов в минеральной среде и в нефтесодержащих отходах определяли по стандартной методике при помощи концентратомера КН-2М. Для определения количества жизнеспособных клеток производили посев из кратных разведений на ПА в 3-х повторностях. Чашки термостатировали при 25С в течение 2-3 суток, после этого проводили подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ) и определяли число КОЕ на 1 г (мл) субстрата. Обработку результатов осуществляли с помощью статистического пакета Statistica 6.0

Результаты и обсуждение

Нами было проведено сравнительное изучение активности нефтеокисляющих актинобактерий, выделенных из нефтезагрязнённых почв, почвогрунтов и нефтешламов. В качестве источника углеводородного питания использовали нормальные парафины ряда С₁₀ - С₁₈.

При 0,1 %-ной начальной концентрации углеводородных фракций в составе среды (табл. 1) наблюдается интенсивная утилизация всеми исследуемыми культурами актинобактерий в ряду С₁₆-С₁₈.

Таблица 1 - Степень утилизации (%) отдельных фракций углеводородов исследуемыми штаммами актинобактерий, при начальной концентрации субстрата 0,1%

При деградации пентадекана наблюдается некоторое различие между S- (Rhodococcus erythropolis F1, Rhodococcus erythropolis B2, Nocardia sp. J2) и R- (Rhodococcus sp. J8, Dietzia maris J1, Gordonia sp. Z7) культурами. S-формы более полно деградируют исследуемый углеводород. Дальнейшее сокращение углеводородной цепочки приводит к угнетению нефтеокисляющей активности, что следует из невысокого процента деградации углеводородных фракций ряда С14-С10. При потреблении этих углеводородов также сохраняется различие в активности между S и R вариантами. Труднее всего R-вариантами потребляются декан и ундекан, степень деструкции, которых не превышает 25%.

При десятикратном увеличении концентрации углеводородов в составе среды также наиболее деградабельными для всех штаммов актинобактерий, используемых в эксперименте, остаются фракции С₁₆-С₁₈ (табл.2)

Таблица 2 - Степень утилизации (%) отдельных фракций углеводородов исследуемыми штаммами актинобактерий, при начальной концентрации субстрата 1%

Различия в потреблении углеводородов ряда декан - пентадекан между S- и R-формами актинобактерий возрастают по мере увеличения концентрации углеводородного субстрата. Возможно, это связано с различными уровнями синтеза и экскреции биосурфактантов [11]. Общий процент потребления этих фракций углеводородов существенно сокращается для штаммов R. sp. J8, D. maris J1, Gordonia sp. Z7 и остается практически неизменным для R. erythropolis F1, R. erythropolis B2 и Nocardia sp. J2.

При увеличении содержания углеводородов в сто раз, по сравнению с начальным, токсическое действие на исследуемые культуры начинает сказываться и в ряду гексадекан - октадекан (табл. 3).

Таблица 2 - Степень утилизации (%) отдельных фракций углеводородов исследуемыми штаммами актинобактерий, при начальной концентрации субстрата 10%

Процент деградации этих углеводородов при данной концентрации субстрата уменьшается в среднем на 10-30%. Высокую активность по сравнению с другими культурами сохраняет лишь штамм R. erythropolis B2. По-видимому, при увеличении концентрации углеводородного субстрата сверх уровней адаптации изучаемых актинобактерий, выделение ими в среду биосурфактантов не оказывает определяющего вклада в процесс потребления углеводородов и снижения их токсического действия на клетку. Степень деградации нефтепродуктов в этом случае детерминируется индивидуальной устойчивостью штамма к токсиканту.

Для дальнейшего исследования углеводородокисляющей способности штаммов и уровня их активности в отношении углеводородов в качестве единственного источника углерода использовали наиболее распространённые поллютанты, такие как сырая российская нефть, топочный мазут М40, дизельное топливо, авиационный керосин, минеральные масла марок М8 и М10 и эмульсол, представляющий собой смесь веретенного масла и высокомолекулярных жирных кислот. Субстрат вносился, как и в предыдущем опыте, из расчёта 0,1%, 1% и 10 %. При деградации нефтепродуктов с превалирующим содержанием легких фракций (нефть, дизельное топливо и керосин), наблюдается одинаково высокая нефтеокисляющая активность у всех исследуемых штаммов актинобактерий (табл. 4). Степень деструкции исследуемых субстратов колеблется у разных штаммов от 76 до 96%.

Таблица 4 - Степень утилизации (%) нефтепродуктов и минеральных масел исследуемыми штаммами актинобактерий, при различной начальной концентрации субстрата

При переходе к минеральным маслам или нефтепродуктам, содержащим большее количество высокомолекулярных углеводородов (эмульсол и мазут), более высокую активность показывают штаммы, выделяющие поверхностно-активные вещества. Наиболее показательны в этом плане штаммы R. erythropolis B2 и R. erythropolis F1, проявляющие наряду с нефтеокисляющими свойствами способность к продукции биосурфактантов [12], чем объясняется наивысшая степень деградации ими всех высокомолекулярных углеводородов. При однопроцентной концентрации углеводородов в среде вновь, как и в опыте с индивидуальными углеводородами, происходит разделение штаммов на две четко обособленные группы. У актинобактерий, выделяющих экзополисахариды (S-формы), нефтеокисляющая активность по отношению ко всем используемым в эксперименте углеводородам существенно выше, у R _ форм. Обособленность групп S- и R-культур в нефтеокисляющей активности сохраняется. В целом же, возросшая концентрация нефтепродуктов не оказала угнетающего воздействия на исследуемые штаммы актинобактерий.

Внесение в питательную среду 10% углеводородов в качестве источника углерода вызвало уменьшение нефтеокисляющей активности у штаммов R. sp. J8, D. maris J1, G. sp. Z7 в два-четыре раза (см.табл. 4). Штаммы R. erythropolis F1 и R. erythropolis B2 сохранили высокое сродство к углеводородному субстрату, несмотря на его концентрацию. Деструкция ими углеводородного субстрата не опускалась ниже 50%. Возникшая разобщённость между исследуемыми актинобактериальными штаммами сохранилась и при 10%-ной концентрации углеводородов. Выраженная разница была между штаммами, выращенными на труднодеградируемых субстратах, содержащих высокомолекулярные углеводороды. Угнетённость штаммов была ниже, чем при использовании индивидуальных углеводородов в аналогичной концентрации, что связывается нами с гетерогенностью используемых субстратов. В этом случае ни один из компонентов сложного углеводорода не достиг концентрации, достаточной для оказания существенного ингибирующего воздействия. Самым труднопотребляемым субстратом оказались минеральные масла вне зависимости от их марки. К их активной деструкции были способны лишь два штамма R. erythropolis F1 и R. erythropolis B2, что даёт возможность эффективного использования данных культур как индивидуально, так и в составе консорциумов при ликвидации загрязнения субстрата минеральными маслами или их компонентами. Общий процент деструкции эмульсола был несколько выше, что может объясняться наличием в его составе высокомолекулярных жирных кислот, за счёт которых происходило начальное интенсивное накопление микробного пула. Достоверные отличия между S- и R-морфотипами в потреблении углеводородов и минеральных масел сохранялись при любой концентрации поллютанта. нефтепродукт актинобактерия углеводород утилизация

Таким образом, нами была определена степень потребления индивидуальных углеводородных фракций, наиболее часто встречающихся в качестве поллютантов минеральных масел, а также установлены различия в активности между исследуемыми штаммами актинобактерий, проявляющиеся в неоднозначной реакции на пониженные и повышенные концентрации нефтепродуктов, содержащих в своём составе легкие и тяжелые фракции.

Для оценки возможности использования штаммов в процессах биоремедиации субстратов, загрязнённых различными углеводородами, проводили изучение скорости роста культур при использовании различных нефтепродуктов в качестве источников углерода. В качестве источников углеродного питания, нами было решено использовать гексадекан (как субстрат, содержащий лёгкие углеводородные фракции), топочный мазут М 40 (как субстрат, содержащий преимущественно тяжелые углеводородные фракции) и сырую российскую нефть (содержащую как легкие, так и тяжелые фракции углеводородов и являющуюся наиболее распространённым загрязнителем окружающей среды) (рис. 1).

Рисунок 1- Максимальные удельные скорости роста культур актинобактерий при культивировании на различных субстратах

Сравнение удельных скоростей роста показывает, что при любом источнике углеводородного субстрата S-формы бактерий проявляют более высокую скорость роста по сравнению с R-формами. Для всех исследуемых культур максимальная удельная скорость роста была отмечена на среде с гексадеканом, наименьшая удельная скорость роста отмечена на среде с мазутом. Исключение составляет штамм Rhodococcus erythropolis B2, для которого удельные скорости роста при культивировании на среде с нефтью и мазутом были одинаковы, а также культура Nocardia sp. J2, для которой удельная скорость роста на среде с мазутом была выше, чем в аналогичной среде с нефтью.

Заключение

В процессе культивирования были отмечены достоверные различия в параметрах роста между S и R-формами нефтеокисляющих актинобактерий. У S-форм выше максимальная удельная скорость роста, для них характерна более быстрая адаптация к новому субстрату. В опытах с использованием в качестве субстрата нефти и мазута S-формы актинобактерий быстрее адаптировались к условиям среды. Таким образом, при проведении работ по биоремедиации целесообразно использовать штаммы Rhodococcus erythropolis B2 и Nocardia sp. J2, относящиеся к S-формам, как обладающие высокой скоростью роста при различных концентрациях углеводородов с различной длиной цепи и фракционным составом.

Список литературы

1. Гирич И.Е., Малахов А.А., Гавриш Е.Ю., Карасева Э.В. Таксономическое разноообразие углеводородокисляющей микрофлоры в нефтезагрязненных почвах Краснодарского края // Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды. Пущино, 2001. С. 24-27

2. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Ильинский В.В., Комарова Т.Н., Поршнева О.В. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов экосистем разных климатических зон // Микробиология. 1994. Т. 63, № 5. С. 917-922.

3. Малахов А.А., Гирич И.Е., Нечитайло Т.Ю., Карасева Э.В. Роль нефтеокисляющей микрофлоры в биоремедиации почв и почвогрунтов, загрязненных нефтью // Экология-2000: Мат. межд. научно-практич. конф. Москва, 2000. С. 23-24

4. Oberbremer A., Mller-Hurtig R. Aerobic stepwise hydrocarbon degradation and forPhmation of biosurfactants by an original soil population in a stirred reactor // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. V. 31. P. 582-586.

5. Makula R., Finnerty W.R. Microbial assimilation of hydrocarbons, fatty acids derived from normal alkanes // J. Bacteriol. 1986. V. 95. P. 2102-2107.

6. Бердичевская М.В. Особенности физиологии родококков разрабатываемых нефтяных залежей // Микробиология. 1989. Т. 58. № 1. С. 60-65.

7. Barbeau C., Deschenes L., Karamanev D., Comeau Y., Samson R. Bioremediation of pentachlorophenol-contaminated soil by bioaugmentation using activated soil // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 48. P. 745-752.

8. Wakayama Y, Nakajima M, Murooka H. Isolation and characterization of S and R strains of Nocardia sp. CF222. Bull Coll Agric Vet Med Univ. 1980;V37. P.99-105.

9. Noriyuki Iwabuchi, Michio Sunairi, Hirosi Anzai, Mutsuyasu Nakajima, Shigeaki Harayama Relationships between Colony Morphotypes and Oil Tolerance in Rhodococcus rhodochrous Appl. Environ. Microbiol. 2000 November; 66(11): 5073-5077.

10. Карасева Э.В., Гирич И.Е., Худокормов А.А., Алешина Н.Ю., Карасёв С.Г. Биоремедиация черноземной почвы, загрязненной нефтью // Биотехнология. -2005. -№ 2. -С. 67-72.

11. Волченко Н.Н., Карасёва Э.В. Скрининг углеводородокисляющих бактерий - продуцентов поверхностно-активных веществ биологической природы и их применение в опыте по ремедиации нефтезагрязненной почвы и нефтешлама // Биотехнология. -2006. -№ 2. -С. 57-62.

12. Карасёва Э.В. Волченко Н.Н., Худокормов А.А., Самков А.А., Карасёв С.Г., Батина Е.В., Самкова С.М. Нефтеокисляющий штамм Rhodococcus erythropolis B2 как основа создания биопрепарата для ликвидации углеводородных загрязнений и рекультивации земель //Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2012. - № 83. - С.154-167

References

1. Girich I.E., Malahov A.A., Gavrish E.Ju., Karaseva Je.V. Taksonomicheskoe raznooobrazie uglevodorodokisljajushhej mikroflory v neftezagrjaznennyh pochvah Krasnodarskogo kraja // Jekobiotehnologija: bor'ba s neftjanym zagrjazneniem okruzhajushhej sredy. Pushhino, 2001. S. 24-27

2. Koronelli T.V., Dermicheva S.G., Il'inskij V.V., Komarova T.N., Porshneva O.V. Vidovaja struktura uglevodorodokisljajushhih bakteriocenozov jekosistem raznyh klimaticheskih zon // Mikrobiologija. 1994. T. 63, № 5. S. 917-922.

3. Malahov A.A., Girich I.E., Nechitajlo T.Ju., Karaseva Je.V. Rol' nefteokisljajushhej mikroflory v bioremediacii pochv i pochvogruntov, zagrjaznennyh neft'ju // Jekologija-2000: Mat. mezhd. nauchno-praktich. konf. Moskva, 2000. S. 23-24

4. Oberbremer A., Mьller-Hurtig R. Aerobic stepwise hydrocarbon degradation and forPhmation of biosurfactants by an original soil population in a stirred reactor // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. V. 31. P. 582-586.

5. Makula R., Finnerty W.R. Microbial assimilation of hydrocarbons, fatty acids derived from normal alkanes // J. Bacteriol. 1986. V. 95. P. 2102-2107.

6. Berdichevskaja M.V. Osobennosti fiziologii rodokokkov razrabatyvaemyh neftjanyh zalezhej // Mikrobiologija. 1989. T. 58. № 1. S. 60-65.

7. Barbeau C., Deschenes L., Karamanev D., Comeau Y., Samson R. Bioremediation of pentachlorophenol-contaminated soil by bioaugmentation using activated soil // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 48. P. 745-752.

8. Wakayama Y, Nakajima M, Murooka H. Isolation and characterization of S and R strains of Nocardia sp. CF222. Bull Coll Agric Vet Med Univ. 1980;V37. P.99-105.

9. Noriyuki Iwabuchi, Michio Sunairi, Hirosi Anzai, Mutsuyasu Nakajima, Shigeaki Harayama Relationships between Colony Morphotypes and Oil Tolerance in Rhodococcus rhodochrous Appl. Environ. Microbiol. 2000 November; 66(11): 5073-5077.

10. Karaseva Je.V., Girich I.E., Hudokormov A.A., Aleshina N.Ju., Karasjov S.G. Bioremediacija chernozemnoj pochvy, zagrjaznennoj neft'ju // Biotehnologija. -2005. -№ 2. -S. 67-72.

11. Volchenko N.N., Karasjova Je.V. Skrining uglevodorodokisljajushhih bakterij - producentov poverhnostno-aktivnyh veshhestv biologicheskoj prirody i ih primenenie v opyte po remediacii neftezagrjaznennoj pochvy i nefteshlama // Biotehnologija. -2006. -№ 2. -S. 57-62.

12. Karasjova Je.V. Volchenko N.N., Hudokormov A.A., Samkov A.A., Karasjov S.G., Batina E.V., Samkova S.M. Nefteokisljajushhij shtamm Rhodococcus erythropolis B2 kak osnova sozdanija biopreparata dlja likvidacii uglevodorodnyh zagrjaznenij i rekul'tivacii zemel' //Politematicheskij setevoj jelektronnyj nauchnyj zhurnal Kubanskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. - 2012. - № 83. - S.154-167

Размещено на Allbest.ru